НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Верьовка Сергій Вікторович

УДК 577.152.34; 616.831:616.98

СТРУКТУРНІ ОСНОВИ МІЖМОЛЕКУЛЯРНОГО РОЗПІЗНАВАННЯ ТА КОМПЛЕКСОУТВОРЕННЯ СЕРИНОВИХ ПРОТЕЇНАЗ

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Радавський Юрій Леонідович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури та функції білків і пептидів

доктор біологічних наук, членкор НАН України, професор

Корнелюк Олександр Іванович

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу білкової інженерії

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Лісняк Іван Олексійович

Інститут експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,

провідний науковий співробітник відділу фотобіології і

фотомодуляції пухлин

Провідна установа Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського

НАН України, відділ медичної хімії.

Захист відбудеться 29 вересня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 29 серпня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження структурних засад міжмолекулярної взаємодії функціонально комплементарних білків становить необхідну передумову для розуміння перебігу опосередкованих цими взаємодіями фізіологічних та патогенних процесів. Встановлення будови окремих ділянок міжмолекулярної взаємодії, їх лігандної специфічності, локалізації в молекулі білка та функціональної ролі дає змогу наблизитись до розуміння процесів міжмолекулярного розпізнавання та комплексоутворення, створює вагомі передумови для моделювання відповідних структур з метою створення хімічних сполук, придатних не лише для препаративних цілей, але й для цілеспрямованого втручання в опосередковані відповідними взаємодіями процеси. Внаслідок великої функціональної ролі серинових протеїназ дослідження молекулярних механізмів регуляції їх дії займає одне з чільних місць серед досліджень цього напряму.

Серинові протеїнази складають велику групу ферментів, що відіграють провідну роль у регуляції численних фізіологічних та патогенних процесів. За єдиної для всього класу будови каталітичного центру ферменти цієї групи відрізняються між собою за специфічністю, тобто направленістю дії, котра зумовлює виконання кожним конкретним ферментом його фізіологічних функцій. В структурному забезпеченні регуляції дії серинових протеїназ чільну роль відіграють ділянки міжмолекулярної взаємодії, тобто розміщені на поверхні білкової молекули структурні групи, що забезпечують високоспецифічну взаємодію ферменту з функціонально комплементарними білками. Всебічне дослідження подібних ділянок не лише дає змогу зрозуміти перебіг опосередкованих протеолізом процесів, їх впливу на ті чи інші стадії каталітичного акту, може бути використано для розробки нових препаративних методів отримання ферментів цієї групи з нових, малоосвоєних, але потенційно багатих, джерел сировини. Водночас встановлення будови структур, що забезпечують ефективну взаємодію з сериновими протеїназами може бути використане для створення відповідних хімічних моделей з метою обмеження надмірного протеолізу в білкових препаратах та ефективного впливу на перебіг опосередкованих надмірною протеолітичною активністю патологій. Поглиблення знань у галузі молекулярних засад регуляції дії серинових протеїназ є також необхідною умовою для з’ясування цілої низки аномалій, пов’язаних з проявом дії ферментів за умов in vitro, пояснити розбіжності між дією медичних препаратів на основі ферментів цієї групи та традиційними уявленнями щодо їх будови та механізму дії.

В той же час дослідження структурних основ міжмолекулярного розпізнавання та комплексоутворення серинових протеїназ дозволяє зробити широкі узагальнення стосовно молекулярних механізмів міжбілкової взаємодії вцілому, дає змогу відійти від однієї лише констатації тих чи інших незрозумілих аномалій, наблизитись до розуміння молекулярних механізмів опосередкованих міжбілковим комплексоутворенням фізіологічних та патогенних процесів, пояснити окремі моменти перебігу патологій, пов’язаних з порушенням нативного процесингу білка та дає змогу обгрунтувати методичні підходи до виявлення, виділення або вилучення білків з відповідними поверхневими групами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках бюджетних наукових тематик та госпрозрахункових тем відділів хімії і біохімії ферментів та структури і функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України: тема 17-11 Д „Синтез аффинных сорбентов и разработка способа выделения при помощи их трипсина, химотрипсина и высокоочищенной смеси трипсина и химотрипсина из пилорических придатков рыб” (Постанова ДКНТ України № 5 від 28.02.92); „Вивчення механізмів регуляції фібринолітичного процесу на етапі утворення фрагментів молекул і їх комплексів” (№ д/р 01930012959); „Вивчення молекулярних механізмів регуляції активації проферментів систем зсідання крові та фібринолізу в нормі та при патології” (№ д/р 0101U000103); № 2 „Вивчення молекулярних механізмів регуляції взаємодії компонентів зсідання крові та фібринолізу з судинно-тромбоцитарною ланкою системи гемостазу” (№ д/р 0104U003276). Вивчення молекулярних механізмів спонгіформних енцефалопатій виконувалось згідно рішення Ученої ради Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України № 1 від 21 січня 1998 року.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення локалізації, лігандної специфічності та функціональної ролі некаталітичних ділянок міжмолекулярної взаємодії серинових протеїназ хімотрипсин-трипсинового типу та ролі подібного роду взаємодій у регуляції міжбілкового розпізнавання та комплексоутворення вцілому.

У процесі виконання роботи вирішувались наступні завдання:

1. Розробка методів первинної очистки протеолітичного комплексу з пілоричних додатків лососевих на основі низькоселективних афінних сорбентів.

2. Створення нерозчинних інігбіторів серинових протеїназ та попередня оцінка їх придатності для пригнічення автолітичних процесів в гетерогенних білкових системах.

3. Синтез групи афінних сорбентів з низькомолекулярними лігандами та порівняння їх хімотрипсин-трипсинової селективності з визначенням придатності для препаративного виділення серинових протеїназ;

4. Розробка принципів методу фермент-фіксованого зонду з метою дослідження локалізації додаткових ділянок міжмолекулярної взаємодії активного центра серинових протеїназ.

5. Дослідження лігандної специфічності, локалізації та функціональної ролі виявленої ділянки.

6. Дослідження можливостей практичного використання отриманих протягом виконання роботи даних з метою створення нових підходів до цілеспрямованого втручання в опосередковані сериновими протеїназами фізіологічні та патогенні процеси.

7. З’ясування ступеню подібності встановлених протягом виконання роботи принципів міжмолекулярного розпізнавання до різного типу міжбілкових взаємодій та зумовлених ними фізіологічними та патогенними процесами.

Об’єкт дослідження – серинові протеїнази та опосередковані ними фізіологічні та патологічні процеси.

Предмет дослідження - молекулярні механізми міжбілкового розпізнавання та комплексоутворення.

Методи дослідження – хімічний синтез афінних сорбентів, субстратів, ефекторів та інгібіторів ферментів, афінна хроматографія серинових протеїназ, методи визначення ферментативної активності та зумовлених досліджуваними сполуками фізіологічних ефектів.

Наукова новизна отриманих результатів. Внаслідок проведених досліджень отримано нові фундаментальні дані щодо специфічності, локалізації та функціональної ролі некаталітичних ділянок міжмолекулярної взаємодії серинових протеїназ. Вперше локалізовано місцезнаходження ефекторної ділянки, доведено її відповідність S2'-ділянці активного центру за номенклатурою Шехтера-Бергера (Schechter I., Berger A., 1968), визначено її функціональну роль в опосередкованих протеолізом фізіологічних та патогенних процесах, а також в окремих аномальних проявах ферментативної активності. Вперше обгрунтовано та доведено принцип синхронної взаємодії зв’язуючої та ефекторної ділянок активного центру ферменту з комплементарним угрупуванням білка-цілі – парою експонованих в належній конформації та відповідних за лігандною специфічністю амінокислотних залишків - як необхідної умови підвищеної спорідненості активного центру ферменту до функціонально обумовлених пептидних зв’язків. Вперше обгрунтовано принцип структурної подоби реактивних центрів білкових інгібіторів серинових протеїназ та ділянок активаційного розщеплення проформ білків як структурної передумови виконання цими білками своїх фізіологічних функцій. Тим самим створено теоретичні підходи до цілеспрямованого втручання в обумовлені сериновими протеїназами фізіологічні та патогенні процеси. Отримані дані та порівняння структурних аспектів окремих патогенних процесів дали змогу обгрунтувати молекулярний механізм спонгіформних енцефалопатій як самопідтримуючого та прогресуючого циклу порушень відомих клітинних процесів, зумовленого порушенням клітинного фолдингу новосинтезованого білка та структурування останнього у взаємодії з ліпідним бішаром клітинних мембран. Пояснено основні особливості безнуклеїнового переносу інфекції, патогенної дії пріонового білка та ряду особливостей перебігу спонгіформних енцефалопатій. Вперше поставлено питання про належність пріон-зумовленого патогенезу до великої групи захворювань, спричинених порушенням клітинного фолдингу білка.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані створюють необхідні передумови для розробки афінно-хроматографічних технологій отримання ферментів на основі сорбентів з наперед заданими зв’язуючими властивостями. Синтезовано групу афінних сорбентів та досліджено їх придатність для препаративного виділення серинових протеїназ чи інгібування останніх в гетерогенних білкових сумішах. Розроблений метод білок-фіксованого зонду створює нові підходи до дослідження та моделювання міжбілкових взаємодій найрізноманітніших типів. Дані щодо локалізації, лігандної специфічності та функціональної ролі ефекторної ділянки серинових протеїназ дозволили пояснити окремі аномалії в перебігу опосередкованих цими ферментами процесів, зокрема - обмеженість терапевтичної дії білкових інгібіторів та молекулярні механізми дії препаратів на основі автолітично деградованих серинових протеїназ. Обгрунтовано структурні вимоги, синтезовано та досліджено антиметастатичну дію принципово нового - полімерного - інгібітору серинових протеїназ. Запропоновано кілька підходів до зумовлених пріоновою проблемою практичних задач, зокрема - методів гарантованого очищення білкових препаратів від домішки патогенної форми пріонового білка.

Особистий внесок здобувача. Всі застосовані в дослідженні афінні сорбенти, субстрати, ефектори та інгібітори синтезовані автором особисто. Більшість афінно-хроматографічних досліджень проведено за його безпосередньої участі у співпраці з к.б.н. Колодзейською М.В. Аналіз літературних даних щодо можливої локалізації додаткової ділянки міжмолекулярної взаємодії серинових протеїназ, обгрунтування методу фермент-фіксованого зонду, формулювання структурних вимог до ефекторів, синтез та визначення їх впливу на каталітичні властивості ферментів виконано автором особисто. Спектрофлуориметриче дослідження взаємодії отриманого ефектора – 1,5-дибензиламіно-пентана з б-хімотрипсином проведено співробітником відділу біофізики мембран Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Ситником О.І. Формулювання структурних вимог до полімерного інгібітору серинових протеїназ та його синтез виконано автором особисто, комплексне дослідження створеного препарату проведено у співпраці зі співробітниками Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України Петіком А.В. та Пясковською О.М. Порівняльне дослідження спорідненості трипсину до різних типів субстратів та інгібіторів проведено за співучасті співробітників лабораторії білкових технологій Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Петіком А.В. та Андріановим С.І. Основні теоретичні положення, що виносяться на захист, висунуто та обгрунтовано автором особисто.

Апробація роботи. Основні положення роботи викладено та обговорено на Всесоюзній конференції "Методи отримання, аналізу та застосування ферментів" (Юрмала, 1990), Всесоюзній нараді "Біологічно активні речовини гідробіонтів - нові лікарсько-профілактичні та технічні препарати" (Владивосток, 1991), VI Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992), 2-ій конференції з молекулярного розпізнавання (Печ, Угорщина, 1996), 3-ій конференції біохіміків Узбекістона (Ташкент, Узбекістон, 1996), 17-му Міжнародному конгресі з біохімії та молекулярної біології (Сан-Франціско, США, 1997), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), Міжнародному з’їзді Interhospital 98 - 21 Deutscher Krankenhaustag (Ганновер, Німеччина, 1998), II-му з’їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000), 3-ій Міжнародній конференції з міжмолекулярного розпізнавання (Печ, Угорщина, 2000), VIII-му Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), XVIII науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, 2003).

Публікації. Основний зміст роботи викладено в 52 наукових працях, з них у 22 статтях в наукових фахових журналах, 3 авторські свідоцтва СРСР, 9 патентів України, 1 навчальний збірник (у співавторстві), та в тезах доповідей на 15 вітчизняних та міжнародних з’їздах та конференцій.

Структура і об’єм роботи. Дисертація викладена на 267 сторінках і складається із вступу, основної частини, яка містить огляд даних літератури, 5 розділів власних досліджень, заключення, висновків та списку використаних літературних джерел (599 посилань). Матеріал ілюстровано 11 таблицями та 24 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

огляді літератури проаналізовано дані щодо будови серинових протеїназ, молекулярних механізмів їх регуляції, специфічності дії та джерел отримання. Наведено дані щодо ділянок міжмолекулярної взаємодії серинових протеїназ - гідролітичного центру, ділянок зв’язування та регуляторної (ефекторної) ділянки. Узагальнено дані щодо методів отримання серинових протеїназ хімотрипсин-трипсинової специфічності, їх участі в численних фізіологічних та патогенних процесах. Окрему увагу приділено власним науковим здобуткам автора щодо лігандної специфічності, локалізації та функціональної ролі ділянок міжмолекулярної взаємодії плазміногену людини, їх ролі в регуляції фібринолітичного процесу. Наведено дані про подальший розвиток наукових здобутків кандидатської дисертації автора (Веревка С.В., 1988) щодо ролі ділянок кринглових структур в регуляції фібринолізу.

Методи експериментальних досліджень

Отримання та характеристику препаратів протеолітичного комплексу з пілоричних додатків лососевих риб провадили за методикою, розробленою у відділі хімії і біохімії ферментів Інституту біохімії НАН України (Аюшин Н.Б., 1986).

Вміст білка в досліджуваних препаратах визначали за методом Лоурі (Lowry O., Rosenbrough N., 1951).

Визначення трипсин- та хімотрипсин-подібних активностей проводили спектрофотометрично з використанням для визначення трипсину метилового чи етилового ефірів N-бензоїл-L-аргініну, для хімотрипсину - відповідних ефірів N-бензоїл-L-тирозину (Schwert G., Takenaka Y., 1955).

Приготування лігнін-вміщуючих сорбентів та дослідження їх придатності для афінної очистки протеолітичних ферментів з пілоричних додатків лососевих проводили на подрібнених та підданих обмеженому кислотному гідролізу зразках різних порід деревени.

Синтез нерозчинного інгібітора серинових протеїназ на основі полівінільного волокна провадили активацією полівінільного волокна в 25% розчині глутарового альдегіду з подальшою іммобілізацією окремих амінокислот та їх комбінацій.

Вміст імобілізованих амінокислот визначали аналізом солянокислого гідролізату висушених наважок зразків на автоматичному аналізаторі амінокислот ААА-881 (Чехословаччина).

Дослідження інгібіторної дії отриманих композицій проводили за допомогою розчину протеолітичного комплексу з пілоричних додатків лососевих з визначенням вмісту білка та хімотрипсин- і трипсин-подібної активності.

Пригнічення автолітичної деградації гетерогенних білкових систем досліджували на прикладі гомогенату оселедців івасі з визначенням за методом Лоурі збільшення кількості розчинного білка порівняно до контролю протягом двохмісячної інкубації при 5оС.

Синтез афінного сорбента для виділення трипсин-подібних протеїназ проводився за методом (Kumazaki T. et al., 1976) і складався з синтезу ліганду - гліцил-гліцил-L-аргініну - та його іммобілізації на активованій бромціаном агарозі.

Умови афінно-хроматографічного виділення трипсину на колонці з отриманим сорбентом було підібрано відповідно до поставленої задачі та попередньо отриманих даних щодо комплексу гідролітичних та сорбційних властивостей трипсин-подібних протеїназ рибного походження (Пивненко Т.Н., 1986).

Синтез групи афінних сорбентів з лігандами гідрофобної природи проводили з використанням спейсер-вміщуючої нерозчинної матриці - аміногексил-агароза - отриманої іммобілізацією 1,6-діаміногексану на BrCN-активованій агарозі (Cuatrecasas P., 1970).

Вміст вільних аміногруп визначали спектрофотометрично з використанням 2,4,6-тринітробензол-1-сульфокислоти (Satake K., et al., 1960).

N-бензоїльні, N-тозильні, N-трет-бутилоксикарбонільні та N-карбобензокси-похідні відповідних амінокислот синтезували за відомими методиками з подальшою активацією отриманих похідних хлористим тіонілом та іммобілізацією на аміногексил-агарозі.

Вміст іммобілізованих амінокислот визначали аналізом солянокислого гідролізату наважки сорбенту і відповідав кількості вільних аміногруп на вихідній матриці.

Використані в роботі субстрати та ефектори синтезували згідно до описаних в літературі методик. Ефіри N-бензоїл-L-тирозину отримували етерифікацією N-бензоїл-L-тирозину в насиченому сухим хлористим воднем в метиловому чи етиловому спирті (Kaufman S., 1949). Для визначення трипсин-подібної активності використовувались відповідні ефіри N-бензоїл-L-аргініну фірми "Reanal" (Угорщина). N-глутарил-L-фенілаланіл-пара-нітроанілід (GPNA) синтезували взаємодією гідрохлориду L-фенілаланіл-хлориду з п-нітроаніліном з подальшою обробкою глутаровим ангідридом (Erlanger B., et al., 1966). Гідрохлорид L-фенілаланіл-хлориду отримували взаємодією L-фенілаланіну з п'ятихлористим фосфором (Blackwood et al., 1965). Пара-нітрофеніл-ацетат (AcONP) синтезували ацилюванням п-нітрофенолу оцтовим ангідридом (Huggins C, Lapides J., 1947). N_карбобензокси-1-аміно-5-феніл-пентан отримано карбобензоксилюванням -феніл-н-аміламіну (Merck E., 1911). N-бензоїл-5-аміно-1-феніл-пентан отримували за Фріделем-Крафтсом взаємодією N-бензоїл--хлораміламіну з бензолом (Merck E., 1911). N,N'-ди-карбобензокси-1,3-діаміно-пропан синтезували карбобензокси-люванням 1,3-діамінопропану в лужному середовищі (Гринштейн Дж., Виниц М., 1965). 1,5-дибензиламіно-пентан синтезували сполученням 1,5-діамінопентану з бензальдегідом з подальшим відновленням утвореного бензилідену боргідридом натрію (Lerman L., 1953). 1,2,3-три--фенілетиламіно-пропан синтезували взаємодією -феніл-етиламіну з 1,2,3-трибром-пропаном в етанольному розчині протягом 18 годин при 1050С з подальшою трикратною перекристалізацією отриманого тригідроброміду. -феніл-етиламін отримано відновленням бензилціаніду алюмогідридом літію (Беккер Г. та інші, 1979). Чистоту та склад застосованих субстратів та ефекторів контролювали методами тонкошарової хроматографії, елементного аналізу та за відповідністю фізичних характеристик до літературних даних.

Порівняльне розділення хімотрипсин-трипсин-подібних протеїназ на групі сорбентів з лігандами гідрофобної природи проводили за стандартною методикою, розробленою з урахуванням раніше отриманих даних про властивості досліджуваного протеолітичного комплексу (Півненко Т. та інші, 1989) та виходячи з ємністних характеристик раніше досліджуваних сорбентів (Аюшин Н.Б., 1986). На колонку, заповнену досліджуваним сорбентом, наносили розчин ліофільно висушеного екстракту пілоричних додатків лососевих в 0.05 М фосфатному буфері рН 7.7. Всі хроматографічні операції проводили за температури 40С. Несорбований матеріал змивали 0.05 М фосфатним буфером рН 7.7, а потім - 0.04 М натрій-ацетатним буфером рН 5.3. Десорбцію специфічно зв'язаного білка проводили 0.001 М НCl з негайним доведенням рН елюату до 7.8.

Вплив концентрації досліджуваних ефекторів на естеразну та амідолітичну активності проводили спектрофотометрично з застосуванням в якості субстратів метилового ефіру N-бензоїл-L-тирозину та пара-нітроаніліду N-глутарил-L-фенілалану (Schwert G., Takenaka Y., 1955 та Erlanger B. et al., 1966, відповідно). В усіх дослідах застосовано кристалічний -хімотрипсин марки "А" Олайнського заводу хімреактивів (Латвія). Протеолітичну активність визначали спектрофотометрично за поглинанням при 280 нм з вкористанням в якості субстрату 2%-ного розчину кристалічного альбуміну людини ("Reanal", Угорщина) та осадженням негідролізованого білка 10%-ною трихлороцтовою кислотою.

Визначення впливу концентрації 1,5-дибензиламіно-пентану на кінетичні параметри опосередкованого -хімотрипсином каталітичного процесу проводили з використанням в якості субстратів N-глутарил-L-фенілаланіл-пара-нітроаніліду (Erlanger B. et al., 1966) та пара-нітрофеніл-ацетату (Клесов A. та інші, 1974).

Константу дисоціації взаємодії -хімотрипсину з 1,5-дибензиламіно-пентаном визначали методом флуоресцентної спектроскопії з підрахуванням результатів за Скетчардом (Chumachenko Y. et al., 1990, Scatchard G., 1949).

Отримання синтетичного полімерного інгібітора серинових протеїназ включало синтез відповідного полімеру, зв'язування ним низькомолекулярного інгібітора серинових протеїназ та подальше дослідження комплексу властивостей отриманого кон'югату.

Співполімер малеїнового ангідриду з N-вініл-пірролідоном отримували за описаним в літературі методом з оптимізацією режиму реакції по відношенню до кількісного виходу співполімеру, молекулярної ваги та співвіднесення мономерних компонентів. Вміст ангідридних груп визначали, розчиняючи наважку співполімера у надлишковій аліквоті титрованого лугу з наступним титруванням 0.1 н соляною кислотою. В залежності від партії отриманого співполімера, співвідношення малеїновий ангідрид:N-вініл-пірролідон коливалось у межах 1:2-1:3. Середньостатистична молекулярна вага співполімера визначалась методом ультрацентрифугування (Самойлова Н.А., 1981).

Кон’югацію отриманого співполімеру з низькомолекулярним інігібтором – складноефірним похідним L-лізину – проводили у дві стадії – кон’югацією L-лізину з співполімером та подальшою етерифікацією вільних карбоксильних груп. У розчин 14.5 г (0.08 М) L-лізин гідрохлориду в 300 мл 0.25 М розчину бікарбонату натрію, рН 8.5, за інтенсивного перемішування з п'ятихвилинними інтервалами додавали двограмовими порціями 25 г лінійного співполімера, утримуючи рН розчину 8.0-8.5 за допомогою 0.5 н розчину NaOH. Після розчинення останньої порції продовжували перемішування протягом трьох годин, після чого розчин піддавали ультрафільтраційному концентруванню і відділенню надлишка вільного лізину та низькомолекулярних складових на мембрані з пропускною границею меншою за 5 кДа (“Владипор”, Росія) з послідовним використанням 0.5 М розчину NaCl, 0.3 М розчину оцтової кислоти та води. Отриманий концентрат високомолекулярної фракції піддавали ліофільній сушці. Кількісний вихід лізин-вміщуючого полімеру складав 14-18 г. Вміст кон’югованого лізину визначали за даними амінокислотного аналізу гідролізату, отриманого 12-годинним гідролізом наважки в 6 н соляній кислоті. Показано, що за даних умов не менше 95% ангідридних груп зв'язують лізин, а частка спонтанно гідролізованих груп коливається в межах 2-5%. Етерифікацію карбоксильних груп кон’югованого лізину проводили за стандартною методикою етерифікації амінокислот розчином хлористого водню у відповідному абсолютному спирті або розчині відповідного спирту в діоксані (Гринштейн Д., 1969).

Антифібринолітичну дію препарату оцінювали за часом лізису фібринового згустку (Muramoto M., 1965).

Оцінку гострої токсичності отриманого препарату проводили відповідно до держстандарту 12.1.007-76. Розрахунок значень токсичності проводили з використанням методу Лінгфільда-Уїлкінсона (Беленький М.Д., 1963).

Оцінку антиангіогенної дії отриманого препарату проводили на моделі індукованого ангіогенезу в хоріоналантоїсній мембрані курячих ембріонів (Ausprunk D.H., Folkman J., 1977).

Антиметастатичну та протипухлинну дію препарату досліджували на моделі карциноми Л’юїс за впливом на ріст та метастазування (Dumont P., et al., 1983). Мишам лінії C57Bl/6 з перевитою карциномою Л’юїс внутрівенно вводили препарат у дозі 125 мг/кг з інтервалом 48 годин 10 разів, починаючи із сьомої доби після перевивки.

Встановлення діючої складової препарату „Фібринолізин” проводили з визначенням вмісту білка в препаратах за Лоурі, гель-фільтрацією, ДСН-електрофорезом в поліакриламідному гелі (Weber K., Osborn M., 1969) з використанням трис-боратної системи (Cummins P., Perry S., 1973).

Протеолітичну активність визначали за гідролізом казеїну, амідолітичну – за гідролізом пара-нітроаніліду N-бензоїл-L-аргініну.

Гель-фільтраційне знесолення більших кількостей фібринолізину проводили на сефадексі G-25 проти 0.05 М натрій-фосфатного буфера рН 8.0.

L-лізин-вміщуючий афінний сорбент для перевірки наявності в складі досліджуваних препаратів білків з лізин-зв'язуючими ділянками отримували іммобілізацією L-лізину за б-аміногрупу на BrCN-активованій агарозі-4В (March S., 1974).

Дослідження афінно-зв'язуючих властивостей білкових препаратів на колонці з L-лізин-агарозою проводили за стандартною методикою з нанесенням білка в 0.05 М натрій-фосфатному буфері рН 7.4 та наступною елюцією 0.2 М розчином 6-аміногексанової кислоти.

Залежність інгібіторної дії соєвого інгібітора трипсину від структури розщеплюваних трипсином субстратів субстратів визначали за стандартними методиками з використанням традиційних для трипсину субстратів - пара-нітроаніліду N-бензоїл-L-аргініну, казеїну, протаміну (Weremeenko K.N., Belitzer W.A., 1963) та плазміногену людини, тобто білка, що має ділянку активаційного розщеплення. Гідроліз останнього субстрату визначали за гель-електрофорезом відновленого меркаптоетанолом препарату проактивованого трипсином плазміну.

Дослідження залежності афінно-зв'язуючих властивостей синтетичних сорбентів від структури іммобілізованого ліганду

Досліджено ступінь очищення протеолітичного комплексу з пілоричних додатків лососевих на лігнін-вміщуючих афінних сорбентах. В досліджуваній групі сорбентів найкращі результати досягнуто на сорбенті на основі підданої обмеженому гідролізу тирси сосни. Питома активність ферментного препарату зросла порівняно до вихідної в 2.8 разів для трипсинової та в 3.7 разів для хімотрипсинової за 85 та 64 % виходу від загальної, відповідно. Сорбційна ємність коливалась в межах 5-5.2 мг на г сухого сорбента. Показано істотну перевагу колоночного методу очищення над статичним. Враховуючи дешевизну та простоту одержання сорбентів на основі частково гідролізованої тирси, отримані дані дають змогу стверджувати про придатність лігнін-вміщуючих структур до попереднього афінно-хроматографічного очищення протеолітичного комплексу з пілоричних додатків лососевих чи подібної до них дешевої фермент-вміщуючої сировини.

Досліджено пригнічення хімотрипсинової та трипсинової активностей в екстракті протеолітичного комплексу з пілоричних додатків лососевих нерозчинним інігбітором на основі активованого глутаровим альдегідом полівінільного волокна. Отримані дані свідчать про істотну залежність інгібіторних властивостей від складу амінокислотних композицій досліджуваних зразків та можливість досягнення повного інгібування ферментного комплексу. Дані щодо вивільнення розчинного білка протягом двохмісячної інкубації гомогенату оселедців івасі за відсутності та в присутності нерозчинних інгібіторів свідчать про істотне пригнічення автолітичних процесів, що за певних амінокислотних композицій можуть бути зменшені до 29 % порівняно до контролю. Тим самим доведено можливість створення ефективного, недорогого та нетоксичного інгібітора серинових протеїназ, придатного для ефективного пригнічення протеолізу в гетерогенних середовищах, зокрема - з метою гальмування небажаних автолітичних процесів.

Досліджено придатність афінних сорбентів з імобілізованим за аміногрупу трипептидом гліцил-гліцил-L-аргініном для селективного виділення трипсин-подібних протеїназ з протеолітичного комплексу пілоричних додатків лососевих риб. Досягнуто 19.5-кратне збільшення питомої трипсинової активності за повного збереження загальної. Подібні дані, за відсутності в очищеному препараті хімотрипсинової активності, можуть бути визнані за успішні та перспективні з точки зору розробки афінно-хроматографічного методу отримання високоочищеного трипсину з відходів переробки рибної сировини.

Таблиця 1А

Залежність афінно-хроматографічних властивостей досліджуваних сорбентів від структури імобілізованих синтетичних лігандів (ряд за сорбцією хімотрипсин-подібної активності)

№

п/п |

Ліганд | Десорбовано

білка,

мг | Активність десорбованого білка за гідролізом БТМЕ

Питома,

од/мг | Збільшення

питомої

активності, разів | Загальна,

% від

нанесеної

1 | 2-тозиламіно-

-3-нафтойна кислота | 0.88 | 5996 | 22.8 | 91

2 | N-карбобензокси-D,L-

-фенілаланін | 0.92 | 5523 | 21.0 | 88

3 | о-тозиламіно-бензойна кислота | 1.00 | 5023 | 19.1 | 87

4 | N-бутилоксикарбоніл-

-L-лейцин | 0.97 | 4813 | 18.3 | 81

5 | м-тозиламіно-бензойна кислота | 1.10 | 3787 | 14.4 | 72

6 | N-тозил-L-лейцин | 1.42 | 2814 | 10.7 | 69

7 | п-тозиламіно-бензойна

кислота | 1.47 | 2630 | 10.0 | 67

8 | N-бензоїл-L-глутаміно- ва кислота | 1.39 | 2630 | 10.0 | 63

9 | N-бензоїл-L-аланін | 1.27 | 1499 | 5.7 | 33

10 | N-бензоїл-L-валін | 1.05 | 1210 | 4.6 | 22

11 | N-бензоїл-L-

-аспарагінова кислота | 1.06 | 710 | 2.7 | 13

Таблиця 1Б

Залежність афінно-хроматографічних властивостей досліджуваних сорбентів від структури імобілізованих синтетичних лігандів (ряд за сорбцією хімотрипсин-подібної активності)

№

п/п |

Ліганд |

Десорбовано

білка,

мг | Активність десорбованого білка за гідролізом БАЕЕ

Питома,

од/мг | Збільшення

питомої

активності, разів | Загальна,

% від

нанесеної

1 | N-карбобензокси-D,L-

-фенілаланін | 0.92 | 955 | 4.1 | 17.1

2 | 2-тозиламіно-

-3-нафтойна кислота | 0.88 | 885 | 3.8 | 15.2

3 | N-тозил-L-лейцин | 1.42 | 839 | 3.6 | 23.2

4 | N-бутилоксикарбоніл-

-L-лейцин | 0.97 | 629 | 2.7 | 11.9

5 | о-тозиламіно-бензойна кислота | 1.00 | 559 | 2.4 | 10.9

6 | м-тозиламіно-бензойна кислота | 1.10 | 512 | 2.2 | 11.0

7 | N-бензоїл-L-глутаміно- ва кислота | 1.39 | 489 | 2.1 | 13.3

8 | N-бензоїл-L-валін | 1.05 | 466 | 2.0 | 9.5

9 | п-тозиламіно-бензойна кислота | 1.47 | 373 | 1.6 | 10.7

10 | N-бензоїл-L-аспарагіно- ва кислота | 1.06 | 303 | 1.3 | 6.3

11 | N-бензоїл-L-аланін | 1.27 | 233 | 1.0 | 5.8

Наведені в Таблицях 1А та 1Б отримані дані щодо ємностей сорбентів, кількості специфічно зв'язаного білка, його питомої та загальної трипсинової та хімотрипсинової активностей свідчать про існування залежності між структурою імобілізованого ліганду та властивостями сорбенту: за наявності в ліганді двох гідрофобних груп зростання ступеню їх стеричної доступності для контакту з білком веде до зростання загальної сорбції протеолітичної активності, що супроводжується падінням хімотрипсин-трипсинової селективності сорбенту. Відмічену залежність не можна було пояснити з точки зору відомих даних про зв'язуючі властивості та будову активного центру серинових протеїназ, що виключають можливість зв'язування більш ніж однієї гідрофобної групи. З іншого боку, аналіз літературних даних про так зване "непродуктивне зв'язування" низькомолекулярних субстратів _хімотрипсином дозволив припустити ефективне розміщення об'ємної гідрофобної структури в зоні, комплементарній "групі, що відходить" субстрату, що стосовно до наших експериментальних даних в свою чергу дозволило припустити її за найбільш вірогідне місце знаходження ділянки взаємодії з додатковою гідрофобною групою афінного ліганду.

Дослідження допоміжної ділянки б_хімотрипсину методом фермент-фіксованого зонду

Перевірка ролі зони взаємодії з "групою, що відходить" субстрату традиційними методами порівняння субстратних чи інгібіторних властивостей групи поліпептидів потребувала синтезу кількох десятків пентапептидів з варіюванням амінокислотних залишків по P1'-, P2'- та P3'-позиціях згідно номенклатури Шехтера-Бергера (рис.1).

Рис.1. Розміщення поліпептидного ланцюга в активному центрі фермента згідно номенклатури Шехтера-Бергера (Schechter I., Berger A., 1967)

За наявних умов виконання подібної роботи було практично неможливим, не кажучи вже про неоднозначність отримуваних у такий спосіб даних через можливість альтернативних зв'язувань. В той же час певна інформація щодо можливого розміщення додаткової ділянки міжмолекулярної взаємодії серинових протеїназ могла бути отримана за допомогою систематичного аналізу наявних даних про структуру реактивних центрів білкових інгібіторів серинових протеїназ, котрі за кінетичними параметрами являють собою чи не ідеальні субстрати відповідних ферментів (Laskowski M., 1981). Видова специфічність білкового інгібітора задається, хоч і не строго, природою амінокислотного залишку в P1-положенні реактивного центру, причому амінокислотна заміна в цій позиції веде до відповідної зміни специфічності інгібітора. За великої різноманітності видів білкових інгібіторів протеїназ (відомо понад двадцять відмінних між собою сімейств) конформації їх реактивних центрів практично ідентичні (Laskowski M., 1980). Будь-які фактори, що порушують цю конформацію, призводять до різкого падіння інгібіторних властивостей (Holmes W., et al., 1987, Bruch M., et al., 1988, Potempa J., et al., 1991). За утворення фермент-інгібіторного комплексу як у ферменті, так і в інгібіторі практично однакові поверхні площиною 1400 Е2 стають екранованими від молекул води, при чому на долю P3-...-P3'-ділянки реактивного центру припадає до 77% прикритої поверхні інгібітору (Janin J., Chotia C., 1976). В складі фермент-інгібіторного комплексу амінокислотні залишки у P1- та P2'-положеннях мають підвищений ступінь маскування та аномально високу кількість контактів з відповідними групами ферменту (Blow D., et al., 1972). Дані рентгеноструктурного дослідження фермент-інгібіторного комплексу дозволили припустити, що P2'-залишок інгібітору грає в процесі комплексоутворення не меншу роль, ніж залишок P1 (Sweet R., et al., 1974). P2'-положенням реактивних центрів білкових інгібіторів різних видів притаманне яскраво виражене домінування амінокислот гідрофобної природи, що неодноразово відмічалось багатьма авторами (Janin J., 1976, Carrel R., Boswell D., 1986, Seemuller U., et al., 1986 та інші). Ні для P1'-, ні для P3'-положень жодної закономірності не спостерігається. Заміна в P2'-положенні інгібітора тирозину на менш гідрофобний гістидин приводить до зменшення інгібіторних властивостей, тоді як розміщення в цьому положенні аспарагінової кислоти взагалі позбавляє білок властивостей інгібітору протеїнеаз (Laskowski M., 1981).

Наведені дані про структуру реактивних центрів білкових інгібіторів серинових протеїназ дозволили висловити припущення про ідентичність додаткової ділянки міжмолекулярної взаємодії серинових протеїназ комплементраній P2'-залишку S2'-ділянці активного центру ферменту.

Перевірку припущення про особливу роль S2'-ділянки серинових протеїназ було проведено новим, що не має аналогів, методом фермент-фіксованого зонду, що полягає у створенні передумов для вміщення в досліджувану ділянку однієї групи ліганду за рахунок гарантованого зв'язування другої групи "гідрофобною кишенею" ферменту з подальшим дослідженням впливу такого роду ефектора на каталітичні властивості ферменту. Досліджуваним ферментом було обрано -хімотрипсин через відому спорідненість його "гідрофобної кишені" до лігандів - аналогів залишків гідрофобних амінокислот. Молекула досліджуваного ефектора мусила правити за своєрідний аналог P1-...-P2'-району реактивного центру білкового інгібітора. Після цілої низки попередніх експериментів було сформульовано наступні структурні вимоги: молекула ефектора мала містити дві гідрофобні (наприклад - бензольні) групи на відстані, достатній для одночасної взаємодії як з S1-, так і з S2'-ділянками ферменту; за такого розміщення в зоні дії гідролітичного центру мав знаходитись зв'язок, нездатний до взаємодії з "гідролітичною тріадою" ферменту; молекула ефектора мала бути симетричною - для забезпечення однозначного тлумачення отримуваних результатів; спектральні характеристики досліджуваного ефектору не повинні співпадати зі значеннями, котрі вимірюються при визначенні гідролітичної активності на відповідних низькомолекулярних субстратах; ефектор мав бути достатньо розчинним у воді. Зазначеним вимогам повною мірою відповідав дигідрохлорид 1,5-дибензиламіно-пентану (рис.2Г).

Вплив цієї сполуки на гідролітичну активність -хімотрипсину якісно відрізнявся від дії низькомолекулярних конкурентних інгібіторів: замість лінійного зменшення гідролітичної дії зростання концентрації ефектору призводило до активації ферменту як по відношенню до N-глутарил-L-фенілаланіл-пара-нітроаніліду (рис.2А), так і по відношенню до білкового субстрату - альбуміну людини (рис.2Б). Визначена спектрофлуориметричним методом (Chumachenko Y. et al., 1990) та розрахована за Скетчардом (Chumachenko Y. et al., 1990, Scatchard G., 1949) константа дисоціації взаємодії -хімотрипсину з 1,5-дибензиламіно-пентаном

становила 1.60.14 мМ, що свідчило про істотно ефективніше зв'язування, ніж за взаємодії з бензолом, толуолом та аніліном (KD 25, 13 і 6.6 mM, відповідно (Wallace R., et al., 1963).

Рис.2. Реактивний центр інгібітора -хімотрипсину та його низькомолекулярні структурні аналоги: А - розміщення реактивного центру інгібітора Баумана-Бірка в активному центрі хімотрипсину (Laskowski M., 1981); Б - 1,9-дифеніл-нонан; В - N- карбобензокси-1-аміно-5-феніл-пентан;

Г - 1,5-дибензиламіно-пентан; Д - 1,2,3-три--фенілетиламіно-пропан

Рис.3. Залежність гідролітичної активності -хімотрипсину від концентрації досліджуваних гідрофобних ефекторів. Субстрати: А - N-глутарил-L-фенілаланіл-пара-нітроанілід (GPNA); Б - альбумін. Ефектори:

1- 1,5-дибензиламіно-пентан; 2 - 1,2,3-три--фенілетиламіно-пропан; 3 - анілін

Отримані дані дозволяють ідентифікувати досліджувану S2'-ділянку як давно відому, але не локалізовану ні за місцем знаходження, ні за функціональним призначенням, ефекторну ділянку серинових протеїназ. Зростання активності ферменту однозначно вказує на ефекторний характер досліджуваної ділянки. Її зв'язуючі властивості можуть бути незрівняно слабшими від "гідрофобної кишені", оскільки захоплення останньою однієї з гідрофобних груп ефектора створює достатньо високі передумови для вміщення другої групи в ефекторну ділянку. Завдяки гнучкості ланцюгу, що поєднує обидві групи ефектору, витіснення молекулою субстрату першої з них з "гідрофобної кишені" ферменту не веде до обов'язкового витіснення другої групи з ефекторної ділянки ферменту. Зрозуміло, що реалізація подібного механізму має ускладнюватися за зростання громіздкості молекул як субстрату, так і ефектору, що й спостерігається у випадку 1,2,3-три--фенілетиламіно-пропану (рис.3).

Проведено дослідження впливу S2'-стимуляції на різні стадії гідролізу. Каталіз протеолітичними ферментами односубстратних реакцій проходить через утворення нековалентного фермент-субстратного комплексу ES, що перетворюється на ковалентний ацил-ензим EA з виділенням первинного продукту P1 та подальшим гідролізом ацил-ензиму до вільного ферменту та вторинного продукту P2 (Антонов В.К., 1991). За гідролізу амідних субстратів швидкість процесу лімітується утворенням ацил-ензиму, тобто kcat = k2, тоді як для випадку складноефірних субстратів лімітуючою стадією є гідроліз ацил-ензиму і відбувається його накопичення. Порівняння кінетичних параметрів гідролізу N-глутарил-L-фенілаланіл-пара-нітроаніліду в присутності різних концентрацій 1,5-дибензиламіно-пентану свідчать про те, що як утворення нековалентного фермент-субстратного комплексу, так і процес його перетворення на ацил-ензим підлягають S2'-стимуляції (Таблиця 2).

Таблиця 2

алежність кінетичних характеристик -хімотрипсину при гідролізі GPNA

від концентрації 1,5-дибензиламіно-пентану

Концентрація ефектора,

Х10-3М | kcat,

х103 с | Km',

х103 М | Km*,

Х103 М | Km*/Km'

0 [197]

0

1

2

3

4

5 | 13.0

12.8

16.4

23.9

27.2

28.8

29.1 | 0.28

0.33

0.40

0.53

0.66

0.68

0.71 | -

-

0.53

0.74

0.95

1.16

1.36 | -

-

1.32

1.40

1.44

1.71

1.92

Наведені дані є статистично вірогідними (р?0.05).

Зростання уявної константи Міхаеліса Km' носить виражений нелінійний характер з наростаючим відставанням від розрахованої за відомим значенням константи дисоціації взаємодії хімотрипсину з 1,5-дибензиламіно-пентаном величини Km* (Рис.4), що свідчить про зростання зв'язуючих властивостей "гідрофобної кишені" хімотрипсину внаслідок S2'-стимуляції активного центру. Таке припущення добре узгоджується як з нашими даними про взаємодію серинових протеїназ з афінними лігандами, що містять дві гідрофобні групи, так і зі збільшенням сили зв'язування -хімотрипсином імобілізованого феніл-бутил-аміну в присутності N-карбобензокси-похідних гідрофобних амінокислот, тобто сполук, що містять дві рознесені у просторі гідрофобні групи (Dunn B., Gilbert W., 1979).

Рис.4. Залежність кінетичних параметрів гідролізу -хімотрипсином N_глутарил-L-фенілаланіл-пара-нітроаніліду від концентрації 1,5_дибензил-аміно-пентану

Викликане S2'-стимуляцією активного центру посилення зв'язуючих властивостей "гідрофобної кишені" дозволяє також пояснити утворення стабільних комплексів між білковими інгібіторами протеїназ та ангідро-похідними ферментів, інактивованих по гідролітичному центру перетворенням серину в дегідроаланін (Ako H., et al., 1972). З іншого боку, низьку стійкість комплексів ангідро-ферментів з серпінами плазми крові - 1-антитрипсином та 2-антиплазміном (Moroi M., et al., 1975, Enghild J. et al., 1994) - може бути пояснено конформаційною рухливістю реактивних центрів цих інгібіторів (Elliott P., Lomas D., et al., 1996).

На відміну від описаного в літературі промотуючого впливу одноядерних гідрофобних сполук на гідроліз -хімотрипсином пара-нітрофеніл-ацетату (Moore L., Jersey J., 1970), за досліджуваних концентрацій субстрата, фермента та ефектора жодного впливу ефектора на перебіг реакції не виявлено. Відсутність як активуючої, так і інгібуючої дії може вважатися за підтвердження механізму S2'-стимуляції, оскільки досліджуваний субстрат не конкурує з ефектором за сильнозв'язуючу ділянку S1, однак утворення ацил-ензиму веде до витіснення пентаметиленового ланцюга з зони дії гідролітичного центра, виводячи тим самим друге ядро ефектора з слабозв'язуючої ефекторної ділянки. Тому лімітуюча стадія процесу - гідроліз ацил-ензиму - відбувається за звичайного неактивованого стану фермента. Таке припущення добре узгоджується з численими даними про прискорюючу (промотуючу) дію великої кількості гідрофобних сполук на гідроліз ацетил--хімотрипсину Як у випадку 1,5-дибензиламіно-пентану, так, ймовірно, і у випадку похідних азобензолу (Erlanger B., 1976), відсутність впливу двоядерних ефекторів на гідроліз пара-нітрофеніл-ацетату може бути пояснено порушенням молекулою субстрату S2'-стимульованого стану ферменту.

Наведені дані дозволяють припустити вплив механізму S2'-стимуляції на всі три стадії гідролітичного процесу - утворення нековалентного комплексу Міхаеліса, його перетворення в ковалентний ацил-ензим та гідроліз останнього. Наявність такого роду механізму становить основу нативного обмеження протеолізу за рахунок утворення стабільних комплексів ферментів з відповідними білковими інгібіторами

Проведено аналіз первинних послідовностей опосередкованих сериновими протеїназами функціонально предетермінованих розщеплень. Однією з важливих фізіологічних функцій трипсин-подібних протеїназ є активація неактивних білків-попередників (проформ, проензимів, профакторів, тощо) до відповідних активних форм за рахунок строго визначених розщеплень на певних стадіях визрівання молекули. Нативний же механізм обмеження протеолізу базується на підвищеній спорідненості активних центрів протеїназ до реактивних центрів інгібіторів. Тому здавалося за доцільне провести порівняльний аналіз первинних послідовностей ділянок активаційних розщеплень в проформах якомога ширшого ряду біологічно активних білків. Внаслідок такого порівняння встановлено структурну аналогію між ділянками активаційних розщеплень та реактивними центрами білкових інгібіторів протеїназ трипсинового ряду: в P1-положеннях знаходяться, як правило, аргінін чи лізин, тоді як для P2'-положень характерно яскраво виражене домінування амінокислот гідрофобної природи. Основна ж відміна ділянок активаційних розщеплень від реактивних центрів білкових інгібіторів полягає у відсутності жорсткої фіксації розщеплюваного зв'язку, що зумовлює подальші конформаційні зміни, необхідні для активаційного процесу. Своєрідним виявом дії такого механізму