НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

Лиманський Олександр Петрович

УДК 577.2

577.32

МОДИФІКАЦІЯ ТА ФУНКЦІОНАЛІЗАЦІЯ ЗОНДІВ І СУБСТРАТІВ

ДЛЯ НАНОБІОТЕХНОЛОГІЇ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у лабораторії нових та маловивчених інфекційних захворювань Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (м. Харків).

Науковий доктор медичних наук, професор

консультант – Волянський Юрій Леонідович,

Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова

АМН України, м. Харків,

директор інституту.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, чл.-кор. НАН України

Малюта Станіслав Станіславович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу молекулярної генетики;

доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник;

доктор фізико-математичних наук, професор

Малюкін Юрій Вікторович,

Інститут сцинтиляційних матеріалів НТК "Інститут монокристалів" НАН України,

завідувач відділу нанокристалічних матеріалів.

Захист відбудеться “29” жовтня 2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Ле-онтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН Украї-ни (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 26 вересня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аналіз тенденцій розвитку суспільства засвідчує, що прогрес як люд-ства взагалі, так і окремих країн наразі та у найближчі часи в значній мірі визначатиметься нано-технологіями. Тому у провідних наукових країнах розроблено пріоритетні національні нанотехно-логічні проекти. При цьому вважають, що існують певні ризики вкладення коштів, але підкреслю-ють, що значно більші ризики виникають у разі невкладення останніх...

Здатність молекул ДНК до регульованого та високоорганізованого складання перетворює її на ідеальний матеріал для нанотехнології та нанобіотехнології (галузі біотехнології, яка направлена на вивчення та створення матеріалів з покращеними фізичними, хімічними та біологічними влас-тивостями на нанорівні, фундаментальні дослідження якої базуються на маніпулюванні біологіч-ними системами з використанням нанотехнологічного обладнання). Увага широкого кола дослід-ників прикута до ДНК навіть через п’ятдесят з лишком років після відкриття структури цієї моле-кули. Величезний інтерес вчених та актуальність таких досліджень обумовлені як роллю, що віді-грає ДНК у найважливіших клітинних процесах, так і можливістю одержати принципово нову ін-формацію через розробку новітніх технологій та методів дослідження.

Потужним імпульсом для розвитку нанобіотехнології, структурної нанобіології, нановірусоло-гії стала розробка численних варіантів скануючої зондової мікроскопії. Найпоширений з таких ме-тодів (атомно-силова мікроскопія, АСМ) відкрив безпрецедентні можливості для візуалізації, ма-ніпулювання та аналізу поодиноких молекул, у тому числі за фізіологічних умов. “Оком” атомно-силового мікроскопа, або своєрідним біосенсором, є зонд, який приєднано до кантилевера. Попе-редні дослідження (Gaub, 1994) показали, що сила розриву між взаємодіючими поверхнями на рів-ні поодиноких пар молекул надає нову та надзвичайно цінну інформацію щодо природи взаємодії: можливо відрізнити специфічну взаємодію від неспецифічної, та навіть енергетично рівновеликі взаємодії також можуть бути диференційовані. Ковалентне зв’язування біополімерів із зондом атомно-силового мікроскопа перетворює останній на мономолекулярний біосенсор. За його допо-могою можливо вивчати тонкі особливості взаємодії ліганда з рецептором, а також локалізувати специфічні рецептори на поверхні зразка.

Створення зондів для вивчення поверхневих властивостей клітин та локалізації білків на повер-хні і всередині клітинного ядра, дослідження структури молекул ДНК при іммобілізації на суб-стратах з різними поверхневими властивостями для фундаментальних і прикладних досліджень за допомогою скануючої зондової мікроскопії є актуальними задачами сучасної нанобіотехнології, яка виникла на стику нанотехнології, молекулярної біології, електроніки, фізики та хімії поверхні.

Визначальна роль в отриманні високоякісних зображень біополімерів за допомогою АСМ від-водиться процедурі модифікації субстрату для іммобілізації молекул. Раніше було розвинено де-кілька методів підготовки зразка ДНК, які нині використовують у багатьох лабораторіях через простоту процедури. Для попередньої обробки слюди, субстрату для АСМ, з метою підвищення її афінності до ДНК використовували ди- та тривалентні катіони (Hansma et al., 1994; Bustamante et al., 1997), природні та синтетичні поліаміни (Okada et al., 1998; Jovin et al., 2001; Langowski et al., 2003). Також для візуалізації ДНК були застосовані субстрати з напилюванням золота, на поверхні якого утворені самоасоційовані моношари тіогруп (Hegner, 1993). Поряд з зазначеними методами, через наявність у них ряду вузьких міст, було розроблено інші підходи до модифікації слюди – об-робкою похідними аміносиланів у розчині та у газовій фазі (Любченко, 1992). Проте залишилися невирішеними питання стосовно структури лінійних молекул ДНК, механізму компактизації су-перспіральних ДНК, іммобілізованих на поверхні слюди. Доцільність проведення таких дослід-жень обумовлена можливістю одержання додаткової фундаментальної інформації, яка може на-близити до розуміння особливостей компактизації ДНК в ядрах еукаріотів, нуклеоїдах бактерій та іммобілізації на субстраті.

Незважаючи на відомі методи модифікації зондів та іммобілізації ДНК на слюді, технологія

створення модифікованих зондів та субстратів із заданими властивостями (а саме регульованою поверхневою щільністю заряду та гідрофобністю) для фундаментальних та прикладних дослід-жень в галузі нанобіотехнології не була реалізована на момент початку досліджень.

Дисертація присвячена розв’язанню наукових проблем нанобіотехнології, що пов’язані з мані-пулюванням біополімерами, – створенню субстратів з регульованими поверхневими властивостя-ми, розробці модифікованих зондів (як універсальних компонентів біосенсорів) та зондів, функці-оналізованих біомакромолекулами, для силової мікроскопії впізнавання поодиноких молекул, мо-лекулярним механізмам компактизації та структурі лінійних і суперспіральних ДНК, іммобілізова-них на субстраті, візуалізації комплексів, що утворює РНК-полімераза (РНКП) бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею при елонгації транскрипції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота пов’я-зана з плановими темами лабораторії нових та маловивчених інфекційних захворювань Інституту мікробіології та імунології ім. Мечникова АМН України: АМН 40/2001 “Розробка молекулярно-генетичних тест-систем для раннього виявлення збудникiв туберкульозу і генотипування мікобак-терій”, № держреєстрації 0101U001328; АМН 47/2002 “Вивчення геномної організації Bacillus an-thracis та розробка молекулярно-генетичних тест-систем для детекції та типування збудника сибір-ської виразки”, № держреєстрації 0102U001570; АМН 59/2004 “Вивчення геномної організації та розробка молекулярно-генетичних тест-систем для детекції та типування коронавірусу людини, зчепленого з тяжким гострим респіраторним синдромом”, № держреєстрації 0104U002959, в рам-ках яких автор був відповідальним виконавцем.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження була розробка нанобіотехнологічних підходів до візуалізації і маніпулювання поодинокими молекулами і клітинами та визначення шля-хів і молекулярних механізмів компактизації молекул суперспіральної ДНК при іммобілізації на субстраті.

Об’єктом дослідження є модифіковані та функціоналізовані біополімерами зонди та суб-страти для атомно-силової мікроскопії, процеси іммобілізації ДНК і білків на їхніх поверхнях.

Предметом дослідження є процеси модифікації та функціоналізації біополімерами зондів та субстратів для атомно-силової мікроскопії, структура молекул ДНК, іммобілізованих на поверх-ні амінослюди. Для досягнення зазначеної мети, зважаючи на існуючий стан проблеми, у роботі були поставлені та вирішені наступні задачі:

1. Розробити технологію наноманіпулювання (витягнення, стиснення) лінійними та суперспіраль-ними молекулами ДНК при іммобілізації на амінослюді.

2. Вивчити зміни конформації лінійних та суперспіральних ДНК в залежності від поверхневих властивостей слюди, на якій іммобілізовані молекули ДНК.

3. Створити технологію аміномодифікації зондів для атомно-силової мікроскопії у газовій фазі з можливістю їх наступної функціоналізації біополімерами.

4. Розробити схеми функціоналізації АСМ-зондів біополімерами на основі амінозондів з приєдна-ними молекулами амінореакційних лінкерів, бичачого сироваткового альбуміну та ДНК.

5. Охарактеризувати поверхневі властивості аміномодифікованих та функціоналізованих біополі-мерами зондів за різних іонних умов за допомогою атомно-силової мікроскопії у режимі силових вимірювань.

6. Вивчити комплекси, що утворює РНК-полімераза бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею в процесі транскрипції.

7. Розробити методичні підходи для АСМ-візуалізації інтактних клітин безпосередньо у буферно-му розчині.

Методи дослідження. Для візуалізації біополімерів у повітрі та інтактних клітин безпосе-редньо у водному середовищі використовували атомно-силову мікроскопію. Вимірювання сили адгезії для різних пар поверхонь зонд-субстрат проводили за допомогою атомно-силової мікроско-пії в режимі силових вимірювань. Комп’ютерний аналіз застосовували для пошуку неканонічних структур у геномі мікроорганізмів, а стандартну полімеразну ланцюгову реакцію – для отримання ампліконів, які використовували як ДНК-матрицю при проведенні транскрипції.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що молекули ДНК, на відміну від відомої їхньої властивості – витягування під впливом прикладеної сили, – можуть бути також стиснуті. Такі стиснуті суперспіральні молекули ДНК, які характеризуються відстанню між нукле-отидами вздовж осі спіралі 1,94 Е Н 2,19 Е, були віднесені до нової форми – S-ДНК, модель якої побудовано.

Візуалізація стиснутих молекул суперспіральної ДНК стала можливою завдяки створенню ме-тодики отримання модифікованої амінослюди з підвищеною гідрофобністю та поверхневою щіль-ністю заряду на відміну від раніше застосованої стандартної амінослюди. Крім того, вперше пока-зано, що при іммобілізації на модифікованій амінослюді довжина осі суперспіралі молекул ДНК зменшується при підвищенні рівня суперспіралізації молекул на відміну від раніше встановленого факту незмінності довжини осі суперспіралі за зазначених умов. Вперше продемонстровано, що суперспіральні молекули ДНК компактизуються укладанням вдвічі та вчетверо з утворенням осей суперспіралі другого та третього порядку відповідно.

Вперше візуалізовано висококомпактизовані структури, утворені поодинокими суперспіральни-ми ДНК, – напівсфероїди, сфероїди та тороїди, на відміну від раніше досліджених мультимолеку-лярних агрегатів ДНК. На основі аналізу отриманих АСМ-зображень розроблено модель конфор-маційних переходів молекул суперспіральної ДНК при підвищенні щільності супервитків та рівня компактизації.

Вперше одержані та охарактеризовані аміномодифіковані зонди для атомно-силової мікроскопії за допомогою їхньої модифікації в парах похідного аміносилану. На відміну від відомих модифі-кованих зондів, що отримують модифікацією у розчині і які характеризуються наявністю на по-верхні самоасоційованих моношарів молекул, одержані в даній роботі амінозонди мають істотно меншу поверхневу щільність реакційних аміногруп завдяки розробленій технології модифікації зондів у газовій фазі. Це особливо важливе для наступної функціоналізації зондів біополімерами з метою зменшення їхньої кількості на поверхні зонда при вивченні взаємодії пар поодиноких моле-кул, іммобілізованих на поверхнях зонда та субстрату.

Вперше детально охарактеризовані термодинамічно стабільні інвертовані повтори для штамів патогенних мікобактерій туберкульозу H37Rv та CDC1551 з повністю секвенованим геномом, які характеризуються різною вірулентністю.

Вперше показано, що об’єм молекули ДНК, іммобілізованої на АСМ-субстраті, який визначено безпосередньо з АСМ-зображення та відповідного перерізу молекули, збігається з теоретичним об’ємом ДНК.

Принципову новизну несе пояснення ефекту розширення адсорбованої на слюді ДНК за раху-нок зміни висоти та ширини молекули (при збереженні об’єму молекули) на відміну від існуючого пояснення через недосконалості процедури підготовки зразка ДНК (висушування, рухливість на субстраті) та недостатню точність вимірювання атомно-силового мікроскопа.

Розроблено принципово новий метод витягування молекул суперспіральної та лінійної ДНК при іммобілізації на поверхню амінослюди із зменшеною поверхневою щільністю заряду.

Аміномодифіковані зонди охарактеризовані не тільки величиною сили адгезії, а й роботою сили адгезії. Тим самим показано можливість одержання нової інформації стосовно їхніх поверхневих властивостей з силових графіків.

Практичне значення одержаних результатів. Одним із важливих напрямків сучасної на-нобіології і нанобіотехнології є створення біосенсорів, які дозволяють локалізувати протеїни на поверхні та всередині клітинного ядра, на основі АСМ-зондів, функціоналізованих біополімерами, специфічними до зазначених протеїнів. Розроблені автором технології, схеми, методичні підходи та емпірично визначені протоколи направлені на вирішення даної проблеми.

Вперше розроблена автором технологія аміномодифікації зондів в парах похідного аміносилану може бути використана як для виробництва аміномодифікованих зондів для атомно-силової мікро-скопії, так і для їх наступної функціоналізації біомолекулами. Розроблена у роботі технологія от-римання амінослюди з заданими властивостями також може бути з успіхом використана при амі-номодифікації зондів. Зазначимо, що отримання аміноповерхні зонда із зменшеною гідрофобністю та поверхневою щільністю заряду (по аналогії з поверхнею амінослюди із зменшеною поверхне-вою щільністю заряду) дозволить зменшити щільність експонованих на поверхні зонда реакційних аміногруп, а отже, і щільність кон’югованих з ними біополімерів, що необхідно для одного з на-прямків нанобіології – силової мікроскопії впізнавання поодиноких молекул.

Запропонований підхід витягування молекул ДНК може бути застосований в експерименталь-них роботах з фундаментальних досліджень взаємодії ДНК з білками за наявності прикладеної до ДНК сили натягу. Структурні параметри S-ДНК можуть бути використані при моделюванні кон-формації молекул ДНК на поверхні з різними властивостями при взаємодії з білками, пептидно-нуклеїновими кислотами, природними поліамінами в умовах підвищеної щільності заряду.

Запропоновані методики обчислення об’єму молекул ДНК, іммобілізованих на амінослюді, без-посередньо з АСМ-зображень з застосуванням відповідних подовжніх перерізів, а також методика оцінки поверхневих властивостей амінослюди через візуалізацію адсорбованих суперспіральних молекул ДНК можуть знайти застосування у фундаментальних дослідженнях з нанобіології біопо-лімерів.

Отримані принципово нові результати з компактизації поодиноких суперспіральних молекул ДНК – візуалізації тороїдів, напівсфероїдів, сфероїдів, а також джгутоподібних молекул, які укла-даються вдвічі у декілька етапів, – можуть бути використані у вищих навчальних закладах у кур-сах біофізики, мікробіології, молекулярної біології та, можливо, з часом і нанобіології та нанобіо-технології.

Одержані дисертантом результати з компактизації ДНК використовують у Харківському націо-нальному університеті ім. Каразіна у курсах лекцій з фізики біополімерів, молекулярної біології та генетики.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає у формулюванні ідеї, обґрунтуванні мети та задач дисертаційної роботи, а також методів їх вирішення шляхом ініцію-вання серії досліджень структурних особливостей геномної ДНК мікроорганізмів та механізму компактизації ДНК з метою отримання як фундаментальної інформації щодо структури лінійних та суперспіральних молекул ДНК, так і створення технології модифікації та наступної функціона-лізації АСМ-зондів біополімерами та технології отримання амінослюди з заданими властивостями.

Наведені у дисертації теоретичні та експериментальні результати отримані автором самостійно [1-3, 6, 7, 9-22, 27-31] та під його науковим керівництвом [4, 8, 23-26, 32-39].

В роботах [1-4, 6-39] авторові належать ідея дослідження, вибір методів та розробка методич-них підходів; постановка задачі роботи [5] була здійснена разом з проф. Любченком Ю.Л.

Основні експериментальні результати у роботі [5], наведені у дисертації, отримані автором са-мостійно, у роботах [2, 4, 10, 12, 15, 23-25], опублікованих із співавторами, – разом із к.б.н., с.н.с. Лиманською О.Ю. Авторові належать ідеї отримання амінослюди з заданими властивостями, роз-робка технології та схеми модифікації та функціоналізації біополімерами АСМ-зондів, створення моделі компактизації суперспіральної ДНК при підвищенні рівня суперспіралізації. Відкриття та побудова моделі стиснутої форми ДНК (S-ДНК) було проведено разом із Лиманською О.Ю. та Ли-манською Л.О. В усіх роботах автор брав участь в обговоренні отриманих результатів, підготовці та написанні статей.

Планування дисертаційної роботи, коректування та обговорення методик дослідження, інтер-претація отриманих результатів з визначення термодинамічно стабільних інвертованих повторів у геномі мікобактерій проведені разом з науковим консультантом д.м.н., проф. Волянським Ю.Л.

Автор висловлює щиру подяку д.м.н., проф. Волянському Ю.Л. за постійну підтримку, числен-

ні плідні обговорення та корисні зауваження, д.ф.-м.н., с.н.с. Косевич М.В. за щиру допомогу та ретельне рецензування роботи, а також к.б.н., с.н.с. Лиманській О.Ю. за конструктивні коментарі та внесок в оформлення результатів роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації були представлені авто-ром у вигляді стендових доповідей та обговорені на нижченаведених конференціях: 2-ій конфе-ренції з оптичної спектроскопії біомолекулярної динаміки (м. Ейлат, Ізраїль, 2006); 5-ому Євро-пейському біофізичному конгресі 15th IUPAB & 5th EBSA (м. Монпель’є, Франція, 2005); Міжна-родній конференції “Microtechnologies for the New Millennium Symposium, Bioengineered and Bioin-spired Systems” (м. Маспаломас, Іспанія, 2003); 1-ому конгресі Європейського товариства мікробі-ологів (м. Любляна, Словенія, 2002); 8-ому Міжнародному симпозіумі “Molecular Aspects of Che-motherapy” (м. Гданськ, Польща, 2001); Міжнародному симпозіумі “Scanning Probe Microscopy, Sensors and Nanostructures” (м. Токіо, Японія, 2001); конференції для молодих науковців, аспіран-тів та студентів з молекулярної біології і генетики (м. Київ, 2001); 185-ому з’їзді Електрохімічного товариства (м. Сан-Франциско, США, 1994); 2-ій Міжнародній конференції “Nanometer Scale Sci-ence and Technology” (м. Москва, Росія, 1993); семінарах Інституту біохімії і біофізики Польської академії наук (м. Варшава, Польща, 2002), лабораторії клітинного ядра та сигнальних механізмів університету Кіото (м. Кіото, Японія, 2004), лабораторії молекулярної мікробіології університету Арізони (м. Темпі, США, 1998-1999), відділу нанокристалічних матеріалів Інституту сцинтиляцій-них матеріалів НТК "Інститут монокристалів" НАН України (м. Харків, 2006), Інституту молеку-лярної біології та генетики НАН України (м. Київ, 2006, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 39 наукових праць, у тому числi 22 статті у фахових наукових журналах, з яких 13 є одноосібними, включаючи 1 огляд, 14 тез допові-дей на наукових конференціях, отримано три патенти України.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, дев’яти розділів, висновків, списку використаних джерел, додатків. Її повний обсяг становить 351 сторінку машинописного тексту, з яких текст займає 309 сторiнок. Дисертацію проілюстровано 100 рисунками та 15 табли-цями. Перелік використаної літератури обсягом 33 сторінки охоплює 349 джерел. Загальний обсяг п’яти додатків становить 9 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень. В роботі використано лінійну ДНК фага довжиною 48502 пари нуклеотидів (п.н.) фірми Promega (США), суперспіральну ДНК pUC8 (довжина 2665 п.н.), лiнiйну та суперспіральну ДНК pGEMEX (довжина 3993 п.н.; Promega, США), бичачий сиро-ватковий альбумін (БСА, 5 фракція; Pierce, США).

Атомно-силова мікроскопія. Для візуалізації лінійних та суперспіральних молекул ДНК, білків у повітрі та клітин у буферному розчині використовували атомно-силовi мікроскопи Nano-scope III з D-сканером та Nanoscope IV MultiMode System (Veeco Instruments Inc., CШA) з E-скане-ром, який забезпечує максимальний дiапазон сканування до 12 мкм. Переважна більшість АСМ-зображень ДНК була записана за допомогою вібруючого варіанта АСМ у повітрі у режимі “висо-та” з використанням кантилеверів OMCL-AC160TS (Olympus Optical Co., Японія) з резонансною частотою 340-360 кГц та константою твердості 42 Н/м, а також стандартних незагострених зондів фірми KTEK International (Росiя) з резонансною частотою 300-360 кГц.

Силові вимірювання. Для характеристики аміномодифікованих субстратів, аміномодифіко-ваних та функціоналізованих біополімерами зондів (шляхом вимірювання сили адгезії) застосову-вали атомно-силову мікроскопію в режимі силових вимірювань. Вимірювання було проведено з V-подібними кантилеверами із нітриду кремнію з золотим напилюванням, використовуючи зонд Е (Microlevers, Park Sсientific Instruments, Inc., США), та OMCL-TR400PSA (Olympus Optical Co., Японія). Графіки відхилення зонда – Z позиція, тобто залежності відхилення зонда від відстані між поверхнями зонда та слюди (в подальшому силові графіки), записані за вертикальної частоти ска-нування 1 Гц та Z-амплітуди 50-200 нм. Графіки сила – відстань, з яких визначали силу адгезії та роботу сили адгезії, отримані перетворенням графіків відхилення зонда – Z позиція за допомогою програмного забезпечення Nanoscope III (версія 4.23b15) та Nanoscope IV (версія 5.12r3, Veeco In-struments Inc., США). Величину сили адгезії, що відповідає максимальному відхиленню зонда на кривій віддалення, визначали як силу розриву, тобто силу, яку необхідно прикласти для виведення із контакту поверхонь зонда і субстрату.

Константу твердості визначали індивідуально для кожного кантилевера за допомогою методу резонансної частоти Клевленда (Cleveland, 1993). Значення сили адгезії та її роботи усереднювали для 50-196 графіків віддалення для різних варіантів модифікації АСМ-зондів. Всього для характе-ризування АСМ-зондів і субстратів було записано та оброблено понад 4000 силових графіків. Ста-тистичну обробку проводили за допомогою програмних пакетів Kaleidagraph (версія 3.01, США) та Origin (версія 5, США).

Модифікація і функціоналізація АСМ-зондів та субстратів. Процедуру отримання стан-дартної амінослюди та амінозондів (модифікованих зондів, поверхня яких рівномірно покрита амі-ногрупами) здійснювали за допомогою модифікації свіжосколотої слюди аміногрупами у парах перегнаного 3-амінопропілтриетоксісилану (АПТЕС), який отримано від Aldrich (США), United Chemical Technologies, Inc. (США) та Wakenyaku (Японiя). В ході виконання дисертаційної роботи розроблено та створено дві установки для вакуумної перегонки АПТЕС. Перший варіант установ-ки було застосовано в університеті Арізони (США), а другий варіант, який дозволив отримати амі-нослюду з можливістю регулювання поверхневої щільності заряду та гідрофобності, – в універси-теті Кіото (Японія).

Для функціоналізації амінозондів використовували два гомобіфункціональних лінкерних аген-ти, що містять на обох кінцях амінореакційну ефірну групу (NHS-ефір): дисукцинімідил суберат (Pierce, США) (ДСС-лінкер) та етиленгліколь-біс (N-гідроксисукцинімідний ефір янтарної кисло-ти) (ЕГС-лінкер). Процедуру наступної функціоналізації АСМ-зондів, для якої використовували бичачий сироватковий альбумін (БСА), ДНК та глютаральдегід, проводили у комерційній рідинній чашечці АСМ.

Субстрати для АСМ, які використовували для іммобілізації біополімерів, можна розташувати у порядку зростання гідрофобності та поверхневої щільності позитивного заряду: свіжосколота слю-да < амінослюда зі зменшеною гідрофобністю < стандартна амінослюда < модифікована аміно-слюда.

Підготовка зразків ДНК для АСМ та ПЛР. На смугу амінослюди площею 1 см2 наносили краплю розчину ДНК у ТЕ буфері (10 мM трис-HCl рН 7,9, 1 мM ЕДТА) об’ємом 10 мкл, промива-ли після 2-хвилинної експозиції деіонізованою водою, обдували потоком аргону та витримували зразок під тиском 100 мм рт. ст. протягом 20 хвилин.

Лінійну ДНК pGEMEX отримували ферментативною обробкою суперспіральної ДНК pGEMEX (рис. 1) рестриктазою ScaI (New England Biolabs, Англія). Сконструйовані праймери обмежували фрагмент ДНК, що містить промотор та область термінації транскрипції Т7 РНК-полімерази. Для ампліфікації фрагмента лінійної ДНК використовували полімеразну ланцюгову реакцію.

Для очищення ампліфікованого фрагмента ДНК використовували наступну процедуру. Після проведення електрофорезу вирізали смугу гелю, що містить амплікон, при цьому опромінюючи гель довгохвильовим випромінюванням УФ-джерела низької інтенсивності (BioRad, США). Для подальшої очистки амплікона від нуклеотидів, праймерів, ДНК-полімерази та бромистого етидію використовували набір QIA-quick PCR purification kit (QIAgen, Японія) відповідно до рекоменда-

цій виробника, а також екстракцію фенол/хлороформом з наступним переосадженням етанолом (рис. 2).

Для проведення ПЛР, крім стандартної Taq ДНК-полімерази (Promega, США), використовували

термостабільнi ДНК-полімерази високої точності двох видів – Pyrobest ДНК-полімеразу (TaKaRa Co., Японія) та Invitrogen Platinum ДНК-полімеразу (Invitrogen, Японія). Для молекулярного моде-лювання структури ДНК використовували вільно поширюваний програмний пакет VMD (версія 1.8.3).

Візуалізація ціанобактерій. В роботі використано клітини ціанобактерій штаму Synechocys-tis PCC 6803. Вимірювання проводили у 50 мM TES буфері (N-трис [гідроксиметил]-метил-2-амі-ноетансірчана кислота) за кімнатної температури. Для отримання зображень ціанобактерій у бу-ферному розчині використовували стандартну скляну рідинну чашечку. АСМ-зображення у вод-ному розчині було записано у вібруючому варіанті АСМ, за частоти сканування 3-4 Гц та ампліту-ди 20-40 мВ за допомогою стандартних V-подібних кантилеверів з константою твердості K = 0,20-0,27 Н/м (Digital Instruments, США).

Проведення транскрипції. Як матрицю для транскрипції використовували амплікон довжи-ною 1414 п.н., що містив промотор та область термінації транскрипції РНК-полімерази бактеріо-

Рис. 2. Очищені амплікони після прове-

дення електрофорезу, вирізання смуги

Рис. 1. Аналіз суперспіральної ДНК pGEMEX1 з ПЛР-продуктом і обробки за допомо-

після проведення електрофорезу у 2 % агарозі гою набору для екстракції QIAquick

та наступного забарвлення бромистим етидієм. extraction kit. Ампліфікація з ДНК-по-

1 – суперспіральна ДНК pGEMEX1 (3993 п.н.); лімеразою: 1 – Pyrobest TaKaRa; 2 –

2 – неочищений амплікон довжиною 1414 п.н.; Invitrogen Platinum. М – 1000 п.н. мар-

3 – 1000 п.н. маркер молекулярної маси кер

фага Т7. Реакцію транскрипції проводили з використанням наборiв для транскрипції за допомогою Т7 РНК-полімерази (Promega, США), MegaScript T7 (Ambion, США) та набору від New England Biolabs (Англія) за різних температурних та часових параметрів. Для видалення матриці ДНК та деградації ДНК, що може контамінувати препарат РНК, після проведення транскрипції до реакцій-ної суміші додавали ДНКазу І (Ambion, США) та інкубували протягом 15 хв. за температури 37 оС. Для інактивації ДНКази реакційну суміш інкубували за температури 70 оС протягом 10 хв. Для контролю ефективності транскрипції після зупинки транскрипції проводили електрофорез у 1,2 % агарозному гелі, що містив 1,8 % формальдегіду.

Результати досліджень та обговорення.

Візуалізація тягнених молекул ДНК. Поверхня слюди, стандартного субстрату для іммобі-лізації біомолекул при АСМ-дослідженнях, негативно заряджена у буферних розчинах за ней-тральних значень рН та невисокої іонної сили (Butt, 1991). Тому для іммобілізації за даних умов на поверхні слюди негативно заряджених молекул ДНК використовують декілька підходів, що до-зволяють змінити сумарний поверхневий заряд слюди з негативного на позитивний. Методика приготування зразка ДНК на амінослюді забезпечує сильне зв’язування молекул ДНК з субстра-том за рахунок суперпозиції електростатичних і вандерваальсових сил. При цьому іммобілізацiя молекул ДНК на поверхнi амінослюди у водному розчині здійснюється переважно через електро-статичну взаємодію між негативно зарядженими фосфатними групами ДНК та позитивно зарядже-ними аміногрупами слюди (рис. 3).

Добре відомо, що ДНК є еластичною молекулою, яка може бути витягнутою, подібно до пру-жини. І такі тягнені молекули ДНК зі збільшеною відстанню між нуклеотидами уздовж осі дуплек-са були отримані та вивчені декiлькома групами дослiдникiв. За допомогою сучасних методів на-номаніпулювання поодинокими молекулами було встановлено, що молекулу ДНК можна розтяг-нути у 1,7 разу до міжнуклеотидної відстані Н = 5,8 Е на відміну від Н = 3,4 Е для В-ДНК (Cluzel et al., 1996; Bustamante et al., 1996).

Беручи до уваги вiдомі експериментальні дані про еластичність молекул ДНК (Leuba et al.,

2004) та важливість дослідження фундаментальних мікромеханічних властивостей молекули ДНК, нами розроблено новий метод отримання витягнутих молекул ДНК з їх наступною візуалізацією за допомогою АСМ. Розроблений метод є надзвичайно простим та ефективним: він дозволяє отри-мувати тягненi молекули ДНК (рис. 4) при експозиції краплі розчину ДНК на поверхні амінослю-ди зі зменшеною гідрофобністю та поверхневою щільністю заряду. Тягнені молекули ДНК форму-ються у процесі пiдготовки зразка для АСМ-візуалізації, а саме, при промиванні слюди ультрачис-тою водою після експозиції з розчином ДНК. Важливо, що точно таку ж процедуру підготовки зразка з інтенсивним промиванням направленим потоком води поверхні слюди ми використовува-ли і для стандартної, і для модифікованої амінослюди із збільшеною гідрофобністю та поверхне-вою щільністю заряду. Проте тягнені молекули ДНК формувалися тільки на поверхні амінослюди зі зниженою гідрофобністю. Аналіз сукупності даних з візуалізації лінійних та суперспіральних

Рис. 3. АСМ-зображення молекули ДНК фага , іммобілізованої на стандартній амінослюді. Розмір кадру 1,8 мкм Ч 1,8 мкм. Наведено шкалу градацій кольору, яка відповідає діапазону координати Z від 0 до 4,6 нм

ДНК на різних субстратах вказує, що формування витягнутих молекул ДНК обумовлено поверхне-вими властивостями субстрату, на якому вони іммобілізовані під впливом механічної енергії спря-мованого потоку води.

Через використання амінослюди зі зменшеною щільністю поверхневих аміногруп різко змен-шується число утворених зв’язків між електронегативними сайтами ДНК та позитивно заряджени-ми аміногрупами слюди. Тому під впливом струму води молекули ДНК витягуються паралельно напрямку, в якому проводиться промивання поверхні слюди. Вимірювання контурної довжини по-одинокої нативної молекули ДНК з субнанометровою роздільною здатністю, що є відмітною особ-ливістю АСМ, дозволяє визначити, знаючи кількість пар нуклеотидів в даній молекулі, відстань між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі ДНК. Відстанню між основами, або райзом (rise), називається відстань між площинами основ, а відстанню між нуклеотидами вздовж осі спіралі (Н) – проекція відстані між основами на вісь подвійної спіралі ДНК. Збільшення контурної довжини суперспіральних молекул ДНК (ссДНК) pGEMEX від 1243 нм (характерного значення для неви-тягнутої молекули) до 1943 нм (рис. 5а) та 2140 нм (рис. 5б) означає, що витягування ссДНК у 1,56 та у 1,72 разу призводить до зростання міжнуклеотидної відстані до H = 4,87 Е та H = 5,36 Е від-повідно. Отримані дані для тягнених молекул ДНК pGEMEX добре узгоджуються з раніше опублі-кованими результатами дослідження тягнених ДНК різними методами, в тому числі і за допомо-гою методу оптичного пінцета (Leuba et al., 2003). Дуже важливим є той факт, що тягнуті молеку-ли ДНК одержано на поверхні амінослюди із зменшеною поверхневою щільністю аміногруп. Від-

Рис. 4. АСМ-зображення витягнутих молекул ДНК фага , якi iммобiлiзованi на амінослюді зі зменшеною поверхневою щільністю аміногруп. Розмір кадру 7,5 мкм Ч 7,5 мкм

разу виникає низка питань. Чи можливо отримати амінослюду з заданими властивостями, а саме з підвищеною поверхневою щільністю аміногруп? Що буде відбуватися з молекулою ДНК при ім-мобілізації на поверхні амінослюди з підвищеною щільністю аміногруп? Якщо на амінослюді із зменшеною поверхневою щільністю аміногруп молекули ДНК витягуються, чи можуть вони бути стиснутими подібно до пружини при іммобілізації на поверхні слюди з підвищеною щільністю аміногруп? Пошуку відповідей на ці запитання були присвячені дослідження, результати яких на-ведено у наступних розділах роботи.

S-ДНК – суперспіральна ДНК з відстанню 1,94 – 2,19 Е між парами основ вздовж осі дуплекса. За допомогою АСМ-візуалізації молекул ДНК та вимірювання їхньої контурної довжи-ни була визначена відстань між нуклеотидами вздовж осі спіралі ДНК. Показано, що для лінійної

Рис. 5. АСМ-зображення витягнутих суперспіральних молекул ДНК pGEMEX, іммобілізова-них на амінослюді зі зменшеною щільністю аміногруп. (а) – контурна довжина ДНК L = 1943 нм, що відповідає відстані між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі Н = 4,87 Е. Розмір кадру 1,13 мкм Ч 1,13 мкм. (б) – контурна довжина ДНК L = 2140 нм, Н = 5,36 Е. Розмiр кадру 1,07 мкм Ч 1,07 мкм

ДНК (а саме для амплікона, отриманого після проведення ПЛР з використанням високоточних ви-дів термостабільної ДНК-полімерази), іммобілізованої на свіжосколотій слюді, контурна довжина зменшується у порівнянні із очікуваним теоретичним значенням, характерним для В-ДНК. На ос-нові визначеної відстані (Н = 3,07 Е) зроблено припущення, що лінійні молекули ДНК, адсорбова-ні на гідрофільній слюді, знаходяться у А-формі, перехід до якої індукують як висушування зразка, так і взаємодія з поверхнею слюди.

Для суперспіральної ДНК pGEMEX, іммобілізованої на свіжосколотій слюді (рис. 6а), були ві-зуалізовані плектонемічні суперспіральні молекули ДНК, що характеризуються невисоким значен-ням щільності супервитків (7 суперспіральних витків, або вузлів, у = - 0,024). Раніше аналогічні зображення були отримані для плазмідних ДНК, адсорбованих на субстратах, оброблених полiка-тiонами полілізином, сперміном (Jovin et al., 2003; Tanigawa et al., 1998). Суперспіральні молекули ДНК pGEMEX на стандартній амінослюді (рис. 6б) компактизованіші, однак їхня контурна довжи-на, обмірювана із АСМ-зображення, лише незначно менша (L = 1216 нм) у порівняннi з контур-ною довжиною плектонемічних молекул ДНК на слюді з катіонами Mg2+ (L = 1243 нм, рис. 6а). Для молекул ДНК, зображених на рис. 6а, довжина суперспіральної осі (осі подвійної спіралі су-перспіральної молекули ДНК, яка може бути закрученою у вигляді спіралі на відміну від осі ліній-ної молекули ДНК) становить l = 466 нм.

В той же час на модифікованій амінослюді (рис. 6в) з підвищеною гідрофобністю та поверхне-вою щільністю позитивного заряду порівняно із стандартною амінослюдою поряд з плектонеміч-ними суперспіральними молекулами ДНК були візуалізовані поодинокі молекули з надзвичайно високим рівнем компактизації, ступінь суперспіралізації яких значно вищий у порівнянні з раніше

досягнутим рівнем як експериментально, так і розглянутим теоретично.

Рис. 6. АСМ-зображення поодиноких суперспіральних молекул ДНК pGEMEX, іммобілізова-них на різних субстратах: свіжосколотій слюді (а), отримане після нанесення краплі розчину ДНК у 10 мM HEPES буфері, що містить 2,5 мM MgCl2, стандартній амінослюді (б) та моди-фікованій амінослюді (в). Контурна довжина ДНК pGEMEX становить: (а) – 1243 нм; (б) – 1216 нм; (в) – 873 нм. Довжина суперспіральної осі молекул ДНК: (а) – 466 нм; (в) – 382 нм. Розмір кадру: а – 583 нм Ч 583 нм; б – 500 нм Ч 500 нм; в – 500 нм Ч 500 нм

Молекула суперспіральної ДНК на рис. 6в, іммобілізована на модифікованій амінослюді, різко відрізняється за своїми параметрами від молекул ДНК на рис. 6а та рис. 6б: кількість вузлів зросла до 11, довжина суперспіральної осі зменшилася до 382 нм, а розрахована із АСМ-зображення кон-турна довжина склала 873 нм (!).

Оскiльки довжина секвенованої послiдовності ДНК pGEMEX становить 3993 п.н., була визна-чена відстань між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі ДНК. І якщо для ДНК pGEMEX, зо-браженої на рис. 6а, міжнуклеотидна відстань H = 3,11 Е, то для надсуперспіралізованої ДНК на рис. 6в розраховане значення склало Н = 2,19 Е (!). Значення Н = 3,11 Е узгоджується з раніше на-веденими фактами незначного зменшення контурної довжини ДНК, висушеної на слюді, у припу-щенні В-форми ДНК (Bustamante et al., 2003). Однак величина Н = 2,19 Е вказує на те, що супер-спіральні молекули ДНК, іммобілізовані на амінослюді з підвищеною щільністю заряду, зазнають значних внутрішньомолекулярних перетворень, якi ведуть не тільки до збільшення рівня суперспі-

ралізації, але і до значного зменшення міжнуклеотидної відстані. Відстань між нуклеотидами для

інших надсуперспіральних молекул ДНК варіювала від 1,94 Е до 2,19 Е (рис. 7 та рис. 8).

Як один із параметрів, який дозволяє відрізнити поодиноку молекулу від димера та інших висо-кокомпактизованих структур, утворених декількома молекулами, ми вибрали об’єм молекули ДНК, розрахований безпосередньо із АСМ-зображення відповідної молекули. Його значення не-значно відрізняється від теоретично розрахованого виключеного об’єму молекули ДНК pGEMEX (Vвикл. = 4010 нм3) та дозволяє надійно диференцiювати поодинокі молекули ДНК від агрегатів. Для точнішого обчислення об’єму ми використовували не обмірюване в одному місці значення ви-соти молекули (яке значно варіює для надсуперспіралізованих ДНК: за характерної висоти однієї нитки подвійної спіралі h = 0,3-0,4 нм висота у вузлах, утворених двома нитками ДНК, що перети-наються, може досягати hmax = 1,3-1,8 нм), а, як правило, подовжній переріз молекули січною пло-

Рис. 7. (а) АСМ-зображення поодинокої надсуперспіральної ДНК pGEMEX в S-формі, отри-мане після іммобілізації на поверхню модифікованої амінослюди. Розмір кадру 250 нм Ч 250 нм. Відстань між нуклеотидами вздовж осі дуплекса для даної молекули Н = 2,19 Е. Стрілка-ми показано дві нитки, кожна із яких утворена подвійною спіраллю ДНК, закручені в праву надсуперспіральну ДНК з чітко помітними 11 надвитками (вузлами). (б), (в) Подовжні пере-різи суперспіральної молекули ДНК pGEMEX. Січну площину проведено перпендикулярно площині рисунка через лінію, показану на вставках. Об’єм молекули розраховано як добуток ширини молекули на суму площ подовжніх перерізів. Шість (рис. 7б) та п’ять піків (рис. 7в) на профілях перерізів відповідають шести та п’яти вузлам. (г) Тривимірне зображення моле-кули. Стрілками вказано нитки дуплекса, що частково розійшлися та утворюють надсупер-спіральну молекулу. (д) Поперечний переріз, виконаний через нитки дуплекса, що розійшли-ся. На вставці показано лінію, через яку проведено січну площину. Два піки відповідають профілям перерізів двох ниток, із яких було визначено їхню висоту. Максимальна висота пі-ка відповідає висоті фрагмента молекули. Стрілками на перерізі та на вставці вказано пік та відповідна йому подвійна спіраль ДНК, висота якої становить h = 0,38 0,05 нм

щиною, перпендикулярною площині слюди. Із наведених в табл. 1 параметрів молекул суперспі-ральних ДНК можна бачити, що значення об’єму для надсуперспіральних молекул ДНК (поз. 3-5

в табл. 1, рис. 6в, рис. 7 та рис. 8) збігається зі значенням об’єму для поодинокої суперспіральної молекули (поз. 1 табл. 1, рис. 6а) в межах погрішності вимірювання (± 7,1 %).

Рис. 8. (а) АСМ-зображення поодинокої лівої надсуперспіральної ДНК pGEMEX в S-формі. Розмір кадру 250 нм Ч 250 нм. (б) Тривимірне зображення молекули. (в) Профіль поперечно-го перерізу, виконаного січною площиною вздовж лінії, яку показано на вставці. Стрілки вказують на пік та відповідний йому фрагмент нитки подвійної спіралі ДНК, висота якої становить h = 0,38 нм. (г) Профіль поперечного перерізу, виконаного вздовж лінії, показаної на вставці. Стрілка вказує на пік, із якого було визначено висоту відповідної частини подвій-ної спіралі ДНК h = 0,40 нм

Іншим важливим результатом, що свідчить про надсуперспіралізацію поодиноких молекул, а не джгутів, є висота закручених ниток, утворених дволанцюговою ДНК. На АСМ-зображенні (рис. 7а) та на тривимірному зображенні даної молекули (рис. 7г) стрілками вказано чітко помітні нитки даної молекули. Виміряна висота цих ниток, які частково розійшлися (рис. 7д), показує, що зазна-чені нитки утворено дволанцюговою ДНК, оскільки висота кожної нитки (h = 0,38 нм) дорівнює висоті нитки поодинокої іммобілізованої на немодифікованій слюді молекули ДНК (поз. 1, табл. 1), що, в свою чергу, збігається з літературними даними з АСМ-вимірювання висоти ДНК, адсорбова-ної на субстраті (Tanigawa et al., 1998). Аналогічні вимірювання були проведені і для іншої надсу-перспіральної молекули ДНК (рис. 8). Як значення об’єму (поз. 4, табл. 1), так і вимірювання висо-ти ниток даної молекули (h = 0,38-0,40 нм) підтверджує, що і дана надсуперспіральна структура утворена однією (!) молекулою ДНК. Значення об’ємів для інших візуалізованих висококомпакти-зованих структур (напівсфероїда, сфероїда, димерів, тримера) підтверджують надійність даного методу визначення об’єму конденсованих структур та ефективність їхньої диференціації.

Такі стиснуті, подібно до пружини, суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною відстанню між нуклеотидами вздовж осі дуплекса Н ~ 2