ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

Української академії аграрних наук

Волощук Сергій Іванович

УДК 633.11: 632.931.1:581.143.6

Клітинна селекція пшениці на стійкість

до Fusarium graminearum schwabeКлітинна селекція пшениці на стійкість до некротрофних грибних патогенів

03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

д и с е р т а ц і ї на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Київ — 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Миронівському інституті пшениці ім. В.М. Ремесла УААН.

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук

Гірко Володимир Сергійович,

Миронівський інститут пшениці ім. В.М. Ремесла УААН

завідувач відділу біотехнології

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук

ШЕРЕПІТКО Валентин Васильович,

Інститут агроекології та біотехнології УААН

завідувач відділу генетики та адаптивної

селекції зернобобових культур

доктор біологічних наук

ЧУГУНКОВА Тетяна Володимирівна,

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України

завідувач відділу генетичних основ гетерозису

Провідна установа: Білоцерківський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, м. Біла Церква.

Захист відбудеться “2” березня 2006 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології УААН за адресою: м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН за адресою: м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розісланий “ 27” січня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Л.І. Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні десятиріччя фузаріоз колоса вважають найбільш небезпечною хворобою стратегічно важливої культури – пшениці та інших зернових у світовому масштабі (Windels, 2000), яка спричиняє значні матеріальні втрати. Основним збудником хвороби є Fusarіum gramіnearum Schwabe. Ураження патогеном викликає зниження до 50 % урожайності (Кислих, Райчук, 1999) та якості зерна пшениці і накопичення мікотоксинів (Ампилогова и др., 1996), отруйність та канцерогенність яких зумовлює непридатність зерна для продовольчих і фуражних потреб (Монастырский, 1998). Аграрне виробництво потребує створення стійких до хвороби сортів. Проте джерел стійкості до патогена мало, і, як показує світова практика, можливості генетичного покращення внутрішньовидового потенціалу стійкості традиційними методами обмежені. Зусилля багатьох дослідників спрямовані на розширення генетичної різноманітності пшениці за стійкістю до фузаріозу шляхом віддаленої гібридизації (Бабаянц и др., 2001; Давоян, 2002), генетичної інженерії та інших біотех-но--ло-гічних прийомів (Морозова и др., 1991; Клечковская и др., 1997; Веденеева и др., 2002) для збільшення ефективності селекції. Показано, що стійкі до біотичних факторів генотипи можна відбирати в культурі і залучати їх до селекційного процесу (Сидоров, 1990; Карпухіна, 2001; Мепаришвили, 2003; Калашникова, 2003).

Однак покращення стійкості пшениці до фузаріозу з використанням клітинної селекції потребує поглибленого вивчення низки теоретичних та методичних аспектів. Недостатньо досліджені біологічна та генетична активність метаболітів Fusarіum gramіnearum у культурі іn vіtro, а також взаємозв’язки прояву стійкості на рівні клітин, тканин і цілого організму. Важливим є вивчення особливостей індукції морфогенезу і сомаклональної мінливості в селективних умовах та виникнення і прояву генетично обумовлених клітинних механізмів стійкості при поєднанні індукованої іn vіtro мінливості і клітинної селекції. Актуальним є пошук найбільш надійних критеріїв оцінки і методів добору в культурі тканин. Мало відомостей щодо характеру мінливості при отриманні стійких варіантів та стабільності успадкування стійкості в потомстві регенерантів у польових умовах. Вирішення цих питань є основою для вдосконалення біотехнологічних прийомів розширення генетико-селек-ційного потенціалу пшениці і отримання генотипів, стійких до фузаріозу колоса.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Викладені в роботі результати досліджень є складовою частиною програм науково-дослідних робіт відділу біотехнології Миронівського інституту пшениці: 1991-1995 рр. – “Фундаментальні дослід-ження” (№ держ-реєстрації UA01009537P); 1996-2000 рр. – “Теоретичні основи селекції і насінництва сільсько-господарських культур” (№ держреєстрації 0197U019452), а також “Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 рр.” (№ держреє-страції 0101U007675).

Метою дослідження було виявити особливості генетичної та фізіологічної дії токсичних метаболітів Fusarіum gramіnearum у калюсній культурі пшениці та розробити технологію індукції, оцінки та до-бо-ру іn vіtro селекційного матеріалу, стійкого до фузаріозу колоса, на основі розширення генетичної мінливості.

Відповідно до цієї мети для вирішення ставились завдання:

1. Дослідити фізіологічну дію метаболітів патогена на різних рівнях організації рослин та виявити специфічність їх впливу.

2. Оптимізувати умови калюсоутворення і регенерації в культурі незрілих зародків, дослідити генетичний контроль регенерації та вплив метаболітів патогена на ці процеси.

3. Дослідити особливості сомаклональної мінливості в культурі незрілих зародків пшениці та генотоксичної дії метаболітів патогена in vitro.

4. Розробити критерії оцінки та добору стійких до токсинів патогена клітинних ліній у культурі незрілих зародків пшениці.

5. Дослідити в модельних та польових умовах стійкість до патогенів відібраних іn vіtro ліній, виявити відповідність між стійкістю in vitro та in vivo.

6. Дослідити успадкування ознаки стійкості до фузаріозу колоса та її компонентів у насіннєвих поколіннях відібраних in vitro генотипів.

Об'єкт досліджень – особливості прояву стійкості пшениці до фузаріозу колоса.

Предмет досліджень – селекція пшениці на стійкість до токсичних метаболітів Fusarіum gramіnearum в умовах in vitro.

Методи дослідження. Методи культури тканин і органів in vitro застосовували для отримання калюсних культур і регенерації рослин в селективних та звичайних умовах і оцінки стійкості генотипів. Стійкість батьківських форм і рослин-регене-рантів вивчали в умовах вегетаційних та польових дослідів на штучних інфекційних фонах. Методи гібридологічного аналізу використано для встановлення генетичної детермінації ознак стійкості та регенераційної здатності. Мікологічні методи вживали для ідентифікації патогена, виділення його в чисту культуру, отримання моноспорових ізолятів і напрацювання культуральних фільтратів. Тонкошарову хроматографію використовували для ідентифікації тріхотеценових токсинів та кількісного визначення їх накопичення в зерні. За допомогою цитологічних методів вивчали зміни в хромосомному апараті культивованих клітин при дії культуральних фільтратів. Для аналізу експериментальних даних використано статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше детально вивчено дію токсичних метаболітів Fusarіum gramіnearum in vitro та in vivo (клітинні культури, проростки, ізольоване колосся, зрілий пилок пшениці) і встановлено залежну від генотипу токсичну, генотоксичну та мутагенну дію культуральних фільтратів на калюсні культури з незрілих зародків пшениці. Виявлено відповідність рівня регенерації в калюсній культурі пшениці при дії селективного фактора і стійкості до патогена в польових умовах, на цій основі розроблено та удо--ско-налено критерії оцінки і добору стійких клітинних ліній. Встановлено, що ефективність селекції in vitro вища при залученні більш стійких генотипів. Виявлено, що ознаки регенераційної здатності контролюються адитивно-домінантною генетичною системою з переважанням ефектів домінування. При дії культуральних фільтратів виявлено збільшення частоти та розширення діапазону сомаклональної варіабельності за якісними та кількісними ознаками. Показано ефективність поєднання комбінаційної, мутаційної і сомаклональної мінливості для отримання більш стійких генотипів. У гібридних популяціях після дії селективного фактора виявлено зміну величини генетичних ефектів та накопичення частки стійких генотипів. Виявлено, що порівняно з вихідними генотипами у відібраних ліній зросли компоненти стійкості, пов’язані з уникненням від первинного проникнення патогена, інгібуванням гіфального росту, інгібуванням синтезу тріхотеценових токсинів, здатністю до їх деградації та резистентністю до інфікування насіння.

Практичне значення одержаних результатів. З використанням розробленої модельної сис-теми відібрано селекційні лінії пшениці, стійкі до F. gramіnearum, які включені в селекційні програми відділу біотехнології Миронівського інституту пшениці ім. В.М. Ремесла. Три відібрані in vitro найбільш стійкі лінії з високою комбінаційною здатністю за компонентами стійкості можна рекомендувати як джерела стійкості до фузаріозу колоса. Розроблені методи оцінки та добору іn vіtro генотипів пшениці на стійкість до фузаріозу колоса можна рекомендувати для застосування як елементи біотехнологічних та традиційних селекційних програм.

Наведені в дисертації теоретичні та практичні результати науково-дослідної роботи та розроблені автором методи селекції в культурі клітин in vitro ввійшли в програму курсу лекцій з генетики і селекції рослин і використовуються в лабораторних практикумах Південного філіалу „Кримський державний аграрнотехнологічний університет” НАУ та Білоцерківського державного аграрного університету. Розроблено методичні рекомендації “Отбор іn vіtro селекционного материала пшеницы на устойчивость к биотическим факторам среды”, які можуть бути застосовані в роботі наукових та селекцій-них установ.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проаналізовано стан досліджуваної проблеми, складено програму досліджень, проведено польові та лабораторні досліди, аналіз результатів досліджень та підготовку матеріалів до друку. Окремі види досліджень (мікологічні, створення штучних інфекційних фонів, цитологічні аналізи) проведено за участю співробітників Інституту захисту рослин УААН та кафедри генетики Київського національного університету ім. Тараса Шев-ченка. В дисертаційну роботу включені матеріали досліджень, у проведенні яких та узагальненні їх результатів частка автора складає 50-80 %.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на Міжнародній конференції “Агробио-техно-логии растений и животных” (Київ, 1997); ІХ Міжнародному Конгресі “Plant Bіotechand Іn Vіtro Bіology іn the 21st Century” (Єрусалим, 1998); ІІ Міжнародному Симпозіумі по біотех-нології рослин (Kиїв, 1998); ІІ Міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-гене-тичних і біотехнологічних роз-ро-бок в генетико-селекційних до-с-лід-женнях” (Одеса, 1998); Міжнародній конференції “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва” (Харків, 1999); науково-практичному семінарі “Вчимося господарювати” (Ча-бани, 1999); Міжнародному Симпозіумі “Wheat Іmprovement for Scab Resіs” (Сучжоу і Наньдзін, Китай, 2000), ІІІ Міжнародній конференції „Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” (Москва, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Наукове забезпечення виробництва зерна тритикале і продуктів його переробки” (Харків, 2005).

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 27 друкованих роботах: 16 статтях у наукових журналах і збірниках (7 у фахових виданнях) та 11 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 197 сторінках друкованого тексту і містить вступ, загальну характеристику роботи, 7 розділів, висновки, практичні рекомендації та перелік посилань з них. Роботу ілюстровано 33 рисунками, 49 таблицями, 5 додатками. Перелік використаних літературних джерел налічує 295 найменувань, з них 165 – іноземними мовами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У розділі висвітлено проблеми стійкості м’якої пшениці до F. gramіnearum, основні принципи, напрямки, можливості та проблеми клітинної селекції на імунітет і досягнення вітчизняних та зарубіжних вчених. Приділено увагу методам оцінки і добору in vitro. Приведено аналіз фенотипового прояву сомаклональної мінливості, природи генетичних змін у культурі тканин та можливостей розширення індукованої in vitro мінливості.

Матеріали і методи досліджень. В роботі використовували сорти озимої м’якої пшениці Trіtіcum aestіvum L.: Nobeoka bozu komugi, Са 8055, 80117, Даха (група сортів, стійких до F.gramіnearum), Arcole (середньоуразливий), Миронівська 808, Донська напівкарликова, Миронівська 61 (група уразливих сортів), а також сорти Миронівська 29, Миронівська 33, Fakta та Co 7250-5, які вирощували в умовах фітотрону та в польових умовах. Культуральні процедури виконували за рекомендаціями Бутенко Р.Г. (1964) і Калініна Ф.Л. та ін. (1984). Використовували середовища MS (Murashіge, Skoog, 1962), SD (Sears, Deckard, 1982), B5 (Gamborg et al., 1968), доповнених 2,4-Д (1-2-4-8 мг/л, залежно від варіанту досліду).

Ідентифікацію збудників та отримання чистих моноспорових культур Fusarіum gramіnearum Schwabe (F.g.) здійснювали за стандартними методиками (Билай, 1977). Культуральні фільтрати (КФ) отримували після культивування F.g. у рідкому картопляно-глюкозному середовищі. КФ різних концентрацій використовували для отримання селективних середовищ, контроль — середовища того ж складу без КФ. Аналіз тріхотеценових токсинів проводили методом тонкошарової хроматографії. Оцінку стійкості пшениці до КФ у проростках та в культурі тканин і ізольованих органів проводили за розробленими і модифікованими нами методиками. Оцінку стійкості рослин на штучному інфекційному фоні проводили за загальноприйнятими методиками, враховуючи індекс розвитку хвороби (Бабаянц и др., 1988) і частку зерен з прихованою інфекцією (Кислих, 2000).

Цитогенетичний аналіз мітозу, мейозу, та аналіз анафаз проводили за Паушевою З.П. (1980), аналіз СХО — за Murata М. (1989) з деякими модифікаціями. Гібридологічний аналіз відселектованих іn vіtro ліній проводили за загальноприйнятими методами, визначення ефектів генів – за Мазером К. і Джинксом Дж. (1985), визначення комбінаційної здатності за компонентами стійкості – згідно з рекомендаціями Турбіна Н.В. та ін. (1974) з використанням ППП БиоСтат. Статистичну та математичну обробку результатів досліджень проводили за Доспєховим Б.О. (1965) і Зайцевим Г.Н. (1984), використовуючи ППП Statіstіca 6.0 та S-Plus 2000.

ФІЗІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ МЕТАБОЛІТІВ F. gramіnearum НА РІЗНИХ РІВНЯХ ОРГАНІЗАЦІЇ РОСЛИНИ-ХАЗЯЇНАРОЛЬ ФIТОТОКСИНIВ ГРИБIВ В РЕАКЦIЇ ВЗАЄМОДIЇ ПАТОГЕНА ТА РОСЛИНИ-ХАЗЯЇНА

Фітотоксичність КФ на рівні організму, ізольованих органів, клітинному та субклітинному рівні. Було виявлено, що максимальної токсичності КФ F.g. набував через 4 тижні культивування. При цьому КФ інгібував проростання насіння сорту Миронівська 808 у розведенні 1:1 на 88,4±2,2, у розведенні 1:8 КФ пригнічував процеси росту кореня та колеоптиля на 47,7±5,1, а при розведенні 1:1 ріст зупинявся. Істотної різниці в інгібуванні ростових реакцій кореня і колеоптиля у проростків стійкого (Са 8055) і нестійкого (Миронівська 61) сортів не виявлено.

Дослідження in situ (культура відсіченого колосся) на середовищах з КФ показали сортоспецифічність реакції за параметрами зав’я-зуваності та маси 1000 зерен.

На субклітинному рівні КФ порушували проникність мембран, збільшуючи вихід бетаціаніну з висічок червоного буряка більше, ніж удвічі. Вони ефективно інгібували енергонакопичувальні реакції фотосинтезу в ізольованих хлоропластах пшениці. Залежність інгібування фотовідновлення НАДФ від концентрації КФ близька до S-подібної. Концентрація КФ, необхідна для інгібування цієї реакції на 50 %, становила біля 17 %. Дія КФ супроводжувалась змінами в біохімічних процесах калюсних тканин – збільшенням виходу електролітів, активності пероксидази та інгібіторів протеолізу. Різниця між стійкими і нестійкими генотипами вірогідна.

На клітинному рівні виявлено цитостатичну та цитотоксичну дію КФ на суспензійну культуру пшениці, яка проявлялась у зменшенні приросту кількості життєздатних клітин, а також токсичний вплив на мікрогаметофіти при формуванні пилку – порушення співвідношення кількості ДНК у вегетативних та генеративних ядрах, зміна площі ядер та зменшення фертильності.

Виявлена сортоспецифічність досліджуваних реакцій та вірогідні значення кореляції з польовими оцінками на штучних інфекційних фонах (табл. ) дають можливість використовувати КФ як селективний агент для первинного скринінгу, а також добору стійких до фузаріозу колоса генотипів пшениці.

Таблиця 1

Зв’язок між стійкістю генотипів озимої пшениці до F. gramіnearum на штучному фоні і токсичністю його КФ на різних рівнях організації рослини-хазяїна

Сорт | Коефіцієнти a лінійної

регресії Y=ax+b | Параметри генеративних ядер пилку, % до контролю | Пригнічення росту (%) проростків при 25% КФ | Розвиток хвороби (%)

росту суспензійної культури | фертильності пилку in situ ** | зав’язуваності

зерен in situ** | маси 1000 зерен

in situ**

площа | вміст ДНК

Nobeoka bozu | -0,15 | -2,01 | -3,08 | -3,34 | 104,0 | 91,2 | 28,4 | 9,2

80117 | -0,25 | -1,87 | -3,23 | -3,48 | 21,4 | 14,9

Ca8055 | -0,36 | -2,97 | -3,29 | -3,61 | 31,2 | 18,5

Миронівська 808 | -0,98 | -2,36 | -3,44 | -3,60 | 73,5 | 145,0 | 56,9 | 28,4

Донська напівкарликова | -0,96 | -2,83 | -3,38 | -3,57 | 69,4 | 166,1 | 58,9 | 39,5

Кореляція з розвитком хвороби | -0,93 | -0,60 | -0,79 | -0,63 | -0,97 | 0,99 | 0,90

*х – експозиція з 50 % КФ; ** х – концентрація КФ у середовищі.

Токсичність КФ F.g. у культурі незрілих зародків. Виявлено, що в контролі на частоту індукції калюсогенезу і регенерації впливають генотип, стан експланта і умови культивування. Оптимальними були середовища MS та SD, розмір зародка – 1 – 1,5 мм, вміст 2,4-Д – 2 мг/л, тривалість пасажу – 3-4 тижні. У зародків, більших за 1,75 мм, значно зростала здатність до передчасного проростання зародкових осей. Проте підвищення вмісту 2,4_Д до 3-4 мг/л давало можливість отримувати ембріогенні калюси навіть при більших розмірах зародків. Для покращення морфогенного потенціалу калюсних культур доцільно знижувати концентрацію 2,4-Д на 0,5 мг/л у кожному наступному пасажі.

Частота індукції калюсних культур на селективному середовищі з КФ була значно меншою, а калюси мали обмежений морфогенний потенціал і регенераційну здатність, вони були здатні в основному до ризогенезу. Попередньо індуковані калюсні культури при пасажі на селективні середовища проявляли генотипову специфічність пригнічення росту. Переважно цитостатичну дію КФ спостерігали на стійких сортах Nobeoka bozu і Ca , переважно цитотоксичну – на уразливих сортах Донська напівкарликова (Д.п.к.) і Миронівська 808 (М.808). Стійкі сорти після 3 тижнів культивування на середо-вищі з КФ відновлювали відносну швидкість росту (рис. ). На селективних середовищах на ембріогенез і регенерацію впливали генотип і концентрація КФ.

Збільшення вмісту КФ в середовищі викликало суттєве зниження частки здатних до геммогенезу калюсів і появи ряду морфотипів з оз-наками некрозу та інтенсивного ризогенезу без утворення пагонів, причому в більшій мірі у менш стійких генотипів. Збіль-шення тривалості культи-вування з КФ також при-зводило до втрати регенераційної здатності.

ГЕНЕТИЧНА АКТИВНІСТЬ КФ У КАЛЮСНІЙ КУЛЬТУРІ ПШЕНИЦІ І СОМАКЛОНАЛЬНА МІНЛИВІСТЬ

При дії на кореневу меристему КФ викликали підвищення частоти абе-рацій (мостів і фрагментів), однак не спричиняли появи багатопо-люсних мітозів та С_мітозів, на відміну від кофе-їну і колхіцину, відповідно. Співвідношення мос-ти/фрагменти було найменшим при низьких концен-тра-ціях КФ, найбільшим – при високих концентраціях. При цьому відмічено і найбільший мітотичний індекс. При дії КФ на калюсні тканини пшениці частка аберантних клітин та їх пошкодженість були істотно більшими, ніж у контролі (табл. 2), що свідчить про високу генотоксичну активність КФ. Збільшення експозиції як у контролі, так і в присутності КФ приводило до поступового зменшення частки анафаз з перебудовами; порівняно до контролю на середовищі з КФ ця тенденція проявлялась більш виражено для стійкого генотипу. Це може бути наслідком або поступового зменшення з часом вмісту селективного агента в середовищі, або скоріше адаптації калюсних культур до дії КФ.

Таблиця 2

Хромосомні аберації в калюсній культурі пшениці під впливом КФ |

Са 8055 | Миронівська 808

Вміст КФ у середовищі, %

0 | 5 | 25 | 0 | 5 | 25

Мітотичний індекс | 6,4±0,4 | 7,8±0,5 | 4,3±0,3 | 6,2±0,4 | 7,1±0,3 | 5,9±0,4

Кількість аберантних клітин, % | 3,3±1,1 | 9,3±2,2 | 21,9±2,6 | 3,9±1,1 | 13,3±1,1 | 46,4±3,4

Пошкодженість аберантних клітин | 0,60 | 1,69 | 2,65 | 0,67 | 1,24 | 2,90

Мости, % | 83,3 | 22,2 | 37,0 | 75,0 | 21,7 | 46,6

Фрагменти, % | 50,0 | 81,5 | 84,2 | 62,5 | 89,1 | 77,3

Співвідношення фрагменти/мости | 0,60 | 3,67 | 2,28 | 0,83 | 4,10 | 1,66

Ефективним тестом генетичної активності різних хімічних сполук вважають сестринські хроматидні обміни (СХО). Виявлено, що середній рівень сестринських хроматидних обмінів на клітину склав до 12-20 в контролі. Короткочасна інкубація калюсних культур з БУдР та КФ призводила до збільшення числа СХО з ростом концентрації КФ у нестійкого сорту (рис. 2, а), при 50 % КФ кількість СХО зменшувалась. Відсутність впливу часу інкубації свідчить про незначні зміни тривалості клітинного циклу. У стійкого генотипу збільшення концентрації КФ зменшує кількість СХО, причому зі збільшенням тривалості інкубації з БУдР цей процес починається при менших концентраціях КФ. Це може свідчити як про підвищення рівня репарації СХО, так і про збільшення тривалості клітинного циклу.

При інкубації калюсних культур на селективних середовищах виявлено, що в обох генотипів рівень СХО був вищим за експозиції 14 діб, ніж 28 діб (рис. 2, б). Оскільки ріст калюсів повністю не припинявся, імовірнішим поясненням цих явищ є елімінація з клітинної популяції клітин з високими рівнями СХО за рахунок припинення поділу пошкоджених клітин і накопичення нормальних. Про підвищення рівня репарації СХО у стійкого сорту свідчить слабка залежність рівня СХО від концентрації через 28 діб інкубації з КФ.

а) б)

Рис. 2. Число СХО на клітину в культурі калюсів озимої пшениці в залежності від концентрації КФ та (а) — часу інкубації з БУдР і (б) — періоду субкультивування з КФ (інкубація з БУдР — 48 год.).

Спонтанна та індукована сомаклональна мінливість у культурі тканин пшениці. Відомо, що культивування in vitro супроводжується появою спадкових сомаклональних варіантів. Генетичними наслідками культивування пшениці іn vіtro була висока частота спадкової мінливості певних груп ознак: висоти рослин, форми колоса, остистості. Було виявлено, що на частоту сомаклональної мінливості впливають, генотип, стан експланта і умови культивування, за оптимальних для культивування та регенерації умов, для більшості вивчених генотипів вона була мінімальною. Максимальний вихід сомаклональних варіантів забезпечували більш жорсткі умови культивування (вищі концентрації регуляторів росту і триваліший період субкультивування), які однак призводили до зменшення виходу рослин.

При використанні мутагенів in vitro та КФ розширювався спектр індукованої спадкової мінливості, порівняно зі спонтанною. Із зафіксованих 25 мутантних ознак в R2 частоти окремих з них досягали 2,5-4,5 % (табл. ). Значна кількість мутантних сімей мали спадкові зміни одразу за групою ознак, переважно в таких комбінаціях: висота – форма колоса – остистість, висота – форма колоса – восковий наліт, форма колоса – остистість – восковий наліт.

Додавання КФ у середовища викликало підвищення, порівняно з контролем, частоти морфологічних змін, яка, в залежності від генотипу, складала в сумі від 7 до 30і була в середньому на рівні 8,4 %, причому різні морфологічні зміни були виявлені в межах окремих сомаклональних серій (нащадків одного вихідного експланта). Отже, КФ проявляв відчутний мутагенний ефект, хоч і слабший за хімічні мутагени.

Таблиця 3

Мінливість ознак у потомствах регенерантів R2 та R3 після культивування

на середовищах з мутагенами та КФ

Група ознак, що змінились | Миронівська 808 | Донська напівкарликова

НЕС* | ДАБ | F.g. | НЕС | ДАБ | F.g.

R2** | Висота рослини | 2,45 | 2,24 | 0,78 | 1,72 | 1,09 | 0,78

Форма і структура колоса | 5,90 | 3,49 | 1,07 | 7,30 | 5,89 | 1,70

Остистість | 0,95 | 1,71 | 0,71 | 1,19 | 1,23 | 0,53

Форма і довжина флаг-листа | 0,76 | 0,56 | 0,41 | 0,92 | 1,01 | 0,51

Хлорофілова недостатність | 0,58 | 0,03 | - | 0,28 | 0,03 | -

Скоростиглість | 0,49 | 0,53 | 0,12 | 0,69 | 0,68 | 0,34

Наявність воскового нальоту | 0,51 | 0,44 | 0,15 | 0,64 | 0,74 | 0,22

R3*** | Число колосків | 8,7 | 11,9 | 14,9 | 11,5 | 13,6 | 8,5

Число зерен | 4,5 | 7,8 | 12,5 | 6,2 | 8,4 | 9,6

Маса головного колоса | 4,8 | 5,7 | 11,3 | 4,2 | 10,4 | 5,8

Маса 1000 зерен | 5,2 | 8,9 | 5,8 | 5,1 | 6,1 | 6,9

* - НЕС – нітрозоетилсечовина (0,05 %), ДАБ – діазоацетилбутан (0,05 %), F.g.- КФ 25 %;

** - сумарний % рослин з морфологічними змінами в R2;

*** - сумарний % сімей в R3, в яких середні значення відрізняються від вихідного генотипу.

Мінливість кількісних ознак у пшениці посилювалась при дії мутагенними чинниками на калюсні культури, отримані з гібридного насіння F1. При цьому змінювались параметри гістограм розподілу (мода, асиметрія та ексцес) і розмах мінливості. Аналіз розщеплення в гібридно-мутантних сім'ях R1F2M1 за ознаками безостість/остистість та наявність воскового нальоту показав, що обробка мутагенами порушувала характер успадкування цих ознак.

СЕЛЕКЦІЯ КЛІТИННИХ ЛІНІЙ НА СТІЙКІСТЬ ДО КФ ІN VІTRO

Добір недиференційованих калюсів на селективних середовищах. У процесі добору форм, стійких до F.graminearum, досліджували особливості дії КФ на калюсні культури пшениці. Криві загибелі калюсів на середовищах з токсинами мали S-подібний характер залежності від концентрації. Лінії регресії логарифму частки калюсів, які нормально ростуть, на концентрацію селективного агента для більш стійких сортів знаходились вище (рис. ), відповідно значення LD50 і LD95 для них були вищі, зокрема для Nobeoka bozu LD95 ,3КФ, для сорту Донська напівкарликова – 17,2 %. По LD95 можна було достовірно диференціювати генотипи відповідно до їх польової стійкості. Повтор-ний добір на се-лек-тивному середовищі при субле-та-ль-них умовах погіршує диферен-ці-ацію генотипів. Суб-летальні значення експозиції при фіксо-ваній кон-цен-трації КФ (25складали 4,1-6,5 тижнів, також відповідно до польової стій-кості генотипу, за винятком низько-куль-ту-ра-бельних сортів, зо-кре-ма, Nobeoka bozu. Оп-ти-маль-ною була трива-лість па-са--жу 4 тижні на середовищі з КФ при суб-ле-тальній концен-трації 25Хоча значне зни-ження ре-гене-раційної здат-ності калюсів (від 10 до 100 ра-зів) ускладнює вико-ристання цього під-хо-ду для ма-со-вого скринінгу іn vіtro, жорстка візуаль-на се-лек-ція калюсів за зовнішнім виглядом дозво-лила нам провести широкомасштабну оцінку і отри-мати ряд більш стійких до КФ ліній (табл. 4).

Добір на рівні регенеруючих калюсів. До-бав-ка токсичних метаболітів піс-ля по-чат-ку регене-рації – закладки ембріоїдподібних структур виявилась зна-чно ефек-тив-ні-шим прийомом за частотою отри-ма-ння реге-не-рантів (табл. 4). Генотип виявив сут-тє-ві-ший вплив на виживання регенерантів.

Таблиця 4

Ефективність добору в калюсних культурах озимої пшениці

Сорт | Відібраних in vitro ліній від вихідних експлантів,

% (шт.) | Ліній, що переважають вихідний сорт, від вихідних експлантів, % (шт.)

в R1, за стійкістю в проростках до КФ | в R3-4, за стійкістю до патогена у полі

Nobeoka bozu | 1,85 (88)*

20,35 (94) | 0,36 (17)

3,25 (15) | 0,15 (7)

2,16 (10)

Ca 8055 | 3,30 (58)

11,56 (147) | 0,63 (11)

1,89 (13) | 0,28 (5)

1,02 (13)

Миронівська 808 | 2,05 (68)

6,75 (75) | 0,18 (6)

0,45 (5) | 0,06 (2)

0,27 (3)

Донська напівкарликова | 2,12 (50)

5,06 (46) | 0,13 (3)

0,22 (2) | 0,13 (3)

0,22 (2)

* — курсивом виділено показники при дії КФ на проліферуючі калюси; підкреслено — на регенеруючі калюси.

Виживання регенеруючих калюсів на селективних середовищах корелювала з польовою стійкістю вивчених сортів, (r = 0,79 при р ,05), що підтверд-жує сортоспецифічність відповіді на дію КФ.

Частота появи стійких ліній при селекції іn vіtro на рівні проліферуючого калюса була незначною (від 10_), однак вищою за частоту спонтанного мутагенезу; при селекції іn vіtro на рівні регенеруючого калюса — вищою (від 10-3), проте стійкість ліній була дещо нижчою. Частка стійких ліній, отриманих від стійких сортів, була в 2-5 разів вищою, ніж від сприйнятливих. Частка отриманих більш стійких ліній R3 в середньому не перевищувала 10від відібраних, а частка останніх складала біля 2,4 % від загальної кількості селектованих калюсів.

Клітинна селекція в гібридних популяціях. Гібридні комбінації за частотою регенерації в контролі займали проміжне положення, дещо ближче до батька з вищою здатністю до регенерації. Частота регенерації під впливом КФ у гібридних популяціях була вірогідно ближчою до більш стійкого з батьків (табл. 5). Частоти регенерації в реципрокних комбінаціях вірогідно не відрізнялись. Перевірка стійкості насіннєвих потомств F2 (потомства регенерантів з F1) по рослинах та в F3 (потомства регенерантів з F2) по сім’ях на штучному інфекційному фоні підтвердило припущення про накопичення більш стійких генотипів у генетично гетерогенній популяції внаслідок клітинного добору.

Таблиця 5

Регенераційна здатність гібридів та батьківських генотипів після дії КФ на калюсні культури і стійкість їх насіннєвих потомств до F.graminearum

Генотип | Контроль | Дія КФ на етапі проліферації | Дія КФ на етапі регенерації

1* | 2 | 1 | 2 | 1 | 2

Са8055 | 55,4±4,2 | 15,2±2,5 | 15,4±3,4 | 16,8±1,6 | 31,5±4,6 | 14,3±0,9

F2 Са8055 х Миронівська 61 | 74,1±3,6 | 35,6±3,6 | 14,1±2,3 | 21,6±1,6 | 28,6±3,2 | 28,1±1,4

F2 Миронівська 61 x Са8055 | 73,1±3,6 | 36,7±3,2 | 14,9±2,1 | 19,5±1,8 | 29,0±3,1 | 30,7±1,6

Миронівська 61 | 84,2±3,6 | 68,7±4,4 | 7,2±2,6 | 52,5±2,9 | 13,6±3,4 | 67,5±1,2

* 1 – % регенерації; 2 – розвиток хвороби, %.

ГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ КЛІТИННИХ ЛІНІЙ ЗА ОЗНАКАМИ РЕГЕНЕРАЦІЇ ТА СТІЙКОСТІ ДО ПАТОГЕНІВ

Успадкування здатності до регенерації. Дисперсійний аналіз здатності до регенерації в контролі підтвердив, що в більшості випадків генотип мав найбільший вплив на цю ознаку. Для оцінки ефектів генів у дослідженні були використані батьки, F1, F2, ВС1 і ВС2 трьох гібридних комбінацій Миронівська 61 х Roazon (1), Миронівська 33 х 80117 (2), Fakta x Co (3) (табл. 6). Аналіз за Мазером і Джинксом (1985) виявив, що ознака „частота появи ембріогенного калюса” контролюється адитивно-домінантною генетичною системою з переважанням ефектів домінування [h], які направлені на посилення регенераційної здатності. Адитивні ефекти [d] послаблюють регенераційну здатність. Протилежні знаки [h] і [l] свідчать про ослаблення домінування (дуплікативний, домінантний епістаз чи рецесивний супресор). Наявність епістазу в полігенній генетичній системі не дозволяє вичленити адитивні та домінантні ефекти з високою точністю. Відмінності між генетичними параметрами ознаки „кількість стебел на регенеруючий калюс” у різних комбінаціях може свідчити про те, що вона контролюються різними генетичними системами.

Таблиця 6

Оцінки генетичних параметрів здатності регенерації в калюсній культурі

незрілих зародків озимої пшениці

Пара-метр | Процент регенерації | Кількість рослинок на калюс

Комбінація схрещування

1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3

m | 57,40 | 58,40 | 49,10 | 4,63 | 5,36 | 5,35

d | -17,40 | -15,40 | -17,45 | -2,88 | -1,15 | 4,48

h | 25,40 | 45,80 | 13,70 | 3,24 | 0,12 | 7,98

i | -0,50 | 15,60 | 3,75 | 1,14 | -0,01 | 2,57

j | 7,60 | 1,20 | -9,10 | -0,69 | 0,62 | -0,89

l | -13,20 | -24,80 | -7,00 | -0,96 | 0,32 | -3,72

Підкреслено вірогідні (р<0,05) компоненти.

При дії КФ на калюсні культури батьківських форм і гібридів F1, F2 комбінації Са 8055 х Миронівська 61на етапі проліферації та на етапі регенерації адитивні ефекти [d] хоч і залишались від’ємними, зменшувались за абсолютною величиною (табл. 7). Домінантні ефекти [h] були додатними і зростали при збільшенні тиску добору, про що свідчить зменшення середнього значення m. Зміни величин генетичних ефектів при дії селективного фактора можуть свідчити про елімінацію з популяції генотипів з сильними від’ємними адитивними ефектами.

Таблиця 7

Параметри простої адитивно-домінантної моделі здатності до регенерації

в калюсній культурі незрілих зародків озимої пшениці

Варіант | Параметр

m | [d] | [h] | c2

Контроль | 70,8±1,3 | -14,3±0,3 | 3,0±1,4 | 2,45

Дія КФ на етапі регенерації | 23,8±1,3 | -9,1±0,5 | 5,9±1,5 | 58,8

Дія КФ на етапі проліферації | 11,3±1,2 | -4,1±0,4 | 6,4±1,7 | 20,7

Успадкування стійкості до патогенів клітинних ліній, відібраних іn vіtro. Оцінка R1 на рівні проростків виявила підвищену стійкість до КФ. Трирічна польова перевірка наступних поколінь показала, що найбільш стійкими, порівняно з вихідними генотипами, виявились 3 лінії, які були схрещені зі сприйнятливим сортом Донська напівкарликова. Розподіли отриманих нащадків за стійкістю до КФ на рівні проростків виявили проміжний характер успадкування стійкості і можливий полігенний контроль, тому для аналізу використовували методи кількісної генетики.

Для аналізу стійкості варіантної лінії LF-48-08 її було схрещено з нестійким сортом Миронівська 33 та вихідним сортом 80117. Для порівняння використано комбінацію 80117 х Миро-нівська . Оцінка типів ефектів генів виявила (табл. 8), що умови практично не впливали на значення m та [d], однак суттєво впливали на значення [h]. Від’ємні значення параметрів [d] та [h] свідчать про наявність генів стійкості. Епістатичні взаємодії не проявились у двох перших комбінаціях, а в комбінації LF 48-08 х 80117 вірогідними були епістатичні ефекти: типу [і], направлені на зменшення розвитку хвороби, та типу [l] — на її збільшення. Знаки оцінок ефектів [h] та [l] різні, тобто є переважання комплементарної дії генів, направленої на послаблення домінування (дуплікативний, домінантний епістаз чи рецесивний супресор). Це може свідчити про неалельність генів вихідного сорту і селектованої іn vіtro лінії. Кількість ефективних факторів для випадку проміжної чи адитивної дії генів (К1) була біля 4, для випадку домінантності (К2) в 1997 р. біля 12, а в 1999 р., коли домінантна компонента була більш суттєвою, – біля 6.

Таблиця 8

Оцінки ефектів генів та генетичні параметри, що характеризують успадкування

стійкості генотипів пшениці до фузаріозу колоса

Комбінація | Рік | m | [d] | [h] | K1 | K2

LF 48-08 x Mиронівська 33 | 1997 | 23,7±3,4 | -19,26±2,3 | -3,9±1,9 | 4 | 12

1999 | 25,56±3,6 | -16,8±2,2 | -11,9±2,3 | 4 | 6

80117 x Mиронівська 33 | 1996 | 28,4±3,4 | -14,2±2,3 | -5,5±1,9 | 3 | 7

LF 48-08 x 80117 | 1998 | 20,4±1,9 | -4,7±2,4 | -11,8±2,0 | 1 | 6

[i]= -7,2±2,4 | [l]=9,5±1,8

Аналіз стійкості нащадків регенерантів реципрокних гібридних комбінацій Са 8055 х Миронівська 61, отриманих на селективних середовищах, показав у більшості випадків перевищення відповідних значень у контролі. Оцінка значень генетичних ефектів виявила (табл. 9), що значення компонентів [d] та [h] від’ємні, тобто адитивна дія генів і домінантні ефекти зменшують розвиток хвороби. Значення компонентів [d] із зростанням тиску добору змен-шується, а значення [h] зростає, що опосередковано свід-чить про накопичення в популяції більш стійких генотипів.

Таблиця 9

Параметри простої адитивно-домінантної моделі розвитку хвороби в нащадках

регенерантів гібридної комбінації Са 8055 х Миронівська 61

Варіант | Параметр | c2

m | [d] | [h]

Контроль | 41,58±1,20 | -26,63±0,63 | -9,24±1,32 | 60,56

КФ на етапі регенерації | 40,28±0,68 | -26,48±0,27 | -18,56±0,74 | 247,11

КФ на етапі проліферації | 34,63±1,07 | -17,87±0,56 | -28,03±1,51 | 961,25

При штучному зараженні на-щадків гібридних комбінацій, які пройшли цикл клітинного добору, виявлено, що ступінь їх ураженості був істотно нижчим. Крім того, нако-пичення на штучному інфекційному фоні основних контамінантів фузаріозу – дезоксиніваленолу та зеа-ра-ленону – у відібраних нащадків також було меншим. Коефіцієнт кореляції (r=0,64) між накопиченням токсинів у зерні та польовою оцінкою був вірогідний (p<0,05).

УСПАДКУВАННЯ ДЕЯКИХ КОМПОНЕНТІВ СТІЙКОСТІ ДО ФУЗАРІОЗУ КОЛОСА У ЛІНІЙ ПШЕНИЦІ, ВІДІБРАНИХ ІN VІTRO Успадкування стійкості до патогенів в клітинних лініях, відібраних на селективному фоні in vitro

Для виявлення найбільш суттєвих компонентів стійкості і встанов-лення характеру їх успадкування було проведено генетичний аналіз за половинною діалельною схемою. На штучному інфекційному фоні аналізували частку зерен з внутрішньою інфекцією, площу під кривою розвитку хвороби, накопичення ДОН та ЗЕА. Віді-брані in vitro лінії переважали вихідні сорти за всіма компонентами (табл. 10).

Таблиця 10

Компоненти стійкості до фузаріозу колоса батьківських компонентів половинної діалельної схеми

Генотип | Площа під кривою розвитку хвороби | Частка уражених зерен, % | Накопичення ДОН, мг/кг | Накопичення ЗЕА, мг/кг

Ефекти ЗКЗ | Варіанса СКЗ | Середні значення | Ефекти ЗКЗ | Варіанса СКЗ | Середні значення | Ефекти ЗКЗ | Варіанса СКЗ | Середні значення | Ефекти ЗКЗ | Варіанса СКЗ | Середні значення

Миронівська 61 | 3,3 | 18,3 | 72,6 | 6,9 | 13,4 | 36,7 | 1,6 | 18,0 | 37,2 | 0,31 | 0,28 | 2,46

Са 8055 | 2,8 | 14,6 | 61,8 | -0,5 | 13,1 | 24,5 | 2,7 | 7,2 | 32,0 | 0,21 | 0,15 | 2,15

80117 | -1,9 | 6,4 | 63,1 | 3,2 | 35,4 | 20,7 | -0,2 | 0,6 | 24,6 | -0,24 | 0,02 | 1,13

LF 04-11 | -0,9 | 8,8 | 49,3 | -2,1 | 10,5 | 21,7 | 0,6 | 6,1 | 28,7 | -0,20 | 0,26 | 1,23

LF 18-12 | -0,8 | 11,2 | 55,4 | -4,4 | 10,5 | 23,9 | -1,2 | 7,6 | 24,6 | 0,02 | 0,05 | 1,47

LF 48-08 | -1,8 | 15,0 | 38,3 | -4,4 | 14,7 | 18,7 | -3,1 | 9,6 | 20,5 | -0,12 | 0,20 | 1,85

НІР05   | 5,2   | 9,8   | 3,8   | 0,18

Розвиток хвороби контролюється адитивно-домінантною генетичною системою з переважанням ефектів домінування, розмір частки зерен з внутрішньою інфекцією – генетичною системою з переважанням адитивних ефектів і неповного домінування, в накопиченні ДОН переважають адитивні генетичні ефекти, в накопи-ченні ЗЕА – ефекти комплементарного епістазу. У лінії LF 04-11 (з сорту Са 8055) та LF 18-12 (з сорту 80117) порівняно з вихідними сортами зросли компоненти стійкості, по-в’язані зі стійкістю типу 1 (уникнення первинного проникнення патогена), типу 2 (ін-гібування гіфального росту та синтезу тріхотеценів) та типу