УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

ЗАНДАРЯН СЕРГІЙ ЮРІКОВИЧ

УДК 619:616.98:578.831.1

МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ШТАМІВ ВІРУСУ НЬЮКАСЛСЬКОЇ ХВОРОБИ, ВИДІЛЕНИХ В УКРАЇНІ, ТА УДОСКОНАЛЕННЯ ДІАГНОСТИКИ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Герман В’ячеслав Валентинович, Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів МАП України, заступник директора з наукової роботи.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Панікар Ігор Іванович, Сумський національний аграрний університет МАП України, завідувач кафедри вірусології, патологічної анатомії і хвороб птиці;

кандидат ветеринарних наук Пархоменко Людмила Іванівна, Луганський національний аграрний університет МАП України, доцент кафедри мікробіології і вірусології.

Провідна установа Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, кафедра епізоотології та ветеринарного менеджменту, Харківська область, сел. Мала Данилівка.

Захист відбудеться “05” квітня 2006 р. о “12” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “01” березня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук,

професор ________________________А.Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ньюкаслська хвороба (НХ) – висококонтагіозне інфекційне захворювання сільськогосподарської, синантропної та дикої птиці, яке характеризується ураженням центральної нервової системи, органів дихання і кишкового тракту. Захворювання наносить значний економічний збиток за рахунок загибелі птиці до 100% (особливо молодняку) та затрат на карантинно-профілактичні заходи. За класифікацією Міжнародного епізоотичного бюро (МЕБ, OIE) НХ належить до особливо небезпечних захворювань. Спалахи захворювання на НХ у світі реєструються МЕБ та Організацією продовольства та сільського господарства (ОПтСГ, FAO) Організації Об’єднаних націй (Bellver-Gallent M., 1985)

НХ вперше зареєстрована у 1926 році в Англії (Doyle, T.M. 1927), на протязі 20 сторіччя призвела до величезних економічних збитків у птахівництві усього світу (Alexander D.J., 2000). Незважаючи на значні досягнення у вивченні біологічних властивостей збудника та розробці заходів щодо діагностики і специфічної профілактики, спалахи захворювання НХ реєструються майже в усіх країнах світу. За даними МЕБ у 2004 році офіційно зареєстровано 11304 спалахи ньюкаслської хвороби більш ніж у 100 країнах світу.

Особливе значення у боротьбі з інфекцією приділяють моніторингу, своєчасній діагностиці та заходам профілактики. На цьому етапі, разом з класичними лабораторними методами діагностики захворювання птиці на НХ (ретроспективна діагностика, яка передбачає виявлення специфічних антитіл за допомогою традиційних серологічних реакцій – реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) та імуноферментного аналізу (ІФА); індикація та ідентифікація ізоляту вірусу за допомогою реакції гемаглютинації (РГА), РЗГА, реакції нейтралізації (РН) та біопроби (Сюрін В.М., 1991)) велика увага приділяється прогресивним методам молекулярної діагностики та біологічним тестам визначення ступеню патогенності збудника. У 1999 році на Генеральній сесії МЕБ було прийнято рішення, що основними критеріями оцінки вірулентності ізоляту вірусу ньюкаслської хвороби (ВНХ) є дослідження первинної структури сайту розрізування білку злиття F0 та визначення індексу інтрацеребральної патогенності (ІІЦП).

Значна частина раніше проведених досліджень щодо ізолятів ВНХ в Україні була спрямована на вивчення морфології та біохімічних властивостей збудника, питань патогенезу, клініки та перебігу епізоотичного процесу, діагностики та імунопрофілактики захворювання, але питання молекулярно-біологічних показників ізолятів ВНХ вивчені недостатньо.

Відповідно до сучасних вимог, розробку та впровадження класифікації ізолятів ВНХ необхідно проводити з урахуванням їх молекулярно-біологічних властивостей, які відіграють вирішальну роль у перебігу епізоотичного процесу. Вивчення цих властивостей надасть можливість науково обґрунтувати систему заходів боротьби та профілактики з метою забезпечення контрольованого епізоотичного стану щодо НХ в Україні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною досліджень, передбачених тематичним планом лабораторії вивчення хвороб птиці ІЕКВМ УААН за темою 07 ”Розробити та впровадити комплексну систему діагностики, терапії та профілактики хвороб птиці” 2001-2005 рр. (№ 0101U001612).

Мета і задачі досліджень. Мета досліджень – проведення моніторингу епізоотичної ситуації щодо НХ в Україні, виділення та вивчення молекулярно-біологічних властивостей польових штамів вірусу НХ, що циркулюють в Україні, удосконалення діагностики НХ.

Для досягнення мети були поставлені задачі:

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження: ньюкаслська хвороба.

Предмет дослідження: вірус ньюкаслської хвороби, молекулярні та біологічні властивості, засоби діагностики.

Методи досліджень. Загальноприйняті епізоотологічні, патологоанатомічні, серологічні, вірусологічні методи, біологічні тести, методи молекулярно-генетичної діагностики та електронної мікроскопії; експериментальні, біохімічні методики; методи статистичної обробки отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна роботи полягає в уточненні епізоотологічних даних щодо НХ в таких регіонах України, як Донецька, Сумська, Дніпропетровська, Луганська, Запорізька, Миколаївська, Харківська, Житомирська та Полтавська області, визначенні нуклеотидних послідовностей ділянки гену F0 ізолятів ВНХ, виділених від птиці на території України, диференціації генетичних груп штамів вірусу НХ, створенні банку даних нуклеотидних та відповідних амінокислотних послідовностей варіабельної ділянки гену F0 вірусу НХ, визначенні індексів інтрацеребральної і внутрішньовенної патогенності ізолятів вірусу НХ та середнього часу загибелі курячих ембріонів, інфікованих ізолятами вірусу НХ.

Аналіз нуклеотидних послідовностей фрагменту гену F0, досліджених ізолятів ВНХ, виявив загальне їхнє походження з ізолятами, що циркулювали в Росії у Приморському краї, а також ізолятами, що були виділені у Південно-Східній Азії.

Практичне значення одержаних результатів. На основі досліджень по удосконаленню діагностики НХ були розроблені – спосіб визначення індексу інтрацеребральної патогенності ізолятів вірусу ньюкаслської хвороби на 14-добових перепелятах (патент України № 7441 від 17.12.2004 р., кл. А61К39/00, автори Герман В.В., Зандарян С.Ю.) та спосіб диференціації лентогенних штамів вірусу ньюкаслської хвороби на курячих ембріонах, що розвиваються (патент України № 11207 від 06.06.2005 р., кл. А61К39/00, автори Герман В.В., Зандарян С.Ю.). Одержані дані було використано при розробці проекту “Інструкції щодо діагностики ньюкаслської хвороби птиці”, який було ухвалено на методичній комісії ІЕКВМ УААН, протокол №1 від 1 лютого 2005 року, та направлено для узгодження і затвердження до Державного департаменту ветеринарної медицини України.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок дисертанта полягає в самостійному виконанні запланованого об’єму методичної та експериментальної роботи, узагальненні та аналізі одержаних результатів. Проведення ЗТ-ПЛР та секвенування ділянки геному здійснено за участю кандидата ветеринарних наук Маніна Т.Б. Праймери для ЗТ-ПЛР розраховані кандидатом біологічних наук Грибановим О.Г.

Апробація результатів дисертації. Результати були представлені, обговорені і схвалені на річних наукових конференціях ІЕКВМ УААН та звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН у 2003-2005 роках; методичній комісії ІЕКВМ УААН, протокол №1 від 1 лютого 2005 року; IV Українській конференції по птахівництву з міжнародною участю (15-19 вересня 2003 р., м. Алушта, АР Крим), Міжнародній конференції молодих вчених (3-5 грудня 2003 р., ІЕКВМ, м. Харків), семінарі „Ветеринарне забезпечення галузі птахівництва” (7-10 квітня 2004 р., НАУ, м. Київ), Міжнародній науково-практичній конференції „Ветеринарна медицина-2004” (24-29 травня 2004 р., ІЕКВМ, м. Феодосія, АР Крим), Міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарна медицина-2005” (30 травня-4 червня 2005 р., ІЕКВМ, м. Ялта, АР Крим).

Публікації. Основний зміст дисертації викладено у 6 друкованих працях, які опубліковано у фахових виданнях, з них 2 одноосібних.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 137 сторінках комп’ютерного тексту, містить 24 таблиці і 17 рисунків. Робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків, пропозицій для практики, списку використаних джерел літератури, який містить 213 найменувань, у тому числі 184 іноземних, та 4 додатків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Представлена робота виконувалася як самостійний розділ завдання 07 ”Розробити та впровадити комплексну систему діагностики, терапії та профілактики хвороб птиці” в 2002-2005 роках, згідно тематичних планів ІЕКВМ, затверджених Українською академією аграрних наук.

В основу роботи покладені матеріали власних досліджень, проведених у птахогосподарствах, розміщених на території України, у лабораторії вивчення хвороб птиці ІЕКВМ УААН та лабораторії молекулярної біології Всеросійського науково-дослідного інституту захисту тварин Міністерства сільського господарства Російської Федерації (ВНДІЗТ МСГРФ).

При виконанні дисертаційної роботи у серологічних реакціях (РЗГА, РНГА, ККРА та ІФА) було досліджено 1700 проб сироваток крові птиці; для ізоляції, ідентифікації, пасажування та визначення біологічних властивостей вірусів використано 850 курячих ембріонів; для біопроби, імунізації, визначення ІІЦП та ВВІП використано 320 курчат, 40 перепелят та 5 нутрій.

Визначення поширення ньюкаслської хвороби в птахогосподарствах проводили шляхом аналізу епізоотичних ситуацій з урахуванням клінічних ознак хворої птиці, даних серомоніторингу та проведення лабораторних досліджень, спрямованих на індикацію та ідентифікацію збудника захворювання.

Ступінь напруженості епізоотичного процесу визначали на основі проведеного аналізу показників захворюваності, смертності, летальності в інтенсивних показниках за методикою І.А. Бакулова та ін., 1979 р.

Епізоотологічні дослідження включали: вивчення інфекційного процесу, джерел збудника, механізму передачі та дію вірусу на організм курчат. Виявляли ступінь поширення, динаміку загибелі, епізоотологічне значення факторів передачі збудника хвороби.

Серологічні дослідження проводили в крово-крапельній реакції аглютинації (ККРА), реакції затримки гемаглютинації (РЗГА), реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з використанням наборів еритроцитарних діагностикумів, виготовлених в лабораторії вивчення хвороб птиці ІЕКВМ УААН, за загальноприйнятими методиками, та за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) при застосуванні діагностичних наборів фірм “Biochek” та “IDEXX”. В серологічних реакціях досліджено 1700 проб сироваток крові з виведенням середньо-геометричного титру специфічних антитіл від курей різного віку. На підставі отриманих даних проведено аналіз тенденцій динаміки серопозитивності щодо НХ в залежності від вибраної вакцини, схеми її застосування, віку курчат та спрямованості технології.

Ізоляцію збудників захворювання проводили з кісткового і головного мозку, трахеї, легенів, залозистого шлунку, селезінки, відібраних від клінічно хворої та загиблої птиці. Разом з патологоанатомічними дослідженнями трупів проводили бактеріологічні дослідження, для чого робили висіви на прості та елективні середовища: МПА, МПБ, Сабуро, Ендо та Едварда.

Виділення вірусу здійснювали на 9 та 11-добових курячих ембріонах, що отримували від благополучного щодо НХ стада, невакцинованого проти інфекційних захворювань. Суспензію з відібраних органів готували на стерильному фізіологічному розчині NaCl (ФР) (рН 7,2-7,4) в співвідношенні 1:10 з додаванням антибіотиків (2000 ОД/см3 бензилпеніциліну натрієвої солі, 200 мг/см3 стрептоміцину сульфату, 0,25 мг/см3 гентаміцину сульфату і 5000 ОД/см3 ністатину). Зараження в алантоїсну порожнину проводили за загальноприйнятою методикою (Сюрін В.М., 1991).

Індикацію гемаглютинуючої активності отриманої алантоїсної рідини проводили в реакції гемаглютинації (РГА) з 1% суспензією еритроцитів півня на ФР. Титром вірусу вважали його максимальне розведення, при якому відбувалась повна аглютинація еритроцитів, що відповідало 1 гемаглютинуючій одиниці (1 ГАО).

Ідентифікацію вірусу проводили в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА), реакції нейтралізації (РН) на курячих ембріонах з позитивною до ВНХ сироваткою, також використовували метод біопроби на сприйнятливих до НХ біо-системах.

Реакцію нейтралізації (РН) проводили з постійним розведенням сироватки та різними дозами вірусу, феномен нейтралізації встановлювали по відсутності загибелі ембріонів, нейтралізуючу активність сироватки визначали обчисленням індексу нейтралізації за Рідом і Менчем.

Біопробу проводили на курчатах віком 40 діб (10 голів курчат для постановки біопроби одного ізоляту вірусу), які не мали специфічних антитіл до ВНХ. Курчат інфікували внутрішньом’язово, враховували зміни клінічного стану, патологоанатомічні ознаки та дані наступних лабораторних досліджень (серологічні реакції та реізоляція збудника). Термін спостереження за курчатами становив 5 діб.

Крім польових ізолятів у дослідженні використовували вакцинні штами ВНХ “Clone 30”, фірми “Intervet”, Голландія; “Vitapest L”, фірми “Ceva”, Франція; ізолят ВНХ “БЧ”, одержаний від невакцинованих проти НХ індичок (Герман В.В., 1967), штами ВНХ “Київ” та “Покров”, ізольовані та ідентифіковані лабораторією вивчення хвороб птиці ІЕКВМ.

Очистку та концентрацію вірусу НХ для імунізації, штам “Clone 30”, проводили методом центрифугування в 20% розчині сахарози.

Індикацію та чистоту вірусу визначали методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та електронної мікроскопії. Для останнього було застосовано метод негативного контрастування вірусних частинок нейтральним 10% розчином фосфорно-вольфрамової кислоти і вольфрамовокислого натрію.

Інактивацію вірусу НХ проводили шляхом додавання у вірусовмісну рідину аміноетиленіміну (АЕЕІ) у 0,1% концентрації, з наступною інкубацією в термостаті протягом 24 годин при температурі +37оС. Повноту інактивації контролювали титруванням на 11-добових курячих ембріонах, згідно з загальноприйнятою методикою.

Вірусоспецифічні сироватки отримували від 5 голів імунізованих нутрій віком 270-300 діб, масою 4,5-5 кг, та 10 голів курей, у віці 90-100 діб, масою 1,2-1,5 кг. Імунізацію проводили ін’єкціями очищеного концентрату вірусу НХ, внутрішньом’язово та підшкірно триразово з тижневим інтервалом у об’ємі 0,5 см3, 1,5 см3 та 2,5 см3.

Визначення індексу інтрацеребральної патогенності (ІІЦП) ізолятів вірусу НХ проводили на добових курчатах та 14-добових перепелятах, індекс внутрішньовенної патогенності (ВВІП) визначали на 6-тижневих курчатах, і середній час загибелі ембріонів (СЧЗ) – шляхом інфікування 9-добових курячих ембріонів, як рекомендовано інструкцією щодо діагностики НХ МЕБ (Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, CHAPTER 2.1.15., Bul. O.I.E., 2004.).

Дослідження літичної дії штамів ВНХ проводили на клітинній культурі FLK-92, культурі клітин нирки вівці, яку було отримано у 1973-1974 роках Van der Maaten у США (National Animal Disease Center, Ames, Iowa). Культура FLK-92 була люб’язно надана нам науково-виробничою лабораторією ІЕКВМ УААН. Клітини культивували у живильних середовищах “Ігла” і “199” у рівних об’ємах з 10% сироватки ВРХ при температурі +37оС, рН 7,2-7,4. Посівна концентрація складала 80-125 тис. клітин у 1 см3, у флакон вносили 100 см3 суспензії клітин. На третю добу культивування, при виповненні клітинного моношару, у флакони з культурою вносили розведену 10-3 вірусутримуючу рідину в об’ємі 1 см3 штамів ВНХ UA/Keg/ch/03, UA/Kup/ch/03, UA/Cirk/ch/03, UA/Lug/ch/03 та “Clone 30”. Після інфікування культуру інкубували протягом 5 діб при температурі +37оС. Препарати фарбували 10% спиртовим розчином метиленового синього протягом 10 хв. та проводили мікроскопію трьох різних полів зору кожного препарату, культуральну рідину досліджували у РГА з 1% суспензією еритроцитів півня на ФР.

Зворотньо-транскриптазну полімеразну ланцюгову реакцію (ЗТ-ПЛР) та секвенування геному штамів вірусу НХ проводили в лабораторії молекулярної біології ВНДІЗТ МСГРФ за методичними вказівками, розробленими ВНДІЗТ, на основі методики по індикації геному та штамової диференціації ВНХ методом ПЛР та секвенування гену F0, 1997 р.

Нуклеотидну послідовність фрагменту F0 гену визначали методом прямого секвенування ампліфікованих фрагментів за допомогою набору “fmol DNA Sequencing System” (Promega, США). Аналіз нуклеотидних і відповідних їм амінокислотних послідовностей проводили, використовуючи пакет прикладних програм SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версія 1.0 (N.J. Knowles, IFAN, Великобританія, 1996 р.).

Цифрові кількісні дані, одержані в результаті проведених досліджень, опрацьовували методом математичної статистики з обчисленням середніх арифметичних величин, ступеня достовірності показників та кореляційного аналізу (Сепетліев Д., 1968).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Моніторинг епізоотичної ситуації щодо НХ у птахогосподарствах України. Проведення аналізу даних ветеринарної статистики на ньюкаслську хворобу надало змоги відмітити, що з 1996 року в Україні не було зареєстровано спалахів захворювання на НХ, що, очевидно, пов’язано з проведенням епізоотологічного моніторингу в промислових птахогосподарствах, де було застосовано оптимальні заходи щодо профілактики захворювання на НХ відповідними службами та постійним контролем з боку Державного департаменту ветеринарної медицини України. Але, як показали дослідження, проведення таких заходів у промислових птахокомплексах та птахофабриках, не гарантувало виключення циркуляції штамів вірусу, в тому числі високовірулентних, серед невакцинованої дикої, синантропної та, особливо, сільськогосподарської птиці, що утримується на дрібних присадибних та фермерських птахогосподарствах, де не дотримуються ветеринарно-санітарні правила та вимоги щодо комплектації та утримання птиці.

Вивчення епізоотичної ситуації у птахівничих господарствах України дозволило дійти до висновку, що ньюкаслська хвороба є досить актуальною проблемою і потребує більш детального вивчення не тільки на підставі серологічного моніторингу, а й на дослідженнях по ізоляції збудників з подальшим вивченням їх властивостей. Така вимога до вивчення епізоотичної ситуації була зумовлена змінами у кількості птиці у регіонах, поширенням контингентів вакцинованої і невакцинованої проти НХ птиці.

З 2002 по 2005 роки був проведений імунологічний моніторинг щодо НХ різновікової птиці у 28 птахогосподарствах. Розшифровку імунограм проводили з урахуванням рівня діагностичного титру антитіл 3 log2 та більше, кількості реагуючої птиці та її віку.

У птиці усіх досліджуваних господарств, з яких 22 – яєчного напрямку виробництва, та 6, що спеціалізувались на вирощуванні курчат-бройлерів, були виявлені специфічні антитіла до ВНХ. Спираючись на дані серологічного моніторингу, було встановлено, що досліджувана птиця мала груповий захист проти НХ (>80%), а у стадах птиці, що його не мали (<80%), була строкатість титрів специфічних антитіл (лише у 8% випадків), яка після вакцинації (ревакцинації) проти НХ поголів’я зникала, а птиця набувала групового захисту.

За даними аналізу, у птахогосподарствах застосовувалися різні програми вакцинопрофілактики НХ. В залежності від спеціалізації господарств, віку та імунного статусу птиці, використовували різноманітні специфічні вакцинні препарати для імунопрофілактики НХ, у більшості випадків лентогенного та асимптоматичного патотипів вірусу: інактивована емульгована вакцина “Nobilis IB+ND+EDS”, жива ліофілізована вакцина “MA 5+Clone 30”, жива ліофілізована вакцина “Nobilis ND Clone 30”, виробництва фірми “Intervet”, Голландія; інактивована емульгована вакцина “Таловак 303” проти НХ, ІБК та СЗН-76, фірма “TAD”, Німеччина; жива ліофілізована вакцина проти НХ “Vitаpest L”, фірма “Ceva”, Франція, жива ліофілізована та інактивована масляна вакцини проти НХ, штам “Ла-Сота”, ВНДІЗТ, Росія; жива ліофілізована вакцина проти НХ, штам “Ла-Сота”, Сумська біофабрика, Україна.

Серологічний моніторинг птиці приватних фермерських та присадибних птахогосподарств Харківської, Луганської, Сумської та Дніпропетровської областей з невеликою кількістю птиці виявив, у більшості випадків, відсутність групового захисту проти НХ та строкатість титрів специфічних антитіл. В цих господарствах практично не застосовувалася вакцинопрофілактика НХ, а коли застосовувалася, то мала нерегулярний характер та не супроводжувалася наступним сероконтролем захисту проти НХ.

При підозрі щодо захворювання птиці на НХ було досліджено 6 неблагополучних фермерських птахогосподарств Харківської, Луганської та Сумської областей, де було здійснено ізоляцію збудників захворювання. Відмічено сезонність прояву у курей клінічних ознак ньюкаслської хвороби, що спостерігалось у зимовий період, вік захворілої птиці становив 28-180 діб, захворюваність та смертність сягали 80-100%. Захворіла птиця, у більшості випадків, не вакцинувалася проти НХ та інших інфекційних хвороб. Отримані дані епізоотологічних обстежень птахогосподарств, клінічного стану птиці, картина патологоанатомічних розтинів та ізоляція вірусів дали можливість віднести їх до вірогідних ізолятів ВНХ, яким було дано ідентифікаційні назви: UA/Bor/ch/03, UA/Poc/ch/03, UA/Kup/ch/03, UA/Lug/ch/03, UA/Cirk/ch/03 і UA/Keg/ch/03, та продовжити роботу для їх чіткої ідентифікації та вивченню властивостей.

Індикація та ідентифікація штамів ВНХ. Для визначення робочої дози антигену при проведенні РЗГА, визначали гемаглютинаційну активність отриманих вірусовмісних ЕЕР в РГА. РЗГА проводили зі специфічними сироватками до ВНХ, параміксовірусу 2 типу (PMV-2), грипу птиці сероваріантів ГП Н5 та ГП Н7. Найбільший титр гемаглютинінів при проведенні РГА, спостерігали у ізоляту UA/Bor/ch/03, де 4 ГАО вірусного антигену відповідало 7 log2, 4 ГАО ізоляту UA/Lug/ch/03 становило 6 log2, ізоляту UA/Poc/ch/03 – 5 log2, робочі дози антигенів UA/Kup/ch/03 та UA/Keg/ch/03 були однакові та дорівнювали 4 log2, а найменший титр спостерігали в ізоляту UA/Cirk/ch/03 – 2 log2. При проведенні РЗГА було відмічено, що специфічна сироватка до вірусу НХ затримує явище гемаглютинації усіх ізолятів у титрі 8 log2, за виключенням ізоляту UA/Kup/ch/03 – 9 log2. Ця різниця, напевно, залежала від ступеню спорідненості ізолятів. Результати постановки РЗГА зі специфічними сироватками до параміксовірусу 2 типу (PMV-2), грипу птиці сероваріантів ГП Н5 та ГП Н7 були негативні (табл. 1).

Отримані в РЗГА дані дали можливість зробити висновок, що виділені ізоляти вірусу відносяться до вірусу ньюкаслської хвороби, параміксовірусу 1-го серотипу.

Таблиця 1

Індикація та ідентифікація ізолятів в РГА і РЗГА

Ізолят | Титр в РГА, log2 | Титр в РЗГА зі специфічними сироватками, log2

ВНХ | PMV-2 | ГП Н5 | ГП Н7

UA/Cirk/ch/03 | 4 | 8 | - | - | -

UA/Kup/ch/03 | 6 | 9 | - | - | -

UA/Poc/ch/03 | 7 | 8 | - | - | -

UA/Bor/ch/03 | 9 | 8 | - | - | -

UA/Lug/ch/03 | 8 | 8 | - | - | -

UA/Keg/ch/03 | 6 | 8 | - | - | -

Контроль 1 | 9 | 8 | - | - | -

Контроль 2 | - | - | - | - | -

Примітка: 1 – антиген НХ інактивований, штам “Ла-Сота”,

2 – алантоїсна рідина неінфікованих ембріонів.

При постановці реакції нейтралізації на курячих ембріонах було виявлено, що індекси нейтралізації (ІН) усіх шести ізолятів ВНХ знаходяться у межах від 3,57 до 6,25. При цьому мінімальним ІН мав ізолят UA/Cirk/ch/03 – 3,57, майже такий же ІН спостерігали у ізоляту UA/Kup/ch/03 – 3,72, у ізоляту UA/Keg/ch/03 – 4,95, у ізолятів UA/Bor/ch/03 та UA/Lug/ch/03 ІН були однакові та дорівнювали 5, а максимальний ІН відмічали в ізоляту UA/Poc/ch/03 – 6,25. При постановці РН у загиблих ембріонів відмічали зменшення середньої ваги тіла до 11,5±0,37 г, у порівнянні з контрольними – 13,3±0,42, та крововиливи у шкіряному покриві ембріонів, особливо виразні в області голови.

Для виявлення геному вірусу НХ із ЕЕР заражених ембріонів було виділено вірусну РНК, яку використовували для реакцій ЗТ-ПЛР. З метою підвищення чутливості реакції, у випадку не виявлення вірусоспецифічних фрагментів кДНК після першої ПЛР через низький вміст РНК вірусу НХ у вихідному матеріалі, використовували варіант “гніздової” ПЛР (nested PCR) із парами внутрішніх праймерів 1В (5’-GTCAACATATACACCTCATC-3’) і 2В (5’- TAACAAACTGCTGCATCTT-3’). Для цього переносили 3 мкл проби у пробірку з реакційною сумішшю, що містила внутрішні праймери і проводили реакцію. У результаті ампліфікації із праймерами 1D (5’-CCATTGATGGCAGGCCTCTT-3’) і 2D (5’-CCGCTACCGATTAATGAGCT-3’), синтезувався вірусоспецифічний фрагмент кДНК розміром 708 пар нуклеотидів (п.н.) в чотирьох пробах екстраембріональної рідини інфікованих ембріонів – UA/Keg/ch/03, UA/Poc/ch/03, UA/Lug/ch/03 та UA/Kup/ch/03. У пробах з UA/Cirk/ch/03 та UA/Bor/ch/03 вірусоспецифічний фрагмент розміром 412 п.н. було виявлено після постановки другої ПЛР (“гніздової”) з праймерами 1В і 2В. Визначення та порівняльний аналіз первинної структури ампліфікованих фрагментів кДНК варіабельної області гену F0 за допомогою нуклеотидного секвенування показали, що всі досліджені проби містили геноми польових ізолятів вірусу НХ.

Вдосконалення методів діагностики НХ. Основою для постановки діагнозу на ньюкаслську хворобу, за класифікацією МЕБ, вважаються ізоляція збудника НХ, ІІЦП якого є більшим або дорівнює 0,7 та визначення залишків основних амінокислот (аргинину чи лізину) у сайті розрізування білку F0. При цьому спостерігається велика кількість вірулентних штамів ВНХ, різноманітних за молекулярно-біологічними властивостями, але загальна риса, що їх об’єднує – це чітка диференціація від штамів ВНХ, що застосовуються для вакцинопрофілактики НХ (за показниками індексів патогенності, будовою білку F0, тощо).

Відмічено, що в Україні, поряд з циркуляцією вірулентних штамів ВНХ серед невакцинованої птиці, проводять ізоляцію і лентогенних збудників НХ, які дещо відрізняються від вакцинних штамів (Прокоф’єва М.Т., Герман В.В., 1972). Проведення диференціації за допомогою молекулярно-генетичних досліджень є самим точним, але дуже дорогим засобом, а визначення біологічних індексів займає багато часу. Тому, з цією метою, нами був проведений дослід сумісного культивування двох лентогенних штамів ВНХ, які мають різне походження, та порівняння їх дії зі змінами, що викликає моноінфекція цими штамами.

У роботі було використано вакцинний штам ВНХ “Ла-Сота” і лентогенний штам “БЧ”, виділений В.В. Герман у 1967 р. від індичок, не вакцинованих проти НХ. З кожного штаму вірусу готували послідовні десятикратні розведення на розчині Хенкса від 10-1 до 10-7, у досліді використовували розведення від 10-3 до 10-7. Першу групу ембріонів заражали вірусом, штам “Ла-Сота”, другу групу – штамом “БЧ”. Третю групу ембріонів заражали сумішшю рівних об’ємів штамів вірусу “Ла-Сота” і “БЧ” у розведеннях. У кожній групі було 20 інфікованих ембріонів і 4 контрольних.

У перші 24 години після зараження загибель по одному ембріону була в першій (у розведенні 10-3) і у третій (у розведенні 10-4) групах. Через 72 години усі інші інфіковані ембріони залишалися живими.

Ембріони дослідних груп, у порівнянні з контрольними, візуально були менше в 1,5 рази, гіперемійовані, інші патологоанатомічні зміни були відсутні. Середня маса ембріонів склала: у групі 1 (“Ла-Сота”) - 9,8±0,33 г, у групі 2 (“БЧ”) - 9,5±0,12 г, у групі 3 (“Ла-Сота”+“БЧ”) - 9,3±0,1 г, у контрольній групі - 11,4 ±0,2 г.

Загальна вага заражених ембріонів у кожній групі становила: група 1 - 49 г, група 2 - 47,4 г, група 3 - 47,5 г.

При постановці РГА з екстраембріональною рідиною курячих ембріонів максимальний титр гемаглютинину в групі 3 (“Ла-Сота”+“БЧ”) був виявлений у ембріонів, заражених вірусовмісною ЕЕР у розведенні 10-6 і він склав 10,0±0,75 log2. Аналогічного титру гемаглютининів не виявилося в жодній із груп при моноінфекції ВНХ курячих ембріонів. У групі 1 (“Ла-Сота”) найвищий титр гемаглютининів був при використанні розведення 10-3 – 8,75±0,25 log2, у другій групі (“БЧ”) в аналогічному розведенні він був нижче на 0,5 log2. Мінімальний титр гемаглютинину в групі 1 був виявлений у ембріонів, інфікованих матеріалом в розведенні 10-7 – 6,75±0,5 log2, і на 0,5 log2 нижче в групі 2.

Вірогідність різниці в репродукції штамів вірусів за рівнем гемаглютининів між групою 1 (“Ла-Сота”) і групою 3 (“Ла-Сота”+“БЧ”), а так само між групою 2 (“БЧ”) і групою 3 (“Ла-Сота”+“БЧ”) становила td=6,6, що відповідає статистичній вірогідності різниці між порівнюваними варіаційними рядами (td>3). Коефіцієнт кореляції між всіма групами склав r=0,2, що вказує на низький зв'язок між штамами і їхнім сполученням (r<0,3). Ці дані свідчать про індивідуальні властивості кожного штаму і їхній зміні при асоційованому культивуванні залежно від розведення вірусовмісного матеріалу.

Відомо, що ІІЦП штамів ВНХ звичайно визначають на добових SPF курчатах або курчатах, що не мають специфічних антитіл до вірусу ньюкаслської хвороби. У зв’язку із труднощами придбання безантитільних до ВНХ або SPF курчат, виникла необхідність пошуку інших сприйнятливих моделей. Для цього у трьох ідентифікованих ізолятів ВНХ – UA/Lug/ch/03, UA/Poc/ch/03 і UA/Bor/ch/03 – у порівняльному аспекті визначили ІІЦП на курчатах і перепелятах.

Після завершення 8-добового строку спостереження за інфікованою птицею, визначали індекс інтрацеребральної патогенності, для чого сумарні показники хворих і загиблих курчат по кожному ізоляту вірусу НХ використовували при обчислюванні індексу. ІІЦП ізолятів ВНХ UA/Poc/ch/03 і UA/Bor/ch/03 становив 1,76 і 1,70, що класифікувало їх як велогенні штами, а ізолят ВНХ UA/Lug/ch/03 мав показник ІІЦП – 0,65, характерний для мезогенних штамів.

На перепелят 7-добового віку за 8-добовий період спостереження всі досліджувані ізоляти ВНХ зумовили летальну дію, а 14-ти та 21-добові перепелята виявили динаміку загибелі, подібну з динамікою загибелі при визначенні ІІЦП на добових курчатах.

При визначенні ІІЦП ізолятів ВНХ на перепелятах було встановлено, що вони мають майже такі ж показники ІІЦП і вірулентність до даного тест-об’єкту, як і для курчат (табл. 2).

Коефіцієнт кореляції між показниками ІІЦП на добових курчатах і групами перепелят склав: 7-добові - 0,73; 14-добові - 0,74; 21-добові - 0,49, що вказує на найбільший кореляційний зв’язок у групі 14-добових перепелят, і найменшу - у групі 21-добових.

Таблиця 2

Тип вірулентності штамів ВНХ та показники ІІЦП на перепелятах різних вікових груп

Ізолят ВНХ | Вік перепелят | ІІЦП | Тип вірулентності штаму ВНХ

UA/Poc/ch/03 |

7 діб | 1,68 | велогенний

14 діб | 1,75 | велогенний

21 доба | 1,59 | велогенний

UA/Bor/ch/03 |

7 діб | 1,9 | велогенний

14 діб | 1,79 | велогенний

21 доба | 1,7 | велогенний

UA/Lug/ch/03 | 7 діб | 0,6 | мезогенний

14 діб | 0,58 | мезогенний

21 доба | 0,11 | лентогенний

Контроль1 | 7 діб | 0 | -

Примітка. 1 – алантоїсна рідина неінфікованих ембріонів.

Дослідження біологічних властивостей штамів ВНХ. Найбільший показник ІІЦП мав штам UA/Cirk/ch/03, показники ІІЦП штамів UA/Kup/ch/03, UA/Poc/ch/03 та UA/Bor/ch/03 знаходилися майже на одному рівні та характеризували їх, як велогенні; штами UA/Keg/ch/03 та UA/Lug/ch/03 за показниками ІЦІП характеризувалися, як мезогенні; а штами “Київ”, “Покров”, вакцинні штами “Clone 30” та “Vitapest L” виявилися лентогенними штамами ВНХ. Штам “БЧ” мав самий низький показник ІІЦП (табл. 3).

Таблиця 3

Показники ІІЦП та тип вірулентності штамів ВНХ

Штам ВНХ | ІІЦП | Тип вірулентності штаму ВНХ

UA/Cirk/ch/03 | 1,81 | велогенний

UA/Kup/ch/03 | 1,66 | велогенний

UA/Poc/ch/03 | 1,76 | велогенний

UA/Bor/ch/03 | 1,70 | велогенний

UA/Lug/ch/03 | 0,65 | мезогенний

БЧ | 0,07 | лентогенний

Київ | 0,38 | лентогенний

UA/Keg/ch/03 | 0,93 | велогенний

Покров | 0,34 | лентогенний

Clone 30 | 0,31 | лентогенний

Vitapest L | 0,10 | лентогенний

Контроль1 | 0,00 | -

Примітка. 1 – алантоїсна рідина неінфікованих ембріонів.

При визначенні показників ВВІП було відмічено, що штами UA/Keg/ch/03, UA/Cirk/ch/03 та UA/Poc/ch/03 мали найбільші показники ВВІП – 2,58, 2,37 та 2,34 відповідно, що характеризувало їх, як велогенні. Штами UA/Kup/ch/03 та UA/Bor/ch/03 мали показники ВВІП 2,09 та 1,59, що також відносило їх до групи велогенних штамів. Показник ВВІП штаму UA/Lug/ch/03 дорівнював 0,16, що дозволило віднести його до групи мезогенних штамів (табл. 4).

Таблиця 4

Показники ВВІП та тип вірулентності штамів ВНХ

Штам ВНХ | ВВІП | Тип вірулентності штаму ВНХ

UA/Cirk/ch/03 | 2,37 | велогенний

UA/Kup/ch/03 | 2,09 | велогенний

UA/Poc/ch/03 | 2,34 | велогенний

UA/Bor/ch/03 | 1,59 | велогенний

UA/Lug/ch/03 | 0,16 | мезогенний

БЧ | 0,00 | лентогенний

Київ | 0,00 | лентогенний

UA/Keg/ch/03 | 2,58 | велогенний

Покров | 0,00 | лентогенний

Clone 30 | 0,00 | лентогенний

Vitapest L | 0,00 | лентогенний

Контроль1 | 0,00 | -

Примітка. 1 - алантоїсна рідина неінфікованих ембріонів.

При визначенні СЧЗ, штам ВНХ UA/Poc/ch/03 мав найменший показник – 48,6; показники штамів UA/Cirk/ch/03, UA/Kup/ch/03 та UA/Keg/ch/03 знаходилися майже на одному рівні – 55,7; 53,4; та 51,8 годин відповідно. Штами UA/Bor/ch/03 та UA/Lug/ch/03 мали показники СЧЗ 79,6 та 86 годин; а штами “БЧ”, “Київ”, “Покров”, “Vitapest L” та “Clone 30” не викликали летальної дії при інфікуванні ембріонів до 90 годин інкубації (табл. 5).

Таблиця 5

Показники СЧЗ та тип вірулентності штамів ВНХ

Штам ВНХ | СЧЗ | Тип вірулентності штаму ВНХ

UA/Cirk/ch/03 | 55,7 | велогенний

UA/Kup/ch/03 | 53,4 | велогенний

UA/Poc/ch/03 | 48,6 | велогенний

UA/Bor/ch/03 | 79,6 | мезогенний

UA/Lug/ch/03 | 86 | мезогенний

БЧ | >90 | лентогенний

Київ | >90 | лентогенний

UA/Keg/ch/03 | 51.8 | велогенний

Покров | >90 | лентогенний

Clone 30 | >90 | лентогенний

Vitapest L | >90 | лентогенний

Контроль1 | >90 | -

Примітка. 1 – алантоїсна рідина неінфікованих ембріонів.

При дослідженні літичної дії штамів ВНХ на культуру клітин FLK-92, в культуральних рідинах, де клітини було інфіковано штамами ВНХ UA/Keg/ch/03, UA/Kup/ch/03 та UA/Cirk/ch/03 було відмічено титри гемаглютинінів, що дорівнювали 4 log2±0,25, а у флаконах з штамами UA/Lug/ch/03 і “Clone 30” - 5 log2±0,5. У неконтамінованій культурі FLK-92 культуральна рідина не володіла гемаглютинуючою активністю. Отримані результати проведення мікроскопії та РГА свідчили про специфічну взаємодію штамів ВНХ та клітинної культури. Як відомо, літичні штами ВНХ швидко виявляють цитопатичну дію, що спостерігали у культурах клітин FLK-92, які були заражені штамами ВНХ UA/Keg/ch/03, UA/Kup/ch/03 та UA/Cirk/ch/03. Штам UA/Lug/ch/03 не викликав майже ніяких змін, а штам “Clone 30” навіть позитивно вплинув на проліферацію клітин у порівнянні з контролем, що дало змогу віднести ці штами до не літичних.

Вивчення і порівняння нуклеотидних послідовностей варіабельної області гену F0 польових штамів вірусу НХ, виділених в Україні та ізольованих за її межами. Порівняльний аналіз опублікованих нуклеотидних послідовностей відомих штамів з послідовністю відповідної області польового ізоляту дозволяє визначити штамову приналежність вірусу, що викликав спалах захворювання. Створення банку даних структур штамів вірусу НХ, виділених у різних регіонах і в різний час, дозволяє проводити порівняння не тільки серед штамів, що циркулюють на території України, але й порівнювати їх зі штамами, виділеними в інших країнах. Для оцінки можливості проведення штамової диференціації за допомогою порівняльного аналізу первинної структури обраної нами варіабельної ділянки, ми використовували нуклеотидні послідовності гену F0 з бази даних European Molecular Biology Laboratory (EMBL).

Філогенетичний аналіз послідовностей варіабельної області гену F0 американських, європейських, австралійських і японських штамів показав, що вони утворюють кілька генетичних груп. Аналіз нуклеотидних послідовностей фрагмента гену F0 досліджених проб показав, що ізоляти, виділені від курей, відносяться до двох генетичних груп.

Нуклеотидні послідовності фрагмента гену F0 ізолятів Смоленськ/курка/423/2004 і Томаровська/курка/390/2004 були ідентичні. Послідовності ізолятів: Україна/Биковичи/курка/382/2004, UA/Cirk/ch/03, UA/Poc/ch/03, UA/Bor/ch/03 і Бєлгород/курка/353/2004 відрізняються від них на 1 нуклеотид. Усі ці ізоляти відносяться до однієї групи VII A. Цю групу складають ізоляти, що були виявлені у 2003 році: Приморськ/курка/2003 і Амурськ/курка/2003.

Ізолят UA/Kup/ch/03 відноситься до групи VI, яка містить ізоляти, що раніше були виділені від курей у господарствах України: Україна/1травня/курка/111/2002, Україна/Київ/курка/284/2003 і Україна/Березанська/курка/187/2003, а також у Російської Федерації: Курськ/курка/158/2002 (рис. 1-2).

Рис. 1 Дендрограма, яка побудована на основі гомології нуклеотидних послідовностей фрагменту гену F0 ізолятів вірусу НХ, а також штамів вірусу НХ, що представляють основні генетичні групи вірусу НХ

Consensus PkDKEACAkAPLeAYNRTLTtLLtPLGDSIRrIQgSVsTsGGrRQkRfIGAiIGsVALGVATaAQITAAA

UKR-1-041 -R-----------------------------K-------------------V------------------

UKR-2-042 -----------------------S----------------------------------------------

UKR-6-043 -R-----------------------------K-------------------V------------------

UKR10-044 -R-----------------------------K-------------------V------------------

TOMAR-045 -R-----------------------------K-------------------V------------------

PG400-046 ***---------D---------------------E--T----G--G-L------G---------------

BELGBR047 -R-----------------------------K-------------------V------------------

TURTLE048 ------------------------------------------------------G-------S-------

382-20049 -R-----------------------------K-------------------V------------------

423-200410 -R-----------------------------K-------------------V------------------

PG407-0411 --------R-----------A--N------------------K-------------------S-------

PG424-0412 --------R-----------A--N------------------K-------------------S-------

PG455-0413 ******--R-----------A--N------------------K-------------------S-------

PG456-0414 --------R-----------A--N------------------K-------------------S-------

PGAL-44615 --------------------A--N---------------P--K-------------------S-------

Рис. 2 Амінокислотні послідовності фрагменту білка попередника F0 досліджуваних ізолятів вірусу НХ. Сайт розрізування відмічено жирним шрифтом

Позначення:

1. UA/Cirk/ch/03, 2. UA/Kup/ch/03,

3. UA/Poc/ch/03 4. UA/Bor/ch/03,

5. Томаровська/курка/390/2004, 6. Mocква/голуб/400/04,

7. Бєлгород/курка/353/2004, 8. Зоопарк/горл/371/04,

9. Биковичи/курка/382/2004, 10. Смоленськ/курка/423/2004,

11. Москва/ голуб/407/04, 12. Москва/ голуб/424/04,

13. Москва/ голуб/455/04, 14. Москва/ голуб/456/04,

15. Алтай/ голуб/446/04.

ВИСНОВКИ

1. Епізоотологічний моніторинг щодо ньюкаслської хвороби у птахогосподарствах України свідчить про циркуляцію штамів вірусів НХ, різноманітних за молекулярно-біологічними властивостями. Встановлено, що виділені в Україні польові ізоляти ВНХ за структурою сайтів розрізування білків F0 та показниками індексів патогенності є велогенними і мають високий ступінь гомології з ізолятами ВНХ, які тривалий час циркулювали на території Росії та Південно-Східної Азії, що дозволяє зробити припущення про їхнє загальне походження.

2. Ідентифікація штамів вірусу НХ, що циркулюють серед птиці в Україні, на основі прямого секвенування амплифікованого в ЗТ-ПЛР фрагменту кДНК гену F0, дозволила віднести їх до VI (UA/Kup/ch/03) та VII А (UA/Cirk/ch/03, UA/Poc/ch/03 і UA/Bor/ch/03) генетичних груп.

3. Індекси інтрацеребральної (ІІЦП), внутрішньовенної (ВВІП) патогенності та середнього часу загибелі (СЧЗ) ембріонів 6-ти польових ізолятів ВНХ відповідно становили: UA/Kup/ch/03 – 1,66/2,09/53,4; UA/Cirk/ch/03 – 1,81/2,37/55,7; UA/Poc/ch/03 – 1,76/2,34/48,6; UA/Bor/ch/03 – 1,7/1,59/79,6; UA/Lug/ch/03 – 0,65/0,16/86 і UA/Keg/ch/03 – 0,93/2,58/51,8.

4. Встановлено кореляцію між ступенем патогенності штамів ВНХ при визначенні ІІЦП, ВВІП та СЧЗ із впливом вірусу на проліферативну активність клітин FLK-92.

5. Розроблено спосіб визначення ІІЦП ізолятів ВНХ на перепелятах та диференціації лентогенних штамів ВНХ на курячих зародках для удосконалення діагностики НХ.

6. Започаткована робота по створенню віртуального банку даних нуклеотидних послідовностей варіабельної ділянки гену F0 і відповідних амінокислотних послідовностей ділянки білку F0 вітчизняних штамів вірусу НХ, що дозволяє проводити порівняльний аналіз і ідентифікацію знову виділених ізолятів ВНХ.

ПРОПОЗИЦІЇ ДЛЯ ПРАКТИКИ

1. На основі виконаних досліджень було розроблено проект “Інструкції щодо діагностики ньюкаслської хвороби птиці”, який було ухвалено на методичній комісії ІЕКВМ УААН, протокол №1 від 1 лютого 2005 року, та направлено для узгодження і затвердження до Державного департаменту ветеринарної медицини України.

2. На основі досліджень по удосконаленню діагностики НХ були розроблені – спосіб визначення індексу