НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

МУДРИК Олена Анатоліївна

УДК 575:581.15:582.475(477)

ДИНАМІКА ГЕНЕТИЧНОЇ СТРУКТУРИ ПРИРОДНИХ ПОПУЛЯЦІЙ ДЕЯКИХ ВИДІВ РОДИНИ PINACEAE LINDL. В УКРАЇНІ

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі промислової ботаніки Донецького

ботанічного саду НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Коршиков Іван Іванович,

Донецький ботанічний сад НАН України,

завідувач відділу промислової ботаніки

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Терновська Тамара Костянтинівна,

Національний університет “Києво-Могилянська академія”,

завідувач кафедри біології;

кандидат біологічних наук

Морозов-Леонов Святослав Юрійович,

Інститут зоології ім. І.І. Шмальгаузена НАН України,

старший науковий співробітник

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

м. Київ

Захист відбудеться "26" жовтня 2006 р. о 1630 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано "18" вересня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О. А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У вирішенні глобальної проблеми збереження біологічної різноманітності ключове значення має визначення факторів і принципів стійкого функціонування популяцій живих організмів. Пізнання закономірностей системної організації популяцій, особливо генетичної складової та її мінливості на різних стадіях онтогенетичного розвитку організмів, необхідне для розкриття механізмів підтримання оптимального рівня генетичної різноманітності та підрозділеності популяцій як основи їх пристосованості та раціональної експлуатації (Алтухов и др., 1996). В ізольованих популяціях перехресно запилюваних рослин з низькою чисельністю, а також у популяціях на межі природних ареалів видів, де дія лімітуючих факторів середовища може бути особливо впливовою, можливий розвиток несприятливого генетичного процесу через зміни у співвідношенні часток інбридингу і ауткросингу (Алтухов, 2003). Зростаючий антропогенний вплив на лісові екосистеми також може призводити до порушень нативної генетичної структури видів-едифікаторів (Коршиков, 1996). Тому дослідження динаміки популяційних генофондів, перерозподілу внутрішньо- та міжпопуляційних компонент генетичної мінливості у часі та просторі необхідні для визначення факторів підтримання еволюційно сформованої оптимальної генетичної різноманітності популяцій. З’ясування генетичної структури популяцій рослин на територіях, що охороняються, необхідне також для практики відтворення порушених через нераціональну господарську діяльність людини популяційних систем (Динамика популяционных генофондов.., 2004).

Для багатьох лісоутворюючих видів хвойних родини Pinaceae Lindl. в Україні вже визначено популяційно-генетичну різноманітність, зокрема, сосни кримської (Pinus pallasiana D. Don), сосни крейдяної (P. sylvestris var. cretacea Kalenicz. еx Kom.), сосни звичайної (P. sylvestris L.) та ялини європейської (Picea abies (L.) Karst.) (Silin, Goncharenko, 1996; Гончаренко и др., 1993; Коршиков, 1996; Гончаренко, Падутов, 2001; Коршиков, Тунда 2004; Коршиков и др., 2005). Однак у цих роботах вивчено генетичну структуру та диференціацію популяцій зазначених видів з використанням генеративно зрілих рослин і майже зовсім не досліджено питання порівняльного аналізу генетичної структури різновікових популяцій, її підтримання у насіннєвому потомстві, не аналізовано систему схрещування та її динаміку у різні роки, а також її зв’язок з насіннєвою продуктивністю рослин. Саме дослідження динаміки генетичної структури важливі для пізнання факторів генетичної стійкості популяцій і можуть слугувати для розробки практичних заходів щодо збереження рідкісних та стабільного відтворення господарсько корисних видів хвойних.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі промислової ботаніки Донецького ботанічного саду НАН України. Дослідження є складовою частиною бюджетних тем: “Дослідження генного різноманіття та факторів генетичної стійкості популяційних систем головних лісоутворюючих видів України з метою їх збереження в екологічно кризових регіонах та селекційного поліпшення” (2002–2006 рр.), № ДР 0102U004909, “Дослідження внутрішньовидової генетичної різноманітності рідкісних, зникаючих та інтродукованих видів родини Pinaceae Lindl. в Україні” (2003–2007 рр.), № ДР 0103U004181, а також робота пов’язана з виконанням госпдоговірної теми “Генетичні дослідження реліктових популяцій сосни звичайної на території Кременецьких гір”, № 4/2005 та проекту науково-дослідних робіт молодих учених НАН України “Аналіз підтримання генетичної структури природних популяцій ялини європейської (Picea abies (L.) Karst.) у насіннєвому потомстві в Українських Карпатах”, № ДР 0105U008150. Експериментальну роботу за даним проектом виконано у лабораторії популяційної генетики Інституту загальної генетики ім. М.І. Вавілова РАН.

Мета та завдання дослідження. Мета – аналіз динаміки генетичної структури у реліктових популяціях сосни крейдяної та сосни звичайної, маргінальних популяціях сосни кримської та ялини європейської на заповідних територіях України з використанням ізоферментів у якості молекулярно-генетичних маркерів.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження. Генетична структура материнських дерев і зародків їх насіння у реліктових популяціях сосни крейдяної та сосни звичайної, маргінальних популяціях сосни кримської та ялини європейської в Україні.

Предмет дослідження. Відтворення популяційних генофондів у насіннєвому потомстві та частка перехресного запилення в популяціях сосни крейдяної, сосни звичайної, сосни кримської та ялини європейської в Україні.

Методи дослідження. Електрофоретичне розділення у поліакріламідному гелі ізоферментів 5 ферментних систем ендоспермів і зародків насіння сосни крейдяної, сосни звичайної, сосни кримської та у крохмальному гелі – 3 ферментних систем ялини європейської. Статистичні методи популяційної генетики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні на основі даних алозимної мінливості проаналізовано особливості підтримання генетичної структури материнських дерев реліктових популяцій сосни крейдяної та сосни звичайної, маргінальних популяцій сосни кримської та ялини європейської у їх насіннєвому потомстві та встановлено значний дефіцит гетерозиготних генотипів на ранній стадії онтогенезу. Розподіли генотипів у вибірках материнських рослин у цих популяціях знаходяться у рівноважному стані генотипів згідно закону Харді–Вайнберга, а у вибірках зародків їх насіння генотипічна рівновага зміщена у бік надлишку гомозигот. У малочисельній реліктовій популяції сосни крейдяної встановлено зниження рівня наявної гетерозиготності та збільшення частот предомінантних алелів з віком дерев. Вперше доведено, що реліктові популяції сосни крейдяної на крейдяних відслоненнях басейну р. Сіверський Донець у Донецькій області та сосни звичайної на дерново-карбонатних ґрунтах Кременецького горбогір’я мають близький рівень генетичної мінливості та подібну генетичну структуру. Визначено, що в популяції сосни кримської у різновисотних поясах Гірському Криму немає чіткої генетичної диференціації дерев та їх насіннєвого потомства. Встановлено, що насіннєва продуктивність сосни кримської залежить від гетерозиготності та ступеня перехресного запилення материнських рослин. Вперше досліджено динаміку ауткросингу в популяціях сосни кримської та сосни крейдяної у різні роки.

Практичне значення одержаних результатів. У сосни крейдяної і сосни кримської визначено ізоферментні локуси для оцінки гетерозиготності насіннєвого потомства конкретних рослин. За цими локусами визначено генотипи дерев, зародки насіння яких мають високий рівень гетерозиготності, що дозволить зменшити частку гомозиготних сіянців при створенні штучних насаджень. Отримані дані щодо системи схрещування усіх досліджуваних популяцій і її зв’язку з насіннєвою продуктивністю, а також зв’язку насіннєвої продуктивності з генетичною мінливістю материнських рослин (у сосни кримської) доцільно враховувати у генетико-селекційній роботі зі збереження і штучного відтворення корисних лісоутворюючих і господарських порід хвойних.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота – самостійне завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень протягом навчання в аспірантурі у 2002–2005 рр. З колективно надрукованих робіт в дисертації використано матеріали, що отримані автором самостійно. Права співавторів публікацій при викладенні дисертації та автореферату не порушено. Формулювання завдань, аналіз та інтерпретація результатів проведено за участю наукового керівника – д.б.н., професора І.І. Коршикова.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи апробовано на II конференції Московського товариства генетиків і селекціонерів “Актуальные проблемы генетики” (м. Москва, 20–21 лютого 2003 р.); III міжнародній школі-семінарі з екології “Экология 2004: Эстафета поколений” (м. Пущино, 27–29 квітня 2004 р.); науково-практичній конференції “Збереження біорізноманітності на південному сході України” (м. Донецьк, 14 вересня 2004 р.); міжнародній науково-практичній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (м. Алушта, 21–23 вересня 2004 р.); IX конференції молодих дослідників “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів” (м. Київ, 24–25 лютого 2005 р.); міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми фізіології та інтродукції рослин” (м. Дніпропетровськ, 5–6 квітня 2005 р.); Другій міжнародній науковій конференції “Відновлення порушених природних екосистем” (м. Донецьк, 6–8 вересня 2005 р.); міжнародній науковій конференції “Наука о лесе: история, современное состояние и перспективы развития” (м. Гомель, 20–24 жовтня 2005 р.); а також неодноразово на засіданнях відділу промислової ботаніки і вченої ради Донецького ботанічного саду НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових праць, включаючи 5 статей у періодичних фахових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 7 розділів, висновків, списку використаних джерел (310 публікацій, в тому числі – 171 іноземних), 2 додатків. Дисертацію викладено на 200 сторінках машинопису, з яких 31 сторінку займає список використаних джерел, 40 – додатки. Робота містить 60 таблиць і 12 ілюстрацій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Природна динаміка популяційних генофондів деревних рослин

(огляд літератури)

Огляд літератури складається з двох підрозділів, в яких розглядаються питання дослідження природної динаміки популяційних генофондів деревних рослин та сучасні підходи щодо аналізу генетичної мінливості лісоутворюючих видів хвойних.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В якості експериментального матеріалу використовували насіння з нормально розвинутих шишок, зібраних з дерев у 5 природних популяціях хвойних в Україні. Загалом проаналізовано 270 дерев та 2476 зародків їх насіння: в популяції сосни крейдяної на крейдяних відслоненнях правого берегу р. Сіверський Донець на території НПП "Святі гори" у Донецькій області (89 дерев і 968 зародків насіння за 2 роки досліджень (2003–2004 рр.); у популяції сосни звичайної на території лісового заказника "Суразька дача" на дерново-карбонатних ґрунтах Кременецького горбогір’я у Тернопільській області (29 рослин, 232 зародки); в популяції сосни кримської у Ялтинському гірсько-лісовому заповіднику на південному макросхилі Головного пасма Кримських Гір (92 дерева і 904 зародки насіння врожаїв 2 років (1996–1997 рр.); у двох популяціях ялини європейської у заповіднику „Горгани” і Карпатському національному парку в Івано-Франківській області (по 30 дерев у кожній популяції та загалом 372 зародки).

В популяції сосни крейдяної насіння зібрано з генеративних дерев трьох вікових категорій (за О.В. Побединським, 1979): молодих (віком до 40 років), середньовікових (40–80 років) та старих (більше ніж 100 років). В популяціях інших видів хвойних насіння зібрано з випадково обраних найстаріших дерев. Насіння сосни кримської зібрано у різних висотних поясах макросхилу поблизу с. Нікіта: одна вибірка – Мис Март’ян (150 м над рівнем моря (н.р.м.) і три вибірки Нікіта (400, 600, 900 м н.р.м.). Групи дерев з різною насіннєвою продуктивністю у досліджуваній популяції сосни кримської виділено раніше за даними щодо кількості повного, порожнього і недорозвиненого насіння (Терлига, 1999). Насіння ялини європейської зібрано в популяціях, що розташовані на висоті 700 м н.р.м. (вибірка Бредулець) і 1400 м н.р.м. (вибірка Бистриця).

Для визначення генотипів дерев та зародків їх насіння використовували метод електрофоретичного аналізу ізоферментів тканин гаплоїдних ендоспермів і диплоїдних зародків відповідно. В якості генетичних маркерів застосовували ізоферменти, генетичний контроль яких для досліджуваних видів було встановлено раніше (Коршиков и др., 2002), і що стабільно виявлялися на електрофореграмах ендоспермів і зародків. При дослідженні популяцій сосни крейдяної, сосни звичайної і сосни кримської використовували ізоферменти 6 ферментних систем: глутаматдегідрогеназу (GDH, К.Ф. 1.4.1.2), глутаматоксалоацетаттрансаміназу (GOT, К.Ф. 2.6.1.1), супероксиддисмутазу (SOD, К.Ф. 1.15.1.1), кислу фосфатазу (ACP, К.Ф. 3.1.3.2), лейцинамінопептидазу (LAP, К.Ф. 3.4.11.1), малатдегідрогеназу (MDH, К.Ф. 1.1.1.37), які розділяли у 7,5%-му поліакріламідному гелі за методикою Davis (1964) на приладі ЕЛФ-2 (Трувеллер, Нефедов, 1974). В якості генетичних маркерів ялини європейської застосовували ізоферменти 3 ферментних систем: GDH, MDH і 6-фосфоглюконатдегідрогеназу (6-PGD, К.Ф. 1.1.1.44.), які розділяли у 13%-му крохмальному гелі у горизонтальних електрофоретичних камерах розміром 215?125 мм. Гістохімічне забарвлення зон ферментативної активності проводили за стандартними методиками (Корочкин и др., 1977; Гончаренко и др., 1989). Генотип материнського дерева визначали за сегрегацією (розщепленню) алелів у вибірках 7-8 гаплоїдних ендоспермів, для оцінювання генетичної структури насіннєвого потомства і системи схрещування використовували 7-8 зародків насіння від кожного дерева. Встановлення гаплотипів батьківських гамет здійснювали шляхом „віднімання” материнського алеля з генотипу зародка. У популяційно-генетичному аналізі використовували традиційні методи та показники (Айала, 1984; Wright, 1965) за допомогою пакету програм BIOSYS-І (Swofford, Selander, 1981). Параметри системи схрещування оцінювали у програмі MLTR (Ritland, 2002).

ВІКОВА ДИНАМІКА ГЕНЕТИЧНОЇ СТРУКТУРИ РЕЛІКТОВОЇ ПОПУЛЯЦІЇ СОСНИ КРЕЙДЯНОЇ

Генетична мінливість дерев різних вікових груп та зародків їх насіння. За 10 локусами у загальній вибірці дерев встановлено 30 алелів і 46 генотипів; зародків насіння – відповідно 30 і 53 (2003 р.) та 27 і 48 (2004 р.) (табл. 1). Серед дерев трьох вікових груп відсутня алельна та генотипічна гетерогенність, що свідчить про генетичну близькість усіх генеративних рослин у

Таблиця 1

Значення основних показників генетичного поліморфізму у вибірках материнських рослин різних вікових груп і зародків їх насіння врожаїв двох років у реліктовій популяції сосни крейдяної (за 10 алозимними локусами)

Вибірка | Обсяг вибірки, шт. | Частка полі-морфних локусів,

Р99 | Середня кількість на локус | Середня

гетерозиготність | Індекс фіксації Райта,

F

алелів, А | геноти-пів,

Pg | очікувана,

HЕ | наявна,

HО

старі дерева

Мр | 24 | 0,800 | 2,400 | 2,900 | 0,2330,026 | 0,2250,025 | 0,035

Зн 2004 р. | 192 | 0,800 | 2,500 | 3,800 | 0,2290,009 | 0,1830,008 | 0,201

середньовікові дерева

Мр | 29 | 0,900 | 2,800 | 3,800 | 0,3180,025 | 0,3070,025 | 0,034

Зн 2003 р. | 267 | 0,900 | 3,000 | 4,700 | 0,3090,009 | 0,2020,008 | 0,346

Зн 2004 р. | 224 | 0,800 | 2,700 | 4,700 | 0,2760,009 | 0,1900,008 | 0,312

молоді дерева

Мр | 19 | 0,900 | 2,900 | 4,000 | 0,3230,031 | 0,3110,030 | 0,038

Зн 2003 р. | 149 | 0,900 | 3,000 | 4,500 | 0,3040,012 | 0,2070,011 | 0,319

Зн 2004 р. | 136 | 0,800 | 2,600 | 3,800 | 0,2350,011 | 0,1890,010 | 0,196

сукупна вибірка з популяції

Мр | 72 | 0,900 | 3,000 | 4,600 | 0,2970,016 | 0,2810,015 | 0,054

Зн 2003 р. | 416 | 0,900 | 3,000 | 5,300 | 0,3090,007 | 0,2050,007 | 0,337

Зн 2004 р. | 552 | 0,800 | 2,700 | 4,800 | 0,2620,007 | 0,1900,006 | 0,275

Примітка. Тут і далі у таблицях Мр – материнські рослини, Зн – зародки насіння.

популяції. Алельна гетерогенність також відсутня в усіх вибірках між материнськими рослинами та зародками їх насіння. При попарному порівнянні вибірок дерев різних вікових груп встановлено поодинокі випадки гетерогенності алелів та генотипів, а вибіркам зародків їх насіння властива висока генетична неоднорідність, особливо у парах старі – молоді і старі – середньовікові рослини. Усі три вибірки різновікових дерев знаходяться у генотипічній рівновазі згідно закону Харді–Вайнберга, а у зародків їх насіння за більшістю досліджуваних локусів встановлено достовірні випадки відхилення, переважно обумовлені ексцесом гомозигот. Середня наявна гетерозиготність у вибірках зародків насіння значно нижча, ніж у вибірках їх материнських рослин; на істотний надлишок гомозигот у насіннєвому потомстві вказують високі позитивні значення індексу фіксації Райта. У вибірці старих дерев середній рівень НЕ та НО значно менший, ніж у середньовікових і молодих. Найбільшу міжвибіркову генетичну диференціацію також встановлено серед генеративно старих та молодих рослин. Можливо, у результаті дії природного добору у степовій зоні України в популяції сосни крейдяної завершальних стадій онтогенезу досягають окремі дерева зі зниженим рівнем гетерозиготності. Крім цього, з віком рослин встановлено підвищення частоти предомінантного алеля більшості локусів, що також є наслідком зміни адаптивного статусу генів у різних вікових групах сосни крейдяної.

Гетерогенність генетичної структури насіннєвого потомства врожаїв двох послідовних років рослин різних вікових груп. Насіннєве потомство середньовікових і молодих дерев у два послідовні роки (2003–2004 рр.) мало значно менший рівень наявної гетерозиготності, ніж материнські рослини (див. табл. 1). У вибірках зародків насіння рослин цих вікових груп середній рівень НО достовірно не відрізнявся та зберігався на однаковому рівні у врожаях насіння двох років досліджень. В насіннєвому потомстві рослин однієї вікової групи, зібраному у різні роки, встановлено більшу кількість випадків достовірної алельної та генотипічної гетерогенності, ніж серед зародків насіння врожаю одного року у дерев різних вікових категорій. Це свідчить про те, що в популяції сосни крейдяної формування генетичної структури потомства більшою мірою залежить від умов запилення рослин у різні роки, ніж від їх віку.

Аналіз системи схрещування у різновікових групах рослин. За одно- та багатолокусною оцінками частка перехресного запилення в популяції сосни крейдяної у 2004 р. достовірно не відрізнялась у різновікових групах рослин та в середньому склала 60,7 і 74,5 % відповідно (табл. 2). Ці дані знаходяться на нижній межі значень показника ауткросингу для видів хвойних (Политов, Крутовский, 1990), і свідчать про те, що підвищена гомозиготність насіннєвого потомства сосни крейдяної є наслідком інбридингу. Достовірне перевищення значення tm над ts вказує на споріднені схрещування як на одну з причин інбридингу. У 2003 р. встановлено істотне зменшення значення ts (молоді дерева ts=5640,095; середньовікові – ts=3710,061) порівняно з

Таблиця 2

Оцінка частки перехресного запилення у природних популяціях сосни крейдяної, сосни звичайної, сосни кримської і ялини європейської в Україні

Вибірка | Частка перехресного запилення

однолокусна оцінка, ts | багатолокусна оцінка, tm

сосна крейдяна (2004 р.)

старі дерева | 0,6640,053 | 0,7780,051

середньовікові дерева | 0,5690,043 | 0,7410,039***

молоді дерева | 0,6870,063 | 0,7900,060

у сукупній вибірці з популяції | 0,6070,031 | 0,7540,028***

сосна звичайна

старі дерева | 0,4530,054 | 0,5640,061

сосна кримська

Мис Март’ян, 150 м н.р.м. | 0,9120,108 | 0,8940,099

Нікіта, 400 м н.р.м. | 0,5110,128 | 0,5470,109

Нікіта, 600 м н.р.м. | 0,7510,120 | 0,8200,118

Нікіта, 900 м н.р.м. | 0,3860,054 | 0,4180,056

у сукупній вибірці з популяції | 0,6330,053 | 0,657±0,056

ялина європейська

Бредулець, 700 м н.р.м. | 0,6840,078 | 0,7210,085

Бистриця, 1400 м н.р.м. | 0,7640,111 | 0,7830,094

в середньому | 0,7240,098 | 0,7520,090

Примітка. *** – різниця достовірна при Р<0.001.

2004 р. (див. табл. 2),що зумовило генетичну гетерогенність насіннєвого потомства у різні роки, але не позначилося на рівні його наявної гетерозиготності (див. табл. 1).

ПОРІВНЯЛЬНИЙ АНАЛІЗ ГЕНЕТИЧНОЇ СТРУКТУРИ НАЙСТАРІШИХ ДЕРЕВ ТА ЇХ НАСІННЄВОГО ПОТОМСТВА РЕЛІКТОВИХ ПОПУЛЯЦІЙ СОСНИ КРЕЙДЯНОЇ І СОСНИ ЗВИЧАЙНОЇ

Особливості генетичної структури материнських дерев та зародків їх насіння популяцій сосни звичайної і сосни крейдяної. У вибірках генеративно старих рослин обох популяцій на карбонатних ґрунтах встановлено однакову кількість алелів і генотипів; середній рівень НЕ та НО у цих вибірках також достовірно не відрізнявся (див. табл. 1, 3). У вибірках дерев порівнюваних популяцій встановлено рівновагу у фактичному розподілі генотипів відносно теоретично очікуваного за законом Харді-Вайнберга, а в їх насіннєвому потомстві – значні відхилення: у сосни звичайної за 7 з 10 досліджуваних локусів, а у сосни крейдяної – за 5 локусами. В обох популяціях середній рівень НО у вибірках зародків насіння значно нижчий, ніж материнських дерев, в першу чергу за рахунок суттєвого надлишку гомозигот. Генетична диференціація популяцій, незважаючи на їх значну географічну віддаленість, невелика (FST/GST=0,026/0,027) і зберігається на тому ж рівні у їх насіннєвому потомстві (FST/GST=0,022/0,029). Найбільший внесок в підрозділеність популяцій вносять локуси Gdh, Got-3.

Таблиця 3

Значення основних показників генетичного поліморфізму у вибірках дерев і зародків їх насіння реліктової популяції сосни звичайної Кременецького горбогір’я

(за 10 алозимними локусами)

Вибірка | Обсяг вибірки, шт. | Частка полі-морфних локусів,

Р99 | Середня кількість на локус | Середня

гетерозиготність | Індекс фіксації Райта,

F

алелів, А | геноти-пів,

Pg | очікувана,

HЕ | наявна,

HО

Мр | 29 | 0,900 | 2,400 | 2,900 | 0,2660,023 | 0,2660,023 | 0

Зн | 232 | 0,800 | 2,500 | 3,700 | 0,2590,008 | 0,1510,007 | 0,417

Генетична дистанція між популяціями також незначна (DN=0,029). Отримані дані свідчать, що сосна крейдяна є екотипом сосни звичайної, що зростає на крейдяних ґрунтах.

Система схрещування в популяції сосни звичайної. Встановлено найменші серед усіх досліджуваних нами популяцій значення ауткросингу: ts= 45,3%, tm= 56,4 % (див. табл. 2). Інбридинг, пов’язаний із самозапиленням, обумовлює підвищену гомозиготність насіннєвого потомства реліктової популяції сосни звичайної у специфічних умовах існування. Можливо, така картина є наслідком низької чисельності популяції та її ізольованості.

ПІДТРИМАННЯ ГЕНЕТИЧНОЇ РІЗНОМАНІТНОСТІ У ПРИРОДНІЙ ПОПУЛЯЦІЇ СОСНИ КРИМСЬКОЇ

Висотно-поясна генетична мінливість материнських рослин і зародків насіння. За 10 локусами у сукупних вибірках материнських рослин та зародків їх насіння з популяції сосни кримської встановлено відповідно 29 і 23 алеля та 34 і 41 генотипи (табл. 4). Максимальну алель ну різноманітність встановлено у вибірках рослин і зародків насіння у середньому (Нікіта, 400, 600 м н.р.м.), мінімальну – у нижньому (Мис Март’ян, 150 м н.р.м.) поясах Гірського Криму. Середні значення очікуваної та наявної гетерозиготності в усіх різновисотних вибірках материнських рослин достовірно не відрізняються, однак відмічено слабку тенденцію підвищення рівня гетерозиготності в цих вибірках від нижнього до верхнього поясу. У насіннєвому потомстві відтворюється алельна різноманітність материнських рослин, про що свідчить відсутність гетерогенності між вибірками зародків та дерев. Вибірки зародків насіння мають значно нижчий середній рівень НЕ та НО, ніж вибірки материнських рослин, та характеризуються дефіцитом гетерозигот, який сприяє порушенню генотипічної рівноваги за законом Харді-Вайнберга (у

Таблиця 4

Значення основних показників генетичного поліморфізму у вибірках материнських рослин та зародків їх насіння в популяції сосни кримської у різних висотних поясах Гірського Криму (за 10 алозимними локусами)

Вибірка | Обсяг вибірки, шт. | Частка полі-морфних локусів,

Р99 | Середня кількість на локус | Середня

гетерозиготність | Індекс фіксації Райта,

F

алелів, А | геноти-пів,

Pg | очікувана,

HЕ | наявна,

HО

Мис Март’ян, 150 м н.р.м.

Мр | 18 | 0,700 | 2,000 | 2,300 | 0,204 0,026 | 0,194 0,024 | 0,049

Зн | 144 | 0,700 | 2,100 | 2,700 | 0,192 0,009 | 0,133 0,008 | 0,307

Нікіта, 400 м н.р.м.

Мр | 29 | 0,800 | 2,300 | 2,600 | 0,176 0,020 | 0,186 0,019 | -0,057

Зн | 232 | 0,700 | 2,500 | 3,100 | 0,151 0,007 | 0,113 0,006 | 0,251

Нікіта, 600 м н.р.м.

Мр | 20 | 0,800 | 2,400 | 2,600 | 0,180 ± 0,024 | 0,190 ± 0,025 | -0,055

Зн | 160 | 0,700 | 2,400 | 3,200 | 0,177 ± 0,009 | 0,140 ± 0,008 | 0,209

Нікіта, 900 м н.р.м.

Мр | 25 | 0,900 | 2,200 | 2,500 | 0,205 ± 0,023 | 0,240 ± 0,023 | -0,170

Зн | 200 | 0,800 | 2,400 | 3,200 | 0,192 ± 0,008 | 0,120 ± 0,007 | 0,375

у сукупній вибірці з популяції на одному макросхилі

Мр | 92 | 0,800 | 2,900 | 3,400 | 0,193 ± 0,013 | 0,203 ± 0,012 | -0,051

Зн | 736 | 0,700 | 2,300 | 4,100 | 0,179 ± 0,004 | 0,125 ± 0,004 | 0,302

сукупній вибірці зародків насіння з популяції – за 6 локусами, а в окремих вибірках – від 4 до 6 локусів).Найбільший дефіцит гетерозигот встановлено у вибірці зародків насіння на верхній межі лісу. Міжвибіркова диференціація дорослих рослин та зародків насіння в усій популяції становила ~1%; середня генетична дистанція Нея між вибірками дерев – 0,003, зародків насіння – 0,005, що вказує на відсутність чіткої генетичної субструктурованості груп дерев та їх насіннєвого потомства в популяції сосни кримської у різних висотних поясах Гірського Криму.

Генетична гетерогенність врожаїв насіння різних років. Між вибірками материнських рослин та зародків їх насіння врожаїв двох років відсутня суттєва алельна гетерогенність, а генотипічна – встановлена лише за одним локусом (Аср). Насіннєве потомство цих рослин у два послідовні роки (1996–1997 рр.) було більш генетично неоднорідне: за алелями – за 3 локусами, за генотипами – за 2. У вибірках зародків насіння в обидва роки досліджень визначено дефіцит гетерозигот та нижчу наявну гетерозиготність, ніж у вибірках материнських рослини (табл. 5). На відміну від рівнинної популяції сосни крейдяної, у гірській популяції сосни кримської встановлено достовірне зменшення рівня наявної гетерозиготності у вибірці зародків насіння врожаю одного року порівняно з попереднім.

Таблиця 5

Значення гетерозиготності та оцінка частки перехресного запилення у різні роки у вибірці дерев у популяції сосни кримської з середнього поясу Гірського Криму

(за 10 алозимними локусами)

Вибірка | Обсяг вибір-ки, шт. | Середня гетерозиготність | Індекс фікса-ції Райта,

F | Частка перехресного запилення

очікувана,

НЕ | наявна,

НО | одно-локусна оцінка, ts | багато-локусна оцінка , tm

Мр | 21 | 0,1920,024 | 0,1760,023 | 0,084––

Зн 1996 р. | 168 | 0,1650,008 | 0,1350,007 | 0,182 | 0,7780,050 | 0,846±0,077

Зн 1997 р. | 168 | 0,1680,008 | 0,1090,007 | 0,352 | 0,5910,128 | 0,6050,124

Аналіз генетичної структури зародків насіння у дерев з різною насіннєвою продуктивністю. Вибірки зародків насіння груп рослин з різною насіннєвою продуктивністю характеризувалися достовірною алельною та генотипічною гетерогенністю за більшістю досліджуваних локусів. Серед цих вибірок рослин найбільшу гетерозиготність встановлено у дерев, що продукують максимум повного та мінімум порожнього насіння у розрахунку на одну шишку (рисунок). Усі вибірки зародків насіння мали достовірно меншу наявну гетерозиготність, ніж відповідні

максимум мінімум мінімум максимум сукупна з

повного порожнього повного порожнього популяції

Рисунок. Значення наявної гетерозиготності (НО) у вибірках зародків насіння і материнських рослин з різною насіннєвою продуктивністю і в сукупній вибірці з популяції сосни кримської: 1 – материнські рослини, 2 – зародки насіння.

вибірки материнських рослин, та знаходились у генотипічній нерівновазі згідно закону Харді–Вайнберга. Насіннєве потомство дерев, що продукують максимум повного насіння, мало достовірно вищий рівень гетерозиготності, ніж вибірки зародків насіння інших груп рослин та у сукупній вибірці з популяції. Це свідчить про те, що генетична якість насіннєвого потомства сосни кримської залежить від генетичних особливостей материнських рослин.

Мультилокусна структура батьківських гамет. Пул батьківських гамет, що сформували життєздатні зародки насіння у рослин зі всіх висотних поясів Гірського Криму, відзначається генетичною однорідністю. Ідентифіковано два найпоширеніші за трьома локусами гаплотипи пилку – Got-21.00Got-31.00Gdh1.00 і Got-21.12Got-31.00Gdh1.00, що, вірогідно, мають найбільш адаптовані комбінації генів.

Система схрещування в популяції. Середня частка ауткросингу за одно- і багатолокусною оцінками в популяції склала 63,3 і 65,7 % відповідно (див. табл. 2). Найвищу частку перехресного запилення серед вибірок рослин встановлено у нижньому, а найменшу – у верхньому поясах Гірського Криму. Підвищене самозапилення дерев у жорстких умовах верхньої межі лісу зумовило найбільший серед інших вибірок зародків насіння дефіцит гетерозигот (див. табл. 4). Відмічено варіювання показників системи схрещування у різні роки в популяції у середньому поясі. Достовірне зменшення частки ауткросингу в 1997 р. порівняно з 1996 р. спричинило суттєве зниження рівня наявної гетерозиготності у насіннєвому потомстві (див. табл. 5). Серед вибірок рослин з різною насіннєвою продуктивністю найменшу частку ауткросингу встановлено у дерев, що продукують максимум порожнього насіння, найбільшу – у рослин з мінімумом повного насіння (табл. 6).

Таблиця 6

Оцінка частки перехресного запилення рослин з різною насіннєвою продуктивністю у вибірках з природної популяції сосни кримської

Вибірка дерев за наявністю насіння у шишці | Обсяг вибірки, шт. | Частка перехресного запилення

дерева | зародки | однолокусна оцінка, ts | багатолокусна оцінка, tm

максимум повного | 22 | 176 | 0,7080,105 | 0,731±0,102

мінімум повного | 13 | 104 | 0,7840,161 | 0,782±0,163

максимум порожнього | 13 | 104 | 0,6180,098 | 0,605±0,104

мінімум порожнього | 15 | 120 | 0,6380,144 | 0,658±0,147

Вірогідно, у першому випадку це пов’язано з підвищеним самозапиленням, а у другому – з перехресним запиленням дерев пилком з летальними генами. У рослин з максимумом повного насіння в шишці частка ауткросингу вища, ніж в середньому у сукупній вибірці дерев з популяції (див. табл. 2).

АНАЛІЗ ПІДТРИМАННЯ ГЕНЕТИЧНОЇ РІЗНОМАНІТНОСТІ У РІЗНОВИСОТНИХ ПОПУЛЯЦІЯХ ЯЛИНИ ЄВРОПЕЙСЬКОЇ В УКРАЇНСЬКИХ КАРПАТАХ

Генетична структура рослин та зародків насіння висотної та низинної популяцій. У вибірках материнських рослин і зародків їх насіння досліджуваних популяцій за 7 алозимними локусами встановлено однакову кількість алелів – 15. У дерев низинної популяції визначено 19 генотипів, висотної – 17, у вибірках зародків насіння в обох популяціях – 21. Середній рівень HО насіннєвого потомства в обох популяціях достовірно менший, ніж у дорослих рослин (табл. 7). Між вибірками материнських рослин та зародків їх насіння у кожній популяції відсутня алельна і генотипічна гетерогенність. Вибірки дерев за досліджуваними локусами знаходяться у генотипічній рівновазі згідно закону Харді-Вайнберга, а у вибірках зародків їх насіння встановлено достовірні випадки відхилення фактичного розподілу генотипів від очікуваного за рахунок ексцесу гомозигот. Підтверджено відсутність генетичної диференціації генеративних дерев досліджуваних популяцій, що було виявлено І.І. Коршиковим зі співавторами (2005), та встановлено відсутність генетичної диференціації у вибірках зародків насіння, а також однорідність пулів батьківських гамет в обох популяціях.

Таблиця 7

Значення основних показників генетичного поліморфізму у вибірках материнських рослин та зародків їх насіння у різновисотних популяціях ялини європейської в Українських Карпатах (за 7 алозимними локусами)

Вибірка | Обсяг вибірки, шт. | Частка полі-морфних локусів,

Р99 | Середня кількість на локус | Середня

гетерозиготність | Індекс фіксації Райта,

F

алелів, А | геноти-пів,

Pg | очікувана,

HЕ | наявна,

HО

Бредулець (700 м н.р.м.)

Мр | 30 | 0,714 | 2,143 | 2,714 | 0,1890,022 | 0,2050,022 | -0,084

Зн | 178 | 0,714 | 2,143 | 3,000 | 0,1810,009 | 0,1360,009 | 0,249

Бистриця (1400 м н.р.м.)

Мр | 30 | 0,857 | 2,143 | 2,428 | 0,2150,025 | 0,2000,023 | 0,070

Зн | 174 | 0,714 | 2,143 | 3,000 | 0,1800,009 | 0,1480,009 | 0,178

Система схрещування в популяціях. Середня частка ауткросингу в популяціях за одно- і багатолокусною оцінками склала відповідно 72,4 та 75,2 % (див. табл. 2). Це погоджується з літературним даними стосовно ялини європейської (Muona et al., 1990). На відміну від досліджених нами вибірок сосни кримської з різних висотних поясів, в обох різновисотних популяціях ялини європейської рівень інбридингу був приблизно однаковий, незалежно від їх висоти зростання у гірських умовах.

СПОСІБ ГЕНЕТИЧНОГО МАРКУВАННЯ ДЕРЕВ, ЩО ПРОДУКУЮТЬ ВЕЛИКУ КІЛЬКІСТЬ ГЕТЕРОЗИГОТНОГО НАСІННЯ

Генетичне маркування дерев у природній популяції сосни кримської. Визначено маркерний локус, за яким в популяціях сосни кримської можна виділяти дерева, що продукують велику кількість гетерозиготного насіння.

Генетичне маркування дерев у природній популяції сосни крейдяної. Визначено маркерні локуси, за якими в популяціях сосни крейдяної можна виділяти дерева, що продукують велику кількість гетерозиготного насіння.

ВИСНОВКИ

1. На основі аналізу мінливості ізоферментних локусів, що контролюють ферментні системи GOT, GDH, SOD, LAP, ACP, MDH, 6PGD у дерев і зародків їх насіння популяцій сосни крейдяної, сосни звичайної, сосни кримської і ялини європейської в Україні встановлено, що алельна різноманітність цих популяцій відтворюється у їх насіннєвому потомстві. У вибірках дерев відмічено рідкісні, а у зародків насіння – численні випадки порушень розподілу генотипів згідно закону Харді–Вайнберга.

2. На ранній онтогенетичній стадії (зародки насіння) у досліджуваних популяціях встановлено істотний надлишок гомозигот і суттєво нижчий рівень наявної гетерозиготності порівняно з рослинами репродуктивного віку.

3. Причина надлишку гомозигот у зародків насіння в досліджуваних популяціях – інбридинг, обумовлений надмірним самозапиленням рослин. Найменшу (56,4%) частку ауткросингу встановлено в популяції сосни звичайної Кременецького горбогір’я; в популяції сосни крейдяної у Донецькій області вона склала 75,4%; в популяції сосни кримської у Гірському Криму – варіювала від 41,8 до 89,4% у різних висотних поясах та в середньому дорівнювала 65,7%; у двох популяціях ялини європейської в Українських Карпатах – 72,1 і 78,3% відповідно.

4. Частка ауткросингу в популяціях сосни крейдяної і сосни кримської варіює у різні роки, що відбивається на генетичних параметрах насіннєвого потомства.

5. У сосни крейдяної відмічено внутрішньопопуляційну вікову динаміку генетичної структури. Серед молодих, середніх та старих генеративних дерев останні відрізнялись істотно меншим рівнем наявної гетерозиготності. Встановлено збільшення з віком рослин частот найбільш поширених у популяції алелів.

6. Реліктові популяції сосни крейдяної на крейдяних відслоненнях басейну р. Сіверський Донець і сосни звичайної на дерново-карбонатних ґрунтах Кременецького горбогір’я мають близький рівень генетичної мінливості та високу подібність генетичної структури, що свідчить про внутрішньовидовий статус сосни крейдяної.

7. У популяції сосни кримської у різних висотних поясах Гірському Криму за досліджуваними локусами не встановлено чіткої генетичної диференціації вибірок дерев і зародків їх насіння, що вказує на відсутність чітких ізоляційних бар’єрів, що обмежують потік генів у межах одного макросхилу.

8. Виявлено генетичні відмінності у дерев сосни кримської з різним рівнем насіннєвої продуктивності. Деревам з максимумом повного насіння у шишці властивий найвищий рівень гетерозиготності, а рослинам з максимумом порожнього і мінімумом повного насіння – найменший. Для зародків найбільшу гетерозиготність встановлено у потомстві рослин з максимальною продуктивністю повного насіння. Генетичні особливості материнських дерев великою мірою визначають генетичну якість насіння.

9. Встановлено найвищу (78,2%) частку ауткросингу серед альтернативних за насіннєвою продуктивністю вибірок рослин сосни кримської у дерев з максимумом порожнього, а мінімальну (60,5%) – з мінімумом повного насіння у шишках. Рослини з максимумом повного насіння у шишці характеризувалися більшою (73,1%) часткою ауткросингу, ніж в середньому в популяції.

10. Визначено маркерні локуси для виділення в популяціях сосни кримської і сосни крейдяної дерев, які продукують велику кількість гетерозиготного насіння.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мудрик Е.А., Горлова Е.М. Генетическая гетерогенность семенного потомства природной популяции сосны крымской (Pinus pallasiana D. Don) // Промышленная ботаника. – 2003. – Вып. 3. – С. 91–94. (Мудрик О.А. приймала участь у експерименті, здійснювала статистичну обробку та інтерпретацію отриманих результатів, підготувала статтю).

2. Коршиков И.И., Мудрик Е.А., Калафат Л.А. Основные критерии оценки и мониторинга внутривидового популяционно-генетического разнообразия // Проблемы экологии и охраны природы техногенного региона: Межведомств. сб. науч. работ / Отв. ред. С.В. Беспалова. – Донецк: ДонНУ, 2003. – Вып. 3. – С. 19–26 (Дисертанткою прийнято участь у написанні оглядової частини та формулюванні висновків статті).

3. Коршиков И.И., Мудрик Е.А. Генетическая гетерогенность урожая семян разных лет в природной популяции сосны крымской // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць / за ред. М.В. Роїка. – К.: КВІЦ, 2004. – С.234–238. (Мудрик О.А. проведено ізоферментний аналіз та статистичну обробку даних, прийнято участь у інтерпретації