НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛIКАРСЬКИХ ЗАСОБIВ

На правах рукопису

Для службового користування

Прим. № _______

ЛИСОЧЕНКО Лілія Михайлівна

УДК 615.322.07

РОЗРОБКА МЕТОДIВ КОНТРОЛЮ ТА СТАНДАРТИЗАЦIЯ

ДЕЯКИХ ФIТОХIМIЧНИХ ПРЕПАРАТIВ ПО БІОЛОГІЧНО

АКТИВНИМ КЛАСАМ СПОЛУК

15.00.03 – стандартизація та організація виробництва

лікарських засобів

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії аналітичної хімії Державного наукового центру лікарських засобів (м. Харків). Коммедбіопром, Національна Академія наук України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук,

Підпружников Юрій Васильович,

Державний науковий центр лікарських засобів,

завідувач лабораторії аналітичної хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Маслова Наталія Федорівна,

Державний науковий центр лікарських засобів,

завідувачка лабораторії фармакології ферментних

та антиферментних препаратів

доктор фармацевтичних наук, професор

Ковальов Володимир Миколайович,

Українська фармацевтична академія,

завідувач кафедри фармакогнозії

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти,

ім. П.Л. Шупика, кафедра фармацевтичної хімії

та фармакогнозії, Міністерство охорони здоров’я

України, м. Київ

Захист відбудеться “28” жовтня 1999 р. о 13 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .817.01 при Державному науковому центрі лікарських засобів (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці ДНЦЛЗ (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).

Автореферат розісланий “28” вересня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор фармацевтичних наук, професор М. О. Казарінов

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність теми. Препарати на основі лікарської рослинної сировини широко застосовуються у медичній практиці. Перелік лікарських засобів фітопрепаратів достатньо широкий (настойки, екстракти, таблетки, мазі, комбіновані препарати, сумарні препарати типу бальзамів та ін.). При приготуванні лікарських засобів із рослинної сировини викорис-товують як індивідуальні речовини, виділені з рослин, так і весь комплекс сполук, які містяться у сировині – сумарні субстанції.

Механізм впливу таких препаратів на організм вивчається досить давно, однак і досі у ряді випадків однозначну відповідь на питання, які саме класи сполук зумовлюють біологічну активність препарату, дати важко. Виділена з рослинної сировини у чистому вигляді сполука може не виявляти очікуваного фармакологічного ефекту, у той час як комплексні препарати (екстракти, настойки) з тієї ж сировини мають таку фармакологічну дію. В іншій ситуації супутні речовини не виявляють необхідної фармакологічної активності. Із вищевикладеного видно, що вивчення складу рослинної сировини, дослідження залежності біологічної активності фітохімічних препаратів від сполук, що входять до складу рослинної субстанції, насьогодні є актуальним. Робота у цьому напрямку є частиною концепції створення препаратів природного походження у Державному науковому центрі лікарських засобів (ДНЦЛЗ).

Стандартизація та контроль якості лікарських засобів є невід'ємною частиною цієї концепції. Сучасні ж вимоги до якості лікарських препаратів диктують необхідність нових об'єктивних методів стандартизації рослинної сировини і препаратів на її основі. Аналітична нормативна документація (АНД) повинна бути створена таким чином, щоб усунути мо-жливість фальсифікації препаратів із дорогої сировини, а також не допустити випуску не-ефективних фітохімічних препаратів за рахунок використання неякісної сировини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Державного наукового центру лікарських засобів (№ державної реєстрації 0193U044239; 0191.0042854).

Мета і завдання дослідження. Основна мета роботи – розробити об'єктивні критерії і методи стандартизації фітохімічних препаратів за групами біологічно активних сполук, що придатні для використання у подальшій роботі з аналогічними лікарськими засобами.

Для реалізації поставленої мети вирішували такі завдання:—

провести експериментальну оцінку якісного складу деяких фітохімічних препаратів і розробити методики кількісного визначення біологічно активних класів сполук, які зумовлюють конкретну фармакологічну дію. На прикладі настойки кореня та кореневищ ехінацеї пурпурової, препарату “Фітон СД” і “Квіткового чаю” вивчити зв'язок адаптогенної дії із хімічним складом; настойки та густого екстракту глоду, густого екстракту кропиви собачої, препаратів “Кратал” і “Кардіофіт” – седативної і кардіотонічної дії;—

розробити методики ідентифікації основних груп біологічно активних речовин (БАР) у комбінованих фітохімічних препаратах: “Фітон СД”, “Кардіофіт” і “Квітковий чай”;—

вивчити кількісний склад основних груп БАР препарату “Авісан”;—

запропонувати оптимальні методи кількісного визначення діючих речовин у кожному конкретному препараті;—

апробувати математичну модель, яка виявляє кореляційну залежність: “біологічна активність – кількісний вміст біологічно активних сполук” на прикладі настойки мирту.

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі даних про специфічну фармако-логічну активність обрані класи сполук, за якими необхідно контролювати якість ряду до-сліджуваних фітохімічних препаратів.

Розроблені об'єктивні методики контролю якості настойки коренів і кореневищ ехінацеї пурпурової, препаратів з плодів глоду, комбінованих фітопрепаратів типу бальзамів.

Вперше в оцінці ряду препаратів введені нові об'єктивні критерії якості за групами сполук, які не враховувалися раніше, наприклад: настойка глоду – тритерпенові кислоти, на-стойка коренів і кореневищ ехінацеї пурпурової – фруктозани, гідроксикоричні кислоти.

Вперше кількісно оцінений склад субстанції Авісан, розроблені надійні і об'єктивні методики аналізу субстанції і таблеток “Авісан”.

На прикладі вивчення груп сполук настойки мирту апробована математична модель, яка виявляє кореляційну залежність кількісного вмісту біологічно активних сполук із їх фар-макологічою дією.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених досліджень розроблені 11 аналітично-нормативних документів для контролю якості рослинної сировини та фітохімічних препаратів: плід віснаги (плід амі зубної) ФС 42У-14/168-304-98; Авісан ФС 42У-14/168-305-98; таблетки “Авісан” ,05 г, покриті оболонкою, ФС 42У-14/168-306-98; настойка коренів і кореневищ ехінацеї пурпурової ТФС 42У-101/38-196-96; настойка глоду ФС У-14-474-99; настойка кропиви собачої ФС 42У-14-473-99; екстракт глоду густий ТФС 42У-4/37-878-98; екстракт кропиви собачої густий ТФС У-4/37-879-98; гранули “Кратал” ТФС 42У-4/37-880-98; “Бальзам Фітон СД” ТФС 42У-4-775-98; “Кардіофіт” ВФС 42У-140/37-565-97.

Особистий внесок здобувача. Особисто дисертантом розроблені методики кількісного визначення БАР у вищезгаданій АНД, та методи контролю якості комбінованих фітопрепа-ратів та зроблене дослідження кількісного складу препарату “Авісан”. Автор брав участь в обробці та обговоренні результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації обговорені на Міжнародних науково-практичних конференціях “Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения” (м. С.-Петербург, 1998), “Фармация в XXI веке: инновации и традиции” (м. С.-Петербург, 1999), “Поиск, создание и изучение новых лекарственных средств растительного и синтетического происхождения” (м. Томск, 1993); Всеукраїнській конференції з аналітичної хімії (м. Ужгород, 1998); конференції молодих учених та спеціалістів ВНДІХТЛЗ (м. Харків, 1991).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 статтей у фахових журналах, та 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 128 сторінках машинопису і складається із вступу, 3 розділів власних досліджень, загальних висновків і списку літератури, який містить 124 джерел, з них 36 – іноземні. Робота включає 17 таблиць, 22 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Стандартизація адаптогенних, седативних і кардіотонічних фітохімічних препаратів

Розробка методів стандартизації настойки коренів і кореневищ

ехінацеї пурпурової

Для контролю якості настойки коренів і кореневищ Echinacea purpurea Moench розроб-лені методики ідентифікації і кількісної оцінки БАР, які забезпечують імуномодулюючий ефект препарату. Попередні дослідження хімічного складу настойки ехінацеї показали, що фруктозани, у тому числі інулін, присутні в препараті в достатніх кількостях для стан-дартизації.

Для ідентифікації фруктозанів та фруктози використовували метод тонкошарової хроматографії (ТШХ). Оптимальні результати були одержані при використанні змішаного сорбентного шару: силікагелю і кизельгуру (використовували стандартні хроматографічні пластинки “Kieselgel /254” виробництва фірми Merck). Складність вибору систе-ми була зумовлена необхідністю розділу фруктози та полісахариду, який складається з 34-35 залишків D-фруктози. На підставі експериментальних даних за оптимальну систему був обраний 55етанол. Для прояву плям хроматограму послідовно обробляли розчинами ре-зорцину і кислоти сірчаної розведеної, після чого нагрівали при температурі 100 0С. У процесі експерименту на хроматографічну пластинку паралельно з пробами безпосередньо настойки, стандартного зразка фруктози і зразка інуліну наносили також фракцію фрукто-занів, одержану при кількісному визначенні.

Пляма на хроматограмі препарату знаходилась на одному рівні з плямою зразка інулі-ну і плямою на хроматограмі виділеної полісахаридної фракції. Це дозволило з достатнім ступенем надійності ідентифікувати фруктозани (Rf в інтервалі 0,80-0,87) у настойці ехинацеї пурпурової.

У числі похідних кофейної кислоти в ехінацеї пурпурової домінує вміст цикорієвої кис-лоти (2,3-О-дикофеноіл-винна кислота). У суцвіттях і листі вміст цикорієвої кислоти біль-ший, ніж у коренях.

Дослідження з розділу кислот проводили на хроматографічних пластинках “Kiesel-gel 254”, у системі розчинників: н-бутанол – кислота оцтова льодяна – вода (40:10:5). Для ідентифікації кислот використовували розчин, одержаний після осадження полісахаридів з настойки, і його упарювання. Після хроматографування пластинку переглядали в УФ-світлі при довжині хвилі 365 нм: на рівні зони зразка кофейної кислоти (з Rf близько 0,7) іденти-фікували кофейну кислоту. Rf цикорієвої кислоти – близько 0,5. Для детектування також використовували діазонієву сіль сульфанілової кислоти в розчині карбонату натрію (реагент Паулі). Кислоти проявляються у вигляді зон цегляно-червоного кольору.

В результаті досліджень з кількісного визначення гідроксикоричних кислот у настойці з кореня і кореневищ ехінацеї пурпурової встановили, що їх вміст у перерахунку на цикорієву кислоту знаходиться в межах від 0,1 до 0,3для різних серій.

Кількісну оцінку вмісту основного класу БАР – суми фруктозанів у настойці – прово-дили спектрофотометричним методом за поглинанням продуктів взаємодії фруктози з резор-цином, що утворилася після розщеплення фруктозанів. Для гідролізу використовували кон-центровану хлористоводневу кислоту (в даних умовах у взаємодію з резорцином вступає тільки фруктоза). Попередньо полісахаридну фракцію осаджували, осад розчиняли в гарячій воді. Як стандарт використовували фруктозу. На попередньому етапі досліджень також ко-ристувалися зразком інуліну. Спектри поглинання розчинів (препарату, стандартного зразка фруктози і зразка інуліну) після реакції з резорцином у кислому середовищі практично іден-тичні (рис. ).

Рис.1. – Спектри поглинання продуктів реакції взаємодії з резорцином:

1 – розчин настойки ехінацеї;

2 – розчин зразка інуліну;

3 – розчин зразка фруктози

При використанні даної методики був проведений аналіз різних зразків настойки. Для порівняння паралельно оцінювали вміст полісахаридів у препараті за фармакопейною мето-дикою ваговим методом. Результати усіх визначень наведені у табл. .

Як видно з табл. , вміст суми фруктозанів у настойці варіює від 0,10 до 0,25у пере-рахунку на фруктозу, в залежності від використаної для виготовлення препарату сировини.

Розроблені методики ідентифікації і кількісного визначення основних БАР, що зумовлюють фармакологічну дію препарату, ввійшли до нормативної документації на на-стойку ехінацеї пурпурової.

При співставленні результатів визначень за двома методиками можна зробити висно-вок, що розроблена нами методика дозволяє специфічно оцінити вміст саме суми фруктоза-нів, а не всіх полісахаридів, які містяться у препараті, що краще з точки зору стандартизації препарату.

Таблиця . – Результати визначення вмісту деяких БАР у різних серіях

настойки коренів і кореневищ ехінацеї пурпурової.

Клас БАР,

що визначають | Настойка виробництва

НВФ АІП Лтд, м. Чернівці | Настойка виробництва фармфабрики “Віола”, м. Запоріжжя | Настойка виробництва ВХФП “Біостимулятор”,

м. Одеса

Вміст суми

фруктозанів

(за розробленою

методикою), |

0,253±0,02 |

0,102±0,007 |

0,108±0,007

Вміст полісахаридів

(ваговим методом за ГФ |

0,526±0,016 |

0,174±0,005 |

0,193±0,006

Вміст гідроксикоричних кислот, |

0,310±0,012 |

0,109±0,004 |

0,120±0,005

Розробка методик аналітичного контролю сумарних

препаратів адаптогенної, загальнозміцнюючої дії

Основним критерієм при виборі груп сполук для контролю якості комбінованих препа-ратів, у яких відносно невисокі концентрації діючих речовин, може бути характер біологічної дії даних препаратів. Такий підхід дозволяє обмежити число сполук, що визначаються і ко-ректно вирішити проблему хімічного аналізу комплексного фітопрепарату із багатокомпо-нентним складом.

Бальзам “Фітон СД” застосовують як адаптоген, загальнозміцнюючий, протиза-пальний, радіопротекторний засіб.

Для створення максимально повного аналітичного “паспорту” препарату бажано іден-тифікувати сполуки, характерні для кожної рослини з яких виготовлений препарат. Однак реалізувати подібну ідею на практиці, коли до складу препарату входять компоненти більше десятка різних видів лікарської рослинної сировини, досить важко.

Проаналізувавши склад рослинної сировини конкретного препарату, його фармако-логічну дію, а також враховуючи, які класи речовин найбільш повно вилучаються 70спиртом у процесі приготування препарату, для стандартизації бальзаму “Фітон СД” вважа-ли доцільним контролювати присутність і вміст флавоноїдів, ефірних масел та дубильних речовин.

Компоненти ефірного масла у препараті ідентифікували методом газорідинної хроматографії (ГРХ). За літературними даними тимол міститься в ефірному маслі материн-ки; анетол – головний компонент ефірного масла плодів анісу, фенхеля; ментол – м'яти перце-вої. Були розроблені ГРХ методики доказу ідентичності на наявність ментолу, анетолу і ти-молу за коефіцієнтами утримування із внутрішнім стандартом метилсаліцилатом і застосу-ванням розчину змішаного робочого стандартного зразка зазначених індивідуальних компо-нентів ефірних масел.

Флавоноїди ідентифікували методом ТШХ. Для оцінки вмісту флавоноїдів у препараті (не менше 0,02використовували відомий із даних літератури метод їх кількісного визначення диференційним спектрофотометричним методом після реакції комплексо-утворення із хлоридом алюмінію. Як стандарт використовували стандартний зразок гіперо-зиду.

Методики ідентифікації і кількісної оцінки інших груп сполук відомі.

Склад “Квіткового чаю” – квітки ромашки, нагідок, волошки синьої, шипшини, соняшника, бузини, листя м'яти кучерявої – свідчить, що практично всі компоненти містять значні кількості ефірних масел. Їх ідентифікували методом ГРХ, за окремими компонентами ефірних масел, характерними для даної рослини. Через відсутність стандартних зразків індивідуальних сполук, характерних для інгредієнтів збору, на попередньому етапі до-сліджень як стандарти використовували гексанові здобування з кожного компоненту збору, одержані в апараті Сокслета.

Як внутрішній стандарт використовували анетол.

В інтервалі відносних часів утримання 0,73-0,77 ідентифікували ментол, що міститься у м'яті. В інтервалі 2,35-2,39 знаходиться пік, що відповідає бісаболол - оксиду, а в інтервалі 3,67-3,71 – пік цис-єн-ін-біциклоефіру (сполук, характерних для екстракту з квіток ромашки).

“Квітковий чай” входить до складу препарату “Ауріта” і діє як загальнозміцнюючий засіб. На цій підставі також вважали доцільним ідентифікувати і кількісно контролювати вміст флавоноїдів, лейко- і антоціанів, які можуть зумовити подібну фармакологічну дію.

Кількісне визначення антоціанів (квітки волошки синьої, шипшини) проводили спект-рофотометричним методом за власним поглинанням їх кислих розчинів у видимій області (не менше 0,05у перерахунку на ціанідин-3,5-диглікозид). Відносна помилка визначення не перевищує 5

Вміст суми флавоноїдів повинен складати не менше 1,5у перерахунку на рутин та суху речовину.

Стандартизація препаратів з плодів глоду (настойка, густий

екстракт)

Зроблена нами попередня кількісна оцінка тритерпенових кислот в препаратах плодів глоду (густому екстракті, настойці) показала, що їх вміст перевищує вміст суми флавоноїдів практично в 10 разів. На підставі одержаних результатів, а також, враховуючи більшу фармакологічну активність тритерпенових кислот у порівнянні з іншими групами БАР, ми вважали більш доцільним для стандартизації препаратів з плодів глоду нормувати вміст суми тритерпенових кислот, у перерахунку на олеанолову кислоту. Ідентичність препаратів з достатнім ступенем надійності доцільно встановлювати за наявністю олеанолової кислоти, лейко- і антоціанів і флавоноїдів (гіперозид).

Для ідентифікації олеанолової кислоти використовували метод ТШХ: хроматогра-фічні пластинки “Sorbfil”; система розчинників: гексан – 96спирт (8:1), як речовину-свідок – стандартний зразок олеанолової кислоти. Хроматограми проявляли 10розчином кислоти сірчаної з наступним нагріванням при температурі від 100 до 105 0С протягом 3 хв. На хрома-тограмі розчину, що випробовується, пляма темно-рожевого кольору із значенням Rf у ме-жах від 0,55 до 0,65 відповідає олеанолові кислоті.

Флавоноїди також ідентифікували методом ТШХ, як речовину-свідок використову-вали гіперозид.

Антоціани та лейкоантоціани ідентифікували за посиленням забарвлення цієї групи сполук при дії на них мінеральних кислот при нагріванні.

Для кількісного визначення суми тритерпенових кислот розроблена спектрофотометрична методика, заснована на здатності сполук цього класу давати забарв-лені продукти взаємодії з різними кислотними реагентами.

Визначення тритерпенових кислот проводили у сировині – плодах глоду, настойці і густому екстракті. Вміст оцінювали за поглинанням здобування з препарату після реакції з 0,5розчином п-диметиламінобензальдегіду (п-ДМАБ) у сірчанокислому розчині, у перера-хунку на олеанолову кислоту. Спектр поглинання розчину препарату, що випробовується, після реакції з п-ДМАБ у кислому середовищі має той же характер, що і спектр стандартного зразка олеанолової кислоти в тих же умовах (рис. ).

Рис. . – Спектри поглинання розчинів після реакції з п-ДМАБ:

1 – настойка глоду;

2 – стандартний зразок олеанолової кислоти (0,03

При розробці методики були оптимізовані процедура пробопідготовки, умови одер-жання забарвленого продукту реакції, вивчена його стабільність.

Оскільки хлороформні здобування з настойки і густого екстракту мають слабке жовтувате забарвлення, ми оцінили його внесок до сумарної оптичної густини розчину, що випробовується, (близько 5значення сумарної оптичної густини). Розчин порівняння – льодяна оцтова кислота з розчином п-ДМАБ, має більш значну оптичну густину. Усклад-нення процедури пробопідготовки для одержання більш чистого здобування приведе до біль-шої похибки визначення, тому вважали можливим використовувати більш простий варіант підготовки проби.

Вміст тритерпенових кислот у перерахунку на олеанолову кислоту у настойці глоду варіює в межах від 0,053 до 0,079; у сировині – від 0,55 до 0,83(у перерахунку на висуше-ну сировину); в густому екстракті складає від 2,5 до 3,8(з урахуваням вологи).

Розробка методів стандартизації сумарного препарату

“Кардіофіт”

Для одержання даного препарату використовується сировина, що містить серцеві глікозиди. Проте, в результаті комплексу доклінічних і клінічних випробувань препарату, проведеного співробітниками ДНЦЛЗ під керівництвом д. мед. н. Гладченко С.В. та в Інсти-туті фармакології і токсикології АМН України, встановлена його дія як гіпотензивного і седативного засобу. При цьому характерної для серцевих глікозидів дії не виявлено.

Наші спроби ідентифікувати серцеві глікозиди у препараті за характерними кольоровими реакціями (Лібермана-Бурхарта, Легаля та ін.) позитивних результатів не дали. Це можна пояснити дуже незначним вмістом сполук, які визначаються, їх лабільністю і, як наслідок, можливим незворотним перетворенням у процесі одержання препарату.

Присутні у достатній для стандартизації кількості кумарини мають коронаророзширюючу і спазмолітичну дію. Заспокійливий ефект може бути зумовлений ефірними маслами. На цій підставі для контролю якості препарату розроблені методики ідентифікації і кількісного визначення кумаринів та ефірних масел. З метою детальнішої характеристики складу БАР препарату, додатково введений ряд якісних реакцій на наявність флавоноїдів, дубильних речовин, хлорофілів, відновлюючих моноцукрів. Присутність останніх у препараті зумовлена тільки рослинною сировиною. Оскільки мова іде про комбінований рослинний препарат, ідентифікація супутніх БАР, що містяться в аналітично значущих кількостях, доповнює аналітичну картину.

Наявність похідних кумарину в препараті встановлюється за характерною флуорес-ценцією в УФ–світлі. Для обгрунтування правильності візуальної реєстрації флуоресценції, на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4A був знятий спектр флуоресценції розчину, що випробовується (рис. ). Збудження проводилося при довжині хвилі 280 нм. Спектр розчину має максимум флуоресценції при довжині хвилі 330 нм. Однак, у видимій області (400 – 450 нм) величина флуоресценції зберігається значною, це дає можливість сприймати оком яскраво-фіолетову флуоресценцію.

Кількісне визначення кумаринів у препараті “Кардіофіт” проводили спектрофото-метричним методом за їх власним поглинанням. Вміст суми похідних кумарину у препараті в перерахунку на кумарин повинен бути не менше 0,02

Ефірне масло препарату ідентифікували методом ГРХ, тимол використовували як стандартний зразок. Кількісне визначення вмісту ефірного масла у препараті (не менше 0,01проводили за методикою, розробленою нами для спиртвміщуючих фітопрепаратів.

Рис. . – Спектри поглинання: 1 – розчин препарату “Кардіофіт”;

2 – розчин зразка кумарину;

3 – спектр флуоресценції розчину препарату “Кардіофіт”.

Нові підходи до стандартизації сумарних фітохімічних препаратів

Кореляція вмісту біологічно активних речовин настойки мирту і його

біологічної активності

Як продовження раніше проведеної нами роботи по дослідженню препарату “Сальвін” (на основі використання регресійних моделей) аналогічним способом вивчена настойка мир-ту з метою встановлення груп БАР, які більше визначають фармакологічний ефект препара-ту.

У першому наближенні ми вважаємо припустимим використовувати лінійну кореляці-йну залежність для того, щоб розглянути залежність біологічної активністі (БА) від складо-вих компонентів.

У загальному вигляді така залежність має наступний вид:

БАk = а0 + а1 Сk1 + а2 Сk2 + а3 Сk3 +… = аj Сkj, k=1,……n,

де: k – номер досліджуваної серії препарату (загальне їх число – n);

1,2,3 – індекси компонентів препарату (у розглянутому нами випадку їх 5).

а0 – незалежний член, що дозволяє внести поправку на початкові умови експерименту.

Коефіцієнти а розраховуються за методом найменших квадратів.

До складу листя мирту входять наступні основні групи сполук: ефірне масло, флаво-ноїди, дубильні речовини, хлорофіли та ін.

Різними фізико-хімічними методами нами був визначений вміст кожної групи речовин в різних серіях настойки мирту (табл. ).

Таблиця . – Результати визначення БА, а також експериментально встановлений

вміст різних груп БАР лабораторних серій настойки мирту.

№ серії |

БА |

Сухий залишок, % | Сума флаво-ноїдів, % | Масова частка хлорофілів, % | Ефірне масло, % | Дубильні речовини, %

1. | 15,69 | 2,97 | 0,287 | 5,87*10-3 | 0,053 | 1,32

2. | 15,17 | 3,80 | 0,229 | 6,13*10-3 | 0,049 | 1,24

3. | 15,31 | 4,19 | 0,258 | 4,49*10-3 | 0,068 | 1,28

4. | 16,95 | 5,74 | 0,431 | 7,51*10-3 | 0,097 | 1,96

5. | 16,00 | 4,88 | 0,333 | 8,41*10-3 | 0,101 | 1,77

6. | 15,63 | 4,12 | 0,263 | 6,29*10-3 | 0,084 | 1,37

7. | 16,19 | 5,26 | 0,375 | 7,35*10-3 | 0,128 | 1,57

Одержані результати служили вихідними даними для розрахунку коефіцієнту кореляції очікуваної функціональної залежності. В результаті проведених обчислень знайдені: незалежний коефіцієнт а0 = ,157, коефіцієнти а1 = - ,0679, а2 = ,180, а3 = - ,644, а4 = - ,191, а5 = ,661. Статистично значущими є коефіцієнти а0 (відповідає за умови експерименту та не враховані фактори), а2 (зв'язаний із вмістом суми флавоноїдів). Коефіцієнт кореляційної за-лежності складає 0,91.

Для обгрунтування внеску кожного компонента в БА були проведені розрахунки з різними комбінаціями параметрів. У будь-яких комбінаціях за винятком вмісту флавоноїдів коефіцієнт кореляції значно зменшувався (до значення 0,83 та менше).

Одержані результати дозволяють зробити висновок про те, що найбільша антимік-робна активність препарату пов'язана із вмістом суми флавоноїдів. Значущим є також пара-метр, відповідний вмісту дубильних речовин, що можна пояснити присутністю групи миртинів (поліфенольних сполук), які визначаються в умовах аналізу сумісно з дубильними речовинами. Вагомий внесок незалежного члену свідчить про те, що ряд груп сполук, сприя-ючих БА препарату, не був нами встановлений з приводу відсутності стандартних зразків та ін. Тому надалі ми плануємо продовжити дослідження у цьому напрямку.

Визначення хімічного складу сумарного очищеного препарату “Авісан”

на основі плодів амі зубної

За даними літератури в плодах амі зубної містяться похідні фуранохромонів і пірано-кумаринів, флавоноїди, жирні масла.

Фармакологічну дію препаратів амі зубної зв'язують, насамперед, з вмістом хромонів, зокрема келіну. Келін застосовується при лікуванні бронхіальної астми, при спазмах кишеч-ника і шлунку. “Авісан” використовують при лікуванні нирковокам'яних захворювань.

Для більш глибокого дослідження препарату, співставлення його хімічного складу із фармакологічною дією, була проведена робота по зведенню балансу за основними групами речовин, що містяться у препараті. При цьому їх сумарний вміст ми прагнули звести до 100 %.

Виходячи зі встановленого хімічного складу амі зубної і технології одержання “Аві-сану”, було проведене кількісне визначення фуранохромонів, піранокумаринів, флавоноїдів, гідроксикоричних і жирних кислот, сумарного вмісту полісахаридного комплексу. Результати визначень наведені у табл. .

Фуранохромони та піранокумарини визначали з їхнього сумарного хлороформного здобування з наступним розділенням на тонкому шарі. Після розділення і детектування в УФ – світлі відповідні зони елюювали тим же розчинником і фотометрували. Оскільки окремі представники природних хромонів в УФ – світлі дають аналогічну з кумаринами флуорес-ценцію блакитного, коричневого або коричнево-жовтого кольору, їх попередньо розрізняли за допомогою діазотованої сульфанілової кислоти, з якої хромони не утворюють забарв-лених сполук, характерних для кумаринів.

Загальний вміст органічних кислот встановлювали титриметрично 0,1 М розчином натру їдкого (індикатор – фенолфталеїн) у перерахунку на хлорогенову кислоту. Кількісне визначення гідроксикоричних кислот встановлювали після попереднього вилучення ліпо-фільної фракції препарату спектрофотометричним методом у перерахунку на хлорогенову кислоту. Попередньо був проведений розділ кислот на тонкому шарі і встановлено, що вміст хлорогенової кислоти є переважаючим.

В препараті був встановлений вміст жирних кислот методом ГРХ після гідролізу і одержання метилових ефірів жирних кислот. Кількісний вміст жирних кислот у перерахунку на пальмітинову кислоту склав близько 0,1Такий низький вміст зумовлений технологією одержання препарату, оскільки плоди екстрагують 50спиртом. Це не дозволяє у достатній кількості здобути сполуки цього класу.

Виходячи з того, що загальна зола у препараті складає близько 20а сульфатна – близько 25було зроблене припущення, що основна маса золи є сумішшю катионів різних металів, у тому числі лужних. Якісний аналіз показав присутність натрію, заліза.

Визначення суми полісахаридів у препараті проводили гравіметричним методом, після висаджування з водяного розчину надлишком 96спирту.

Таблиця . – Результати кількісного визначення основних груп речовин

препарату “Авісан”.

Назва речовини, яка визначається |

Результат визначення, % | Примітки

Вміст вологи | 1,40 – 2,50

Загальна зола | 18,65 – 18,81

Нерозчинна у хлористоводневій кислоті зола | 0,34

Сульфатна зола* | 29,34 – 32,69

Фуранохромони | 11,56 – 15,15 | У перерахунку на келін

Піранокумарини | 5,83 – 7,41 | У перерахунку на віснадін

Органічні кислоти | 15,05 – 16,53 | У перерахунку на хлорогенову кислоту

(без флавоноїдів, гідрокси-коричних і жирних кислот)

Гідроксикоричні кислоти | 10,96 – 11,27 | У перерахунку на хлорогенову кислоту

Жирні кислоти |

0,1 | У перерахунку на пальмітинову кислоту

Флавоноїди | 2,36 – 3,84 | У перерахунку на рутин

Полісахаридний комплекс | 19,30 – 20,02

Всього |

85,59 – 95,66

* Примітка. При зведенні балансу за кількісним вмістом основних груп речовин, що містяться у препараті, цей показник не враховувався.

В результаті проведених визначень був досліджений кількісний склад основних груп речовин препарату “Авісан”. Сумарний вміст присутніх у препараті різних класів сполук склав близько 96з урахуванням похибки визначень.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Основний зміст дисертаційної роботи викладений у наступних публікаціях:

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Лисоченко Л.М. Розробка методів контролю та стандартизація деяких фітохімічних препаратів по біологічно активним класам сполук. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.03 – стандартизація та організація виробництва лікарських засобів. – Державний науковий центр лікарських засобів, Харків, 1999.

На підставі даних про характер специфічної дії деяких фітохімічних препаратів обгрунтований вибір груп сполук для стандартизації цих препаратів. Розроблені методики кількісного визначення біологічно активних класів сполук, які зумовлюють фармакологічний ефект настойки коренів і кореневищ ехінацеї пурпурової (полісахариди); сировини, настойки і густого екстракту плодів глоду (тритерпенові кислоти); комбінованих фітопрепаратів (“Фітон СД”, “Кардіофіт”).

На підставі кореляційної залежності типу “вміст біологічно активних речовин – біологічна активність” встановлений найбільший вплив суми флавоноїдів на біологічну активність настойки мирту.

Представлені результати кількісного визначення основних груп сполук препарату “Авісан”, що дозволило пояснити специфіку його фармакологічної дії.

Ключові слова: стандартизація, контроль якості, методики, кількісне визначення, лікарські засоби, настойки, фітопрепарати, біологічна активність.

Лысоченко Л.М. Разработка методов контроля и стандартизация некоторых фитохимических препаратов по биологически активным классам соединений. – Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.03 – стандартизация и организация производства лекарственных средств. – Государственный научный центр лекарственных средств, Харьков, 1999.

На основании данных о характере специфического действия некоторых фитохимических препаратов обоснован выбор групп соединений для стандартизации этих препаратов. Разработаны методики количественного определения биологически активных классов соединений, обуславливающих адаптогенный эффект настойки корней и корневищ эхинацеи пурпурной (полисахариды); кардиотоническое и седативное действие – сырья, настойки и густого экстракта плодов боярышника (тритерпеновые кислоты).

Подлинность настойки эхинацеи пурпурной предложено устанавливать по наличию фруктозанов (часть полисахаридной фракции препарата, в большей степени обуславливающая иммуномодулирующий эффект), а также фруктозы и гидроксикоричных кислот (цикориевой, кофейной). Для идентификации указанных соединений были разработаны методики с использованием метода тонкослойной хроматографии.

Количественную оценку содержания суммы фруктозанов (в том числе низкомолекулярных фракций) в настойке проводили спектрофотометрическим методом по поглощению продуктов взаимодействия фруктозы, образовавшейся после расщепления фруктозанов, с резорцином в кислой среде.

Предложенная спектрофотометрическая методика определения содержания тритерпеновых кислот в препаратах боярышника основана на способности соединений этого класса давать окрашенные продукты с кислотными реагентами (в работе использовали раствор п-диметиламинобензальдегида в сернокислом растворе). При разработке методики были оптимизированы процедура пробоподготовки, условия получения окрашенного продукта реакции, изучена его стабильность. Содержание тритерпеновых кислот в настойке боярышника предложено нормировать на уровне – не менее 0,05в пересчете на олеаноловую кислоту (ранее качество препарата контролировалось по содержанию суммы флавоноидов – не менее 0,004в пересчете на гиперозид).

На примере комбинированных фитопрепаратов “Фитон СД” (адаптоген), “Кардиофит” (седативное и гипотензивное средство), типа бальзамов, и “Цветочного чая” (общеукрепляющее), входящего в препарат “Аурита”, предложены критерии стандартизации аналогичных препаратов: идентификация основных и сопутствующих биологически активных групп соединений или индивидуальных веществ для получения максимально полного аналитического “паспорта” препарата; нормирование количественного содержания групп биологически активных веществ, отвечающих в первую очередь за фармакологическое действие препарата.

Представлены результаты по изучению настойки мирта на основе использования регрессионной модели типа “содержание биологически активных веществ – биологическая активность”.

Различными физико-химическими методами было установлено содержание эфирного масла, суммы флавоноидов, дубильных веществ, хлорофиллов в различных сериях настойки мирта. Результаты послужили исходными данными для расчета параметров регрессионной зависимости и коэффициента корреляции. Обработку результатов проводили по методу наименьших квадратов.

Для обоснования вклада каждого из определенных компонентов препарата в биологическую активность были проведены расчеты с различными комбинациями параметров. При любых комбинациях с исключением параметра, соответствующего содержанию флавоноидов, коэффициент корреляции значительно уменьшался. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, наибольшая антимикробная активность настойки мирта связана с содержанием суммы флавоноидов. Значимым является также параметр, соответствующий содержанию дубильных веществ, что можно объяснить присутствием в препарате группы миртинов (полифенольных соединений), которые определяются в условиях анализа совместно с дубильными веществами.

Представлены результаты изучения баланса основных групп веществ, содержащихся в препарате “Ависан”, что позволило объяснить специфику фармакологического действия данного препарата.

Исходя, из химического состава амми зубной и технологии получения препарата “Ависан”, было проведено количественное определение фуранохромонов, пиранокумаринов, флавоноидов, гидроксикоричных и жирных кислот, суммарного содержания полисахаридного комплекса. Суммарное содержание различных классов соединений, присутствующих в препарате, составило около 96с учетом погрешности определений.

В каждом случае количественной оценки содержания биологически активных соединений предложена оптимальная процедура их определения. Разработанные методики характеризуются необходимой точностью.

Ключевые слова: стандартизация, контроль качества, методики, количественное определение, лекарственные средства, настойки, фитопрепараты, биологическая активность.

LisochenkoМ. Development of methods of the control and standardization of some phytochemical preparations using biologically active classes of compounds. – Manuscript.

The thesis for scientific degree of candidate of pharmaceutical sciences on speciality 15.00.03 – standardization and organization of manufacture of drugs. – State Scientific Centre of Drugs, Kharkov, 1999.

On the basis of the data on character of specific action of some phytochemical preparations the choice of groups of compounds for standardization of these preparations is reasonable. The methods of quantitative definition biologically active classes of compounds causing pharmacological effect of tincture of roots and rhizome Echinaceae purpureae (polysacharides), of raw material, tincture and dense extract of fruits Crataegus (triterpene acid), of combined plant drugs (“Phiton”, “Cardiophytum”) are developed.

On the basis of correlation dependence of type “the contents biologically of active substances – the biological activity” it was found the mixture of flavonoids to have most powerful influence on biological activity of tincture Mirtus.

The results of quantitative definition of the basic groups of compounds of the preparation “Аvisun” were submitted. The results allowed to explain specifity of its pharmacological action.

Key words: standardization, quality control, methods, quantitative definition, drugs, tinctures, phytochemical preparations, biological activity.

Відповідальний за випуск В.В.Білетченко

Формат 6084/16. Папір офсетний. Друк офсетний.

Ум. - друк.арк. 1.0

Підпісано до друку 23.09.99 р.

Наклад 100 прим.

Надруковано ПФ “Парус”