НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Конуп Людмила Олександрівна

УДК 579.25:632.35:634.8.03/.05

БАКТЕРІАЛЬНИЙ НЕКРОЗ І ПОЧОРНІННЯ ДЕРЕВИНИ ВИНОГРАДУ НА ПІВДНІ УКРАЇНИ

06.01.11 – фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії вірусології і мікробіології Національного наукового центру “Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова”, УААН (м. Одеса) та в Одеському національному університеті ім. І.І. Мечникова Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Мілкус Борис Наумович,

Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова,

професор кафедри мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, професор, членкор УААН

Цилюрик Анатолій Васильович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри захисту лісу

кандидат біологічних наук, професор

Каленич Федір Семенович,

Інститут садівництва УААН,

завідувач лабораторії захисту рослин

Провідна установа – Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України

відділ фітопатогенних бактерій, м. Київ

Захист відбудеться “25” травня 2007 року о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, кімн. 41

Автореферат розісланий “24” травня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мороз М.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основні параметри якості винограду визначаються багатьма показниками, у тому числі агрокліматичними умовами вирощування, сортами й відсутністю захворювань. Серед хвороб, що уражують виноград, особливе місце посідають бактеріальні й фітоплазмові хвороби, що завдають великої шкоди виноградарству України.

Серед бактеріальних хвороб загрозу для європейських сортів винограду й продуктивності підщепних сортів становить бактеріальний некроз, збудником якого є бактерія Xylophilus ampelinus (Panagopoulos). Згідно з діючим “Переліком карантинних шкідників, хвороб рослин та бур'янів, що мають карантинне значення в Україні”, затвердженим 21.01.2003 р., бактеріальний некроз відноситься до карантинних об'єктів списку Б.

Потенційні втрати врожаю на кущах, уражених збудником бактеріального некрозу, можуть досягати 80 %. Шкодочинність цієї хвороби виявляється також у скороченні довговічності виноградників.

Природно-кліматичні умови півдня України сприятливі для адаптації збудника хвороби, тому й імовірність розповсюдження її дуже висока (Леманова, Гатина, 1991). У зв'язку з загрозою проникнення і поширення бактеріального некрозу на Україну виникла проблема вивчення збудника, його діагностики й ідентифікації.

Іншою, не менш небезпечною хворобою винограду, є почорніння деревини. Ця хвороба поширена в Італії, Франції, Югославії, Німеччині, а на території СНД до цього часу не реєструвалася. Збитки від цієї хвороби дуже значні. За шкідливістю мікоплазмені інфекції рослин відносяться до катастрофічних захворювань, які часто приймають характер епіфітотій. Економічний збиток може коливатись від часткового зниження урожаю і його якості до повної втрати урожаю (Chen Y.D., 1998).

Діагностика цих небезпечних бактеріозів є важливою задачею для запобігання їх розповсюдження.

Наші дослідження були спрямовані на розробку швидких і надійних методів діагностики цих хвороб.

Значимість вирішення цих проблем і зумовила вибір теми дисертаційної роботи й актуальність досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в межах робочої програми Інституту виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова УААН (ІВіВ ім. В.Є. Таїрова) за завданням 04- “Розробити та застосувати комплекс молекулярно-біологічних методів діагностики вірусних і бактеріальних хвороб винограду з метою отримання здорового садивного матеріалу цінних сортів і клонів винограду” (номер державної реєстрації 0198U002660), у рамках спільної робочої програми з Дослідною станцією карантину винограду і плодових культур Інституту захисту рослин УААН за завданням 06. – “Удосконалити методи виявлення, локалізації та ліквідації вогнищ карантинних шкідників, хвороб та бур’янів” (номер державної реєстрації 0101U003711), а також спільного українсько-молдовського проекту “Розробка молекулярно-біологічних і серологічних методів діагностики вірусів і збудників бактріального раку винограду” за підтримкою держбюджетної теми Міністерства освіти і науки України № М/214-2004 (наказ № 630 від 29.07.04).

Робота виконувалась у лабораторії вірусології і мікробіології ІВіВ ім. В.Є. Таїрова, на кафедрі мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова (ОНУ ім. І.І. Мечникова), а також на базі лабораторії вірусології, мікробіології і агрохімії Розсадницького комплексу ЗАТ “Одеський коньячний завод” (атестат акредитації №РО-1005/2004 від 01.11.2004 р.).

Мета і задачі дослідження. Метою нашої роботи було вивчення поширення бактеріального некрозу й почорніння деревини на виноградниках півдня України, вивчення морфологічних і біохімічних властивостей збудника бактеріального некрозу; морфології і локалізації в клітині збудника почорніння деревини винограду, удосконалення методів їх діагностики й розробка заходів щодо захисту рослин від бактеріального некрозу й почорніння деревини винограду.

Для досягнення вказаної мети дослідження були поставлені такі основні задачі:

- провести обстеження промислових насаджень винограду в Одеській, Херсонській, Миколаївській областях і АР Крим на наявність бактеріального некрозу й почорніння деревини винограду;

- виділити і вивчити властивості збудника бактеріального некрозу винограду;

- одержати високоспецифічну поліклональну антисироватку до О-антигену збудника бактеріального некрозу для застосування в непрямому сендвіч-методі імуноферментного аналізу (ІФА);

- визначити сорти винограду, стійкі до збудника бактеріального некрозу в умовах півдня України;

- за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і електронної мікроскопії ультратонких зрізів клітин флоєми винограду виявити збудника почорніння деревини й вивчити його локалізацію;

- виявити переносника почорніння деревини на промислових насадженнях винограду в Одеській області;

- розробити заходи щодо захисту рослин від бактеріального некрозу й почорніння деревини винограду.

Об'єкт дослідження: насадження винограду, виноградні саджанці, виноградна лоза. Ізоляти збудника бактеріального некрозу - Xуlophilus ampelinus, музейний штам Xylophilus ampelinus 120-1, збудник почорніння деревини винограду - Bois noir.

Предмет дослідження: візуальна й латентна зараженість бактеріальним некрозом і фітоплазмовими хворобами різних сортів винограду на півдні України, діагностика бактеріального некрозу винограду за допомогою непрямого сендвіч-методу ІФА; діагностика фітоплазмових хвороб за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та електронної мікроскопії.

Методи дослідження: фітосанітарне обстеження виноградників; мікробіологічні методи виділення і вивчення збудника бактеріального некрозу винограду; непрямий сендвіч-метод ІФА для діагностики збудника бактеріального некрозу; ПЛР-діагностика фітоплазмових хвороб винограду; електронна мікроскопія уражених тканин винограду.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні був ідентифікований збудник бактеріального некрозу винограду.

Отримана високоспецифічна антисироватка з високим титром - 1:4096 до збудника бактеріального некрозу винограду, яка застосована в імуноферментному аналізі для масової діагностики.

Вперше в Україні на сорті Шардоне при обстеженні виноградників Одеської області були виявлені симптоми хвороби, яка викликається фітоплазмою – збудником почорніння деревини.

Проведено електронно-мікроскопічне дослідження ультратонких зрізів клітин флоеми винограду на наявність фітоплазм.

Проведена робота щодо визначення сортів винограду, стійких до бактеріального некрозу винограду.

Практичне значення отриманих результатів. У результаті фітосанітарного обстеження виноградників деяких регіонів півдня України встановлено їх ураженість збудником бактеріального некрозу й збудником почорніння деревини винограду.

Розроблено методи діагностики бактеріального некрозу і почорніння деревини винограду.

Отримана високоспецифічна антисироватка до збудника бактеріального некрозу, за допомогою якої можна швидко проводити масове тестування винограду непрямим сендвіч-методом ІФА.

Розроблено заходи щодо захисту винограду від бактеріального некрозу й почорніння деревини винограду.

Відпрацьовано режим термообробки виноградних саджанців, уражених почорнінням деревини. Визначено та рекомендовано для впровадження у виробництво оптимальний метод термообробки виноградних саджанців.

На основі проведеної роботи підготовлено й видані методичні рекомендації:“Виявлення та діагностика бактеріального в'янення винограду” і “Проведення обстежень на виявлення золотистого пожовтіння винограду”. На виноградниках СПК “Ізумрудний” АР Криму виділені здорові кущі сорту Шардоне, які будуть використані для закладки здорового маточника прищепних лоз, що підтверджується відповідним актом впровадження.

Особистий внесок автора полягає в доборі та аналізі літератури за темою дисертації щодо збудників бактеріального некрозу й почорніння деревини винограду, плануванні та проведенні дослідів, фітосанітарному обстеженню, виділенню збудника бактеріального некрозу з різних частин ураженої рослини, тестуванні проб методами ІФА, ПЛР та зараження тест-рослин, одержанні й аналізі результатів експериментів, оформленні дисертаційної роботи, формулюванні висновків і науково-обгрунтованих пропозицій виробництву.

Визначення задач дослідження, планування експериментів, узагальнення та інтерпретація результатів проводилися разом із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені для обговорення на звітних сесіях вченої ради ІВіВ ім. В.Є. Таїрова (1995-2001 р.р.); на 14 міжнародній конференції по вивченню вірусних і вірусоподібних хвороб винограду (14th ICVG, Локоротондо, Італія 12-17 вересня 2003 р.); на X з’їзді “Товариства мікробіологів” (Одеса, 2004 р.); на II Балканському симпозіумі по виноградництву й екології (Плевен, 8-10 вересня, 2004 р.); на міжнародній науковій конференції “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія” (Київ, 4-6 жовтня 2005 р.); на міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології” (Одеса, 11-15 вересня 2006 р.); на міжнародній науково-практичній конференції “Інтегрований захист рослин. Проблеми та перспективи” (Київ, 13-16 листопада 2006 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових робіт, із них: 2 – методичні рекомендації, 3 статті – у наукових журналах, 3 – у збірниках наукових робіт, 6– у тезах наукових конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 178 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, описання матеріалів і методів дослідження, експериментальної частини, висновків і пропозицій виробництву, містить 26 таблиць, 17 рисунків, із них 12 фотознімків та додатків. Список проаналізованих джерел літератури включає 206 робіт, у тому числі 192 іноземних авторів.

Висловлюю щиру подяку своєму науковому керівнику д.б.н. Мілкусу Б.Н., Кульмінській Л.О., ст.н.с. Одеської дослідної станції карантину винограду та плодових культур ІЗР УААН, к.с-г.н. Калашяну Ю.А., завідувачу лабораторії вірусології Молдовського науково-дослідного інституту плодівництва, м. Кишинів, к.б.н. Микитюку В.Ф., доценту кафедри зоології безхребетних тварин ОНУ ім. І.І. Мечникова, м. Одеса, доктору Nuredin Habili, Австралія і доктору Boudon-Padieu, Франція за допомогу при виконанні дисертаційних досліджень.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

На основі узагальнення літературних джерел висвітлена історія вивчення бактеріального некрозу винограду та фітоплазмових хвороб, їх поширення, діагностика, система захисту рослин від цих хвороб у різних країнах. Наведені дані біологічних особливостей патогенів. Описані типові симптоми бактеріального некрозу та фітоплазмових хвороб, способи передачі хвороб та поширення патогенів у природних умовах.

Матеріали і методи досліджень

Матеріалом наших досліджень були ізоляти збудника бактеріального некрозу - Xуlophilus ampelinus із різних сортів винограду Одеської області (ІВіВ ім. В.Є. Таїрова, ДГ “Таїровське”), а також фітоплазма, збудник почорніння деревини винограду в Одеській області на сорті винограду Шардоне (АСТ “Украгро”, ТОВ “Технолог”).

Ізоляти збудника бактеріального некрозу були ідентифіковані у лабораторії вірусології і мікробіології ІВіВ ім. В.Є. Таїрова, на кафедрі мікробіології і вірусології ОНУ ім. І.І. Мечникова та у лабораторії вірусології, мікробіології та агрохімії Розсадницького комплексу ЗАТ “Одеський коньячний завод”. Ідентифікацію бактеріального некрозу проводили мікробіологічними (Lehoczky, 1971), біохімічними (Методические указания, 1981) та серологічними (Никитин, 1977, Фримель, 1979) методами. Патогенність ізолятів перевіряли на тест-рослинах: мікросаджанцях винограду та виноградних кущах (Леманова, 1988). Ідентифікацію фітоплазми проводили методом полімеразної ланцюгової реакції згідно Boudon-Padieu et al. (2005) та за допомогою електронної мікроскопії (Granata, Grimaldi, 1991).

Поширення бактеріальних хвороб винограду вивчали на промислових насадженнях господарств Одеської, Миколаївської, Херсонської областей і АР Крим. Обстеження промислових насаджень проводили на відповідність нормативному документу - “Технология производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда”, 1989.

Референтний штам бактеріального некрозу Xуlophilus ampelinus 120-1 був отриманий з Іспанії (Instituto Valenciano de Insticaciones Agraris). Антисироватку до соматичного антигену збудника бактеріального некрозу отримували відповідно до методики B. Digat (1978), шляхом імунізації кроликів породи шиншила, з однаковим віком 1,5-2 роки, вагою 2-3 кг та однієї статі. Кролики добре переносили процес імунізації. На основі отриманої нами антисироватки було виготовлено діагностичний набір для виявлення збудника бактеріального некрозу винограду. Діагоностика збудника бактеріального некрозу з діагностичним набором фірми “Loewe” (Німеччина) підтвердила наші результати. Спектрофотометрія виконувалась на спектрофотометрі Dynatech (США).

Для діагностики фітоплазми використовували метод ПЛР та електронну мікроскопію. ПЛР ампліфікацію проводили з універсальною парою праймерів, специфічною для фітоплазм fU5/rU3 у програмованому термостаті „Терцик”, фірми „ДНК – Технологія” (Росія) (Мілкус та інші, 2005). Фрагменти ДНК фага л 2100 – 150 пар нуклеотидів використовували як маркер молекулярної маси. Результат реєстрували за допомогою УФ-трансілюмінатора. Для виявлення локалізації фітоплазм в тканинах винограду виготовляли ультратонкі зрізи жилок листя на ультрамікротомі LKB-8800A і досліджували за допомогою електронних мікроскопів HU-11E, JEM-7, TESLA BA613.

У якості тест-рослин використовували мікросаджанці винограду, зелені пагони та кущі винограду (Vitis vinifera L.). Зараження тест-рослин проводили за загальноприйнятими методиками (Goodman et al., 1993).

Термотерапію виноградних саджанців і лози, уражених почорнінням деревини проводили на промисловому пристрою Розсадницького комплексу ЗАТ “Одеський коньячний завод”.

Усі математичні розрахунки проводились із використанням спеціальних математичних програм (Statistica 6.0, Excel XP, Non Linear) персональних ЕВМ (IBM Pentium 4) (Доспехов, 1985).

Фітосанітарне обстеження виноградників на ураженість

збудником бактеріального некрозу винограду

Одеська область, що межує з Молдовою і Румунією, піддається загрозі завезення садивного матеріалу, хворого на бактеріальний некроз, тому фітосанітарне обстеження промислових виноградників є дуже актуальним.

При обстеженні насаджень у зоні промислового виноградарства на території Одеської і Миколаївської областей було виявлено на окремих кущах симптоми бактеріального некрозу, що проявлялися у відставанні росту кущів, хлорозі, зменшенні цукристості ягід, і, нарешті, у загибелі рослини.

За період з 1995 р. по 2001 р. були обстежені виноградники на наявність симптомів бактеріального некрозу винограду в Одеській області: ІВіВ ім. В.Є. Таїрова, ДГ “Таїровське”, ДГ ІВіВ ім. В.Є. Таїрова (120 га), АСТ “Украгро” (236 га) і ТОВ “Технолог” (160 га), винконцерн “Винко” (50 га); в Миколоївській області - ВАТ “Коблево” (50 га); в Херсонській області - ВАТ “Кам’янський” (20 га) та у АР Крим СПК “Ізумрудний” (60 га).

При проведенні обстежень в 1995-2001 роках на винограднику ДГ “Таїровське” і клонодослідній ділянці були виявлені окремі кущі винограду з характерними симптомами бактеріального некрозу (табл.1).

Таблиця 1 - Результати обстеження виноградників на наявність бактеріального некрозу винограду (ДГ “Таїровське”, клонодослідна ділянка ІВіВ ім. В.Є. Таїрова, 1995-2001 рр.)

Рік обстеження | Кількість обстежених кущів, шт. | Із симптомами | на пагонах, шт. | на листках, шт. | на штамбі, шт. | уражені

кущі, % | зміна за роками, % | 1995 | 1500 | 6 | 5 | 1 | 0,8 | - | 1996 | 1500 | 3 | 3 | 0 | 0,4 | -0,4 | 1997 | 1500 | 0 | 0 | 0 | 0 | -0,4 | 1998 | 1500 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1999 | 1500 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2000 | 1575 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2001 | 1575 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |

Відповідно до даних таблиці, симптоми бактеріального некрозу на молодих пагонах, листях і штамбі були виявлені в 1995 р., коли спостерігався найвищий відсоток хворих кущів і складав 0,8. У 1996 р. таких кущів було шість, що склало 0,4 %. Збільшення хворих кущів винограду за роками не спостерігалося, і вже починаючи з 1997 р. таких кущів винограду не було виявлено. Це пов’язано зі своєчасним виявленням, знищенням хворих рослин і профілактичними заходами захисту рослин від цієї хвороби.

Найбільш ушкодженими були кущі винограду сортів: Ранній Магарача, Молдова, Мускат таїровський, Одеський сувенір, Сухолиманський білий.

Одиничні кущі, уражені збудником бактеріального некрозу, були виявлені на винограднику сорту Каберне Совіньйон ВАТ “Коблево” Березанського району Миколаївської області, але, завдяки своєчасним заходам профілактики і знищення ураженних кущів, удалося запобігти розповсюдження цієї небезпечної хвороби.

Метод фітосанітарного обстеження не дозволяє виявити всі хворі рослини при помірному прояві симптомів або латентній формі хвороби. Крім того, у ряді випадків фізіологічні порушення можуть бути прийняті за симптоми хвороби. Тому фітосанітарне обстеження повинно проводитись у комплексі з іншими методами діагностики.

Ідентифікація ізолятів збудника бактеріального некрозу

Діагностика збудника бактеріального некрозу складалась із наступних етапів: виділення збудника на тверде глюкозо-пептонове середовище із різних частин винограду; ідентифікації ізолятів морфологічними, біохімічними та серологічними методами. Для ідентифікації виділених бактерій до роду Xylophilus, вивчали їхні морфологічні та біохімічні характеристики, тинкторіальні особливості, процеси обміну (табл.2).

Таблиця 2 - Порівняльна біохімічна і фізіологічна характеристики ізолятів X. apelinus і музейного штаму X. ampelinus 120-1

Біохімічні і фізіологічні властивості | Виділені ізоляти | Xylophilus ampelinus штам 120-1

Розмір клітин, мкм | 0,5-1 | 0,5-2,5 х 0,6-1,5 | Рухомість | + | + | Забарвлення за Грамом | - | - | Оптимальна температура росту, °С | 25-27 | 25-27 | Аероби | + | + | Толерантніть до NaCl, % | 1 | 1 | Утворення кислоти на джерелах вуглецю:

арабіноза, галактоза, глюкоза,

фруктоза, сахароза |

+

- |

+

- | Гідроліз крохмалю | - | - | Оксидазна активність | + | + | Каталазна активність | + | + | Гідроліз твіну-80 | + | + | Примітка: “+” - позитивна реакція; “-” - негативна реакція.

Відповідно до даних таблиці незалежно від сорту винограду, різних територіальних місць виділення різні ізоляти, а їх було виділено 22, проявили себе однаково в рості на глюкозо-пептоновому середовищі, у споживанні 5 цукрів та інших біохімічних характеристик і були на рівні контрольного музейного штаму X. ampelinus 120-1.

Для діагностики ізолятів використовували модифікований непрямий подвійний сендвіч-метод ІФА. Суспензії живих мікроорганізмів застосовували як антигени. Як антитіло – діагностичну антисироватку, отриману шляхом імунізації кроликів. Антисироватку одержували згідно трьом схемам імунізації кроликів. У результаті порівняння трьох схем імунізації найбільш ефективною виявилась 3-я схема (табл. 3).

Таблиця 3 - Порівняльні результати антисироваток, отриманих за трьома схемами імунізації кроликів

Схема імунізації | Спосіб введення | Титр антисироватки | 1 | Комбіновано

(Внутрішньом’язово + внутрішньовенно) | 1:128

2 | Внутрішньовенно | 1:512 | 3 | Внутрішньовенно | 1:4096 |

Відповідно до даних таблиці 3, найвищий титр 1:4096 мала антисироватка, отримана за схемою № 3. В результаті дослідження встановлено, що бактерії, виділені із різних частин винограду, серологічно однакові. Вони аглютинувалися за допомогою антисироватки та давали позитивну реакцію при її розведенні 1:4096. Отримана нами антисироватка до збудника бактеріального некрозу була високоспецифічною, оскільки аглютинували тільки ті ізоляти, які відносяться до даної групи бактерій (табл. 4).

Таблиця 4 - Результати порівняння непрямого сендвіч метода ІФА інокулятів хворої рослини за допомогою антисироватки та діагностичного набору фірми Loewe (Німеччина)

Культура | Результати ІФА при різних титрах антисироватки | 1:128 | 1:256 | 1:512 | 1:4096 | тест-набірXylophilus ampelinus колекційний штам 120-1 |

# |

# |

# |

# |

# | Ізоляти бактерій з листя винограду | # | # | # | # | # | Ізоляти бактерій з пагонів | # | # | # | # | #

Ізоляти бактерій із штамбу | # | # | # | # | #

Agrobacterium rubi | - | - | - | - | -

Примітка: “#” - реакція аглютинації позитивна; “-” - відсутність реакції аглютинації.

Результати ідентифікації виділених бактерій із хворої рослини за допомогою антисироватки, отриманої нами були подібні проведеним за допомогою діагностичного набору фірми Loewe (Німеччина). Метод ІФА з антисироваткою дозволяє тестувати велику кількість виноградних кущів та саджанців на ураження збудником бактеріального некрозу. Для одержання здорових підщепних саджанців проводили аналіз виноградних кущів на латентне ураження збудником бактеріального некрозу (табл.5).

Таблиця 5 - Результати тестування виноградних кущів методом ІФА на наявність латентної форми бактеріального некрозу (ДГ “Таїровське”, 1995-2001 рр.)

Рік тестування | Кількість перевірених кущів, шт. | Інфіковані кущі, % | Зміна за роками, % | 1995 | 1500 | 0,9 | 1996 | 1500 | 0,9 | 0 | 1997 | 1500 | 0,4 | -0,5 | 1998 | 1500 | 0,1 | -0,3 | 1999 | 1500 | 0,1 | 0 | 2000 | 1000 | 0 | -0,1 | 2001 | 1000 | 0 | 0 |

Відповідно до даних таблиці, у разі перевірки встановлено, що в 1995 р. кількість кущів з прихованою інфекцією була найвища і складала 0,9 %, що створювало ризик розповсюдження хвороби. При сприятливих умовах довкілля латентна форма хвороби могла б проявитися і кількість хворих рослин збільшилась, що могло перерости в епіфітотію. Для запобігання розповсюдження хвороби також перевіряли саджанці винограду на відсутність прихованої форми ураження збудником бактеріального некрозу винограду (табл.6).

Таблиця 6 - Результати тестування виноградних саджанців методом ІФА на наявність латентної форми бактеріального некрозу (ДГ “Таїровське”, 1995-2001 рр.)

Рік тестування | Кількість перевірених саджанців | Уражені саджанці, % | Зміна за роками, % | 1995 | 500 | 0,8 | 1996 | 450 | 0,5 | -0,3 | 1997 | 520 | 0,5 | 0 | 1998 | 1000 | 0,5 | 0

1999 | 400 | 0,3 | -0,2

2000 | 350 | 0 | -0,3

2001 | 560 | 0 | 0

Як видно з таблиць 5 і 6, дослідження виноградних рослин на латентну інфекцію збудником бактеріального некрозу показали, що з кожним роком відсоток ураження виноградних кущів і саджанців зменшувався. Наявність навіть незначного відсотка ураження збудником бактеріального некрозу пов’язана із декількома факторами: по-перше, під час сезонної підрізки виноградних кущів відбувається зараження здорових рослин через інструменти, по-друге, погодні умови, а саме, холодна затяжна весна і дощове холодне літо сприяють поширенню інфекції. При виробництві щепленого садивного матеріалу через інструменти відбувається зараження майбутніх саджанців.

Для виявлення патогенності ізолятів бактерій також використовували тест-рослини, а саме мікросаджанці винограду, вирощені на штучному поживному середовищі “Біона” і кущі винограду на інфекційній ділянці Дослідної станції карантину винограду і плодових культур ІЗР УААН.

Ізолятами бактерій X. ampelinus заражували всі зелені і здеревілі частини виноградного кущу: пагони, листя, суцвіття, рукави, штамб. Симптоми бактеріального некрозу проявлялися в різні періоди вегетації винограду. Однак інтенсивність розвитку хвороби перебувала у прямій залежності від кількості бактерій та погодних умов у період вегетації.

Фітосанітарне обстеження виноградників на ураженість фітоплазмою

У результаті обстеження виноградників Одеської області на сорті Шардоне у 2002 р. нами були виявлені виноградні кущі з симптомами схожими на вірусне захворювання скручування листя. У результаті серологічного дослідження за допомогою подвійного сендвіч методу ІФА (DAS-ELISA) з діагностичними наборами фірми “Agritest” (Італія) зараження кущів винограду вірусом скручування листя 1-го і 3-го серотипів (GLRaV 1 і GLRaV 3) не підтвердилось. У всіх уражених рослин можна було спостерігати спільні ознаки, пов'язані зі специфічними змінами вегетативних та репродуктивних органів, що дозволило візуально ідентифікувати хворобу як фітоплазмову. Встановлено, що ця хвороба має тенденцію до прогресування.

Обстеження виноградників проводилося протягом чотирьох років (з 2002 по 2005 рр.), і з кожним роком число кущів з характерними симптомами збільшувалося (рис.1).

Рис. 1. Динаміка розповсюдження почорніння деревини винограду на сорті Шардоне

(АСТ “Украгро”.)

Із рисунка 1 видно, що найбільший відсоток ураження фітоплазмою спостерігався в 2005 році, на четвертий рік від посадки винограду, що характерно для прояви таких фітоплазмових хвороб, як почорніння деревини винограду і золотисте пожовтіння.

Почорніня деревини виявлено в незначному ступені й на інших сортах винограду: Каберне Совіньон, Мерло, Піно чорний, однак сорт Шардоне найбільш чутливий до цієї фітоплазменої інфекції.

Ураження виноградників фітоплазмовими хворобами наносить великий збиток сільському господарству, що проявляється у знижені врожаю, цукритості, збільшенні кислотності ягід.

Рис. 2. Зміна врожаю винограду на сорті Шардоне за период з 2002 по 2005 рр.

(АСТ “Украгро”)

Відповідно до рис.2, врожай винограду сорту Шардоне за період з 2002 р. по 2005 р. зменшився приблизно у 26 раз з 140 ц/з га у 2002 році до 6 ц/з га у 2005 році.

Ідентифікація фітоплазми

Для підтвердження ураженості виноградних кущів фітоплазмою та вивчення її локалізації було проведено електронно-мікроскопічне дослідження ультратонких зрізів жилок листків, відібраних з кущів винограду. При перегляді ультратонких зрізів жилок листя винограду сорту Шардоне у клітинах паренхіми флоеми спостерігали плеоморфні мікроорганізми переважно округлої, овальної і витягнутої форм. Вони були розташовані в жилках листя, яке відбиралося наприкінці липня, коли симптоми хвороби тільки починали проявлятись. У зрізах, виготовлених зі зразків листків винограду, відібраних у серпні, також були виявлені фітоплазми. Фітоплазми мали вигляд поліморфних тіл, які були оточені тришаровою цитоплазматичною мембраною, що складалася з двох електронно-щільного і електронно-прозорого шарів, що оточувала однорідну цитоплазму з більш-менш чіткою ядерною зоною. У стромі фітоплазми знаходилися рибосомоподібні частки і ДНК-подібні нитки. Розмір мікоплазм коливався у межах 500-1000 нм (рис. 3). За морфологічними ознаками виявлені нами мікоплазми слід віднести до “зрілих тіл”. Не всі рослинні клітини містили фітоплазми. Деякі клітини виглядали морфологічно неушкодженими. У контрольних зразках фітоплазми не виявлені.

Рис. 3. Фітоплазмові організми у клітині флоеми винограду, ураженого почорнінням деревини (х 15000). Стрілками показано наявність в клітині фітоплазм

Для додаткового доказу ураженості винограду фітоплазмою ми провели визначення збудника виявленої нами хвороби разом із доктором Nuredin Habili (Австралія). Виділення ДНК з здеревянілих чубуків проводили за методикою N.Habili (особисте повідомлення). ДНК наносили на целюлозний фільтр марки Hybon H+, який надсилали в Австралію. Дослідження, яке проводилося з універсальною парою праймерів fU5/rU3 підтвердило, що сорт Шардоне уражений фітоплазмовою інфекцією (рис. 4). Подальші дослідження методом гніздової ПЛР дозволили встановити, що хвороба викликається мікоплазмою з групи стовбуру, яка відома під назвою почорніння деревини винограду.

К М 1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК фітоплазм, виділених з винограду,

ураженого збудником почорніння деревини з праймерами fU5/rU3 в агарозному гелі:

К – негативний контроль ( дейонізована вода); М маркер молекулярної ваги;

1 – 6 зразки, що містили фітоплазму (чубуки виноградної лози сорту Шардоне)

Для ідентифікації збудника почорніння деревини було використано метод ПЛР з парами праймерів R16F2n/R16R2 і P1/P7. Дослідження були проведені у Лабораторії екології фітоплазм (Франція) під керівництвом доктора E. Boudon-Padieu. Результати показали, що на виноградниках розповсюджена фітоплазмова хвороба – почорніння деревини (Bois noir), збудник якої належить до групи стовбуру. Ця хвороба була вперше ідентифікована в СНД.

Рис. 5. Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК фітоплазм, виділених з винограду,

ураженого збудником почорніння деревини з парами праймерів R16F2n/R16R2 і

P1/P7 в агарозному гелі: 1 – негативний контроль ( дейонізована вода);

2, 3 – зразки, що містили збудника почорніння деревини (чубуки хворих рослин

сорту Шардоне); 4 – чубуки здорових рослин; 5 – маркер молекулярної ваги (л 2100 -

150 п.н)

У результаті визначення виду відловлених цикад, встановлено, що на теріторії Одеської

області, знайдена цикада Hyalesthes obsoletus – переносник збудника почорніння деревини.

Таким чином, ця небезпечна фітоплазмова хвороба винограду, що завдає значних збитків

виноградарству, набула масового поширення на промислових виноградниках Одеської області

через завезення зараженого садивного матеріалу й розповсюдження її за допомогою переносника

фітоплазм - Hyalesthes obsoletus.

Оздоровлення винограду від фітоплазми

Для оздоровлення інфікованих фітоплазмовою інфекцією саджанців і лози застосовували водну термотерапію у пристрої, сконструйованому в Розсадницькому комплексі ЗАТ “Одеський коньячний завод”. Пристрій забезпечує підтримку постійної температури 50 °С при безперервному перемішуванні води, що є обов’язковою умовою.

Термотерапія чубуків сорту Шардоне при різних поєднаннях температури і часу показала, що оптимальними умовами є обробка їх 30 хвилин при 50 °С.

На основі отриманих нами результатів була проведена термотерапія 13000 саджанців сорту Шардоне, які були висаджені в АСТ “Шустов-агро”. При обстеженні цих насаджень протягом трьох років симптомів почорніння деревини не виявлено.

Отже, термотерапія є ефективним методом боротьби з фітоплазмовими хворобами.

ВИСНОВКИ

1. Проведено фітосанітарне обстеження виноградників Одеської, Миколаївської, Херсонської областей і АР Крим на наявність бактеріального некрозу і почорніння деревини винограду на загальній площі 696 га.

2. Встановлено, що в Одеській області були виявлені виноградні кущі із симптомами бактеріального некрозу. Найбільш ураженими збудником бактеріального некрозу виявились сорти винограду Ранній Магарача, Сухолиманський білий, Мускат таїровський і Молдова, ураженість яких склала 0,8 %; 0,8 %; 0,8 % і 0,7 % відповідно. Стійким при штучному зараженні виявився підщепний сорт Рипариа х Рупестрис 101-14.

3. Вперше в Україні отримана антисироватка до збудника бактеріального некрозу Xylophilus ampelinus. Оптимізована методика діагностики за допомогою непрямого сендвіч методу ІФА на основі розведення антисироватки антикролячого коньюгату з лужною фосфатазою та встановлення оптимальної концентрації суспензії бактерій, титр антисироватки в непрямому сендвіч методі ІФА склав 1:4096. Тестування 10 тисяч кущів винограду і 3780 саджанців цим методом показало, що 0,9 % кущів і 0,8 % саджанців винограду інфіковано збудником бактеріального некрозу.

4. Встановлено, що одним із джерел розповсюдження збудника бактеріального некрозу в Україні є інтродукований садивний матеріал. Інфікованість виноградних саджанців сортів Рислінг рейнський, Мерло і Каберне Совіньйон з Югославії виявилась: 0,3 %; 0,1 %; 0,16 % відповідно.

5. Вперше в Україні виявлена й ідентифікована фітоплазмова інфекція. Ідентифікація була проведена за допомогою ПЛР-аналізу і дозволила встановити, що збудник відноситься до групи стовбуру, який на винограді викликає захворювання, відоме як почорніння деревини.

6. Оптимізовані умови проведення ПЛР для виявлення збудника почорніння деревини. На відміну від рекомендованої Фаджолі (Австралія) методики ПЛР, кількість проби, внесеної в реакційну суміш, було зменшено до 0,5 мкл, а концентрація магнію збільшена до 3 мМ, що привело до утворення чітких одиничних ампліконів у кожній повторності.

7. В ультратонких зрізах флоеми листя винограду, ураженого почорнінням деревини, виявлені фітоплазмоподібні тіла. У клітинах здорових рослин вони були відсутні. Це є додатковим свідченням того, що збудником почорніння деревини є фітоплазмоподібні організми.

8. На виноградниках і на різнотрав'ї уздовж них виявлена цикада Hyalesthes obsoletus, відома як переносник збудника почорніння деревини. Рекомендації зі знищення бур'янів – резерваторів фітоплазми дозволили попередити поширення захворювання.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Профілактика бактеріального некрозу і почорніння винограду полягає в проведенні заходів, спрямованих на попередження їх виникнення і поширення з метою отримання здорового садивного матеріалу і створення високопродуктивних насаджень.

Заходи щодо профілактики цих хвороб винограду включають:

1. Проведення обстеження виноградних насаджень двічі на рік: восени після опадання листя, до заготівлі лози і влітку (липень-серпень), уражені кущі викорчовувати, а з 4-х суміжних зрізати лозу, потім це все спалювати;

2. Проведення ретельного фітосанітарного відбору прищепного садивного матеріалу;

3. При щепленні саджанців, для запобігання зараження і подальшого поширення бактеріозів проводити замочування протягом 24 годин чубуків прищепи і підщепи у розчині 0,06 %-ного ДНОКу з наступним промиванням чубуків водою;

4. Перед посадкою саджанців проводити ретельний огляд саджанців. Забраковані саджанці з ознаками бактеріального нерозу спалювати;

5. Закладку виноградників проводити на площах, де раніше не вирощувався виноград неменше ніж 10-12 років, при оздоровленні земель від збудників цих хвороб необхідно включати до сівообороту рослини, які благотворно впливають на ріст і розвиток мікробів-антагоністів (овес, жито, ячмінь, пшеницю), а також рослини, які містять фітонциди (цибулю, часник);

6. Використовувати фунгіциди, які містять у собі мідь: а) після підрізки дезинфікувати рани 5 % розчином бордоської рідини (Блу бордо); б) перед розпусканням листків обробляти 2 % розчином бордоської рідини (Блу бордо); в) у стадії 3-х листків необхідно обробляти 2 % розчином бордоської рідини (Блу бордо); г) під час вегетації обробляти препаратами міді;

7. Для боротьби з переносниками почорніння деревини необхідно проводити заходи по знищенню бур’янів на виноградниках і в лісосмугах;

8. Для оздоровлення виноградної лози і саджанців проти почорніння деревини необхідно проводити водну термотерапію при 50 °С 30 хвилин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Милкус Б.Н., Картузова В.И., Мулюкина Н.А., Гайдай А.Е., Конуп Л.А. Биотехнологические методы диагностики вирусных болезней и бактериального рака//Виноградарство и виноделие. Сборник научных работ.- К: Аграрная наука, 1997. – С. 32-37.

2. Клечковський Ю.Е., Кульмінська Л.О., Тітова Л.Г., Конуп Л.О. Бактеріальне в’янення – небезпечне карантине захворювання винограду//Захист і карантин рослин.- 2000. – Вип.46. – С. 100-106.

3. Мілкус Б.Н., Конуп Л.О. Вірусні і бактеріальні хвороби винограду на Україні//X з’їзд Товариства мікробіологів України: Тез. доп. 15-17 вересня 2004 р., Одеса, 2004. – С. 257.

4. Милкус Б.Н., Конуп Л.А., Жунько И.Д., Лиманская Н.В. Фитоплазменное заболевание винограда на Украине//“Магарач” Виноградарство и виноделие. – 2004. - №3. – С. 12-14.

5. Кульмінська Л.О., Конуп Л.О. Виявлення та діагностика бактеріального в'янення винограду (Методичні рекомендації). – К: Колобіг, 2005.- 16 с.

6. Кульмінська Л.О., Конуп Л.О. Проведення обстежень на виявлення золотистого пожовтіння винограду (Методичні рекомендації). – К: Колобіг, 2005. – 18 с.

7. Мілкус Б.Н., Конуп Л.О., Жунько І.Д., Ліманська Н.В. Тестування деяких сортів винограду на наявність збудника бактеріального раку і вірусів коротковузля та скручування листя // Мікробіол. журн. – 2005. – Т. 67, № 1. – С. 41– 48.

8. Милкус Б.Н., Конуп Л.А., Лиманская Н.В., Жунько И.Д. Бактериальные заболевания винограда в Украине//Зб. статей учасн. міжнар. наук. конф. “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія”. – Київ 4-6 жовтня, 2005 р.- Житомир: Державн. екологічн. університет, 2005. - С. 59-63.

9. Милкус Б.Н., Конуп Л.А., Лиманская Н.В., Жунько И.Д. Бактериальные болезни винограда в Украине//Міжнар. наук. конф. “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія”: Тез. доп. 4-6 жовтня 2005 р., Київ, 2005. – С. 24.

10. Милкус Б.Н., Конуп Л.А., Лиманская Н.В., Жунько И.Д. Диагностика бактериальных болезней винограда на Украине//Міжнар. наук. конф. “Мікробні біотехнології”: Тез. доп. 11-15 вересня 2006 р., Одеса, 2006.- С. 18.

11. Конуп Л.О. Почорніння деревини винограду та заходи щодо захисту рослин від цієї хвороби//Науковий Вісник аграрн. університ. Біологія.-2006.- № 102. – С. 76-80.

12. Клечковський Ю.Е., Кульмінська Л.О., Конуп Л.О. Бактеріальне в’янення винограду – нова небезпека для виноградарства України//Матер. міжнар. наук.-практ. конф. “Інтегрований захист рослин. Проблеми та перспективи”. – Київ, 13-16 листопада. – 2006. – С. 131-133.

13. Konup L., Limanskya N., Zhunko I., Milkus B. The production of grapevine certified planting material in Ukraine//14th IC VG Meeting: Abstracts, Locorotondo, Italy, 12-17th September, 2003. – Locorotondo.- 2003. – P.164.

14. Milkus B., Konup L. Phytosanitary selection of grapevine in the Ukraine//II Balkan symposium of vitilture and enology, Pleven, 8-10th September, 2004.- Pleven. – 2004. – P.64-65.

Конуп Л.О. Бактеріальний некроз і почорніння деревини винограду на півдні України. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 06.01.11 – фітопатологія. – Національний аграрний університет, Київ, 2007.

Дисертація присвячена вивченню бактеріального некрозу і почорніння деревини винограду, виділенню й ідентифікації збудників цих хвороб, методам діагностики і боротьби з ними. Проведено фітосанітарне обстеження промислових виноградників різних областей півдня України на ураженість бактеріальним некрозом винограду за період з 1995 по 2005 рр., а також почорнінням деревини. Встановлено, що на території Одеської області знайдено рослини, уражені бактеріальним некрозом і почорнінням деревини.

Вперше на Україні виявлений і ідентифікований збудник бактеріального некрозу. Встановлено, що найбільш ураженим збудником бактеріального некрозу були сорту винограду Ранній Магарача, Сухолиманський білий, Мускат таїровський і Молдова. Стійким сортом до збудника бактеріального некрозу виявився підщепний сорт Ріпаріа х Рупестріс 101-14.

Отримана високоспецифічна антисироватка до збудника бактеріального некрозу винограду з титром 1:4096, за допомогою якої можна проводити масове тестування винограду на відсутність збудника бактеріального некрозу винограду.

Вперше на Україні виявлена й ідентифікована за допомогою ПЛР аналізу й електронної мікроскопії фітоплазма, збудник почорніння деревини.

Виявлено й ідентифіковано, що переносником цієї хвороби є цикада Hyalesthes obsoletus.

Розроблено заходи щодо захисту винограду від фітоплазмової інфекції, які включають водну термотерапію виноградної лози і саджанців при 50 єС протягом 30 хвилин. Дано рекомендації виробництву по профілактиці бактеріального некрозу винограду і почорніння деревини.

Ключові слова: бактеріальний некроз, фітоплазма, почорніння деревини винограду,