НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

КОРЕЦЬКА Наталія Віталіївна

УДК 575.224+577.11

ВПЛИВ ЛЕКТИНІВ НА СПОНТАННИЙ ТА

ІНДУКОВАНИЙ МУТАГЕНЕЗ У BACILLUS SUBTILIS

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики людини Інституту

молекулярної біології і генетики НАН України, м.Київ

Науковий керівник: кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

КАРПОВА Ірина Сергіївна,

Інститут молекулярної біології і

генетики НАН України, старший науковий

співробітник відділу генетики людини

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України,

МАЛЮТА Станіслав Станіславович,

Інститут молекулярної біології і

генетики НАН України,

завідувач відділом молекулярної генетики;

доктор біологічних наук, професор

ЧУГУНКОВА Тетяна Володимирівна,

Інститут фізіології рослин і

генетики НАН України,

завідувач відділом генетичних основ гетерозису

Захист відбудеться_25 жовтня__2007 року о _14__годині

на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано_18 вересня_2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.А.Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лектини – це білки або глікопротеїни неімунної природи. Вони здатні специфічно та зворотно взаємодіяти з вуглеводними біополімерами, не змінюючи структури останніх. Лектини володіють широким спектром біологічної активності, що дає підстави до застосування їх у різних галузях біології і медицини. Останнім часом ці речовини привертають увагу фармакологів. Так, лектин омели білої у Німеччині застосовується як препарат з протипухлинною та антимутагенною дією. Присутність лектинів у всіх організмів, від вірусів та бактерій до людини, вказує на їхню фундаментальну роль у процесах життєдіяльності. Біологічна дія лектинів реалізується у прямих нековалентних реакціях з вуглеводами та глікокон'югатами або шляхом опосередкованого мембраною сигнального впливу на різні ланки метаболізму клітини. Добре відома мітогенна активність лектинів бобових, котра має своїм результатом активацію транскрипції та реплікації ДНК. Для деяких лектинів злакових рослин відома також амітогенна активність. На сьогодні в галузі лектинології вже існують десятки напрямків фундаментальних та прикладних досліджень, але відомості про здатність лектинів впливати на мутаційний процес фактично відсутні. Лише у поодиноких роботах сповіщалось про мутагенні/антимутагенні властивості окремих лектинів. Виявлено, опосередковану імунною системою, протипухлинну та антимутагенну дію фітогемаглютиніну з насіння квасолі звичайної (Phaseolus vulgaris) у вищих тварин та людини (Лалчев С., 1987). Проте є свідчення щодо стимуляції фітогемаглютиніном поділу соматичних клітин ссавців (Banwell J.G. et al, 1995). Галактозоспецифічний лектин з суцвіть бузини чорної, в залежності від дози, може знижувати або підвищувати частоту спонтанного та індукованого алкілуючим агентом МННГ мутагенезу в клітинах китайського хом'ячка in vitro (Лукаш Л.Л., Карпова И.С. и др., 1997).

Перспектива використання лектинів у медицині та фармакології висуває на перший план задачу дослідження мутагенних та антимутагенних властивостей цих речовин. Тим більше, що зараз важливою проблемою є пошук протекторів та антимутагенів природного походження для захисту геному людини від мутагенних пошкоджень, індукованих шкідливими факторами сучасного довкілля. Під дією генотоксичних факторів відбувається підвищення рівнів спадкової та неспадкової мінливості, яке призводить до зростання захворюваності на спадкові та онкологічні хвороби. Захист геному передбачає досконале розуміння закономірностей і механізмів впливу на мутаційний процес та можливість керувати цим процесом. Вперше ідею про можливість керування мутаційним процесом висловив С.М. Гершензон.

Для скринінгових досліджень речовин-антимутагенів, лектинів у тому числі, необхідно застосовувати зручні та ефективні тест-системи. Складність еукаріотичних організмів та затратність експериментів з ними обгрунтовує доцільність розробки та застосування простої та чутливої бактеріальної моделі для тестування впливу лектинів на мутаційний процес та дослідження механізмів такого впливу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках бюджетних тем відділу генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України: "Дослідження антимутагенної дії деяких білків" (№ держреєстрації 0198U000676, 1998-2000 рр.), "Дослідження ролі репарації ДНК в прояві мутагенної та антимутагенної активності білків" (№ держреєстрації 0101U000359, 2001-2004 рр.) та "Дослідження можливостей регуляції мутаційної мінливості в популяціях клітин ссавців при їх диференціації та злоякісній трансформації in vitro" (№ держреєстрації 0105U0013262, 2005-2008 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було дослідження протекторного, антимутагенного та модифікуючого впливу лектинів на спонтанний та індукований мутаційний процес у B. subtilis. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1)

2)

3)

4)

5)

Об'єктом дослідження є процес спонтанного та індукованого мутагенезу. Предмет дослідження складав модулюючий вплив лектинів на спонтанний та індукований мутагенез у B. subtilis.

Методи дослідження: генетичні: визначення частоти прямих і обернених мутацій під дією мутагенів та в разі модулюючого впливу лектинів на мутаційний процес; бацилярний rec-тест з використанням мутантів, дефектних за системами репарації/реплікації/рекомбінації, а також молекулярно-генетичні, молекулярно-біологічні, мікробіологічні, біохімічні методи, інгібіторний аналіз, статистична обробка результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено факт модулюючого впливу рослинних лектинів на процеси спонтанного та індукованого мутагенезу у мутантних штамів B. subtilis. Розроблено оригінальні умови для максимального прояву протекторної та антимутагенної дії лектинів: склад бактеріального середовища, порядок та спосіб внесення лектинів та мутагенів у тест-систему, а також їх концентраційне співвідношення. Встановлено, що визначальними факторами при здійснені модулюючого ефекту лектинів на мутаційний процес є: генотип rec-мутанта B. subtilis (нормальна, чи пошкоджена система репарації/ рекомбінації, молекулярна структура лектину, тип мутації та механізм дії мутагену при індукованому мутагенезі. Показано, що реалізація генетичного впливу лектинів відбувається за участі бактеріальних білків системи репарації/рекомбінації. Вперше визначено, що власний бактеріальний лектин відіграє ключову роль у здійсненні модулюючого впливу рослинних лектинів на мутаційний процес у B. subtilis. Встановлено, що при наявності мутації у гені recP у мутанта recP149 втрачається здатність до продукування власного позаклітинного сіалоспецифічного лектину. Показано, що за модифікованим нами методом електрофокусування лектиновмісного екстракту можна одержати спектр молекулярних форм лектину з різними фізико-хімічними та біологічними характеристиками і різною здатністю до впливу на мутаційний процес. Шляхом застосування метаболічних інгібіторів з різним механізмом дії, показано можливість впливу лектинів на процеси реплікації та транскрипції. У системі транскрипції in vitro встановлено, що клітинною мішенню дії власного сіалоспецифічного лектину B. subtilis є ДНК-залежний синтез РНК.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлення протекторної та антимутагенної дії лектинів обумовлює доцільність їх подальшого вивчення з метою створення фармакологічних препаратів на основі лектиновмісних лікарських рослин для профілактики та корекції мутагенних пошкоджень геному людини, індукованих шкідливими факторами довкілля. Показано доцільність застосування модифікованого методу електрофокусування для отримання та відбору ізоформ лектинів з найбільш ефективними протекторними та антимутагенними властивостями. Розроблено тест-систему для оцінки протекторної та антимутагенної дії лектинів, яка може бути застосована для подальшого дослідження впливу лектинів та їх окремих ізоформ на мутаційний процес, а також механізмів такого впливу.

Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано та проаналізовано особисто автором та у співавторстві з керівником дисертаційної роботи і співавторами статей, опублікованих за матеріалами дисертації. Автор брала безпосередню участь у плануванні та проведенні експериментів, статистичній обробці й аналізі результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали, викладені в дисертації, пройшли апробацію на міжнародних форумах INTERLEC19 (Форталеза, Бразилія, 2001) та INTERLEC 20 (Копенгаген, Данія, 2002); 32nd Annual Meeting of Europian environmental mutagen society (Варшава, Польща, 2002); 4th Parnas Conference (Вроцлав, Польща, 2002); на VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002); Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); на конференції "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2004" (Київ, 2004); на Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); на міжнародному симпозиумі "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, Росія, 2004); на міжнародній конференції "Мікробні біотехнології" (Одеса, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 експериментальних статей, з них 9 у фахових наукових виданнях, та тези 10 доповідей на науково-практичних конференціях і з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, яка має три розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаної літератури, що охоплює 238 джерел. Дисертацію викладено на 162 сторінках машинописного тексту. Вона містить 39 рисунків та 17 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається з п'яти підрозділів, що висвітлюють сучасний рівень дослідження лектинів; також розглядаються фактори мутагенного впливу на геном організмів та речовини природного походження, що застосовують як модулятори мутагенезу. Приділяється увага бактеріальним тест-системам, що використовують у дослідженні мутагенної та антимутагенної дiї речовин та інгібіторному аналізу для пошуку клітинних мішеней такої дії.

Матеріали і методи дослідження. В роботі використано колекцію з 15 штамів, отриманих від професора А.А. Прозорова (ІОГен, Москва, Росія), що мають спільне походження від еталонного штаму B. subtilis (Мarburg 168) та містять мутації в генах системи репарації/реплікації/рекомбінації. В окремих експериментах були задіяні генетично нестабільні мутанти B. subtilis, одержані шляхом інсерції фрагментів чужорідної ДНК (колекція відділу генетики людини ІМБіГ НАНУ) та штам-продуцент лектину В-7014 B. subtilis з колекції ІМВ НАНУ.

Досліджували вплив на мутагенез комерційних препаратів лектинів (“ЛЕКТИНОТЕСТ”, Львів) з відомою структурою, які належали до трьох найбільш поширених класів рослинних лектинів: лектини бобових (дощу золотого - LAA, конавалії мечовидної - СonA, квасолі звичайної - РНА); лектини з хітинзв’язувальним доменом (зародки пшениці – WGA, картопля - STA); лектини - інгібітори білкового синтезу (кора бузини чорної - SNA, омела біла - VAA) та одного лектину тваринного походження (слимака виноградного НРА). Порівнювали дію сумарного препарату РНА (гетеротетрамера) та його гомотетрамерних, еритроцитарної (РНА-Е) та лейкоцитарної (РНА-L), ізоформ, а також дію ізолектинів суцвіть бузини чорної (Sambucus nigra), одержаних за методом ізоелектрофокусування у нашій модифікації. Аналогічно нами були виділені для роботи ізоформи власного лектину B. subtilis із його сумарного препарата (автор Др. Е.О. Коваленко, ІМВ НАНУ).

Для індукції мутагенезу були залучені мутагени з різним механізмом дії. Основним мутагеном слугували іони Ni(ІІ) у складі розчинної солі NiCl2 (Україна), що призводять до одноланцюгових розривів ДНК, а також алкілуючий агент МННГ (N-метил-N'-нiтрозогуанiдин), люб'язно наданий для роботи Др. Л.Л. Лукаш, та мітоміцин С ("Sigma", США), що утворює міжланцюгові зшивки ДНК. З метою пошуку клітинних мішеней дії лектинів застосували метаболічні інгібітори - антибіотики, що блокують матричний синтез ДНК (мітоміцин С), транскрипцію - рифампіцин ("Sigma", США), біосинтез білка – стрептоміцин та біосинтез пептидоглікану клітинної стінки – ампіцилін ("Київмедпрепарат"), а також аналоги азотистих основ – синтетичні похідні феназину (автори – І.В. Алексеєва, Л.Г. Пальчиковська, М.О. Платонов ІМБіГ НАНУ).

Методичною основою роботи слугував бацилярний rec-тест у нашій модифікації з використанням мутантів B. subtilis, дефектних за системами репарації/ реплікації/рекомбінації. Для виявлення модулюючого впливу лектинів на мутаційний процес проводили визначення зміни частоти прямих і обернених спонтанних та індукованих мутацій у результаті дії лектину в порівнянні до контролю (без лектину). З метою швидкого скринінгу впливу лектинів на фоні різної чутливості мутантів до дії генотоксичних чинників застосовували сучасну модифікацію методу дифузії в агар (Felmingham D.,2001) та метод мінімальної інгібуючої концентрації (Tarantino P.M. et al., 1999, Andrews J.M, 2001). Культивування мутантів B. subtilis проводили на рідких та агаризованих середовищах (Прозоров А.А., 1988). Основною модифікацією було вилучення із складу повноцінного середовища глюкози, котра заважає, як прояву генотоксичної дії досліджуваних мутагенів, на фоні якого можна виявляти вплив лектинів, так і дії самих лектинів. Проводили виділення і очищення лектинів конвенційними методами білкової хімії та за модифікованим нами методом ізоелектрофокусування (Sova O., 1985); досліджували вуглеводну специфічність та гемаглютинувальну активність лектинів; для аналізу одержаних ізоформ лектинів використовували метод електрофоретичного аналізу білків у ПААГ (Laemmli, 1970). З метою з’ясувати роль власних бактеріальних лектинів у прояві модулюючого впливу рослинних лектинів на мутаційний процес проводили перевірку динаміки продукування лектинів, залежно від фаз росту культури різних штамів В. subtilis. Присутність лектинів визначали як у звільненій від клітин культуральній рідині (вільна форма), так і у суспензії клітин (поверхневозв'язана форма). Для підтвердження інсерції Alu-повтору людини в геномі мутанта B. subtilis Alu-1 проводили її ідентифікацію із використанням методу ПЛР з візуалізацією продукту за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Інгібіторний аналіз для пошуку клітинних мішеней дії лектинів проводили як in vivo, так і у системі транскрипції in vitro із залученням ДНК-залежної РНК-полімерази бактеріофага Т7 (Пальчиковська та ін., 2005). Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Quattro Pro для Windows, враховуючи критерій Стьюдента. Денситограми цифрового зображення гелів для аналізу одержаних ізоформ лектинів будували за допомогою програми Image для Windows. Кількісну оцінку синтезованих РНК-продуктів проводили з використанням програм Sigma Plot 5.0 і Origin 5.0 для Windows.

Результати дослідження та їх обговорення

Дослідження протекторної дії комерційних лектинів, представників основних структурних класів. Літературні дані щодо антимутагенної дії РНА і лектину омели білої (VAA) та дослідження модулюючої дії лектину суцвіть бузини чорної (Лукаш Л.Л., Карпова І.С. та ін., 1997) на мутаційний процес у культурі клітин ссавців, проведені у відділі генетики людини, створили теоретичні передумови розробки бактеріальної моделі для поглибленого вивчення впливу лектинів на процес мінливості геному. Оскільки методики вивчення дії лектинів на мутагенез у мікроорганізмів не існувало, ми розробили відповідний методичний підхід на основі B. subtilis rec-тесту (Kada T. et al., 1984). Принцип відомого методу полягає у використанні підвищеної чутливості мутантів, дефектних за системою репарації/рекомбінації до дії потенційних мутагенів/антимутагенів, порівняно з ізогенним (rec+) контролем. Застосовуючи велику колекцію rec- мутантів, ми встановили, що найбільшого протекторного ефекту відносно використаних нами мутагенів можна досягти за умови попередньої обробки культури лектинами у суспензії. Також були підібрані оптимальні співвідношення лектин/мутаген.

Досліджували протекторний вплив семи комерційних препаратів лектинів рослинного походження щодо генотоксичної дії іонів Ni(II). Ефект лектинів порівнювали згідно їхньої приналежності до трьох найбільш поширених структурних класів, враховували також і вуглеводну специфічність (рис.1).

Рис.1. Протекторний вплив лектинів - представників різних структурних класів щодо токсичної дії іонів Ni(II) (0,5 М): A - бобових, В - з хітинзв'язувальним доменом, С – лектинів - інгібіторів білкового синтезу. Вісь абсцис - зменшення зони інгібування росту культури обробленої лектином (дослід) по відношенню до такої без обробки лектином (позитивний контроль ) у %; вісь ординат – лектини. 1 – штам SB25 (rec+); 2 - штам recP149 (recР); * - достовірні відхилення від контролю (р< 0,05)

Серед лектинів бобових, що мають глобулярну структуру, манозо/глюкозо специфічний СonA повністю блокував дію іонів Ni(II). Ефективними протекторами виявились також фукозоспецифічний LAA та РНА із специфічністю до олігосахаридів. З двох лектинів з однаковою специфічністю до N-ацетил-глюкозаміну, у структурі яких є хітинзв’язувальні домени, лектин картоплі (STA) діяв як ефективний протектор, а лектин зародків пшениці (WGA) не виявив за даних умов протекторного впливу. Серед лектинів, що належать до інгібіторів білкового синтезу, сіалоспецифічний лектин SNA виявив протекторну активність (40%), проте галактозоспецифічний VAA такої дії не показав. Таким чином, в розробленій тест-системі B. subtilis, п'ять досліджених лектинів виявили протекторну дію щодо іонів Ni(II) в ряду ConA = STA > PHA-P > LAA > SNA, при цьому три з них були лектинами бобових. Протекторна здатність не показала зв'язку з вуглеводною специфічністю лектинів. Це свідчить, що дія лектинів не обмежується мембраною. Ефективними протекторами щодо Ni(II) виявились також тваринний лектин – НРА, специфічний до N-ацетил-галактозаміну, та сіалоспецифічний бактеріальний лектин B. subtilis. Найбільш вагомим результатом, одержаним на даному етапі досліджень, було встановлення залежності протекторної дії лектинів від генотипу тест-об'єкту за станом системи репарації/рекомбінації: описані протекторні ефекти лектинів спостерігались у rec+ штаму SB25 B. subtilis і були відсутні у ізогенного мутанта recP149, котрий додатково має мутацію recP, що впливає на процес рекомбінації та репарації (rec-).

Більш детальне дослідження протекторної дії щодо іонів Ni(II) було проведено для сумарного препарату класичного лектину квасолі звичайної (РНА) та його ізоформ, що мають різний склад та біологічні властивості. Множинність молекулярних форм характерна для переважної більшості лектинів і зумовлена субодиничною організацією молекули. У широко досліджених лектинів бобових встановлено, що структурні відмінності субодиниць призводять до їхньої функціональної автономії. Тому, для розуміння принципів регуляторної дії лектинів, доцільно вивчати властивості окремих ізоформ. На рис.2 видно, що найбільшу протекторну дію здійснював мітогенний препарат РНА-Р, у складі якого переважають гетеротетрамерні молекули. Дещо меншу, але достовірну протекторну дію виявляла лейкоцитарна форма ( РНА-L ), що складається з 4-х субодиниць L-типу. Проте еритроцитарна форма лектину (структура 4Е) такої властивості не мала. Достовірні протекторні ефекти згаданих форм лектину виявлені у штаму SB25 з непошкодженою системою репарації/рекомбінації та в меншій мірі у штаму BD293 (polC) з порушенням функціїї ДНК-полімерази ІІІ. У той же час штам recP149 виявився нечутливим до протекторної дії щодо іонів Ni(II), як сумарного препарату РНА-Р, так і окремих ізоформ. Це вказує, що реалізація протекторного та антимутагенного впливу лектинів здійснюється за участі системи репарації/рекомбінації.

Рис.2. Протекторний вплив сумарного препарату та окремих ізоформ РНА щодо токсичної дії іонів Ni(II) (0,5 М). Вісь абсцис - зменшення зони інгібування росту культури обробленої лектином (дослід) по відношенню до такої без обробки лектином (позитивний контроль ) у %. Вісь ординат – форми РНА. 1 – штам SB25 (rec+); 2 - штам recP149 (recР); 3 – штам BD293 (polC). * - достовірні відхилення від контролю (р< 0,05)

Характер протекторної дії лектинів виявив залежність не тільки від генотипу штаму, але і від типу мутагенного пошкодження ДНК Як показано вище, певні досліджені лектини виявили протекторний ефект щодо одноланцюгових розривів, спричинених дією іонів Ni(II). При застосуванні мітоміцину С, основним механізмом дії якого є утворення міжланцюгових зшивок, картина змінюється (рис.3). Так, представник лектинів бобових СonA, найкращий протектор щодо дії іонів Ni(II), не захищає клітини B. subtilis від дії мітоміцину С. Лектин з хітинзв'язувальним доменом WGA, навпаки, виявляє достовірну протекторну дію щодо мітоміцину С у штаму rec+, хоча не показав такої в разі впливу на клітини іонів Ni(II).

Рис.3. Протекторний вплив лектинів щодо ефекту генотоксичних чинників з різним механізмом дії: А – Ni(ІІ) (0,5 M); B – мітоміцин С (10 мкг/мл). Вісь абсцис – лектини; вісь ординат - зменшення зони інгібування росту культури обробленої лектином (дослід) по відношенню до такої без обробки лектином (позитивний контроль ) у %. 1 – штам SB25 (rec+); 2 - штам recP149 (recР); * - достовірні відхилення від контролю (р< 0,05)

Вплив лектинів на спонтанний мутагенез. У зв'язку з тим, що рівень спонтанного мутування є результатом сумарного впливу на геном факторів самого різного походження, які можуть спричиняти помилки у реплікації та репарації ДНК, ми вважали за доцільне перевірити можливість впливу лектинів на спонтанний мутаційний процес. Як відомо, спонтанний мутагенез має генетично визначену частоту і специфічність виникнення прямих і обернених мутацій, тому дію лектинів у мутантів B. subtilis виявляли за зміною частоти спонтанних реверсій до прототрофності.

Оскільки на прикладі РНА було показано, що одна ізоформа (PHA-L) має протекторні властивості, а інша - РНА-Е не має, це дало підстави при дослідженні впливу лектинів на мутагенез в системі B. subtilis зробити акцент на порівняння не різних лектинів, а окремих ізоформ одного лектину. Перевірка впливу ізоформ РНА на виживання бактеріальних клітин, що передувала дослідженню мутагенного/ антимутагенного ефекту, показала різницю їхньої дії (рис.4). РНА-Е на повноцінному агаризованому середовищі вже у концентрації 0,1 мкг/мл виявив значну цитотоксичну дію, за якої число життєздатних клітин знижується на 90%. РНА-L не виявив достовірного впливу на виживання клітин в усьому діапазоні застосованих концентрацій, а для РНА-Р відмічено тенденцію дещо збільшувати кількість життєздатних клітин.

Рис.4. Вплив сумарного препарату та ізоформ РНА на виживання клітин на повноцінному агаризованому середовищі, штам SB25 (rec+). * - достовірні відхилення від контролю (p<0,05)

Ізоформи РНА показали різну здатність впливати на частоту спонтанних реверсій до прототрофності (рис.5): обробка клітин препаратом РНА-L не змінювала ревертабільності штаму, а РНА-Р дозозалежно збільшував число trp+ ревертантів у діапазоні концентрацій від 0,1 до 10 мкг/мл. Проте залежність ефекту від дози мала нелінійний характер, про що свідчило значне зниження виходу ревертантів в разі найвищої з використаних концентрацій РНА-Р (100 мкг/мл), за якої можливе утворення нерозчинних агрегатів.

Рис.5. Вплив сумарного препарату РНА-Р (1) та ізоформи PHA-L (2) на формування ревертантів у штаму SB25 (rec+) B. subtilis за триптофановим маркером. * - достовірні відхилення від контролю (р< 0,05)

Стимулюючий ефект РНА-Р на вихід ревертантів виявив специфічність щодо ауксотрофних маркерів та залежав від генотипу штаму за системою репарації/рекомбінації і у мутанта recP149 не проявлявся (рис.6).

Рис.6. Вплив РНА-Р (10 мкг/мл) на виникнення реверсій за гістидиновим та триптофановим маркером у B. subtilis: 1 - штам SB25 (rec+) ; 2 – штам recP149 (recР)

Окреме дослідження було проведено по виявленню впливу лектинів на подовжений мутаційний процес, спричинений дією гетерологічної ДНК, у генетично нестабільних мутантів B. subtilis, що за своїми властивостями схожі на природні мутації, які є результатом активності мобільних генетичних елементів. Встановлено, що вплив лектинів на рівень спонтанних реверсій залежить від природи мутації. Так, дія ConA і WGA виявляє стабілізуючий ефект (30-50%) у випадку надревертабільної мутації Leu-5-3 (6-9х107), спричиненої інсерцією невеликої послідовності чужорідної ДНК; в разі точкової мутації Lys-42 впливу даних лектинів на ревертабільність не виявлено, а у мутанта, геном якого містить інсерцію Alu-повтору людини розміром 600 нп, відмічено тенденцію до збільшення частоти ревертування у відповідь на дію лектинів.

Дослідження антимутагенного впливу лектинів на мутаційний процес, індукований іонами Ni(II). На прикладі ізолектинів квасолі звичайної (РНА) показано можливість впливу лектинів на частоту trp+ реверсій, яка має високий рівень під дією Ni(II) (табл.1). У таблиці показано реєстрацію спонтанного рівня мутагенезу (варіант 1), вплив на цей процес лектину та Ni(II) окремо (варіанти 2 та 3 відповідно), а також комбіновану дію двох чинників, які додавалися одночасно до стандартизованої суспензії клітин (варіант 4), або у різній послідовності: попередня обробка лектином щодо дії Ni(II) (варіант 5) та внесення лектину через 15 хв після додавання Ni(II) (варіант 6). За даними варіанту 2 видно, що сумарний препарат РНА-Р достовірно підвищував число trp+ ревертантів у 7-8 разів, порівнянно із спонтанним фоном, чого не спостерігалося для ізоформи РНА-L. Мутагенний ефект Ni(II) значно

Таблиця 1

Вплив ізоформ РНА на виживання та частоту реверсій, індукованих іонами Ni(II), у культурі B.subtilis SB25 (rec+ )

№ |

Варіант | Виживання на повноцінному середовищі | Число trp+ ревертантів

на чашку

абсолютне число колоній х106 | % до контролю | абсолютне число | кратність до контролю

РНА-Р, 10 мкг/мл

1 | Контроль без лектину, без Ni(II) |

134,94 + 8,99 |

100,00 |

1,17 + 0,35 |

1,00

2 | Обробка лектином | 170,11 + 9,83 * | 126,07 | 9,17 + 2,18 * | 7,83

3 | Обробка Ni(II) | 124,89 + 8,70 | 92,55 | 19,50 + 1,74 * | 16,67

4 | Одночасна обробка

РНА-Р та Ni(II) | 136,67 + 9,22 | 101,28 | 20,90 + 0,85 * | 17,86

5 | Послідовна обробка: I - РНА-Р, II - Ni(II) | 115,50 + 9,46 | 85,59 | 2,42 + 1,79 ** | 2,07

6 | Послідовна обробка: I - Ni(II), II - РНА-Р | 130,34 + 3,27 | 96,59 | 6,38 + 1,95 ** | 5,45

РНА-L, 10 мкг/мл

1 | Контроль без лектину, без Ni(II) |

73,51 + 3,00 |

100,00 |

0,75 + 0,50 |

1,00

2 | Обробка лектином | 77,00 + 2,00 | 104,75 | 1,50 + 0,50 | 2,00

3 | Обробка Ni(II) | 80,50 + 7,33 | 109,51 | 12,00 + 2,57 * | 16,00

4 | Одночасна обробка

РНА-L та Ni(II) | 65,25 + 5,75 | 88,76 | 16,59 + 3,68 * | 15,63

5 | Послідовна обробка: I - РНА-L, II - Ni(II) | 64,25 + 3,75 | 87,40 | 2,00 + 0,59 ** | 2,67

6 | Послідовна обробка: I - Ni(II), II - РНА-L | 77,00 + 4,50 | 104,75 | 4,25 + 0,50 ** | 5,67

* - достовірні відхилення від контролю (р < 0,05)

** - достовірні відхилення від варіанта №3 (обробка Ni (ІІ), 0,1 M)

перевищував спонтанний рівень реверсій (у 16 разів і більше), причому додавання лектину одночасно з Ni(II) не змінювало цей ефект. При попередній обробці культури лектинами спостерігався достовірний антимутагенний ефект, про що свідчив вихід ревертантів у 5-8 разів нижчий, за такий при самостійній дії іонів Ni(II). Антимутагенний вплив лектинів зареєстровано також у разі післядії щодо Ni(II). Проте в цьому варіанті здатність лектинів перешкоджати мутагенній дії виражена менше, порівняно з попередньою обробкою, де результуючий вихід ревертантів близький до спонтанного рівня. Таким чином показано, що вплив лектину на індукований Ni(II) мутаційний процес залежить від послідовності внесення чинників у стандартизовану суспензію клітин. При попередній обробці клітин лектином та в разі його післядії щодо мутагену можуть відбуватися різні варіанти активації репаративної системи, включаючи SOS-репарацію, що і призводить до різниці у виході ревертантів. Одночасній обробці культури лектином і Ni(II) не передує індукція репаративних систем, що призводить до більшої можливості закріплення мутації при реплікації.

Отже, виявлено певну функціональну автономію різних субодиниць лектину РНА, яка в разі РНА-Е проявляється цитотоксичністю, в разі PHA-L – протекторною та антимутагенною дією, а сумарний препарат РНА-Р міг виявляти власну мутагенну активність та, залежно від умов, достовірний антимутагенний вплив щодо Ni(II). Це зумовлює використання як антимутагенів не сумарних препаратів лектинів, а необхідність виявлення окремих ізоформ з найбільш ефективними та направленими антимутагенними властивостями.

Дослідження протекторної здатності ізоформ лектину суцвіть бузини чорної (S. nigra). Виходячи з перспективи фармакологічного застосування лектинів, було досліджено протекторну здатність ізоформ лектинів суцвіть бузини чорної - поширеної в Україні лікарської рослини. Одержання ізоформ лектинів проводили за модифікованим методом автофокусування. Виявилось, що екстракт суцвіть бузини має три ізоформи лектину, для яких характерна значна аглютинувальна активність. Вони відрізняються за фізико-хімічними та біологічними властивостями. Дві ізоформи були задіяні у генетичних дослідженнях та позначені як ЛБЧ-1 та ЛБЧ-2. ЛБЧ-1 має сумарний негативний заряд, концентрується при рН 5,0-5,5 та аглютинує, як нативні еритроцити людини системи АВ0 (А>0), так і формалінізовані еритроцити барана. Друга форма (ЛБЧ-2) з позитивним сумарним зарядом концентрується при рН 9,0-10,0, аглютинує еритроцити людини. Встановлено, що ЛБЧ-2 локалізується у пилку бузини чорної.

Перевірка модулюючої здатності ізоформ лектину суцвіть бузини щодо генотоксичної дії іонів Ni(II) за дифузним методом показала (рис.7), що полярні за зарядом молекулярні форми лектину – ЛБЧ-1 та ЛБЧ-2 відрізняються за своєю дією. Ізоформа ЛБЧ-1 показала залежність модулюючого впливу від стану системи репарації/реплікації мутанта. Так, у rec+ штама BD170 ізоформа ЛБЧ-1 здійснювала значно більший протекторний ефект (74%), ніж комерційний препарат SNA з кори бузини чорної. Достовірний, але менший (26 %) протекторний ефект дана ізоформа виявляла і у штама BD224 (recЕ4). Тільки штам recP149 (recP) виявився повністю нечутливим до впливу лектинів S. nigra. Ізоформа ЛБЧ-2 не мала протекторного ефекту при застосованих умовах експерименту. Встановлено, що обидві досліджені ізоформи лектину суцвіть бузини, так, як і SNA, можуть посилювати дію Ni(II) у штама BD293 (polC), що має порушення ДНК-полімерази ІІІ.

Рис.7. Модулюючий вплив щодо токсичної дії іонів Ni(II) (0,5 М) ізоформ ЛБЧ у порівнянні з впливом SNA. Вісь абсцис – лектин; вісь ординат - зміна зони інгібування росту культури обробленої лектином (дослід) по відношенню до такої без обробки лектином (позитивний контроль ) у %. 1 – штам BD170 (rec+); 2 - штам BD224 (recЕ4); 3 - штам recP149 (recP); 4 – штам BD293 (polC). * - достовірні відхилення від контролю (р< 0,05)

Ізоформа ЛБЧ-1 могла також достовірно протидіяти впливу N-метил-N'-нiтрозогуанiдину (МННГ) у двох rec- штамів, чутливих до дії даного алкілуючого агента. Індуковані МННГ мутації виникають головним чином у точці реплікації ДНК. Вони призводять до утворення метильованих основ – О6 –метилгуаніну та О4 -метилтиміну, в результаті чого відбувається неправильне спарювання і заміна основ. Ізоформа ЛБЧ-2 не протидіяла процесу алкілування ДНК, а у одного із штамів (recB) показала навіть посилення ефекту МННГ, що може вказувати на спільну мішень їх дії.

Отже, різниця у дії ізоформ свідчить про залежність протекторного впливу лектинів від структури молекули. Одержані результати стверджують існування певної функціональної автономії ізоформ лектинів, зокрема лектину суцвіть бузини, і показують можливість та доцільність відбору ізоформи з протекторними властивостями.

Дослідження ролі власного бактеріального лектину B. subtilis у прояві модулюючого впливу на мутаційний процес лектинів рослинного походження. За багатьма дослідженнями була виявлена нечутливість штаму recP149, дефектного за системою репарації/рекомбінації, до впливу лектинів на мутаційний процес, як спонтанний, так і індукований іонами Ni(II) та мітоміцином С. Даний факт став підставою до висновку, що має існувати важлива ланка у системі репарації/рекомбінації, без якої чужорідні лектини не здійснюють свій вплив на мутаційний процес. Оскільки продукт гена recP досі не був біохімічно охарактеризований і лише висловлювалась можливість його приналежності до класу топоізомераз, це стало основою для припущення, що продукт даного гена може бути лектином. Проведене дослідження активності власних екзолектинів B. subtilis на різних фазах росту rec+ та rec- штамів показало, що з дев'яти перевірених штамів, тільки у культуральній рідині штаму recP149 був відсутній позаклітинний сіалоспецифічний лектин. Отже мутація у гені recP системи рекомбінації/репарації призводить до неможливості продукування активного екзолектину B. subtilis. При відсутності власного бактеріального лектину блокується модулююча дія рослинних лектинів на мутаційний процес у B. subtilis.

Пошук чутливих до дії лектинів клітинних мішеней. Шляхом застосування метаболічних інгібіторів, якими правили антибіотики з різним механізмом дії та біорегулятори, створені на основі феназину, встановлено здатність лектинів по-різному впливати на внутрішньоклітинні процеси в залежності від структури лектину та генотипу мутанта за станом системи репарації/реплікації. Зменшення прояву модулюючої дії рослинних лектинів у дефектних штамів, свідчить, що лектини діють за сигнальним типом через посередництво бактеріальних білків, які входять до даних систем. Найбільш специфічний модулюючий ефект лектини здійснювали щодо дії інгібітора матричного синтезу ДНК - мітоміцину С (табл.2). Максимальний, але протилежно направлений вплив, чинили лектини з хітинзв'язувальним доменом у rec+ штаму. Дещо менший вплив окремі лектини здійснювали також у rec+ штаму щодо інгібітора транскрипції - рифампіцину. В разі дії антибіотика стрептоміцину було зареєстровано посилення його дії під впливом SNA та ізоформи ЛБЧ-2, що вказує на існування їхньої спільної з антибіотиком мішені, пов'язаної з процесом біосинтезу білка. ЛБЧ-1 не змінювала дію стрептоміцину, але показала у штаму polC з пошкодженою ДНК-полімеразою ІІІ протекторний ефект щодо впливу мітоміцину. Отже різні за вуглеводною специфічністю та поведінкою у електричному полі ізоформи ЛБЧ по-різному впливають на внутрішньоклітинні процеси, залежно від їхньої структури.

Таблиця 2

Вплив лектинів на чутливість штамів B. subtilis до

бактеріостатичної дії мітоміцину С (10 мкг/мл)

Лектини | Штами

SB25 | recP | BD293

Зона пригнічення росту бактеріального газону у % до контролю

ConA | 90,42 * | 93,46 | 99,10

LAA | 100,42 | 103,27 | 107,17

PHA-P | 126,67 * | 114,05 | 97,40

STA | 138,75 * | 132,68 * | 94,34

WGA | 61,67 * | 97,39 | 98,19

SNA | 115,00 | 120,26 * | 98,87

VAA | 90,00 * | 104,58 | 102,47

HPA | 117,08* | 100,78 | 83,77 *

BSL | 90,00 * | 68,95 * | 84,64 *

*- достовірні відхилення від контролю (р< 0,05)

Власний лектин B. subtilis виявив найбільш специфічну протекторну дію також щодо мітоміцину, але саме у дефектних штамів recP та polC. У той же час він не діяв на штам recЕ. Відмінності у впливі лектину B. subtilis, зареєстровані у двох мутантів з дефектною системою репарації, вказують, що механізм, за яким лектин впливає на внутрішньоклітинні процеси, є складним і опосередкованим. Одержані результати свідчать на користь можливості дії даного лектину на рівні репарації та реплікації ДНК. Всі виявлені взаємодії можуть мати виключно внутрішньоклітинну локалізацію.

Застосування низькомолекулярних біорегуляторів, похідних феназину та феназин-1-карбонової кислоти (ФКК-1), показало, що лектини модулюють цитостатичні ефекти вихідних речовин та їх піримідинових похідних у ряду: феназин < ФКК-1 < кон'югат ФКК-1 з 6-азацитозином < кон'югат ФКК-1 з 6-азаурацилом. У мутанта recP, що втратив здатність до продукування власного бактеріального лектину, модулюючий ефект був відсутнім. Це свідчить про його посередницьку роль у взаємодіях високо- та низькомолекулярних біорегуляторів. Значний антагоністичний вплив всього спектру лектинів відносно дії кон'югату ФКК-1 з 6 азаурацилом у rec+ штаму вказує на існування конкуренції за спільну клітинну мішень. Шляхом використання модельної системи транскрипції in vitro, із залученням РНК-полімерази фага Т7, було показано, що лектин B. subtilis дозозалежно інгібує вихід РНК-транскрипту (рис.8), аналогічно до дії кон'югату ФКК-1 з 6 азаурацилом. Це свідчить про те, що їх спільною мішенню є ДНК-залежний синтез РНК.

Рис.8. Електрофореграма (А) та денситограма (В) продуктів транскрипції in vitro при різних концентраціях лектину B.subtilis: 1 – 100; 2 – 10; 3 – 1 мкг/мл; К – (контроль) – повний транскрипт, отриманий за відсутності лектину

Таким чином, за сукупністю одержаних результатів, очевидно, що механізми, за якими лектини впливають на внутрішньоклітинні процеси, є комплексними і залежать від репаративних функцій. Отже, рослинні лектини та власний лектин B.subtilis можна віднести до природних речовин - репарогенів, здатних впливати на точність репарації ДНК. Це відкриває перспективу використання речовин такого типу, особливо у складі лікарських рослин, як потенційних протекторів та антимутагенів.

Розроблена тест-система B. subtilis для оцінки протекторної та антимутагенної дії лектинів, як потенційних засобів захисту геному, показала свою ефективність. Дана тест-система може бути застосована для вияву партнерів взаємодій лектин-білок та лектин-ДНК, що, в свою чергу, відкриває підходи до управління мутаційним процесом шляхом використання біологічно активних речовин.

ВИСНОВКИ

Робота відноситься до малодослідженої проблеми - вивчення впливу лектинів на мутаційний процес. Отримані результати доводять здатність лектинів до модулюючого впливу на процес спонтанного та індукованого мутагенезу. Вперше, з використанням мутантів B. subtilis, що мають пошкодження в системі репарації/рекомбінації, знайдено умови, за яких дані білки виявляють генопротекторну і антимутагенну дію, та показано участь власного лектину B. subtilis в реалізації такої дії.

1. Розроблено схему тестування модулюючої дії лектинів на спонтанний та індукований мутаційний процес, де задіяні мутанти B. subtilis, дефектні за ключовими ланками системи репарації/рекомбінації/реплікації: recA, recB, recE, recF, recG, recH, recL, recM, recP, add-5, polC. Експериментально одержано характеристики умов максимального прояву протекторної і антимутагенної дії лектинів: відсутність глюкози у складі бактеріального середовища, концентраційні співвідношення лектин/мутаген (ефективні концентрації лектинів знаходяться у діапазоні від 1,0 до 100,0 мкг/мл), черговість їх внесення в тест-систему (попередня обробка лектином).

2. Визначено лектини, представники різних структурних класів, які є