Інститут Мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Рахімова Олена Леонідівна

УДК 579.821

БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ МІКСОБАКТЕРІЙ

ПРИРОДНИХ БІОЦЕНОЗІВ ПІВДНЯ УКРАЇНИ

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова.

Науковий керівник:доктор біологічних наук, професор Іваниця Володимир Олексійович, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, завідувач кафедри мікробіології і вірусології, МОН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Кіпріанова Олена Андріївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу антибіотиків

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, Колтукова Наталія Володимирівна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, старший науковий співробітник відділу загальної мікробіології

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінет Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “15” лютого 2006 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “6“ січня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Міксобактерії – це ковзні бактерії, що утворюють плодові тіла. Вони особливо цікаві завдяки своїм унікальним біологічним особливостям та інтенсивному метаболізму. Широко відома здатність міксобактерій до пересування за допомогою ковзання з формуванням швармів на поверхні субстрату або на межі розділу вода-повітря. Міксобактерії приваблюють дослідників своєю витонченою системою міжклітинного спілкування і високорозвиненою соціальною поведінкою [Reichenbach H., 1999].

Викликає інтерес їх спосіб життя мікрохижаків, що здатні полювати на клітини інших мікроорганізмів завдяки продукції літичних ферментів. Встановлено, що міксобактерії мають значний біотехнологічний потенціал як продуценти унікальних антибіотиків та протипухлинних речовин [Sasse F. et al., 1999; Sasse F. et al., 2000; Mahmud T. et al., 2002].

Міксобактерії мають широкий ареал розповсюдження і заселяють різні середовища від Антарктики до тропічних дощових лісів і пустель [Brockman E.R., 1976; Dawid W. et al., 1988], проте лише окремих представників визнано дійсно морськими [Iizuka T. et al., 2003].

Міксобактерії України до теперішнього часу залишаються не дослідженими. Практично відсутні дані про біохімічні властивості міксобактерій. Не з’ясовані механізми ковзного руху та роль адгезії на різних етапах розвитку міксобактерій. Залишається не вивченим вплив токсикантів, у тому числі важких металів, на фізіологію і життєвий цикл міксобактерій [Collins Y.E., Stotzky G., 1992; Ivanitsa V., 1997; Warren L. A., Haack E. A., 2001]. Певні проблеми, що пов’язані з виявленням та культивуванням міксобактерій, а особливо з надійним збереженням культур у життєздатному стані, суттєво стримують дослідження цієї групи мікроорганізмів [Shimkets L.J., Dworkin M., 1997; Sproer C., 1999; Kaiser D., Welch R., 2004].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно тематичного плану науково-дослідних робіт Одеського національного університету і входила як розділ до теми: “Вивчення взаємовідносин мікроорганізмів та їх адаптація в природних та штучних умовах” (номер державної реєстрації 0100U001493) та теми: “Збереження мікробних ресурсів шляхом підтримування колекції культур мікроорганізмів та їх використання в екологічній біотехнології” (номер державної реєстрації 0103U003804). Частина роботи виконувалась за підтримки програми INTAS у рамках міжнародного проекту № YSF99-3908.

Мета дослідження: Встановити розповсюдження ковзних бактерій порядку Myxococcales у природних біоценозах півдня України та визначити їх біологічні властивості, таксономічне положення і роль в природних біоценозах.

Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

- Встановити закономірності росту міксобактерій та підібрати живильне середовище ефективне для виділення ковзних бактерій, що утворюють плодові тіла, із об’єктів довкілля.

- Виділити штами ковзних бактерій, що утворюють плодові тіла, з різних природних джерел та створити їх колекцію.

- Вивчити морфологічні, культуральні, фізіолого-біохімічні властивості ізольованих чистих культур міксобактерій та визначити таксономічне положення ізольованих штамів міксобактерій.

- Вивчити антагоністичну активність досліджуваних штамів міксобактерій до тест-штамів прокаріотних і еукаріотних мікроорганізмів.

- Встановити рівень чутливості до антибіотиків типових та ізольованих штамів міксобактерій.

- Вивчити адгезивність ковзних бактерій, що утворюють плодові тіла, до гідрофобних, гідрофільних та позитивно і негативно заряджених поверхонь за різних умов.

- Дослідити взаємодію міксобактерій з важкими металами на різних етапах життєвого циклу.

- Встановити закономірності та розробити способи довгострокового збереження виділених культур міксобактерій для забезпечення найбільшої життєздатності клітин у популяції.

Об’єктом дослідження були штами міксобактерій, ізольовані з різних природних джерел південної частини України, а також колекційні штами.

Предметом дослідження був таксономічний склад ізольованих міксобактерій, їх морфологічні, культуральні, фізіолого-біохімічні та інші біологічні властивості, а також взаємодія міксобактерій з важкими металами.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених задач використовували сучасні та класичні мікробіологічні, фізіолого-біохімічні, молекулярно-біологічні, фізико-хімічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів.

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Практичне значення одержаних результатів. Показано, що штами міксобактерій є перспективними для використання у розробці екологічних біотехнологій вилучення важких металів. Створена колекція міксобактерій, яка поповнила фонд Української Колекції мікроорганізмів. Запропоновані середовища та методичні засоби для виділення міксобактерій із об’єктів довкілля. Вибрані способи довгострокового збереження міксобактерій в колекції. Визначені оптимальні періоди життєвого циклу міксобактерій для консервування штамів. Показана можливість використання прискореного тесту (accelerated storage test) для визначення термінів виживання ліофілізованих культур міксобактерій у процесі довгострокового збереження. Отримані результати використовуються в розділі спецпрактикуму “Ізоляція, ідентифікація та систематика бактерій”, “Збереження культур мікроорганізмів”, “Антимікробні агенти” та спеціальних курсів “Систематика прокаріот”, “Молекулярно-генетичні механізми мінливості мікроорганізмів”.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконані і подані в дисертації експериментальні дослідження, проаналізовані їх результати та обґрунтовані висновки. Пошук надійного методу збереження міксобактерій проведено на базі Всеросійської колекції мікроорганізмів (ВКМ, Росія). Молекулярно-біологічні дослідження проведені на базі Південного біотехнологічного центру у рослинництві (УААН МОН України). Вивчення біоритмів у життєвому циклі міксобактерій проведено у Радіоастрономічному інституті (НАН України). Частина досліджень щодо вивчення адгезивних особливостей міксобактерій була виконана під час стажування у Вестмінстерському університеті (Великобританія).

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались на міжнародних наукових конференціях “Ecological Effect of Microorganism Action” (Вільнюс, Литва, 1997), “Циклы природы и общества” (Ставрополь, Росія, 1998), “Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 2001), “Биологические эффекты солнечной активности” (Росія, 2004), “Astrobiology Science Conference, NASA” (США, 2004); на з’їздах товариства мікробіологів України (Чернігів, 2000, Одеса, 2004) а також на 55-ій (2000), 56-ій (2001), 57-ій (2002), 58-ій (2003), 59-ій (2004) і 60-ій (2005) наукових конференціях професорсько-викладацького складу і наукових співробітників ОНУ.

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 14 робіт (з них 6 статей в профільних журналах і 8 – в тезах доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 155 сторінках машинописного тексту і складається з „Вступу”; розділів “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати досліджень”; “Заключення”, “Висновків”, “Списку літератури”, який містить 287 посилань (з яких 265 іноземних авторів). Робота містить 34 таблиці та 18 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури представлений шістью підрозділами. В ньому розглянуто систематичне положення міксобактерій, морфологічні і фізіолого-біохімічні властивості міксобактерій, хімічний склад і будову клітин, феномени ковзної рухливості та здатності формувати плодові тіла, а також розповсюдження представників цієї групи бактерій в природі.

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

Об’єктами дослідження були 52 штами ковзних бактерій, що утворюють плодові тіла, із котрих 44 штами були виділені із різних джерел довкілля і 8 штамів склали типові і колекційні штами: C. fuscus UCMB_Т, M. coralloides UCMB-10037Т, M. fulvus UCMB-10038, UCMB_, M. virescens UCMB-10040Т, M. xanthus UCMB-10042Т, P. cellulosum UCMB-10043, 10044.

Для дослідження були відібрані: зразки ґрунту (50 проб) і рослинного матеріалу (20 проб) з Миколаївської, Херсонської і Одеської областей; морська вода (50 проб) з прибережної зони Чорного моря Одеської області; зразки ґрунту (33 проби) і вода (8 проб) із зони заплеску, що періодично контактує з морською водою у прибережній зоні Чорного моря. Проби висівали на живильні середовища (рН 7,2 – 7,4) протягом години після відбирання. Було використано 11 варіантів живильних середовищ і їх модифікацій.

При ідентифікації міксобактерій використовували критерії, що викладені у Визначнику бактерій Бергі та ряді оригінальних робіт [Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1989; Reichenbach H., Dworkin M., 1992]. Вміст ГЦ пар у ДНК досліджуваних штамів визначали за загальноприйнятою методикою [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., 1984]. Морфологічні особливості міксобактерій вивчали в живих і фіксованих препаратах під світлопольним мікроскопом “БІОЛАМ-4” і у фіксованих препаратах під електронним мікроскопом [Теппер Е. З., Шильникова В.К., Переверзева Г., 1987]. Визначали фізіолого-біохімічні властивості міксобактерій; гідролазну активність по відношенню до фібрину, казеїну, колагену, хітину, знежиреного молока, целюлози, крохмалю і желатину; літичну активність по відношенню до Saccharomyces cerevisiae УКМy-497, Micrococcus luteus ATCC 4698 та Escheriсhia coli ATCC 25922; ліполітичну активність по відношенню до Твін-80. Антагоністичні властивості вивчали методом агарових блоків, фунгіцидні властивості методом перпендикулярних штрихів. Чутливість до антибіотиків визначали за допомоги методу стандартних розведень (дворазових) у агаризованому живильному середовищі YСА (клітини S. – 0,5 г; CaCl2.2H2O - 0,1 г; агар – 1,5 г; 0,5 мкг/мл ціанкобаламіна; 100 мл дистильованої води; рН 7,2). Для ряду стійких до антибіотиків штамів було проведено виділення плазмідної ДНК експрес методом лужного лізису [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., 1984]. Після вилучення ДНК плазмід був проведений аналіз її якості та розміру методом електрофорезу у агарозному гелі з EtBr відносно маркерів молекулярної ваги.

Для визначення адгезивної здатності міксобактерій використовували методику, запропоновану S. McEldowney і M. Fletcher (1986, 1988).

Накопичення важких металів біомасою M. хanthus у різних умовах визначали після вирощування на щільному живильному середовищі. У зразках визначали вміст Zn2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Pb2+, Cr3+ за допомоги атомно-адсорбційного спектрофотометру (Perkin-Elmer 3100) при довжинах хвиль 230,8; 232,0; 228,8; 324,7; 217,0 і 357,8 нм відповідно у газово-ацетиленовій суміші.

Для визначення оптимального способу збереження життєздатності міксобактерій використовували методи кріоконсервації, ліофілізації, висушування на твердофазних носіях, суспендування у дистильованій воді або у фізіологічному розчині і збереження під шаром мінеральної олії.

З метою оцінки ефективності використаних захисних середовищ та визначення можливого часу збереження, використовували прискорений тест прогнозування виживання ліофілізованих культур бактерій (accelerated storage test) [Mitic S., Otenhajmer J., Damjanovic V., 1974; Griffin D.M., Cook E.S., Mehaffey M.A., 1981].

Життєздатність культур визначали методом граничних розведень шляхом висіву суспензій культур на гнійний агар з подальшим підрахунком числа колоній, здатних утворювати плодові тіла. Отримані дані опрацьовували статистично і для кожного значення визначали довірчий інтервал [Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2001].

Для виявлення кореляції кількості життєздатних клітин міксобактерій з фазами циклу Місяця з 3-и добової культури M. xanthus UCM 10041 готували суспензію з концентрацією 103 кл/мл щодоби. Висіви робили з відповідних розведень на чашки з дріжджовим агаром для обліку титру життєздатних клітин за кількістю колонієутворювальних одиниць (КУО). Культивування проводили на середовищі YСА протягом 5 діб при 30 2 оС. Усі досліди проводили у п’яти повторах. Статистичне опрацювання результатів дослідів здійснювали за загальноприйнятими методиками при 95 рівні вірогідності.

Розділ 3. Результати досліджень

Виділення і очищення міксобактерій. Виділення міксобактерій проводили без попереднього етапу отримання нагромаджувальної культури прямим висівом на щільні живильні середовища. Оцінку ефективності використання різних варіантів запропонованих і модифікованих нами живильних середовищ для виділення міксобактерій проводили за такими критеріями: 1) швидкість появи плодових тіл; 2) універсальність середовища для росту міксобактерій з різними харчовими потребами; 3) інтенсивність росту супутньої мікробіоти.

У результаті проведених досліджень показана найбільша ефективність і швидкість методу виділення протеолітичних і агаролітичних міксобактерій на водному агарі з нанесенням на поверхню агарової пластинки живих клітин E., M. luteus або S. cerevisiae. Завдяки цьому підходу 80 % від загального числа ізольованих штамів були виділені в чистій культурі без додаткового очищення, тому що водний агар, на який були нанесені штрихи харчових організмів, не підтримував ріст супутньої мікробіоти.

Запропоновано використовувати накладання на половину агарової пластинки стерильного фільтрувального паперу. Це дозволило збільшити видове різноманіття міксобактерій, що виявляються, за рахунок целюлозолітичних видів. На поверхні агарового середовища з дуже низьким вмістом поживних речовин в агаровій пластинці, за штрихами харчових організмів розповсюджувались бактеріолітичні види, в агар вростали агаролітичні види, а на поверхні субстрату, прикритого фільтрувальним папером, були легко помітні целюлозолітичні міксобактерії. Кількість контамінуючих гетеротрофних бактерій при цьому була незначною, а видове різноманіття міксобактерій було найбільшим. Цьому сприяла наявність в агарі як білкового, так і вуглеводного компонентів у мінімально можливих концентраціях. Штрихи харчових організмів, нанесені на агарову пластинку, дозволяли міксобактеріям, що були здатними до ковзання, пересуватися по штриху харчових організмів практично у чистому вигляді. Для очищення ряду штамів міксобактерій від мікробіоти, що їх контамінує, було використано два методи: 1) пересів краю шварма, який рухається попереду контамінуючого бактеріального росту; 2) прогрівання суспендованих у стерильній воді плодових тіл на водяній бані при 60 оС 15 хв. Використання першого методу очищення вимагало багаторазових повторів. При цьому частина штамів втрачала здатність утворювати плодові тіла після декількох пасажів. Використання другого методу дозволило очистити контаміновані штами у 75 % випадків. Невдачі, очевидно, були пов’язані з прогріванням “незрілих” плодових тіл – у котрих перехід вегетативних клітин у міксоспори ще не був закінчений повністю, і форми спокою, що характеризуються стійкістю до підвищених температур, не були сформовані.

У результаті проведених досліджень у 54 (33,5 %) із 161 проби були виявлені міксобактерії (табл. 1). Вперше показано, що у південному регіоні України найбільша кількість міксобактерій виявляється як у ґрунтах степової зони, так і зони, що контактує з морською водою. І якщо про наявність міксобактерій в ґрунтах степів, пустель, лісів повідомлялося неодноразово, то про виділення міксобактерій із засолених ґрунтів, що постійно контактують з морською водою, у доступних літературних джерелах відомості відсутні.

Таблиця 1

Частота виявлення міксобактерій у природних джерелах півдня України

Об’єкт | Число проб | Із них з позитивним результатом

абс. | %

Ґрунт | 50 | 25 | 50,0

Рослини | 20 | 2 | 10,0

Морська вода | 50 | 3 | 6,0

Вода зони заплеску | 8 | 4 | 50,0

Ґрунт зони заплеску | 33 | 20 | 60,6

Усього | 161 | 54 | 33,5

Привертає до себе увагу те, що із ґрунтів зони заплеску міксобактерії виділяються частіше, ніж із ґрунтів степової зони. Можливо, тут основну роль відіграє постійне зволоження – один із принципів вдалого вирощування міксобактерій. Вода зони заплеску також містить міксобактерії. Дослідження показали, що колонії міксобактерій води зони заплеску ідентичні колоніям міксобактерій, що виділені з ґрунтів. Це дозволяє припустити, що вода зони заплеску містить міксобактерії, що вимиваються із ґрунту.

У результаті проведеної ідентифікації, яка заснована на вивченні культуральних і морфологічних ознак, виділені штами міксобактерій віднесені до 4-х родин: Myxococcaceae, Archangiaceae, Cystobacteraceae, Polyangiaceae, котрі представлені 7 видами (табл. 2).

Таблиця 2

Таксономічний склад міксобактерій півдня України

Родина | Вид | Число штамів

абс. | %

Myxococcaceae | Myxococcus fulvus | 6 | 13,6

Myxococcus xanthus | 6 | 13,6

Myxococcus stipitatus | 1 | 2,3

Усього: | 13 | 29,5

Polyangiaceae | Polyangium cellulosum | 4 | 9,1

Nannocystis exedens | 2 | 4,5

Усього: | 6 | 13,6

Archangiaceae | Archangium gephyra | 8 | 18,3

Cystobacteraceae | Cystobacter fuscus | 17 | 38,6

Разом: | 44 | 100,0

Для штамів виду M. fulvus вміст ГЦ пар склав від 70,1 до 70,2 Моль %; M. xanthus – 71,2 Моль %; M. stipitatus – 71,8 Моль %; A. – 68,3 Моль %; P.cellulosum – 69,0 Моль %; N. exedens – 72,0 Моль %. Визначенний вміст ГЦ пар відповідає певним видам і укладається у діапазон характерний для міксобактерій – між 67 і 72 Моль %.

Найбільшим числом видів (3) представлена родина Myxococcaceae, до котрої увійшли бактерії роду Myxococcus: Myxococcus fulvus (Cohn) Jahn 1921, Myxococcus xanthus Beebe 1941, Myxococcus stipitatus Thaxter 1897.

Родина Archangiaceae представлена одним видом Archangium gephyra Jahn 1924. Родина Cystobacteraceae також представлена одним видом (Cystobacter fuscus Schroerer 1886) з найбільшим числом штамів – 38,6 % від усіх досліджених.

Ідентифіковано 2 види міксобактерій родини Polyangiaceae: вид Polyangium cellulosum Link 1809 і вид Nannocystis exedens Reichenbach 1970. Таким чином, більша частина міксобактерій була ізольована із ґрунту (36 із 44 штамів). Це підтверджує, що представники групи міксобактерій можуть бути знайдені в Україні (як і в усьому світі), в основному, у ґрунті. У ході проведених досліджень вперше показано наявність міксобактерій у зразках ґрунту, що періодично контактує з морською водою.

Фізіолого-біохімічні властивості. Таксономія міксобактерій ґрунтується на морфологічних ознаках. При втраті штамами здатності до утворення плодових тіл її застосування не ефективне. Ідентифікація на основі фізіолого-біохімічних властивостей до нинішнього часу не розроблена.

Для усунення цього недоліку, додатково до морфологічних властивостей нами були вивчені деякі фізіологічні і біохімічні властивості виділених штамів. Було виявлено, що всі штами є аеробними, мезофільними, віддають перевагу нейтральному або слабко лужному середовищу і можуть рости у широкому діапазоні концентрацій NaCl (0 – 10що не суперечить опублікованим даним. Однак, здатність до росту у середовищі з 15 % NaCl протягом 3 пасажів була характерною тільки для штамів, котрі були виділені нами із ґрунту і води зони заплеску.

Усі вивчені штами були каталазопозитивними, більшість – оксидазонегативними. Тільки штами, що належать до виду A. gephyra і виду M. stipitatus, були оксидазопозитивними. Усі штами, крім штамів виду P. cellulosum, не відновлювали нітрати. Штами P. cellulosum відновлювали нітрати до нітритів (25,0і до молекулярного азоту (75,0 %). Уреазну активність проявили 100 % штамів виду C. fuscus. Для представників інших видів цей тест був проведений вперше і дав негативний результат. Вперше було визначено наявність у міксобактерій -галактозидази, ліпази, лізиндекарбоксилази, фенілаланіндезамінази, аргініндегідролази, утворення аміаку і ацетилметилкарбінолу. Частина ізольованих штамів, ідентифікованих як M. fulvus, M. xanthus, M. stipitatus, A. gephyra, C. fuscus, P. cellulosum, N., дала в цих тестах позитивну реакцію. Негативна реакція усіх досліджених штамів була показана в тестах на наявність у міксобактерій декарбоксилаз орнітину, дезаміназ фенілаланіну, а також здатність до утворення індолу і сірководню.

Була проведена оцінка здатності ізольованих штамів міксобактерій утилізувати різні вуглеводи, багатоатомні спирти, органічні кислоти, деякі природні полімери і клітини проавтоклавованих мікроорганізмів. Виявлено, що лише невеликий відсоток “протеолітичних” штамів використовували глюкозу, сахарозу і арабінозу, причому тільки в аеробних умовах. Велика кількість “протеолітичних” штамів утилізували мальтозу і маніт. Переважна більшість “целюлозолітичних” штамів утилізували практично весь спектр запропонованих багатоатомних спиртів і вуглеводів.

Ізольовані “протеолітичні” міксобактерії виявили значну гідролітичну здатність щодо природних органічних полімерів і літичну щодо клітин мікроорганізмів. Встановлено, що штами цієї групи утилізують казеїн, желатин, фібрин, колаген, лізують клітини M. luteus, E. coli, S. cerevisiae. Щодо агару, целюлози і крохмалю досліджені міксобактерії виявили диференційну реакцію. Агар утилізували штами P. cellulosum і N., вони утворювали характерні зони вростання (пенетрації), що призводило до ерозії агару. Здатність до гідролізу целюлози із усіх міксобактерій була характерною лише для целюлозолітичних поліангій. Гідроліз крохмалю здійснювали тільки штами A. gephyra і C. fuscus. Усі досліджені штами не виявили здатності до зброджування субстрату.

Відмінностей у властивостях між штамами, ізольованими із проб ґрунту, морської води та із зразків рослин, а також між штамами контактної зони, не спостерігалось. Єдиним виключенням стало відношення ряду штамів контактної зони до росту у середовищі з 15 % NaCl. Необхідно відмітити, що штами, здатні до гідролізу целюлози, були ізольовані в однаковій кількості як із зони заплеску, так із інших місць мешкання, хоча у відсотковому відношенні целюлозолітичних штамів було виділено значно менше, ніж протеолітичних.

Ряд властивостей міксобактерій виявився характерним для певних таксономічних груп (табл. 3).

Таблиця 3

Диференціація родин порядку Myxoсoccales

Родина | Ознака

Пенетрація в агар | Адсорбція Конго рот | Оксидаза | Гідроліз крохмалю | Уреаза | Редукція нітратів

Myxococcaceae | -* | + | - | ± | - | -

Archangiaceae | - | + | + | + | - | -

Cystobacteraceae | - | + | - | + | + | -

Polyangiaceae | + | - | - | - | - | +

Примітка: “+” наявність ознаки; “-” відсутність ознаки; “±” ознака варіює;* - виключення штами виду M. stipitatus.

Узагальнюючи дослідження фізіолого-біохімічних особливостей виділених вперше та музейних штамів, можна стверджувати, що такі тести як адсорбція Конго рот, наявність оксидази, гідроліз крохмалю, пенетрація в агар, уреазна активність і здатність до відновлення нітратів можуть бути використані як діагностичні для ідентифікації міксобактерій до рівня родини.

Утилізація амінокислот. Міксобактерії – хижаки. Вони здатні використовувати як джерело поживних речовин та енергії білкові субстрати. Здатність до використання валіну, аланіну, лейцину, ізолейцину, проліну, аргініну, метіоніну і лізину як єдиного джерела вуглецю та енергії представниками протеолітичних видів було визначено вперше. Показано, що досліджені міксобактерії не ростуть на середовищі з аспарагіновою кислотою. На середовищах, до складу яких входили аланін, ізолейцин і пролін, штами росли протягом 10 – 15 пасажів, однак уже в першому пасажі спостерігалось утворення атипових плодових тіл. Цікаво відмітити, що ізоелектрична точка амінокислот, що сприяють утворенню атипових плодових тіл, лежить у діапазоні рН 6,02 – 6,10. Негативно заряджена (кисла) аспарагінова амінокислота, що не підтримує ріст міксобактерій, має ізоелектричну точку 2,97. На середовищах із рештою амінокислот, клітинами S. cerevisiae і пептоном спостерігався добрий ріст і утворення значної кількості типових плодових тіл із міксоспорами.

Антагоністична активність міксобактерій. Одним із етапів нашої роботи було дослідження антагоністичної активності ізольованих штамів міксобактерій щодо про- і еукаріотних мікроорганізмів. Як видно із табл. 4 більшість ізольованих штамів міксобактерій продукували антагоністичні речовини до тест-штамів E. coli ATCC 25922, S. ATCC 25923, P. ATСС 27853, M. luteus ATCC 4698, Candida albicans UCMY 2501, Penicillium ochro-chloron VKMF 1702. Всі досліджені штами видів M. xanthus і M. fulvus характеризувались антагоністичною активністю різного ступеню.

Ступінь проявленої антагоністичної дії серед штамів одного і того ж виду був різним і залежав як від виду міксобактерій, так і від індикаторного штаму. Найбільшою мірою досліджені міксобактерії пригнічували ріст грампозитивних тест-штамів S. aureus і M. luteus. Пригнічення росту E. coli відмічено для меншого числа штамів міксобактерій – 46,2 %. Поодинокі штами проявили антагоністичну

Таблиця 4

Антагоністичні властивості штамів міксобактерій (діаметр зони затримки росту тест-штаму, мм)

Штам-антагоніст |

E. coli ATCC 25922 | P. aeruginosa ATСС 27853 | C. albicans UCMY2501 |

Penicillium

ochro-chloron

VKMF 1702

S. aureus ATCC 25923 | M. luteus ATCC 4698

M. fulvus 6 | 32,3±0,2 | 30,5±1,3 | 22,6±1,1 | 0,0 | 22,9 ±0,9 | 0,0

M. fulvus

UCMB 10038 | 25,0±0,4 | 26,0±0,3 | 16,0±0,3 | 0,0 | 0,0 | 0,0

M. xanthus

V-25 | 31,8±0,2 | 30,3±0,7 | 24,3±0,9 | 0,0 | 24,2±0,8 | 0,0

M. xanthus

UCMB 10042Т | 22,4±1,2 | 20,8±1,1 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0

C. fuscus 33 | 29,1±1,1 | 28,5±2,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0

C. fuscus

UCMB 10004Т | 21,5±0,6 | 23,6±0,7 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0

А. gephyra 8 | 30,3±0,5 | 29,4±0,4 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0

P. cellulosum 13 | 28,3±1,1 | 30,0±0,5 | 25,3±0,9 | 26,2±1,1 | 25,0±0,3 | 0,0

P. UCMB 10043 | 21,0±0,2 | 22,8±0,5 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 10,2

активність щодо представника дріжджеподібних грибів Candida albicans, мікроміцету Penicillium ochro-chloron (рис. 1) і P. аeruginosa. Цікаво відзначити, що антагоністична активність ізольованих штамів була значно вищою, ніж типових і колекційних штамів: C. fuscus UCMB 10004Т, M. fulvus UCMB 10038, M. xanthus UCMB 10042Т, P. UCMB 10043.

Рис. 1. Фунгіцидна активність P. cellulosum 13 по відношенню до Penicillium ochro-chloron VKMF 1702.

Чутливість до антибіотиків. Як показало дослідження, більшість штамів міксобактерій чутливі до антибіотиків у широкому діапазоні концентрацій (табл. 5). Деякі штами проявили високу стійкість до мономіцину, ампіциліну, тетрацикліну і левоміцетину. Від 25 % до 45 % штамів були максимально стійкими до флоріміцину, лінкоміцину, бензилпеніциліну і оксациліну. Найбільшу кількість стійких штамів було виявлено до ністатину (92гентаміцину (75 %) і рубоміцину (58,2 %).

Не виявлено жодного штаму міксобактерій стійкого до канаміцину, стрептоміцину і поліміксину. Щодо канаміцину вивчені штами мали найвужчий діапазон МІК, що є підтвердженням високої чутливості міксобактерій до цього антибіотика.

Виявлено відмінності у чутливості до антибіотиків між представниками різних родин. Так, усі досліджені нами представники родини Archangiaceae проявили резистентність до усього діапазону концентрацій лише ністатину. Для представників родини Cystobacteraceae окрім ністатину характерна максимальна резистентність і до гентаміцину. Антибіотикорезистентність типових штамів міксобактерій була на низькому рівні.

Таблиця 5

Стійкість міксобактерій до антибіотиків

Антибіотик | Частка стійких

штамів, % | Мода МІК мкг·мл-1/% | Діапазон МІК мкг/мл

Стрептоміцин | 0 | 8,0/33,3 | 1 – 2000

Канаміцин | 0 | 4,0/46,7 | 0,125 – 250

Мономіцин | 6,7 | 500/26,7 | 2 – 2000

Гентаміцин | 76,6 | 0,125/6,7 | 0,125 – 3000

Бензилпеніцилін | 33,3 | 2000/16,6 | 0,5 – 2000

Оксацилін | 43,3 | 250,0/16,6 | 4 – 2000

Ампіцилін | 3,3 | 2000/36,7 | 2 – 2000

Лінкомицин | 23,3 | 4,0/16,6 | 0,125 – 2000

Тетрациклін | 13,3 | 1,0/26,7 | 1 – 2000

Левоміцетин | 13,3 | 16,0/16,6 | 2 – 500

Поліміксин | 0 | 32,0/33,3 | 1 – 500

Флоріміцин | 25,0 | 0,125/16,6 | 0,125 – 2000

Ністатин | 89,9 | 2000/9,9 | 2000

Рубоміцин | 49,9 | 16,0/16,6 | 4 – 2000

У двох штамів, що характеризувались підвищеними рівнями резистентності до досліджених антибіотиків, була виявлена плазмідна ДНК. Після елімінації плазмідної ДНК акридиновим оранжевим із високорезистентних штамів, стійкість до ряду антибіотиків зникала.

Адгезивні властивості мікcобактерій. Виявлено, що штами M. xanthus 422 i M. xanthus V-25 мають подібні закономірності у динаміці адгезивності: обидва штами краще прикріплюються до гідрофобної поверхні (рис. 2). Адгезивність збільшується у стаціонарній фазі росту (48 год), котра відповідає фазі зрілих плодових тіл, у порівнянні з пізньою логарифмічною фазою (24 год) і різко знижується у ранній фазі клітинного відмирання (72 год).

Рис. 2. Адгезія до краплин жиру клітин M. xanthus V-25, х 630.

Протонофор – карбоніл цианід м-хлорфенілгідразон СlССР (carbonil cyanide m-chlorophenyl-hydrazone), що знімає електрохімічний потенціал з поверхонь цитоплазматичних мембран клітин і порушує процес окиснювального фосфорилювання, призводить до незначного збільшення адгезивної здатності обох штамів.

Крім того, у обох штамів у стадії пізньої логарифмічної фази росту по відношенню до гідрофільної поверхні адгезивність збільшилась на 10 % порівняно з контролем, а для гідрофобної – приблизно на 35 %. У стаціонарній фазі спостерігалась максимальна адгезивність, і це пояснюється тим, що саме в цей період культури розпочинають процес утворення плодових тіл, що вимагає особливо міцних зв’язків як між самими клітинами, так і клітин з поверхнею прикріплення. У цій стадії росту адгезивність у присутності СlССР у обох штамів залишилась на приблизно тому ж рівні як до гідрофільної поверхні, так і до гідрофобної поверхні. До найбільшого зростання адгезивності присутність СlССР призводила у ранній фазі відмирання клітин у обох штамів і склала близько 100для гідрофільної поверхні і близько 15 % для гідрофобної поверхні.

Адгезія до гідрофобної поверхні послаблювалась із підвищенням рН. Прикріплення до гідрофільних поверхонь так само послаблювалось із підвищенням рН до 7 для M. xanthus V-25 і до 8 – для M. xanthus 422, але, подальше підвищення рН призводило до незначного збільшення прикріплення до цього типу поверхні, однак воно було значно нижчим, ніж при кислих значеннях рН. Введення протеази і хлорамфеніколу до експозиційного середовища не призводило до зниження сорбції клітин: прикріплення до гідрофільних поверхонь у міксобактерій виявилось так само стабільним, як і прикріплення до гідрофобних поверхонь (табл. ).

Результати цього дослідження показують, що синтез білка не має значного впливу на механізм прикріплення міксобактерій до двох досліджених типів поверхонь. Хлорамфенікол, що є інгібітором синтезу білка, може опосередковано впливати на адгезію шляхом порушення продукції ензимів, що зв’язані з утворенням інших потенційно адгезивних молекул, таких як поліцукриди. Однак, за короткий період експозиції (2 год) синтез нових поверхневих компонентів клітини, що підтримують адгезію, очевидно, не відбувається.

Таблиця 6

Частка клітин, що відкріпилися, у штамів M. xanthus під впливом хлорамфеніколу, протеази і періодата натрію, (%)

Агент обробки | M. xanthus V-25 | M. xanthus 422

Гідрофобна поверхня | Гідрофільна поверхня | Гідрофобна поверхня | Гідрофільна поверхня

Хлорамфенікол | 0,0 | 0,0 | 0,1 | 0,0

Протеаза | 0,2 | 0,5 | 0,1 | 1,1

Періодат натрію | 30,0 | 10,0 | 40,0 | 20,0

Найбільше процесу відкріплення міксобактерій від гідрофільної і гідрофобної поверхонь сприяє періодат натрію, що здатний руйнувати 1-2-, 1-3-, 1-4-, 1-6-глікозидні зв’язки. Причому, вплив на клітини, прикріплені до гідрофобних поверхонь, був більш значним, ніж на клітини, прикріплені до гідрофільних поверхонь. Це можна пояснити вагомішим внеском поліцукридів у прикріплення до гідрофобних поверхонь у досліджених штамів міксобактерій.

Крім того, нами була проведена оцінка стану клітинної поверхні у міксобактерій у різні періоди розвитку популяції, оскільки загальновідомо, що адгезивні властивості клітин безпосередньо пов’язані зі станом клітинної поверхні. Для цього була використана взаємодія з ліпофільним сефадексом, аніонобмінною та амфолітною смолами. Отримані нами результати показують, що у клітинних поверхнях обох досліджених штамів переважають гідрофобні взаємодії. Негативний заряд на всіх етапах розвитку культури міксобактерій переважає над позитивним. В умовах нейтрального значення рН і 0,1 мМ концентрації катіонів металів у дисперсійному середовищі клітинна адгезія до ліпофільного сефадексу, аніонобмінної та амфолітної смоли значно зростала.

Взаємодія міксобактерій з важкими металами. Вплив важких металів на міксобактерії виявлявся у тому, що пригнічувалась продукція біомаси, здатність до ковзного руху, утворення плодових тіл. Це може бути викликано двома незалежними процесами: токсичною дією важких металів і прямим впливом на екзополімери клітин. Штами M. V-25 і M. xanthus 422 акумулюють значні кількості важких металів як на щільних живильних середовищах, так і в суспендованому стані (табл. 7). Проведені нами дослідження дозволили отримати підтвердження того, що більша частина нагромаджених важких металів локалізується на поверхні: по-перше, нагромадження металу триває у перші 15 хвилин експозиції, по-друге, метали, акумульовані із суспензії, можуть бути практично повністю вилучені з біомаси промиванням ЕДТА.

Таблиця 7

Рівень зв’язування важких металів біомасою штамів M. xanthus (мгг-1 сухої маси) до і після обробки ЕДТА

Штам | Обробка ЕДТА | Ni2+ | Cu2+ | Zn2+ | Cd2+ | Pb2+

M. V-25 | До | 109025,0 | 3503,0 | 168035,0 | 18110,0 | 850030,0

Після | 3 0,1 | 260,3 | 90,1 | 241,0 | 765,0

M. 422 | До | 6003,0 | 3203,0 | 230025,0 | 196620,0 | 1270040,0

Після | 150,1 | 400,1 | 590,1 | 50,1 | 390,3

Збереження культур міксобактерій. Практичним результатом роботи по виділенню міксобактерій стало створення їх колекції. Перспективи тривалого збереження міксобактерій в колекції були вивчені на прикладі ряду штамів (табл. 8).

Таблиця 8

Життєздатність міксобактерій після 2 років збереження

Штам | Спосіб збереження

Ліофіліза-ція | Кріоконсер-вація | Висушу-вання |

Суспенду-вання у захисному середовиці | Суб-культивуван-ня під шаром мінеральної олії

M. xanthus 10041 | ++ | ++++ | +++ | - | -

A. 10001 | ++ | ++++ | +++ | - | -

P. 10043 | ± | ++++ | - | + | -

Примітка: “++++” - висока життєздатність; “+++” - середня життєздатність; “++” - задовільна життєздатність; “+” - незадовільна життєздатність; “” - погана життєздатність; “” - втрата життєздатності.

Представники міксобактерій з целюлозолітичним типом метаболізму мали найбільший відсоток життєздатних клітин при збереженні у суспензіях на фізіологічному розчині або дистильованій воді.

Вперше доведена можливість використання методу збереження міксобактерій у ліофілізованому стані на стадії зрілих плодових тіл. Для міксобактерій, котрі втратили здатність утворювати плодові тіла, успішно був застосований метод кріоконсервації при температурі рідкого азоту (_ оС) або його парів (_ оС).

Показана можливість прогнозування виживання ліофілізованих вегетативних клітин міксобактерій за допомогою прискореного (accelerated storage) тесту у ліофілізованих препаратах на основі порівняння прогнозованих і експериментально отриманих даних. Встановлено, що додавання антиоксидантів: цистаміну, іонолу, -токоферолу до захисного середовища (цукрозо-желатиновий агар) позитивно не вплинуло на життєздатність міксобактерій при ліофілізації на стадії вегетативних клітин.

Важливе теоретичне значення має вперше виявлена наявність у міксобактерій біологічних ритмів. З практичного аспекту це дозволило визначити сприятливі періоди часу для проведення дослідження міксобактерій і закладання їх на тривале збереження.

В и с н о в к и

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.