МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

КУРЧЕНКО АНДРІЙ ІГОРОВИЧ

УДК 615.5-002-056.3-07:57.083.3:615.3:612.017.1

АТОПІЧНИЙ ДЕРМАТИТ: ХАРАКТЕРИСТИКА ЗМІН

СИСТЕМНОГО ТА ЛОКАЛЬНОГО ІМУНІТЕТУ

14.03.08 – імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

КИЇВ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор Драннік Георгій Миколайович, Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри клінічної імунології та алергології з курсом дитячої клінічної імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Бережна Нінель Михайлівна, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені. Р.Є.Кавецького НАН України, керівник лабораторії імунології та алергології;

доктор медичних наук, професор Прилуцький Олександр Сергійович, Донецький державний медичний університет імені М.Горького МОЗ України, завідувач кафедри клінічної імунології та алергології;

доктор медичних наук, професор Бєлоглазов Володимир Олексійович, Кримський державний медичний університет імені С.І.Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри внутрішньої медицини №2.

Захист відбудеться “6”--березня 2008 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 у Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця МОЗ України за адресою: 01023, м. Київ, вул. Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О.Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “25 ” грудня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор __________________ С.Г.Свирид |

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Атопічний дерматит (АД) - хронічне рецидивуюче запальне захворювання шкіри, що характеризується папульозними висипаннями з типовою локалізацією морфологічних елементів, ліхеніфікацією, екскоріаціями, вираженою сухістю шкіри та частими бактеріальними ускладненнями. АД є найпоширенішим системним алергійним захворюванням, що має стійку тенденцію до прогресуючого плину та зустрічається із частотою 10-20% у населення економічно розвинених країн [Ревякина В.А., 2000; Novak N.,2003]. Серед алергійних захворювань частота АД становить від 30 до 60% [Bieber T., 2004; Leung D.Y.M., 2004; Степаненко В.І., 2005]. За даними публікацій за останні три десятиліття в усьому світі відзначений істотний ріст (в 10 і більше раз) захворюваності АД, у тому числі й в Україні [ Коляденко В.Г., 2002; Ласиця О.І., 2003; Драннік Г.М., 2006]

У світі усе ще формуються концепції розвитку АД та намічені тенденції застосування спрямованої, патогенетично обґрунтованої терапії цього захворювання. Становить інтерес визначення характеру імунологічних порушень, що відбуваються на системному та локальному рівні у хворих на IgE-залежну та IgE-незалежну форму АД [Werfel T., 1999; Кунгуров Н.В., 2000; Курамшина Д.В., 2003; Novak N., 2003]

На сьогоднішній день у клініці відома та виділяється підгрупа хворих з типовими шкірними проявами АД, для яких не характерні прояви гіперчутливості до аеро- і харчових алергенів. В анамнезі таких хворих немає вказівок на прояви інших атопічних захворювань, таких як алергійна астма та ринокон’юктивіт. У таких хворих спостерігаються нормальні рівні сироваткових IgE-антитіл. Такий тип АД зустрічається рідше (від 10 до 40% дорослого контингенту хворих на АД) і виділяється як IgE-незалежна форма АД, на противагу IgE-залежній формі, для якого характерний підвищений рівень IgE у крові [Akdis C.A., 2006].

Безсумнівно, розвиток IgE-залежної форми АД, з характерним підвищенням у крові рівня IgE, пов'язане з активацією імунітету на системному рівні. Відомо, що в запальних інфільтратах шкіри хворих IgE-залежної форми АД не спостерігається В-лімфоцитів і плазматичних клітин, які продукують IgE. Можна думати, що в умовах IgE-залежної форми АД локальне запалення шкіри ініціює розвиток IgE-залежної відповіді на системному рівні, тоді як при IgE-незалежній формі АД імунна відповідь формується переважно на локальному рівні, без залучення в процес клітин, що синтезують IgE [Schmid-Grendelmeier P., 2001].

У зв'язку із цим викликає інтерес зіставлення порушень в усіх ланках формування системної та локальної імунної відповіді як при IgE-залежній так і IgE-незалежній формі АД. Можна припустити, що в цих зіставленнях з'явиться можливість розкрити особливості, якими буде визначатися розвиток різних форм АД, а також виявити нові критерії діагностики цих захворювань.

У рамках розмежування шляхів активації імунної відповіді на системну і локальну, стає більш привабливим застосування цілеспрямованої терапії препаратами, що чинять вибірковий вплив, як місцево, так і на системному рівні.

Розуміння суті імунологічних порушень при різних клінічних формах АД, дозволить також визначити підходи до профілактики та лікування не тільки АД, але й інших атопічних захворювань, таких як бронхіальна астма та алергійний ринокон’юнктивіт. При цьому доступність шкіри для досліджень уможливлює розкриття механізмів хронічних алергійних хвороб інших, малодоступних для дослідження локалізацій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Проведені наукові дослідження є частиною комплексних науково-дослідних робіт які були виконанні на кафедрі клінічної імунології та алергології Національного медичного університету імені О.О.Богомольця в рамках наукових тем за планами МОЗ України: “Розробити нові методи діагностики та лікування імунозалежної патології на основі вивчення механізмів їх розвитку з врахуванням факторів міжклітинної кооперації” - № державної реєстрації 0199U002962 (2002-2004 рр.); “Розробка та впровадження нових методів імунодіагностики та імунотерапії атопічних захворювань” - № державної реєстрації 0105U003574 (2004-2006 рр.). У ході виконання планових наукових робіт автор виконував обов’язки відповідального виконавця, провів літературний та патентний пошук, підбір та клінічне обстеження хворих, вибір тактики їх лікування та розробив диференційний підхід щодо імунодіагностики хворих на різні клінічні форми АД.

Мета дослідження: Визначити системні та локальні особливості імунологічних механізмів розвитку IgE-залежної й IgE-незалежної форм АД, оптимізувати критерії їхньої диференціальної діагностики та намітити можливі шляхи медикаментозної корекції.

Завдання дослідження:

1. Дослідити імунофенотипічні властивості мононуклеарних клітин та їх співвідношення у периферичній крові хворих з різними формами АД у гострому та хронічному періоді захворювання.

2.З'ясувати функціональні особливості клітин CD4+Т-хелперної субпопуляції лімфоцитів периферичної крові хворих на IgE-залежну й IgE-незалежну форму АД на підставі визначення експресії CD45RO, CD45RА, HLA-DR, CD25 та CLA антигенів.

3. Дослідити імунофенотипічні властивості CD14+ клітин моноцитарно-макрофагального ряду периферичної крові, визначаючи експресію високо- та низькоафінних рецепторів для IgE (FcRI, FcRII) у хворих на IgE-залежну та IgE-незалежну форму АД.

4. Вивчити імуногістохімічі особливості клітин що формують склад запальних інфільтратів ураженої шкіри у хворих IgE-залежною та IgE-незалежною формою АД.

5. Вивчити кількісні зміни й характер розподілу в епідермісі запаленої шкіри клітин, експресуючих молекули CD1a та HLA-DR, ко-стимуляторні молекули (CD80, CD86), молекули адгезії ICAM-1 та рецептори до гамма-інтерферону (ІFN-R) у хворих з різними формами АД.

6. З'ясувати особливості цитокінового профілю периферичної крові хворих на IgE-залежну та IgE-незалежну форму АД в гострому та хронічному періоді захворювання на підставі визначення фонового рівня концентрації IL-2, IL-5, IL-10, IL-12, IL-16, IL-18, а також ІFN- та TNF-.

7. Дослідити ступінь функціональної активності мононуклеарних клітин циркулюючої крові за рівнем спонтанної та індукованої продукції in vitro цитокінів ( IL-1, TNF-, IL-12, IL-2, IFN-, IL-4, IL-5, IL-10 і TGF-) у хворих IgE-залежною й IgE-незалежною формою АД в гострому та хронічному періоді захворювання.

8. Провести імунофенотипічний аналіз культивованих in vitro лімфоцитів ураженої шкіри хворих IgE-залежною та IgE-незалежною формою АД.

9. Визначити in vitro рівень проліферативної активності лімфоцитів, виділених із запаленої шкіри хворих АД, при стимуляції стафілококовим токсином токсичного шоку - 1 (TSST-1) та ентеро-токсином В (SEB).

10. Вивчити можливість асоціації HLA фенотипу індивіда з розвитком IgE-залежної та IgE-незалежної форм АД.

11. Дослідити імуномодулюючий ефект препарату Ербісол, визначаючи in vitro характер його впливу на продукцію цитокінів: IFN-, IL-4 і TGF- мононуклеарними клітинами крові хворих IgE-залежною формою АД.

12. Вивчити протизапальний ефект антигістамінних препаратів, визначаючи зміни спонтанної та індукованої продукції цитокінів мононуклеарними клітинами крові in vitro і експресію кератиноцитами молекул адгезії ICAM-1 in vivo у хворих IgE-залежною формою АД.

Об’ект дослідження: імунні механізми, що формують розвиток запального процесу в шкірі хворих атопічним дерматитом.

Предмет дослідження: характеристика локальних і системних імунних реакцій при IgE-залежній і IgE-незалежній формі АД.

Методи дослідження: клінічні, лабораторні, імунологічні, імуногістохімічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Основні положення, які характеризують новизну результатів досліджень, що виносяться на захист, зводяться до наступного: Доведено, що формування IgE-залежної форми АД пов'язано зі збільшенням кількості клітин периферичної крові, експресуючих маркери CD25 і HLA-DR, збільшенням у рамках субпопуляції CD4+ Т-лімфоцитів чисельності клітин з експресією CD45RA, CD45RO, CLA антигенів, а також збільшенням чисельності CD14+CD16+ і CD14+FcеRI+ моноцитів. Для IgE-незалежної форми АД характерних розходжень у співвідношеннях клітин імунної системи периферичної крові не виявлено.

Показано, що IgE-залежна форма АД характеризується збільшенням кількості CD1a+дендритних клітин епідермісу, експресуючих ко-стимуляторні молекули CD80 та CD86, збільшенням кількості кератиноцитів, що експресують рецептори до IFN-, молекули адгезії ICAM-1 та HLA-DR антигени, а також збільшенням кількості клітин дермального інфільтрату що експресують CD25 та HLA-DR антигени. При аналогічному зіставленні імуноморфологічних властивостей епідермального та дермального компонентів ураженої шкіри хворих різними формами АД у хворих на IgE-незалежну форму АД особливостей не виявлено.

Встановлено розходження в цитокіновому профілі периферичної крові хворих IgE-залежною та IgE-незалежною формами АД, як у гострому, так і в хронічному періоді захворювання. IgE-залежна форма АД, на відміну від IgE-незалежної форми в гострому періоді захворювання супроводжується збільшенням у крові рівня концентрації цитокінів Th2 профілю та зниженням рівня концентрації цитокінів Th1 профілю. Для хронічного періоду IgE-залежної форми АД характерне підвищення в крові концентрації IL-2, IL-5, IL-12, IL-16, IL-18, а також підвищення показників рівня концентрації IFN- та TNF-.

Отримані нові дані про функціональні властивості мононуклеарних клітин крові хворих різними формами АД, що виявилися в спонтанній та індукованій продукції цитокінів в умовах in vitro. Для IgE-залежної форми АД був характерний високий рівень індукованої продукції клітинами IL-5, IL-12, TNF- і IFN- при незначному підвищенні рівня продукції IL-1, IL-2, IL-10 і зменшенні продукції TGF-. Для мононуклеарних клітин крові хворих IgE-незалежною формою АД був характерний високий рівень спонтанної продукції TGF- і IFN-, при незначному підвищенні IL-5, IL-1, IL-12, IL-4. Для цієї форми АД було також характерне підвищення індукованої продукції IL-12, TGF-, TNF-, IL-4, при підвищенні продукції IL-1, IL-2, IL-5, IL-10 і зниженні продукції IFN-.

Вперше показано, що IgE-залежна форма АД характеризується асоціацією з HLA-А24, В7, В22, DR2 фенотипами, що не характерно для IgE-незалежної форми захворювання.

При випробуванні виявлені нові властивості препарату Ербісол, які проявляються в здатності стимулювати in vitro продукцію цитокінів TGF- і IFN- лімфоцитами, виділеними із крові хворих IgE-залежною формою АД.

Вперше виявлено властивості антигістамінного препарату цетиризин, що проявляються в збільшенні синтезу мононуклеарними клітинами крові TGF- та IL-10, а також у зменшенні експресії молекул адгезії ICAM-1 кератиноцитами базального відділу епідермісу у хворих IgE-залежною формою АД.

Практичне значення та впровадження одержаних результатів. На підставі великої кількості досліджень автором розкриті нові механізми імунопатогенезу різних клінічних форм АД та запропонований імунодіагностичний алгоритм, що дозволяє проводити диференціальну діагностику між IgE-залежною й IgE-незалежною формою АД.

Запропоновано новий метод культивування лімфоцитів, що інфільтрують уражену шкіру, який дозволяє провести кількісний імунофенотипічний аналіз лімфоцитарного складу запального інфільтрату у хворих різними формами АД, а також визначити ступінь проліферативної активності лімфоцитів у відповідь на дію стафілококових токсинів.

Проведені в умовах in vitro експерименти дозволили встановити, що препарат Ербісол має ефект із впливом на клітинну ланку та цитокіновий профіль, що дає можливість включити його в схему імунотропної терапії у хворих IgE-залежною формою АД. На підставі клініко-лабораторних і сучасних імунологічних досліджень були продемонстровані позитивні ефекти пролонгованої терапії сучасним антигістамінним препаратом цетиризин.

Запропонований алгоритм диференціальної імунодіагностики та методи лікування хворих на різні клінічні форми АД апробовано на кафедрі клінічної імунології та алергології Національного медичного університету імені О.О.Богомольця та в клініці Київського міського шкірно-венерологічного диспансеру. Результати дослідження та запропоновані методи діагностики та лікування хворих на АД можуть бути впроваджені в спеціалізованих клініках та при амбулаторному лікуванні фахівцями відповідного профілю - алергологами, клінічними імунологами, дерматологами, а також у навчальний процес (в тематику лекцій та практичних занять на кафедрах клінічної імунології та алергології, дерматовенерології, патологічної анатомії та клінічної фармакології. Матеріали дисертації увійшли в розділи посібника під редакцією професора Г.М. Дранніка: „Навчальний посібник з клінічної імунології та алергології для позааудитної роботи студентів” (Київ, 2005 р.). Методичні підходи до імунодіагностики IgE-залежної та IgE-незалежної форм АД дозволяють рекомендувати їх для використання, крім вищезгаданих фахівців, лікарями-лаборантами і педіатрами.

Особистий внесок здобувача. Ідея дисертаційної роботи запропонована автором і підтримана провідними спеціалістами в області клінічної імунології, алергології та дерматології - доктором медичних наук, професором Г.М. Дранніком і доктором медичних наук, професором Б.Т. Глухеньким. Автором самостійно проведено відбір, обстеження та лікування хворих АД зі спостереженням пацієнтів у динаміці. Діагностика і терапія хворих на АД проводилася за допомогою як традиційних, так і запропонованих дисертантом науково-обґрунтованих внаслідок проведених досліджень методів. У процесі роботи над дисертацією автором оптимізовані та розроблені методи диференційної імунодіагностики і терапії різних форм захворювання. Загально-клінічне, алергологічне, імунологічне та імуногістохімічне обстеження хворих було проведено автором спільно з фахівцями відповідного профілю. Дерматологічне обстеження пацієнтів відбувалося на клінічній базі НМУ - Київського міського шкірно-венерологічного диспансеру і кафедри клінічної імунології та алергології НМУ імені О.О.Богомольця. Імунологічні дослідження були проведені разом зі співробітниками імунологічних лабораторій інститутів урології, нефрології та гематології АМН України. Імуногістохімічні дослідження були проведені спільно з фахівцями кафедри патологічної анатомії Буковинського державного медичного університету та лабораторіями патоморфології інститутів урології та нефрології АМН України. Розробка основних напрямків досліджень, визначення мети і завдання роботи, а також аналіз отриманих результатів, положень і висновків проведено автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були повідомлені та обговорені на конференціях і з'їздах: “V Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології та алергології” (Київ, 2000); Всеукраїнський науково-практичній конференції “Імунозалежні, мікотичні, паразитарні дерматози та захворювання, що передаються статевим шляхом” (Київ, 2001); “Науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю Наукового товариства лікарів-дерматовенерологів міста Києва” (Київ, 2001); “VI Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації” (Київ, 2002);

“І Українській науково-практичній школи-семінару з актуальних питань клінічної імунології та алергології” (Судак, 2003); VI Міждисциплінарній науково-практичній конференції: „Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика, лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій” (Київ, 2004);

“VII Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації” (Київ, 2005); I(VIII)З’їзді української асоціації лікарів-дерматовенерологів і косметологів” (Київ, 2005); “VIIІ Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології та імунореабілітації” (Київ, 2007); “II Національному конгресі з клінічної імунології та алергології” (Миргород 2007).

На міжнародних симпозіумах і конгресах: “American College of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting”(Orlando, USA, 2001); “American Academy of Allergy, Asthma and Immunology 58th Annual Meeting”(New-York, USA, 2002); “World Allergy Organization Congress – XVIII ICACI” (Vancouver, Canada, 2003); American Academy of Allergy, Asthma and Immunology 60th anniversary meeting” (Denver, USA, 2003); “XXII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology” (Paris, France, 2003); “American College of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting”(New Orleans, USA, 2003); “American College of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting”(Boston, USA, 2004); “American Academy of Allergy, Asthma and Immunology 61st Annual Meeting” (San-Antonio, USA, 2005); “Federation of Clinical Immunology Societies (FOCIS) 5th Annual Meeting”(Boston, USA, 2005); “World Allergy Congress” (Munich, Germany, 2005); “American College of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting” (Anaheim, USA, 2005); “American Academy of Allergy, Asthma and Immunology 62nd Annual Meeting” (Florida, USA. 2006); “XXV Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology” (Vienna, Austria, 2006); “American College of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting” (Philadelphia, USA, 2006); “American Academy of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting” (San Diego, USA, 2007); “XXVI Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology” (Goteborg, Sweden, 2007); “American College of Allergy, Asthma and Immunology Annual Meeting”(Dallas, USA, 2007).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи достатньо повно висвітлені у 55 роботах, у тому числі в 27 статтях у фахових наукових журналах, які входять до переліку ВАК України, 28 в матеріалах конференцій: тезах та постерних доповідях, з яких 17 опубліковано за кордоном.

Структура та обсяг дисертації. Загальний обсяг дисертації становить 320 сторінок, робота складається із вступу, огляду літератури, 8 глав власних досліджень, аналізу та узагальненню отриманих результатів, висновків, рекомендацій щодо наукового та практичного використання здобутих даних. Результати досліджень відображені у 32 таблицях та у 35 малюнках. Вказівник літератури включає 350 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дисертаційна робота базується на аналізах результатів обстеження та лікування 160 хворих з різними клінічними формами атопічного дерматиту, які перебували на стаціонарному та диспансерному лікуванні в умовах поліклінічного та стаціонарного відділень клініки Київського міського шкірно-венерологічного диспансеру, а також на базах кафедри клінічної імунології та алергології НМУ імені О.О.Богомольця що розташовуються на території вузлової залізничної лікарні № 1 ст. Дарниця та поліклініки № 3 Подільського району м. Києва в період з 1999 по 2006 рр. Досліджувану групу склали винятково дорослі люди віком від 16 до 55 років. По вікових групах хворі розподілилися в такий спосіб (рис.1). Контрольну групу склали 30 здорових осіб репрезентативного віку.

Рис. 1. Процентний розподіл хворих за віком.

Комісією з біоетики Національного медичного університету імені О.О.Богомольця (протокол № 20 від 30.05.07 р.) встановлено, що обстеження, лікування хворих, проведення лабораторних та наукових досліджень в дисертаційній роботі відповідають вимогам норм біоетики.

Діагноз атопічний дерматит визначався згідно широко використовуваним в зарубіжній і вітчизняній практиці клінічним критеріям, запропонованим Hanifin і Rajka [1980] та підтвердженим рекомендаціями об'єднаного експертного комітету європейської та американської академій алергології та клінічної імунології [PRACTALL, 2006]. У більшості обстежених хворих спостерігалися 2 основних і 3-4 додаткових клінічних критеріїв, що було достатньо для постановки діагнозу. Беручи до уваги поліморфізм клінічної картини АД, а також відсутність єдиної думки із приводу класифікації дерматозу, ми провели поглиблене комплексне клініко-лабораторне обстеження всіх 160 хворих. При розподілі хворих на групи ми використовували один з основних діагностичних лабораторних критеріїв АД, запропонованих проблемною комісією по номенклатурі атопічних захворювань Європейської академії алергології та клінічної імунології [EAACI, 2001] яким служила висока концентрація загального IgE в крові хворих на АД. Відповідно до цих рекомендацій всі обстежені хворі атопічним дерматитом (80 пацієнтів), що мали високі рівні, як загального, так і специфічного IgE були визначені нами в групу IgE-залежної форми АД.

Хворі, з типовими клінічними проявами захворювання, у яких концентрації загального і специфічного IgE були низькими, або перебували в межах показників вікової норми, склали групу (80 хворих) IgE-незалежної форми атопічного дерматиту.

Відповідно до встановлених мети і завдань при обстеженні пацієнтів підбиралися та використовувалися загальноприйняті в алергології та клінічній імунології клініко-анамнестичні та лабораторні методи дослідження. Основна увага приділялась збору алергологічного анамнезу.

Концентрацію загального та алерген специфічного IgE в сироватці крові визначали відповідними тест-системами методом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) за методикою запропонованою фірмою “ICN” (СШA).

Рівень імуноглобулінів (IgG, IgМ і IgА) та сироваткових цитокінів ( IL-2, IFN- і TNF-, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-12, IL-16, IL-18 та sIL-2R) також визначали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Для визначення концентрації цитокінів використовували методики та комерційні набори тест-систем фірм “Immunotech” і “Diaclone” (Франція).

Для визначення спонтанної та індукованої продукції цитокінів мононуклеарами периферичної крові in vitro використовувалося культуральне середовище RPMI-1640, що містило 10% ембріональної телячої сироватки, 40 мкг/мл гентаміцина, 5х10 М 2-меркаптоетанола та 3% L-глютамін. Клітинну суспензію в концентрації 1,5х10 кл/мл інкубували 24 години в СО2-інкубаторі при 37єС без стимулюючого агента, а також у присутності мітогенів. По закінченні строку інкубації клітини осаджували центрифугуванням при 1600 об/хв. протягом 10 хвилин, збирали супернатанти та зберігали до тестування при -20єС. Вміст цитокінів (IL-1, TNF-, IL-12, IL-2, IFN-, IL-4. IL-5, IL-10 та TGF-) у супернатантах визначали за допомогою методу імуноферментного аналізу, згідно методики запропонованої фірмами-виробниками:“Immunotech” і “Diaclone” (Франція).

Антигени HLA визначали за допомогою стандартного мікролімфоцитотоксичного тесту на планшетах Терасакі з використанням спеціальної панелі анти-HLA сироваток, за допомогою якої можна визначити більше 20 антигенів локусу А, близько 30 - локусу В и 20 антигенів локусу DR. Лімфоцити, необхідні для проведення типування, виділяли з гепаринізованої периферичної крові шляхом центрифугування на градієнті щільності фікол-верографіна.

Вірогідність різниці в частоті визначення порівнюваних HLA-антигенів оцінювали за допомогою критерію хі-квадрат. У випадках, коли один з показників був менше 10, для оцінки вірогідності різниці використовували метод Фішера. Величину відносного ризику захворювання (RR) визначали за коефіцієнтом: RR = аб/вг, де а – кількість хворих, позитивних по даному антигену, б – кількість осіб у контролі, негативних по даному антигену, в – кількість хворих, негативних по даному антигену, г – кількість осіб у контролі, позитивних по даному антигену. При цьому вірогідно значимими вважали показники RR>2,0.

Визначення імунотипових властивостей та кількісних співвідношень клітин мононуклеарної фракції периферичної крові здійснювали за допомогою метода лазерної проточної цитофлуорометрії. Виділені мононуклеарні клітки периферичної крові хворих на АД і здорових донорів фарбували за допомогою прямого одно- і двокольорового імунофлуоресцентного метода. У дослідженні використовували різні панелі моноклональних антитіл, мічених як флюоресцєїном, так і фікоерітрином. Список застосованих в дослідженні мкАТ приведений в табл. 1.

Імунофенотипічний профіль клітин вивчали на проточному лазерному цитофлуориметрі FACScan фірми “Becton Dickinson” (CШA). Збір даних і статистичну обробку отриманих результатів проводили за допомогою програмного забезпечення LYSYS-II Ver.I.I. (Becton Dickinson), Win MDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, LA Jolla, CA, USA) та Microsoft Excel 2000 з пакета Microsoft Office 2000.

З метою встановлення остаточного діагнозу АД та диференційної діагностики АД та Т-клітинної лімфоми шкіри у 33 хворих було проведено гістологічне та імуногістохімічне дослідження біоптатів ураженої шкіри. Досліджувалися біоптати шкіри, діаметром 3мм. Біоптичний матеріал брався після письмової згоди пацієнтів. Контролем служили біоптати шкіри, одержані при косметологічних операціях. Біоптати після узяття заморожували в рідкому азоті або безпосередньо в кріостаті. В умовах кріостата одержували послідовні серійні зрізи завтовшки 10 мікрон. Одержані серійні кріостатні зрізи наносили на стекла, покриті поли L-лізином, підсушували на повітрі протягом 1 години і фіксували 5 мін в ацетоні при температурі 3°С. У дослідженні було застосовано стандартний метод біотін-стрептавідін імунопероксидазного фарбування (Strept ABComplex/HRP) виробництва фірми “DAKO”(Данія) з використанням як хромогенного субстрату 3-амино-9-этилкарбозола (АЕС) або ж 3,3’ діамінобензідіна солянокислого (DAB). Фонове фарбування проводили за допомогою гематоксиліна. У дослідженні використовували панель моноклональних антитіл різної антигенної спрямованості (список антитіл приведений в табл. 1).

Таблиця 1

Моноклональні антитіла, використані у дослідженнях

CD | Маркер | Фірма-Виробник

CD1a | Дендритні клітини, клітини Лангерганса | DAKO

CD3 | Pan Т-лімфоцити | DAKO

CD4 | Т-лімфоцити хелпери | DAKO

CD8 | Т-лімфоцити кілери/супресори | DAKO

CD14 | Моноцити/макрофаги | Beсton Dickinson

CD16 | NK-клітини | Beсton Dickinson

CD19 | Pan В-лімфоцити | Beсton Dickinson

CD22 | Pan В-лімфоцити | DAKO

CD25 | Клітини, що несуть IL-2R, T-reg | Beсton Dickinson

CD56 | NK-клітини | DAKO

CD80 | Молекули ко-стимуляції (В7.1) | Beсton Dickinson

CD86 | Молекули ко-стимуляції (В7.2) | Beсton Dickinson

HLA-DR | Антиген головного комплексу гістосумісності II класу | DAKO

CLA | Шкірний лімфоцитарний антиген | Beсton Dickinson

CD54 | Адгезивні молекули ICAM-1 | Beсton Dickinson

FcRI | Високоафінний рецептор IgE | Hoffmann-La Roche

FcRII/23 | Низькоафінний рецептор IgE | Beсton Dickinson

CD119 | Рецептор до ІFN- | Caltag laboratories

CD45RO | Т-лімфоцити пам'яті/ефекторні клітини | Beсton Dickinson

CD45RA“ | Наївні” Т-лімфоцити | Beсton Dickinson

CD7 | Адгезивна молекула | Beсton Dickinson

Отримані результати оброблені статистично на персональному комп'ютері за допомогою пакета програм “SPSS for Windows. Версія 11” і “MedStat”. Математична обробка отриманих результатів проводилася з урахуванням перевірки показників на нормальний розподіл і порівняння груп за ознаками статі й віку з використанням тесту Колмогорова-Смирнова і критерію хi-квадрат [Славин М.Б., 1989]. Для статистичної обробки використовувалися параметричні критерії статистики - тест Ст’юдента або метод Шефе та непараметричні - критерій Уілкоксона, аналіз Крускала-Уолліса [Пилипенко М.І., 2000]. Для порівняння залежних вибірок використовували критерії Ст’юдента і Уілкоксона. Достовірною вважали різницю при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При зіставленні клітинних гематологічних показників периферичної крові здорових осіб і хворих, що знаходилися у гострому періоді IgE-залежної форми АД звертає на себе увагу значне збільшення чисельності CD3+, CD4+, CD19+ і CD56+ лімфоцитів (табл. 2). Збільшення чисельності CD4+ клітин хелперної популяції було найвагомішим (65,5%, контроль - 38,4%). Трохи, але зростала чисельність CD8+Т-клітин, що належать до субпопуляції кілерів/супрессорів. У хелперній субпопуляції Т-лимфоцитів зростала чисельність активованих клітин з маркером CD4+HLA-DR+ (18.1%, контроль – 6.2%) та чисельність CD4+CD25+ Т-лімфоцитів (24.9%, контроль – 5.3%). Підвищення в крові рівня загального IgE, властивого для загострення IgE-залежної форми АД, супроводжувалося підвищенням в крові чисельності CD19+В-лимфоцитов (26,3%, контроль – 17,2%). Відмічені зміни вказують на активацію імунітету системного рівня з характерним підкріпленням гуморальної ланки надходженням з кісткового мозку в кров незрілих В-лімфоцитів та їх подальшим перетворенням в зрілі В-лімфоцити та плазматичні клітини. Для гострого періоду IgE-залежної форми АД було властиве також збільшення в крові чисельності CD14+ клітин мієлоїдного ряду. Підвищувалася кількість CD14+CD16+ клітин – попередників макрофагів та дендритних клітин (21.6%, контроль – 9.1%), а також CD14+FcеRI+ клітин (8.5%, контроль – 2.5%), що мають на своїй поверхні високо афінний рецептор до імуноглобуліну E. Вихід CD14+CD16+ клітин в зону запалення повинен супроводжуватися посиленням напруженості у запаленні, а із зростанням кількості CD14+FcеRI+ клітин буде пов’язане підвищення реактогенності на присутність алергену.

При зіставленні клітинних показників крові у гострому періоді IgE-залежного АД та IgE-незалежного АД з показниками норми звертає на себе увагу відсутність в крові хворих при загостренні IgE-незалежного АД істотних змін в чисельності CD3+, CD4+, CD4+HLA-DR+, CD4+CD25+, CD8+, CD56+Т-лімфоцитів, CD19+В-лімфоцитів, а також CD14+CD16+ та CD14+FcеRI клітин. При чому, чисельність цих клітин була близька до показників норми. Виявлені особливості гострого періоду IgE-незалежного АД вказують на малий ступінь реактогенності імунітету на системному рівні при цій формі захворювання.

Для хронічного перебігу IgE-залежного АД було властиве збереження в крові великої чисельності CD19+В-лімфоцитів та не таке помітне зменшення чисельності CD3+, CD4+, CD4+ CD25+Т-лімфоцитів. Зіставлення клітинних показників хронічного перебігу IgE-залежного АД та хронічного перебігу IgE-незалежного АД показує чітку відмінність у кількості CD19+В-лімфоцитів. Хронічному перебігу IgE-залежного АД була властива велика кількість CD19+В-лимфоцитів (27.1%, контроль – 17.2%) на відміну від IgE-незалежного АД де вміст CD19+В-лімфоцитів знаходився у межах норми. В хронічному періоді IgE-залежного АД у хворих була відмічена велика чисельність CD4+HLA-DR+ і CD4+CD25+ клітин. Незначне перевищення показника норми в кількості цих клітин спостерігалося й при хронічному перебігу IgE-незалежного АД.

Таблиця 2

Субпопуляційний склад та експресія маркерів активації клітинами імунної системи периферичної крові хворих на IgE-залежну АД та IgE-незалежну форму АД

CD фенотип % | Контрольна група |

IgE-залежна форма АД

Загострення | IgE-залежна форма АД

Хроніч. стад | IgE-незалеж форма АД

Загострення | IgE-незалеж форма АД

Хроніч. стад

CD3+56,4±2,4 | 84,3±3,2* | 66,5 ± 4,8* | 67.1±3,6 | 63,3 ± 2,5

CD4+T | 38,4 ± 2,5 | 65,5±2,7* | 52,3 ± 3,2* | 42,2±1,6 | 42,9 ± 1,2

CD8+ | 19,7 ± 3,9 | 23,3±1,5 | 20,6 ± 1,2 | 18,3±9,3 | 18,2 ± 3,5

CD19+ | 17,2 ± 5,4 | 26,3±4,9* | 27,1 ± 3,8 * | 16,5±1,4 | 17,8 ± 1,4

CD56+ | 9,8 ± 0,021 | 15,5±4,5* | 14,9 ± 6,3* | 8,9±0,25 | 9,5 ± 0,22

CD4+HLA-DR+ | 6,2 ± 0,54 | 18,1±1,5* | 14,5 ± 2,5* | 7,3±0,13 | 8,2 ± 0,31

CD4+CD25+ | 5,3± 0,17 | 24,9±3,7* | 18,2±5,1* | 5,6±0,19 | 6,7±0,15

CD4+CLA+ | 11.5± 0,24 | - | 29.3± 3.4 | - | 13.5±2.1

CD8+CLA+ | 4.4±0,23 | - | 5.3± 1.4 | - | 3.9± 0,23

CD4+CD45RO+ | 19.2±5.3 | - | 32.5±1.8 | - | 18.5±3.4

CD4+CD45RO+CLA+ | 5.1±0,24 | - | 17.2±6.5 | - | 6.6±0,12

CD14+CD16+ | 9.1±0,34 | 21.6±1.3 | - | 10.2±5.4 | -

CD14+CD16- | 77.3±1.5 | 55.2±0,24 | - | 69.1±3.6 | -

CD14+FcеRI+ | 2.5±0,13 | 8.5±0,22 | - | 3.1±0,47 | -

CD14+ FcеRII+ | 1.2±0,24 | 1.4±0,31 | - | 1.3±0,15 | -

*- р < 0,05 достовірно в порівнянні з показниками в контрольній групі

Відмінності між IgE-залежною та IgE-незалежною формами АД в хронічному перебігу захворювання найчіткіше виявляються в особливостях субпопуляцій циркулюючих лімфоцитів (табл.2). IgE-залежна форма АД характеризується більшою присутністю в крові CD4+CLA+ Т-лімфоцитів (29,3%, норма – 11,5%), тобто лімфоцитів, здатних до міграції в шкіру, тоді як при IgE-незалежній формі АД такого виразного збільшення чисельності CD4+CLA+Т-лімфоцитів по відношенню до показників норми не спостерігається (13,5%, норма – 11,5%). Цікаво, що в крові хворих на різні форми АД не підвищується чисельність субпопуляції CD8+CLA+ Т-лімфоцитів, що теж мають здатність до міграції у шкіру (IgE-залежна форма – 5,3%, IgE-незалежна форма – 3,9%, норма – 4,4%). В умовах хронічного перебігу IgE-залежного АД в циркулюючій крові серед лімфоцитів хелперної субпопуляції збільшується чисельність CD4+CD45RO+ клітин пам'яті (32,5%, норма – 19,2%), чого не відмічено у групі хворих з хронічним перебігом IgE-незалежної форми захворювання (18,5%). Більш того, 17,2% CD4+CD45RO+ Т-лімфоцитів периферичної крові в хронічному періоді IgE-залежного АД виявилися здатними до міграції в шкіру, експресуючи молекулу CLA (CD4+CD45RO+CLA+ Т-лімфоцити), тоді як в хронічному періоді IgE-незалежного АД цей показник виявився значно нижчим (6.6%, норма – 5.1%). Ці особливості на нашу думку можуть служити диференційним діагностичним критерієм для розмежування різних клінічних форм АД.

Імунна відповідь визначається активацією клітинних систем локального і системного рівня, їх регуляторною і коригуючою взаємодією. Ці взаємодії клітинних систем здійснюються за допомогою цитокінів. Градієнтом локальної концентрації цитокінів визначаються локальні параметри клітинних реакцій у вогнищі запалення, а фоновим рівнем концентрації цитокінів крові визначається як якісний рівень системної відповіді, так і якісні і кількісні особливості локальної реакції у формі запалення. В цілому, рівень концентрації цитокінів в периферичній крові повинен відображати особливості і параметри формування імунної відповіді при АД.

Таблиця 3

Рівень цитокінів периферичної крові у хворих на IgE-залежну та IgE-незалежну форму АД.

Цитокіни | Контроль | Загострення | Хронічна стадія

IgE-залежна | IgE-неза-лежна | IgE-залежна | IgE-неза-лежна

IL-2 pg/ml | 15,7± 7,2 | 25,7±3,2* | 25,1±1,5* | 25,5±9,7* | 17,5±2,3

IFN-г pg/ml | 2,3±0,18 | 0.5±0,11* | 2.3±0,72 | 3,9±0,12* | 1,9±0,24

TNF-б pg/ml | 1,2±0,16 | 0,3±0,26* | 2,1±0,42* | 2,3±0,14* | 0,5±0,18*

IL-4 pg/ml | 20,1±3,7 | 50,3±6,5* | 25,3±1,2 | 25,2±3,3 | 25,1±4,3

IL-5 pg/ml | 15,3±4,3 | 103,2±8,3* | 18.7±8,2 | 50,6±6,7* | 20,3±3,4*

IL-10 pg/ml | 55,1±3,2 | 82,3±1,3* | 40,1±4,2 | 63,4±5,3* | 44,7±4,3*

IL-12 pg/ml | 1,1±0,02 | - | - | 0,1±0,07* | 0,05±0,003*

IL-13 pg/ml | 40,1±2,3 | - | - | 63,7±4,1 | 37,8±2,5

IL-16 pg/ml | 352.5±14,5 | 991.6±12,7* | 452.8±13,3* | 861,5±16,7* | 398,7±15,3

IL-18 pg/ml | 153,2±2,5 | - | - | 211.3±4,6* | 147.4±5,2

*- р < 0,05 достовірно в порівнянні з показниками в контрольній групі

Проведення зіставлень показує (табл. 3), що для гострого періоду обох клінічних форм АД характерне підвищення рівня ключового чинника імунної відповіді - IL-2, стимулюючого як лімфоїдний (Т- і В- лімфоцити), так і мієлоїдний компонент (IgE-залежна форма АД –25.7 pg/ml, IgE-незалежна форма –25.1 pg/ml, норма –15.7 pg/ml). Проте у фонових рівнях IL-4, IL-5 та IL-10 при загостренні IgE-залежного і IgE-незалежного АД помітні чіткі відмінності. IgE-залежний АД характеризується в цей час значним підвищенням рівня IL-4 (50.3 pg/ml, норма –20.1 pg/ml), IL-5 (103.2 pg/ml, норма –15.3 pg/ml) та IL-10 (82.3 pg/ml, норма –55.1 pg/ml), тоді як при IgE-незалежній формі при загостренні захворювання виразних змін у концентрації цитокінів не відмічено (IL-4 –25.3 pg/ml; IL-5 –18.7 pg/ml; IL-10 –40.1 pg/ml). У гострому періоді IgE-залежної форми АД спостерігалося зниження в крові рівня IFN-г (0.5 pg/ml; норма –2.3 pg/ml) та TNF-б (0.3 pg/ml; норма –1.2 pg/ml), тоді як при IgE-незалежній формі АД рівень IFN-г був в межах норми, а рівень TNF-б підвищувався (2.1 pg/ml; норма –1.2 pg/ml). Виявлені зміни відзначають особливості гострого періоду АД, що пов’язане з перевагою Тh2 типу імунної відповіді з характерним підвищенням продукції CD4+ Т-лімфоцитами IL-4, IL-5 та IL-10 в умовах їх стимуляції. Фоновим рівнем IL-4 визначається трансформація “наївних” CD4+Т-лимфоцитів в Тh2 фенотип. Рівень IL-4 також сприяє перетворенню В-лімфоцитів на клітини, що продукують антитіла. Переважне накопичення у вогнищі гострого запалення в умовах АД CD4+Т-лімфоцитів обумовлене підвищенням фонового рівня в крові IL-16 (IgE-залежна форма –991.6 pg/ml; IgE-незалежна –452.8 pg/ml; норма –352.5 pg/ml). IL-16, як відомий хемоатрактант лімфоцитів, вибірково сприяє міграції CD4+Т-лімфоцитів, будучи крім CD8+Т-лімфоцитів, продуктом еозинофілів, накопичення яких характерне для вогнища запалення при АД.

Для хронічного перебігу запалення IgE-залежної форми АД характерне деяке зниження в крові фонового рівня IL-4, IL-5 та IL-10, проте, в цілому, рівень цих цитокінів відповідно показникам норми залишається підвищеним (табл.3). Звертає на себе увагу високий рівень IL-16 (861.5 pg/ml; норма –352.5 pg/ml), який, як відмічено, сприяє міграції CD4+Т-лімфоцитів у зону запалення. У хронічному періоді IgE-залежного АД відмічено підвищення рівня IFN-г (3.9 pg/ml; норма –2.3 pg/ml) та TNF-б (2.3 pg/ml; норма –1.2 pg/ml). При хронічному перебігу IgE- незалежної форми АД не відмічено чітких змін у вмісті в крові IL-4, IL-5, IL-10, та IL-16, при виразному зниженні рівня TNF-б (0.3 pg/ml; норма – 1.2 pg/ml). Звертає на себе увагу відсутність змін у рівні IL-12 як при IgE-залежній, так і при IgE-незалежній формі АД. З підвищенням рівня IL-12 звичайно зв'язується перетворення “наївних” Т-лімфоцитів в Тh1 фенотип, а також хронізация локального запалення. Можливо, хронізация локального запалення не визначається тільки загальним фоновим рівнем IL-12. У хронічному періоді IgE-залежної форми АД має місце підвищення фонового рівня IL-18 (відомого індуктора продукції IFN-г), якого не відмічено при хронічному перебігу IgE-незалежної форми АД (IgE-залежна форма –211.3 pg/ml; IgE-незалежна –147.4 pg/ml; норма –153.2 pg/ml). У хронічному періоді IgE-залежної форми відмічене також підвищення рівня IL-13, чинника, що інгібірує запальний процес і підсилює гуморальну IgE-залежну відповідь (63.7 pg/ml; норма –40.1 pg/ml). Такого підвищення рівня IL-13 не відмічено при хронічному перебігу IgE-незалежної форми АД (37,8 pg/ml; норма – 40.1 pg/ml). На підставі виявлених змін можна припустити, що активація імунної системи в гострому і хронічному періоді IgE-залежної і IgE-незалежної форми АД неоднорідна. Відмічені відмінності можуть бути проявом дефектної реакції системного рівня у відповідь на стимуляцію або ж особливостями стимуляції імунної системи локальним запальним процесом в шкірі, оскільки фоновий рівень цитокінів крові є сумарним виразом продукції цитокінів як у вогнищі запалення (локальний рівень), так і в лімфоїдній тканині (системний рівень), де здійснюється презентація антигена дендритними клітинами.

Загальний рівень концентрації цитокінів у крові не відображує функціонального цитокін-продукуючого потенціалу клітин, мобілізованих з лімфоїдної системи в кровотік. Синтез цитокінів клітинами повинен проявити себе безпосередньо, після виходу цих клітин з кровотоку, в зоні запалення, де відбувається активація їх функції. У даному дослідженні зроблено вивчення цитокін-продукуючих властивостей клітин мононуклеарної фракції крові хворих з різними формами АД. Визначався рівень продукції цитокинів мононуклеарними клітинами в умовах in vitro без дії на них стимулюючого чинника (спонтанна продукція) і при неспецифічній стимуляції мітогеном (індукована продукція). Припускали, що в умовах in vitro повинна проявити себе як генетично обумовлена недостатність клітин щодо