НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ГАРАЩУК ОЛЬГА ВІТАЛІЇВНА

УДК 612.822

Механізми регуляції кальцієвого гомеостазу в сомі та дендритах нейронів центральної

нервової системи ссавців

03.00.13 – Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук України та Інституті фізіології Заарландського університету Федеративної Республіки Німеччини.

Консультант: академік, доктор біологічних наук, зав. відділом

фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Кришталь Олег Олександрович

Офіційні опоненти: професор, доктор біологічних наук, зав. відділом фізіології стовбура мозку Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Лиманський Юрій Петрович

професор, доктор біологічних наук, заступник директора Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Костерін Сергій Олексійович

доктор медичних наук, Головний науковий співробітник Інституту фармакології і токсикології АМН України, керівник Центру доклінічного вивчення лікарських засобів Державного нуково-експертного центру МОЗ України Соловйов Анатолій Іванович

Провідна установа: Інститут фізіології ім. Петра Богача при Київському Національному університеті им. Тараса Шевченка

Захист відбудеться 11 квітня 2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої ради Д-96.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано 17 лютого 2000 р.

Вчений секретар спеціалізовоної ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Вступ

Актуальність проблеми: Йони кальцію є одними з найбільш важливих і універсальних регуляторів клітинних функцій. Змінами їх внутрішньоклітинної концентрації регулюється ряд фізіологічних та біохімічних процесів, таких як проліферація, секреція, виникнення збудження та його розповсюдження, синтез білків та ін. (Kostyuk, 1992). Підтримання внутрішньоклітинної концентрації йонів кальцію ([Ca2+]i) на дуже низькому рівні (10-8 -10-7 моль/літр) в стані спокою та часовий перебіг підвищення [Ca2+]i під час клітинної активності забезпечується завдяки взаємодії різноманітних структур, розташованих як в цитоплазмі, так і в мембрані клітини.

Останнім часом зусиллями багатьох дослідників (Костюк, 1992) було досягнуто значного прогресу в з`ясуванні молекулярних та функціональних механізмів дії цих структур в ізольованих нейронах та нейронах, культивованих in vitro. Проте ряд важливих аспектів кальцієвого гомеостазу в інтактних нейронах та їх дендритах, місцях розташування синаптичних контактів, все ще залишаються нез`ясованими. Грунтовного дослідження вимагають також питання взаємодії цих механізмів як на рівні окремої клітини, так і на рівні нативних мереж нейронів. Особливо це стосується нейронів ЦНС, дослідження яких в умовах, близьких до природних (наприклад, в зрізах мозку), довший час залишалось недоступним із-за відсутності адекватних методичних підходів. В той же час вивчення різноманітних процесів, які в нейронах ЦНС регулюються змінами [Ca2+]i, неможливе без грунтовного знання механізмів регуляції їх кальцієвого гомеостазу, а саме: (1) механізмів входу Ca2+ через канали, розташовані в клітинній мембрані, (2) механізмів вивільнення Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо і (3) механізмів зв'язування Ca2+ в цитоплазмі як відповідними білками, так і внутрішньоклітинними Ca2+-депо.

Мета роботи полягала в з'ясуванні синаптичних та клітинних механізмів, що впливають на рівень [Ca2+]i в цитоплазмі нейронів ЦНС в зрізах мозку, а також у вивченні їхньої взаємодії та зміни в процесі онтогенезу.

Для досягнення даної мети були поставлені такі конкретні завдання:

1.Вдосконалити метод точного вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків з метою його застосування для вивчення рецептор-каналів, розташованих в сомі та дендритах нейронів ЦНС в зрізах мозку. Порівняти кальцієву проникність соматичних та дендритних йонотропних глутаматних рецептор-каналів (NMDA- та не-NMDA-типу) в збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС.

2.Охарактеризувати молекулярну будову даних рецептор-каналів. Дослідити взаємозвўязок між кальцієвою проникністю глутаматних рецептор-каналів певного типу та їх молекулярною будовою.

3.Дослідити функціональні властивості соматичних та дендритних внутрішньоклітинних Ca2+-депо, що відповідають за Ca2+-індукований викид Ca2+ в цитоплазму. Порівняти функціональні властивості цих депо в збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС.

4.З'ясувати роль Ca2+-зв'язуючих білків (на прикладі кальбіндину) та їх вплив на часовий перебіг внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів.

5.Вивчити механізми генерації кальцієвих сигналів в період раннього постнатального розвитку. З'ясувати роль ГАМК-активованого підвищення [Ca2+]i в сомі та дендритах.

6.Дослідити взаємодію різних механізмів регуляції [Ca2+]i та їх роль в процесі формування функціональної глутаматергічної синаптичної мережі під час раннього постнатального розвитку.

Наукова новизна. В процесі виконання роботи метод точного вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків було вдосконалено та вперше застосовано для визначення Ca2+-проникності глутамат-активованих рецептор-каналів, розташованих на сомі та дендритах нейронів в зрізах мозку щурів. Завдяки цьому вперше вдалося виміряти Ca2+-проникність дендритних глутамат-активованих рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу в фізіологічних умовах. Встановлено, що Ca2+-проникність дендритних, ймовірно синаптичних рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу, збігається з проникністю соматичних, позасинаптичних рецептор-каналів і становить 11.12% та 0.6% відповідно.

Досліджено особливості молекулярної будови рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу в принципових збуджуючих (на прикладі пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу), принципових гальмівних (на прикладі клітин Пуркіньє мозочку) нейронах, а також інтернейронах (на прикладі ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки) в зрізах мозку щурів. Виявлено, що властивості глутамат-активованих рецептор-каналів NMDA-типу зумовлюються присутністю домінантної NR2В-субодиниці.

Досліджено функціональні властивості соматичних та дендритних рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу та клітинах Пуркіньє мозочку щурів. Показано, що в умовах фонової клітинної активності вони виступають в ролі кальцієвого буферу, чим сприяють підтриманню [Ca2+]i на низькому рівні. У період підвищеної клітинної активності, навпаки, ці депо здатні значно підсилювати Ca2+-сигнали в цитоплазмі завдяки процесові Ca2+-активованого викиду Ca2+.

Виявлено механізм „ємнісного" входу Ca2+ в нейрони ЦНС. Показано, що цей трансмембранний Ca2+-потік відповідає за наявність Ca2+ всередині депо, а отже, за їх дієздатність в стані спокою. Показано, що рианодин-чутливі Ca2+-депо мають надзвичайно велику буферну ємність і під час потужної клітинної активності здатні накопичувати до 20 разів більше йонів кальцію, ніж їх там знаходиться в стані спокою. Виявлено, що йони кальцію, вміст яких всередині депо збільшується пропорційно до підвищення [Ca2+]i, повільно витікають звідти протягом наступних хвилин після відновлення контрольного рівня [Ca2+]i. Завдяки цим властивостям рианодин-чутливі кальцієві депо здатні виступати в ролі елементу "памўяті" або "детектора співпадіння", значно підсилюючи лише ті внутрішньоклітинні Ca2+-сигнали, котрі виникають під час посиленої клітинної активності.

Використовуючи методи генної інженерії створено мишей-мутантів, позбавлених кальцій-звўязуючого білку кальбіндину. Показано, що кальбіндин виступає в ролі швидкодіючого кальцієвого буферу, що драматично зменшує наявність вільного кальцію в цитоплазмі нейрону протягом перших 100 мс після активації входу Ca2+.

Досліджено механізми генерації внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів в період раннього постнатального розвитку щурів. Показано, що на ранніх стадіях постнатального розвитку, коли глутаматергічні синаптичні звўязки перебувають в зародковому стані, ГАМК, що є основним гальмівним нейромедіатором ЦНС у дорослому віці, викликає синаптичне збудження та генерацію внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів в сомі та дендритах пірамідних нейронів гіпокампу внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів, а також Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Виявлено, що 85 % нейронів в зрізах гіпокампу щурів віком 1-7 днів бере участь в генерації спонтанних періодичних (0.007-0.03 Гц) Ca2+-сигналів, які виникають в усіх нейронах одночасно. Ці кальцієві осциляції в період раннього постнатального розвитку мають синаптичне походження і критично залежать від активації збуджуючих ГАМК-ергічних синапсів. Встановлено, що виявлена нейрональна активність здатна трансформувати зародкові глутаматергічні синаптичні контакти в функціональні синаптичні контакти зрілого типу і, таким чином, сприяти формуванню повноцінної мережі синаптичних зв`язків. В основі цієї здатності лежить синхронна активація описаних в роботі механізмів регуляції [Ca2+]i, як то глутамат- та ГАМК-активованих рецептор-каналів, потенціал-залежних Ca2+-каналів та внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Зважаючи на те, що зародкові глутаматергічні синаптичні контакти було виявлено при народженні, крім гіпокампу, також в корі (Isaac, 1997; Rumpel, 1998) та спинному мозку (Li, 1998) ссавців та оптичному тектумі амфібій (Wu, 1996), вперше описаний в даній роботі механізм переходу зародкових глутаматергічних синаптичних контактів в функціональні синаптичні контакти зрілого типу може мати універсальне значення.

Практична цінність роботи полягає у вдосконаленні методів вимірювання з метою дослідження Ca2+-проникності агоніст-активованих рецептор-каналів, розташованих в місцях синаптичних контактів, та у висвітленні механізмів регуляції кальцієвого гомеостазу як в нейронах дорослих тварин, так і в нейронах, що знаходяться в процесі постнатального розвитку. Отримані в роботі дані про домінантну роль NR2В-субодиниці дають основу для створення високоселективних фармакологічних засобів, здатних протидіяти викликаній глутаматом під час травматичних пошкоджень та ішемії цитотоксичності. Висвітлення збудливої дії ГАМК під час раннього постнатального розвитку сприяє створенню ефективних лікарських засобів, які могли б застосовуватись при лікуванні дитячої епілепсії. Натепер найбільш поширеним терапевтичним засобом для лікування дитячої епілепсії є пентобарбітал, речовина, що підсилює ГАМК-активовані синаптичні струми. Не дивлячись на успішну дію цього препарату при лікуванні епілепсії у дорослих, чисельні дослідження вказують на обмежений успіх цього препарату при лікуванні новонароджених (Holmes, 1998), в ЦНС яких дія ГАМК є, найбільш ймовірно, збуджуючою. Більше того, дослідження, проведені на тваринах, вказують на негативний вплив пентобарбіталу на збільшення ваги мозку та розвиток сенсорних функцій під час постнатального розвитку (Mikati, 1994).

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідались на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Інституту біофізичної хімії імені Макса Планка (Гьоттінген, Німеччина), Інституту фізіології Заарландського Університету (Гомбург, Німеччина), Конференціях фізіологічного (Мюнхен, 1993; Йена, 1994; Мюнстер, 1995; Росток, 1997; Бонн 1999) та фармакологічного (Майнц, 1998) товариств Німеччини, Конференції фізіологічного товариства Великобританії (Лондон, 1993), Конференції Європейської асоціації з нейронаук (Відень, 1994; Берлін, 1998), Обўєднаній конференції німецького та швейцарського фізіологічних товариств (Цюріх, 1996), Конференціях нейрофізіологічного товариства Німеччини (Гьоттінген, 1995; 1997; 1999), Міжнародному симпозіумі з кальцій-звўязуючих білків (Лунд, 1997), Міжнародному симпозіумі з властивостей та функції глутаматних рецепторів (Тюбінген, 1998), Конференціях американського товариства з нейронаук (Вашінгтон, 1996; Нью-Орлеан, 1997; Лос Анджелес, 1998, Майамі, 1999) та лекціях, прочитаних на запрошення центру молекулярної медицини ім. Макса Дельбрюка (Берлін, 1998), відділу біохімії інституту психіатрії ім. Макса Планка (Мюнхен, 1998), біологічного факультету Бохумського університету (Бохум, 1999), медичного факультету університету ім. Мігеля Хернадеца (Аліканте, 1999) і біологічного факультету Кайзерслаутернського університету (Кайзерслаутерн, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 статей у наукових журналах та книгах.

Обсяг та структура дисертації. Роботу викладено на 230 сторінках друкованого тексту та проілюстровано 73 малюнками і 4 таблицями. Дисертація складається з вступу, опису сучасного стану досліджень, методів дослідження, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел з 220 найменувань.

ОбўЄкти та методи дослІдженнЯ

Робота виконувалась на візуально ідентифікованих нейронах в трансверсних зрізах гіпокампу, фронтальних зрізах серединної перетинки та сагітальних зрізах мозочку щурів (Garaschuk, 1995; Garaschuk, 1996; Garaschuk, 1997; Plant, 1997; Garaschuk, 1998). В дослідженнях використовували нейрони, розташовані на відстані 20-40 µм від поверхні зрізу, що сприяло збереженню будови нейронів та їх нативних синаптичних контактів. В більшості експериментів було поєднано електрофізіологічні та флюорометричні методи дослідження з метою одночасної реєстрації змін внутрішньоклітинної концентрації Ca2+ ([Ca2+]i) та асоційованих змін потенціалу на мембрані нейрону. Для реєстрації електричних сигналів використовували підсилювач EPC-9 (HEKA, Ламбрехт, Німеччина). Процеси запису даних, електричної стимуляції клітин та аплікації хімічних речовин контролювалися за допомогою комп`ютерної програми "Pulse" (HEKA, Ламбрехт, Німеччина). Для реєстрації флюорометричних Ca2+-сигналів використовували як установку на базі CCD-камери (charge-coupled device camera) (Garaschuk, 1998), так і установки на базі конфокального мікроскопу з одно- та двофотонним збудженням барвника. Забарвлення нейронів Ca2+-чутливим барвником fura-2 проводили або шляхом включення барвника у склад внутрішньоклітинного розчину, або шляхом інкубації зрізів в зовнішньоклітинному розчині, що містив fura-2 AM, спеціальну форму барвника, здатну проникати через клітинну мембрану (Garaschuk, 1998).

Для вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків, викликаних активацією глутаматних рецепторів, Ca2+-чутливий барвник fura-2 у високій концентрації (1-2 мМ) додавали до внутрішньоклітинного розчину. За цих умов fura-2 витісняє ендогенні кальцієві буфери, зв'язує всі йони Ca2+ і тому дає змогу вимірювати загальну кількість йонів кальцію, що проходять через клітинну мембрану. Цей метод дозволяє вимірювати трансмембранні кальцієві потоки при фізіологічних значеннях зовнішньоклітинної концентрації Ca2+ та при потенціалі спокою (Schneggenburger, 1993; Neher 1995).

Щоб дослідити взаємозв`язок між властивостями ліганд-активованих рецептор-каналів та їх молекулярним складом, ми використовували методи зворотньої транскрипції та ланцюгової реакції полімерази на окремих нейронах в зрізах (Lambolez, 1992). Після закінчення флюорометричних і/або електрофізіологічних вимірювань вміст цитоплазми нейрону висмоктували через ту саму піпетку, що використовувалась для внутрішньоклітинного діалізу, і досліджували на вміст мРНК, що кодує певні субодиниці ліганд-активованих рецептор-каналів (Garaschuk, 1996; Tempia, 1996; Plant, 1997).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Кальцієва проникність нативних глутаматних рецептор-каналів в нейронах ЦНС

Кальцієва проникність глутаматних рецептор-каналів в пірамідних нейронах СА1 регіону гіпокампу.

Для вимірювання Ca2+-проникності нативних глутаматних рецептор-каналів в сомі та дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу метод фіксації потенціалу на мембрані окремого, візуально ідентифікованого пірамідного нейрону, було поєднано з внутрішньоклітинною перфузією цього нейрону розчином, що містить високу концентрацію (1-2 мМ) Ca2+-чутливого барвника fura-2. Щоб встановити частку Ca2+ в агоніст-активованому катіонному струмі було визначено величину f, яка є відношенням зміни флюоресценції fura-2 на Ca2+-чутливій довжині хвилі (DF380) до загального катіонного струму через клітинну мембрану: f= DF380/ I dt (Neher, 1992; Schneggenburger, 1993; Garaschuk, 1996). Якщо катіонний струм переноситься виключно Ca2+, то f наближається до константи "fmax", що дорівнює DF380 на одиницю кальцієвого заряду. Якщо ж катіонний струм переноситься різними йонами, то f/fmax є "фракційним кальцієвим струмом", що скорочено позначається Pf. Значення Pf показує, який відсоток загального катіонного заряду переноситься йонами кальцію.

Проаналізувавши дані, отримані в результаті 302-х йонофоретичних аплікацій NMDA до соми 37 пірамідних нейронів регіону СА1, ми отримали значення PfNMDA, що дорівнює 10.69 ± 2.13%. Отже, при потенціалі на клітинній мембрані -60 мВ та зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 1.6 мМ приблизно 11 % загального заряду через соматичні рецептор-канали NMDA-типу переноситься йонами кальцію. Мал. 1 ілюструє залежність NMDA-активованих трансмембранних струмів і викликаних ними флюоресцентних сигналів від потенціалу на клітинній мембрані в присутності 1 мМ Mg2+ в зовнішньоклітинному розчині. Як показано на мал. 1Б, потенціал-залежність часових інтегралів NMDA-активованих трансмембранних струмів (QNMDA) відображає добре відому потенціал-залежність струму через NMDA-рецептор-канали, що зумовлюється потенціал-залежним блокуванням NMDA-рецептор-каналів йонами Mg2+ (Nowak, 1984; Mayer, 1987). Зауважте, що при потенціалах на мембрані від -70 до -20 мВ зміна амплітуди Ca2+-чутливих сигналів (DF380) відбувалась паралельно до зміни амплітуди QNMDA (мал.3Б), залишаючи, таким чином, PfNMDA без змін. Цікаво, що значний вхід Ca2+ через NMDA-активовані рецептор-канали спостерігався навіть тоді, коли загальний потік йонів через ці канали дорівнював 0 або набував протилежного напрямку (при потенціалах на мембрані від 0 до +30 мВ).

Мал. 1. Потенціал-залежність Ca2+-потоку через рецептор-канали NMDA-типу.

А, NMDA-опосередковані трансмембранні струми (внизу) та відповідні зміни F380 (вгорі) при різних підтримуваних потенціалах на мембрані нейрону. Б, залежність значень часового інтегралу відповідного NMDA-активованого струму (QNMDA) та значень амплітуди відповідних змін флюоресценції DF380 від підтримуваного потенціалу.

Мал. 2 ілюструє експеримент, метою якого було вимірювання Ca2+-проникності дендритних рецептор-каналів NMDA-типу. Розміщуючи йонофоретичну піпетку неподалік від головного апікального дендриту та аплікуючи NMDA на короткий час (20-50 мс), NMDA-активовані Ca2+-сигнали вдавалось викликали селективно в обмеженій ділянці дендриту, розташованому навпроти йонофоретичної піпетки (мал. 2). Аналізуючи дендритні сигнали ми отримали значення PfNMDA, що дорівнює 10.70 ± 1.96% (n= 9 нейронів).

Мал. 2. Вимірювання Ca2+-потоків через рецептор-канали NMDA-типу, розташовані на дендритах пірамідних нейронів. А, псевдокольорове зображення пірамідного нейрону СА1-регіону гіпокампу до (а) та підчас (b) короткої йонофоретичної аплікації NMDA (50 мс, 1 µА). Йонофоретичну піпетку позначено стрілкою. Б, NMDA-активований трансмембранний струм (внизу) та відповідна зміна F380 (вгорі), отримані в експерименті, проілюстрованому в А. Суцільна лінія є результатом симуляції кривої зміни флюоресценції на основі зміни трансмембранного струму згідно до рівняння: DF380(t) = f*[I(t) - I0]*Dt - [F380(t) - F380,0]*Dt/t, де I(t) - I0 - є приростом трансмембранного струму, а F380(t) - F380,0 - аналогічно виміряним приростом флюоресцентного сигналу (Schneggenburger, 1993). Параметри f і t змінюють доти, доки виміряний та симульований сигнали не співпадуть.

Порівнюючи безпосередньо Ca2+-проникність дендритних рецептор-каналів NMDA-типу з Ca2+-проникністю соматичних рецептор-каналів одного й того ж самого нейрону (мал. 3), майже ідентичні значення PfNMDA було отримано попарно в сомі та дендритах кожної з пірамідних клітин (n=7, мал. 4).

Мал. 3. Порівняння Ca2+-потоків через соматичні та дендритні рецептор-канали NMDA-типу одного й того ж самого нейрону. А, комбіноване епіфлюоресцентне та світлове зображення пірамідного нейрону СА1-регіону гіпокампу. Криві, представлені в Б і В, є кривими зміни флюоресценції в соматичному (1) та дендритному (2) регіонах відповідно. Б та В ілюструють синхронні зміни флюоресценції та трансмембранного струму внаслідок йонофоретичних аплікації NMDA почергово до соми (Б) та дендритів (В). А - ілюструє місце розташування йонофоретичної піпетки під час дендритних аплікацій NMDA.

Мал. 4. Порівняльна характеристика Ca2+-проникності соматичних та дендритних рецептор-каналів NMDA-типу. А, графік залежності декременту зміни флюоресценції DF380 від часового інтегралу QNMDA відповідного трансмембранного струму під час локальних соматичних (n=20, заштриховані символи) та дендритних (n=17, порожні символи) аплікацій NMDA. Б, порівняння значень PfNMDA, отриманих попарно в сомі та дендритах одних і тих же нейронів (n=7). В кожній з пар дендритне значення є нормалізованим до значення PfNMDA, отриманого в сомі відповідного нейрону.

Отже, Ca2+-проникність соматичних та дендритних глутаматних рецептор-каналів NMDA-типу є подібною, складаючи приблизно 11%.

До останнього часу рецептор-канали не-NMDA-типу вважались непроникними для Ca2+ (Jonas, 1992). В подальших експериментах ми дослідили можливу роль цих рецепторів як джерела глутамат-активованого входу Ca2+ в клітину. Йонофоретичні аплікації як АМРА, так і каїнату до апікальних дендритів пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу викликали чітко окреслені Ca2+-сигнали, засвідчуючи ненульову Ca2+-проникність цих рецептор-каналів. Варто, однак, зауважити, що для реєстрації АМРА- та каїнат-активованих Ca2+-сигналів було необхідно викликати значно більші трансмембранні струми, ніж у випадку NMDA-активованих сигналів. За цих умов середнє значення Pf для соматичних та дендритних каїнат-активованих рецептор-каналів дорівнювало 0.68 ± 0.20% (n= 12) та 0.61 ± 0.16% (n= 7) відповідно. Подібне значення Pf було отримано для соматичних каїнат-активованих рецептор-каналів. Мал. 5А ілюструє експерименти, в яких дендритні Ca2+-сигнали викликали за допомогою йонофоретичної аплікації АМРА. І в цьому випадку активація АМРА-рецепторів приводила до входу Ca2+ всередину клітини. В середньому, ми отримали значення Pf 0.66 ± 0.25% (n = 5 нейронів) для дендритних та 0.58 ± 0.34% (n = 9 нейронів) для соматичних аплікацій АМРА.

Мал. 5. Трансмембранний вхід Ca2+ через соматичні та дендритні рецептор-канали не-NMDA-типу. А, АМРА-активовані трансмембранні струми (внизу) та відповідні зміни F380 (вгорі), отримані внаслідок локальних йонофоретичних аплікацій АМРА до апікального дендриту пірамідного нейрону. Б, подібність значень Pf, виміряних попарно в сомі та дендритах пірамідних нейронів гіпокампу у відповідь на локальну йонофоретичну аплікацію АМРА і каїнату. Дендритні значення є нормалізованими до відповідних значень Pf, отриманих в сомі відповідного нейрону.

Щоб порівняти Ca2+-проникність соматичних та дендритних не-NMDA-рецепторів, відповідні значення Pf було виміряно попарно в сомі та дендритах одних і тих же нейронів (мал. 5Б). Дані досліди не виявили значної відмінності між Ca2+-проникністю соматичних та дендритних АМРА- та каїнат-активованих рецепторів. Отже, в даній роботі нам вперше вдалося виміряти Ca2+-проникність "класичних" глутаматних рецепторів не-NMDA-типу, що довгий час вважались непроникними для Ca2+, і встановити, що їх Ca2+-проникність становить 0.6%.

Кальцієва проникність глутаматних рецептор-каналів в клітинах Пуркіньє мозочку

На сьогодні загальноприйнятою є думка, що глутаматні рецептори в клітинах Пуркіньє мозочку представлені виключно рецепторами не-NMDA-типу, оскільки клітини Пуркіньє не мають функціональних NMDA-рецепторів (Perkel, 1990; Farrant, 1991; Llano, 1991). Оскільки до цього часу Ca2+-проникність класичних рецептор-каналів не-NMDA-типу вважалась мізерною, їх вплив на [Ca2+]i систематично не вивчався. Однак, як показано на мал.6, за умов присутності 1 мМ fura-2 у внутрішньоклітинному розчині йонофоретична аплікація як АМРА, так і каїнату викликала великі трансмембранні струми, кожен з яких супроводжувався значною зміною флюоресценції на Ca2+-чутливій довжині хвилі F380. В середньому, значення Pf для соматичних АМРА-активованих рецептор-каналів складало 0.57 ± 0.33 % (n=4), а значення Pf для соматичних каїнат-активованих рецептор-каналів складало 0.63 ± 0.12 % (n= 4) при потенціалі на клітинній мембрані від -60 до -80 мВ та зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 1.6 мМ.

Мал.6. Йонофоретичні аплікації АМРА і каїнату викликають активацію рецептор-каналів зі схожою Ca2+-проникністю. А, каїнат-активований трансмембранний струм (внизу) та відповідна зміна F380 (вгорі), виміряні в клітині Пуркіньє мозочку 4-денного щура. Суцільна лінія є результатом симуляції кривої зміни флюоресценції на основі зміни трансмембранного струму. Б, Аналогічно проілюстровані результати локальної аплікації АМРА до нейрону Пуркіньє в зрізі мозочку 5-денного щура. В, лінійна залежність між Ca2+-зарядом, що проникає в клітину напротязі перших 5-ти сек після активації АМРА-активованих рецептор-каналів, та сумарним переміщенням заряду за той самий час. Тангенс кута нахилу прямої, що є лінійним наближенням експериментальних даних, обчисленим за методом найменших квадратів, дорівнює значенню фракційного Ca2+-струму.

Таким чином, клітини Пуркіньє дійсно експресують рецептор-канали не-NMDA-типу з низькою Ca2+-проникністю, що нагадує проникність рецептор-каналів не-NMDA-типу в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу. Однак, зважаючи на велику амплітуду глутамат-активованих струмів в цих нейронах, за фізіологічних умов їх активація може викликати значну зміну [Ca2+]i.

Кальцієва проникність рецептор-каналів NMDA-типу в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки

Для отримання більш повного уявлення про властивості нативних глутаматних рецепторів в різних типах нейронів ЦНС ми провели дослідження NMDA-рецепторів в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки, котрі є одним з типів гальмівних інтернейронів.

Мал.7. Вимірювання фракційного Ca2+-струму через NMDA-активовані рецептор-канали в сомі нейронів серединної перетинки. А, мікрофотографія ГАМК-ергічного нейрону серединної перетинки. Б, трансмембранний струм (внизу) та асоційований Ca2+-сигнал (вгорі) у відповідь на йонофоретичну аплікацію NMDA. В, співвідношення значення електричного заряду, що потрапляв в клітину за умов активації рецептор-каналів NMDA-типу, та відповідного значення PfNMDA. Даний графік підсумовує результати, отримані в усіх дослідах цього типу.

Оскільки морфологічно ці нейрони не відрізняються від холінергічних нейронів, присутніх в цьому регіоні мозку (Naumann, 1992), всі досліджені клітини було ідентифіковано на основі наявності в них глутаматдекарбоксилази (GAD), специфічного маркера ГАМК-ергічних нейронів (Gritti, 1993). Мал. 7 ілюструє типовий ГАМК-ергічний нейрон серединної перетинки і зареєстровані в цьому нейроні зміни Ca2+-чутливої флюоресценції fura-2 (F390) та трансмембранного струму у відповідь на йонофоретичну аплікацію NMDA. Отримане в дослідах даного типу значення Pf для соматичних NMDA-активованих рецептор-каналів складало 12.0 ± 3.9% (n=10 клітин). Цікаво, що це значення майже співпадало зі значенням Pf, отриманим для пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу, засвідчуючи, що збудні та гальмівні нейрони в різних відділах ЦНС експресують функціонально схожі NMDA-рецептори.

Отже, в даній роботі ми вдосконалили метод, розроблений свого часу Неєром та Августином для вивчення кальцієвого гомеостазу в секреторних хромафінних клітинах (Neher, 1992), вперше пристосувавши його для вимірювання Ca2+-проникності нативних глутаматних рецепторів, розташованих на нейронах в зрізах мозку, де ці нейрони зберігають своє надзвичайно розгалужене дендритне дерево. Це дало можливість виміряти частку йонів кальцію, що проникають в нейрон через рецептор-канали NMDA- та не-NMDA-типу. Завдяки високій чутливості застосованого методу нам вдалося виміряти Ca2+-проникність "класичних" глутаматних рецепторів не-NMDA-типу, що довгий час вважались непроникними для Ca2+. Проведене нами дослідження дало змогу порівняти властивості глутаматних рецептор-каналів в основних типах нейронів ЦНС, таких як: принципові збуджуючі нейрони (на прикладі нейронів СА1-регіону гіпокампу), принципові гальмівні нейрони (на прикладі клітин Пуркіньє мозочку) та гальмівні інтернейрони (на прикладі ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки). Таким чином, дана робота є найбільш повним, на сьогодні, порівняльним дослідженням Ca2+-проникності нативних глутаматних рецепторів в нейронах ЦНС. Крім того, в даній роботі ми розробили підхід (Garaschuk, 1998; Garaschuk, 1999), за допомогою якого метод вимірювання трансмембраних потоків можна застосувати для вивчення дендритних глутаматних рецепторів. На сьогодні, дана робота є єдиним дослідженням Ca2+-проникності дендритних глутаматних рецепторів за фізіологічних умов. В той час, як соматичні рецептори є в переважній більшості позасинаптичними, ймовірно, що велика частка досліджених нами дендритних рецепторів репрезентує синаптичні глутамат-активовані рецептори. Таким чином, нами встановлено близькість функціональних властивостей позасинаптичних (соматичних) та синаптич-них глутаматних рецептор-каналів як NMDA- так і не-NMDA-типу.

Взаємозвўязок між молекулярним складом та функціональними властивостями нативних глутаматних рецепторів

Щоб встановити, чи існує взаємозв'язок між молекулярною будовою нативних глутаматних рецепторів та їх Ca2+-проникністю, а також іншими функціональними властивостями, досліджені вище типи нейронів ЦНС було проаналізовано на вміст мРНК, що кодує різні субодиниці глутаматних рецепторів.

Молекулярна будова нативних NMDA-рецепторів в глутамат- та ГАМК-ергічних нейронах ЦНС

Нативні NMDA-рецептори складаються з пўяти різних субодиниць, названих NR1 та NR2A-D (щурі, (Monyer, 1992)) або z1і e1-e4 (миші, (Kutsuwada, 1992)). Попередні молекулярно-біологічні дослідження рекомбінантних рецепторів показали, що NR1-субодиниці зустрічаються у всіх відділах ЦНС та є необхідними для утворення функціональних NMDA-рецепторів (Monyer, 1994; Zukin, 1995). Різноманітні ж властивості рекомбінантних NMDA-рецепторів визначаються присутністю певного типу NR2-субодиниць (McBain, 1994). Тому ми зосередили свою увагу на виявленні мРНК, що кодують різні NR2-субодиниці.

Для встановлення взаємозв`язку між функціональними властивостями та молекулярним складом NMDA-рецепторів в нейронах певного типу вміст мРНК окремих клітин було досліджено за допомогою методу зворотньої транскрипції та ланцюгової реакції полімерази (Lambolez, 1992). Після закінчення електрофізіологічних та флюориметричних вимірювань вміст цитоплазми клітини було висмоктано через ту саму піпетку, що застосовувалась для внутрішньоклітинної перфузії, та проаналізовано на вміст мРНК, що кодують різні NR2-субодиниці. Використовуючи праймери, специфічні для комплементарних ДНК, які кодують NR2A-, NR2B- та NR2C-субодиниці, було показано, що в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки 96% клітин експресують NR2B-субодиницю. При цьому 20% проаналізованих клітин експресували виключно NR2B, 40% - NR2B та NR2A, 28% - NR2B та NR2C, і, нарешті, 8% експресували NR2B-, NR2C- та NR2A-субодиниці. Лише в одній з усіх проаналізованих клітин NR2B-субодиниці не було виявлено, натомість було знайдено виключно NR2A-субодиниці.

Таблиця 1. Субодиниці рецептор-каналів АМРА- та NMDA-типу, виявлені в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу.

В окремій серії експериментів присутність NR2D-субодиниці було виявлено в 75% проаналізованих нейронів. NR2B-субодиниця також виявилась присутньою в більшості пірамідних клітин СА1-регіону гіпокампу. З 23 проаналізованих клітин 19 експресували NR2B й NR2A, 2 - лише NR2B та 2 - NR2B, NR2A й NR2C (табл. 4.1). На підставі цих молекулярнобіологічних даних ми висунули гіпотезу, що функціональні властивості нативних NMDA-рецепторів, включаючи їхню проникність для Ca2+, в значній мірі обумовлюються присутністю домінантної NR2B-субодиниці.

Дійсно, коли цю гіпотезу було провірено більш детально для нейронів серединної перетинки, виявилось, що в них NMDA-рецептори з високою ефективністю блокуються зовнішньоклітинними йонами магнію, що характерно для рекомбінантних рецепторів, які включають NR2B-субодиницю. В подальших дослідах було показано, що NMDA-рецептори нейронів серединної перетинки з високою ефективністю блокуються також специфічним блокатором NR2B-субодиниці іфенпродилом (мал. 8).

Мал. 8. Вплив селективного блокатора рецептор-каналів NMDA-типу, що містять NR2В-субодиницю, іфенпродилу на амплітуду NMDA-активованих струмів. А та Б, блокування NMDA-активованих струмів іфенпродилом. Струми було зареєстровано під час поступової зміни потенціалу на мембрані нейрону від +40 до -80 мВ (60 мВ/сек, так званий voltage ramp) в присутності 50 µМ NMDA у зовнішньоклітинному розчині в контролі, та в присутності 3 µМ іфенпродилу. Наведені дані ілюструють різницю в ступені блокади, що спостерігалась в різних клітинах.

Більше того, основний рівень провідності окремих NMDA-активованих каналів, зареєстрованих у фрагментах клітинної мембрани цих ГАМК-ергічних нейронів, складав 42 pS та 49 pS при зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 2 та 1 мM відповідно. Подібні значення було отримано при вивченні провідності окремих каналів рекомбінантних NMDA-рецепторів, що складаються з NR1-, NR2A- або NR1-, NR2B-субодиниць (50/51pS; (Stern, 1992; Tsuzuki, 1994)).

Молекулярна будова нативних АМРА-рецепторів в глутамат- та ГАМК-ергічних нейронах ЦНС

Дослідження, подібні до описаних вище для NMDA-рецепторів, було проведено також для нативних АМРА-рецепторів в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу та клітинах Пуркіньє мозочку. В цьому випадку цитоплазму нейронів було проаналізовано на вміст мРНК, що кодують GluRА-D субодиниці (Lambolez, 1992). З особливою увагою ми поставились до виявлення GluRB-субодиниці, що визначає Ca2+-проникність рекомбінантних АМРА-рецепторів (Hollmann, 1991; Hume, 1991; Burnashev, 1992). Як показано в таблиці 1, з 9 досліджених пірамідних клітин СА1-регіону гіпокампу всі експресували GluRA- і GluRB-субодиниці і всі, за винятком однієї клітини, експресували GluRC-субодиницю. Присутність GluRD-субодиниці було виявлено лише в одному нейроні.

Подібні дані було отримано також в дослідах з клітинами Пуркіньє мозочку, де фрагменти комплементарної ДНК, що відповідають GluRA-C-субодиницям, було виявлено в усіх нейронах обох досліджених вікових груп (Р5-7, n=8 клітин та Р14-17, n=6 клітин). В той же час GluRD-субодиницю було виявлено лише у двох клітинах молодшої вікової групи.

Таким чином, отримані молекулярно-біологічні дані узгоджуються з результатами вимірювання Ca2+-проникності і приводять до висновку, що низька Ca2+-проникність нативних рецепторів не-NMDA-типу зумовлюється присутністю в їх складі GluRВ-субодиниці.

Завдяки вивченню рекомбінантних глутаматних рецепторів за останній час було накопичено досить докладні дані про функціональні властивості деяких типів гомо- та гетеромерних рецепторів (Sommer, 1991; Burnashev, 1992; Monyer, 1992; Burnashev, 1995; Koh, 1995). Однак, як показано в цьому (див. табл. 1) та інших (Lambolez, 1992; Bochet, 1994; Monyer, 1994; Burnashev, 1995) дослідженнях, ці результати не можна безпосередньо застосувати для з`ясування властивостей нативних глутаматних рецепторів в нейронах ЦНС, оскільки ці нейрони містять велику кількість різних субодиниць глутаматних рецепторів. В нашому дослідженні ми вперше поєднали вимірювання Ca2+-потоків через нативні глутамат-активовані рецептор-канали на мембрані нейронів ЦНС та аналіз вмісту мРНК, які кодують ці рецептор-канали. Це дозволило співвіднести дані про Ca2+-проникність глутаматних рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу з їх молекулярною будовою. На основі порівняння молекулярної будови та функціональних властивостей глутаматних рецептор-каналів, виявлених в різних типах нейронів ЦНС, ми прийшли до висновку, що функціональні властивості, і в першу чергу Ca2+-проникність, рецептор-каналів NMDA-типу зумовлюються домінантною NR2В-субодиницею. Аналогічно, наші дослідження підтвердили виявлену при вивченні рекомбінантних не-NMDA-рецепторів визначальну роль GluR-В-субодиниці у детермінації властивостей гетеромерних не-NMDA-рецепторів. Таким чином, отримані нами дані дають змогу прогнозувати властивості нативних глутамат-активованих рецептор-каналів не-NMDA- та NMDA-типів спираючись на дані про їх молекулярну будову. Віриться, що отримані результати сприятимуть глибшому розумінню функції нативних глутаматних рецептор-каналів в різних відділах мозку та створенню ліків, здатних селективно впливати на певні види рецепторних комплексів.

Регуляція [Ca2+]i внутрішньоклітинними рианодин-чутливими Ca2+-депо

Викид та запасання йонів кальцію рианодин-чутливими Ca2+-депо в сомі і дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу

Викид Ca2+ в цитоплазму клітини з внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо може потенційно активуватися як специфічними агоністами рианодинових рецепторів (кофеїн, циклічна АДФ-рибоза), так і йонами Ca2+, що потрапляють в цитоплазму через мембрану клітини (так званий Ca2+-індукований викид Ca2+, СICR) (Nabauer, 1989). В переважній більшості наведених нижче експериментів для активації викиду Ca2+ з цих депо ми використовували специфічний агоніст кофеїн, який локально аплікували з тонкої скляної піпетки за допомогою тиску.

Мал. 9 ілюструє схему експерименту, розроблену нами для проведення наведених нижче дослідів. Короткотривала (3 с) аплікація кофеїну з піпетки, схематично зображеної на мал.9Б, до групи пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу, забарвлених ліпід-розчинним Ca2+-чутливим барвником fura-2 АМ, викликала зріст [Ca2+]i в усіх нейронах, що знаходились поблизу піпетки (мал. 9Г). Амплітуда кофеїн-активованих Ca2+-сигналів в 105 пірамідних клітинах, розташованих безпосередньо поблизу піпетки, набувала значень від 50 до 600 нМ (в середньому 253±269 нМ, n=105 клітин з 85 зрізів гіпокампу).

Мал. 9. Ca2+-сигнали, викликані локальною аплікацією кофеїну до пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу. А, схема експерименту. Б, мікрофотографія шару пірамідних клітин СА1-регіону гіпокампу, забарвлених fura-2 AM. Пронумеровані прямокутники окреслюють регіони, сигнали від яких показано в В. В правому верхньому куті схематично позначено місце розташування мікропіпетки для аплікації кофеїну. В, кофеїн-активовані Ca2+-відповіді 4-х нейронів, позначених в Б, що знаходились в безпосередній близькості до мікропіпетки. Позначені літерами стрілки відмічають моменти часу, що відповідають аналогічно позначеним псевдокольоровим зображенням в Г. Г, псевдокольорові зображення, що ілюструють значення [Ca2+]i отримані в контролі (а), під час аплікації кофеїну (b) та після повернення [Ca2+]i до контрольного рівня (с).

Кофеїн-активовані Ca2+-сигнали спостерігались в переважній більшості (123 з 133) досліджених пірамідних нейронів і не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (мал. 10, 11; Vh=-60 мВ). На відміну від Ca2+-сигналів, викликаних активацією потенціал-залежних Ca2+-каналів, кофеїн-активовані Ca2+-сигнали зберігались за відсутності Ca2+ в зовнішньоклітинному розчині і селективно блокувались специфічним блокатором рианодинових рецепторів рианодином (n=21; мал. 10).

Мал. 10. Рианодин селективно блокує кофеїн-активовані Ca2+-сигнали в пірамідних нейронах гіпокампу. Кофеїн-активовані Ca2+-сигнали та асоційовані трансмембранні струми, зареєстровані в контролі та в умовах присутності 20 µМ рианодину в зовнішньо-клітинному розчині. На цьому та наступних малюнках момент аплікації кофеїну позначено трикут-никами. Зауважте, що рианодин селективно блокує кофеїн-активовані Ca2+-сигнали, не впливаючи на амплітуду транс-мембранних струмів та асоційованих Ca2+-сигналів, викликаних деполяриза-цією нейрону (вертикальні стрілки).

За умови присутності у внутрішньоклітинному розчині К+ як основного катіону кофеїн-активовані Ca2+-сигнали супроводжувались вихідним струмом (n= 4), котрий повністю блокувався при заміні К+ на Cs+ (мал. 10). Отже, викид Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо відбувається в безпосередній близькості від клітинної мембрани, так, що викликаний зріст [Ca2+]i є достатнім для активації Ca2+-активованих К+-каналів.

Щоб дослідити просторове розташування функціональних рианодин-чутливих Ca2+-депо, ми локально аплікували кофеїн до соми та дендритів одних і тих же пірамідних нейронів. Аплікація кофеїну як до соми, так і до дендритів приводила до реєстрації локального Ca2+-сигналу (мал. 11). Ca2+-сигнали, викликані в дендритах, не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (мал. 11Б) і, загалом, були подібними до сигналів, зареєстрованих в сомі (n=9 експериментів, 6 нейронів).

Отже, функціональні рианодин-чутливі Ca2+-депо знаходяться не лише в сомі, а також і в апікальних дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону, і можуть активуватись незалежно від соматичних Ca2+-депо.

Мал. 11. Локалізовані кофеїн-активовані Ca2+-сигнали в сомі і дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу. А, псевдокольорове зображення зросту [Ca2+]i, викликаного локальною аплікацією кофеїну до соми та апікального дендриту нейрону. Б, Ca2+-сигнал та асоційований трансмембранний струм, зареєстровані під час аплікації кофеїну до апікального дендриту іншого пірамідного нейрону.

Коли кофеїн аплікували декілька разів підряд, амплітуда Ca2+-сигналу, викликаного другою і наступними аплікаціями, завжди була меншою за амплітуду першого Ca2+-сигналу (мал. 12). Відновлення амплітуди кофеїн-активованого Ca2+-сигналу відбувалось спонтанно і поступово, протягом 2 хв після останньої аплікації.

Мал. 12. Спустошення та спонтанне відновлення Ca2+-вмісту рианодин-чутливих Ca2+-депо. А, три пари кофеїн-активованих Ca2+-сигналів, що відрізняються інтервалом між моментом першої та другої аплікації. Накладання контрольних Ca2+-сигналів один на один дозволяє проілюструвати часову залежність процесу відновлення Ca2+-вмісту всередині депо. Б, дані, отримані в усіх дослідах даного типу (29 нейронів, 56 пар даних). Амплітуду тестового Ca2+-сигналу було пронормалізовано на амплітуду контрольної відповіді та відкладено як функцію часового інтервалу Dt між цими аплікаціями. Суцільна лінія ілюструє наближення отриманих даних експоненційною функцією, отримане за методом найменших квадратів. Пунктирна лінія ілюструє апроксимацію отриманої функції до початку координат.

Часова константа спонтанного відновлення Ca2+-вмісту всередині Ca2+-депо становила 59 с. Активація потенціал-залежних Ca2+-каналів одразу після повного спустошення рианодин-чутливих Ca2+-депо 6-ма послідовними аплікаціями кофеїну приводила до підвищення [Ca2+]i і швидкого відновлення вмісту Ca2+ всередині депо, свідчачи, що в описаних дослідах йдеться саме про спустошення Ca2+-депо, а не, скажімо, про тимчасову десенситизацію рианодинових рецепторів в присутності кофеїну. Відновлення вмісту Ca2+-депо, викликане підвищенням [Ca2+]i, було значно швидшим за спонтанне відновлення.

В більшості тканин транспортування Ca2+ всередину внутрішньоклітинних депо відбувається за допомогою ендоплазматичних Ca2+-насосів (Ca2+-АТФаз), які, як відомо, зворотньо блокуються циклопіазоновою кислотою (CPA; (Seidler, 1989)) та незворотньо - тапсигаргіном ((Thastrup, 1990)). В наших дослідах присутність 20-30 мкМ СРА чи 1-3 мкМ тапсигаргіну у зовнішньоклітинному розчині перешкоджали спонтанному відновленню вмісту Ca2+ всередині депо, свідчачи, що цей процес опосередковується ендоплазматичними Ca2+-насосами. Цікаво, що навіть за відсутності попереднього спустошення Ca2+-депо, присутність СРА у зовнішньоклітинному розчині напротязі 7 хв приводила до зникнення кофеїн-активованих Ca2+-сигналів (6 з 6-ти клітин). Наведені дані свідчать, що