ДЕРЖАВНА УСТАНОВА “ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ”

ЛИПКО ПАВЛО МИХАЙЛОВИЧ

УДК 582.282.23:57.087.085:615.28

АНТИМІКРОБНІ, БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ПРЕПАРАТІВ, ЩО МІСТЯТЬ ЧОТИРЬОХВАЛЕНТНИЙ АЗОТ, ХІНОЛОНІЙ І МЕНТОЛ

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків– 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І.Пирогова МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Палій Гордій Кіндратович, Вінницький національний медичний університет
ім. М.І.Пирогова, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

доктор медичних наук, професор Климнюк Сергій Іванович, Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я.Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри медичної біології, мікробіології, вірусології та імунології.

Захист дисертації відбудеться “27” грудня 2007р. о 11.00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.618.01 при ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України” (61057 м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечнікова АМН України” (61057 м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

Автореферат розісланий “24” листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к.мед.н., ст.н.с. Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У структурі світового виробництва антимікробних препаратів у широкому асортименті представлені засоби різних груп. Безперервно розширюють наукові дослідження у галузі створення нових ефективних антимікробних препаратів, які переважають існуючі по таких показниках як спектр дії, фармакокінетична характеристика, токсичність, переносимість. Подальші дослідження в галузі антимікробних препаратів направлені на створення лікарських засобів для лікування захворювань, які викликають стійкі форми мікроорганізмів, анаеробних інфекцій.

Широке застосування антимікробних препаратів у медичній практиці призвело до подальших фундаментальних змін в екології мікроорганізмів. Формування антибіотикостійкості є вкрай несприятливим фактором для популяції людей, оскільки в результаті зниження ефективності етіотропного лікування інфекційних захворювань відбувається зсув рівноваги у взаємовідношеннях “людина-мікроорганізм” на користь мікроорганізмів.

У відповідності до об’єднаної думки експертів ВООЗ та Європейського Союзу такі заходи повинні включати впровадження розумного використання антимікробних засобів, розробку та реалізацію дослідницьких програм, спрямованих на боротьбу з резистентністю; пошук нових високоефективних лікувальних та профілактичних препаратів, що відрізняються здатністю впливу на мікроорганізми. (Палій Г.К, Волянський Ю.Л., Мороз В.М. 2000; Дикий I.Л. і співавт., 2006 Палій В.Г., 2006 Paterson D.L., 2000).

Арсенал протимікробних засобів, які використовують сьогодні в медицині перевищує 4 найменувань, але на жаль, вони далеко не повністю задовольняють вимоги медиків, ветеринарів, працівників харчової промисловості у ефективності та безпечності. Тому проблема пошуку та конструювання більш ефективних профілактичних і лікувальних препаратів, антисептиків та дезінфектантів на сьогодні вельми актуальна (Дикий І.Л. і співавт., 2004; 2006; Ковальчук В.П., 2004; Циганенко А.Я. і співавт.,2006).

Суттєві переваги перед антибіотиками мають антисептики за частотою, рівнем, спектрам та темпами надбання стійкості збудників. До більшості антисептиків, що застосовують в медичній практиці, стійкі варіанти мікроорганізмів формуються дуже повільно (Желіба М.Д. і співавт., 2003; Крижанівська А.В., Превар А.П., 2004).

На теренах України вчені – хіміки разом із фармацевтами та мікробіологами досліджують нові хімічні сполуки, які володіють протимікробною активністю. Так, було створено, досліджено і впроваджено у медичну практику антисептичний препарат широкого спектру дії – декаметоксин на основі четвертинного азоту. Увагу вчених привернули хімічні сполуки які містять хіноліній та ментол (Палий Г.К. і співавт., 2001,
Мороз В.М. і співавт., 2002).

Отже, зростання кількості антибіотикостійких штамів, зміна структури етіологічних чинників запальних процесів на користь умовно-патогенної флори та поширеність імунодефіцитних станів потребує постійного вдосконалення антимікробних засобів, у відповідності з існуючими критеріями, з метою попередження розповсюдження внутрішньо-лікарняних інфекцій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт МОЗ України та Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова. Результати досліджень увійшли до НДР: “Експериментальне, клінічне дослідження багатовекторності фармакодинамічних проявів, властивостей нових антисептичних препаратів (№ державної реєстрації 0104U006406).

Автор вивчив антимікробні, біологічні властивості восьми антисептичних препаратів, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол.

Тема дисертації затверджена республіканською проблемною комісією “Вірусологія, мікробіологія” МОЗ України (протокол № 29 від 16.03.05)

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є пошук та дослідження антимікробних препаратів, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол.

Задачі дослідження:

1. Вивчити протимікробну активність і спектр дії антисептичних препаратів, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол на музейних та свіжовиділених штамах мікроорганізмів;

2. Визначити вплив несприятливих факторів на протимікробну активність сполук, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол;

3. Дослідити особливості формування резистентності мікроорганізмів до препаратів що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол;

4. Визначити адґезивну здатність у мікроорганізмів у присутності досліджуваних антисептичних препаратів;

5. Дослідити фармакологічну, лікувальну характеристику антисептичних препаратів, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол на макроорганізм.

Об’єкт дослідження: інфекційні та гнійно-запальні захворювання.

Предмет дослідження: мікроорганізми, антисептики, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол.

Методи дослідження: мікробіологічні (визначення протимікробних властивостей антисептиків), біохімічні (ідентифікація мікроорганізмів, вивчення впливу протимікробних препаратів на адгезивні властивості стафілококів; формування стійких варіантів бактерій), фармакологічні, хіміотерапевтичні. Статистичні методи дослідження відповідно до наказів та вказівок МОЗ України.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на штамах мікроорганізмів з генетичною і набутою стійкістю до антимікробних препаратів визначено ступень впливу 5 препаратів, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол.

Вперше досліджено антимікробні властивості антисептичних препаратів, які містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол, в залежності від різних фізико – хімічних умов. У процесі дослідження антисептичних препаратів визначено їх залежність від вмісту білків, різного рН поживного середовища, мікробного навантаження.

Вперше у роботі наведено дані про вплив антисептичних засобів на адгезивну здатність стафілококів. У дослідах визначено особливості формування стійкості стафілококів при дії нових антисептиків.

Вперше встановлено фармакологічну дію, хіміотерапевтичну ефективність антисептиків при гнійно – запальних захворюваннях, обумовлених стафілококами.

Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних мікробіологічних досліджень являють етап визначення протимікробної активності 8 антисептичних препаратів. Результати експериментального та клінічного дослідження декаметоксину включено до Аналітичної нормативної документації на субстанцію вітчизняного антисептика декаметоксину (Decamethoxinum), яка затверджена наказом МОЗ України 09.10.2002р № 367 (реєстраційне посвідчення № П.10.02/05401).

Одержані результати мікробіологічних досліджень є науковим обґрунтуванням їх практичного застосування. На основі результатів дослідження запропоновані нові лікарські препарати декасан, горостен, які, відповідно до порядку державної реєстрації лікарського засобу, затвердженого Постановою Кабінету Міністрів України від 13.09.2000р,№ 1422, випускає вітчизняна медична промисловість, а саме:

· лікарський засіб декасан® зареєстровано у державному реєстрі лікарських засобів МОЗ України (реєстраційне посвідчення № Р.12.01/04161 від 22.12.2001р.), дозволено до медичного застосування і промислового виробництва в Україні:

· лікарський антисептичний засіб під назвою горостен® зареєстровано у державному реєстрі лікарських засобів МОЗ України (реєстраційне посвідчення №UA/2048/01/01 від 22.10.2004р.), дозволено до медичного застосування і промислового виробництва в Україні.

Перераховані вище реєстраційні посвідчення на нові лікарські засоби діють на всій території України. Дослідно – промисловий регламент на виробництво антисептичної мазі палісепт №02010669:13328191 затверджено технологічною комісією ДНЦЛЗ України 26.06.1996 (протокол № 32). Фармакологічний комітет МОЗ України затвердив інструкцію, дозволив медичне застосування та промислове виробництво мазі палісепт 29.06.1995р. (протокол №6).

Результати роботи впроваджено у навчальний процес у вищих медичних учбових закладах (Вінницький національний медичний університет імені М.І.Пирогова МОЗ України, Луганський державним медичний університет МОЗ України, Кримський державний медичний університетім. С.І. Георгіївського МОЗ України).

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів патентно-інформаційний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації, підбір методик дослідження, їх виконання та аналіз одержаних результатів. Дисертантом самостійно проведене порівняльне вивчення антимікробної активності 5 антисептичних препаратів в експерименті, клініці. Автор провів статистичну обробку одержаних результатів, їх аналіз, та сформулював висновки та практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації було обговорено й позитивно оцінено на V міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2001), Всеукраїнській конференції студентів та молодих вчених “Актуальні проблеми клінічної, експериментальної та профілактичної медицини” (Донецьк, 2002), наукових конференціях молодих вчених та фахівців ВНМУ ім. М.І. Пирогова (Вінниця, 2005, 2006, 2007), Другому конгресі європейських мікробіологів (Іспанія, Мадрид, 2006), міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні питання стратегії, тактики застосування та дослідження антисептиків, антибіотиків” (Вінниця, 2006), IV науковій дослідній конференції асоціації американських мікробіологів “Біологічна безпека та небезпечні інфекції” (США, Вашингтон, 2007), V міжнародній науково-практичній конференції студентів та молодих вчених (Ужгород, 2007), IV міжнародній науковій конференції студентів та молодих учених (Вінниця, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 статей у періодичних наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України, 11 робіт в інших виданнях.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 187 сторінках, ілюстрована 34 рисунками, 29 таблицями, складається зі вступу, огляду літератури, 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків та практичних рекомендацій, списку використаних джерел, що містить 273 найменувань, з них 82 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали і методи досліджень. У вступній частині висвітлено мету та завдання дослідження, що розв’язували при виконанні дисертаційної роботи. Обґрунтовано актуальність теми, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів дисертації. Викладено обсяг і структуру дисертації. В даній роботі наведені результати мікробіологічного, фізико-хімічного, фармакологічного дослідження синтетичних антимікробних препаратів чотирьохвалентного азоту, що містять ментол (5 сполук), хіноліній (3 сполуки). Визначення антимікробної активності цих сполук проводили на 234 музейних та свіжовиділених з організму хворих клінічних штамах мікроорганізмів, методом послідовних серійних розведень досліджувальних препаратів. Вивчення швидкості формування резистентності до досліджувальних сполук, проводили методом тривалого пасажування тест культур у присутності суббактеріостатичних концентрацій антимікробних препаратів (40 пасажів). Експериментальні дослідження були покликані встановити фізіологічні механізми і біологічну суть процесу формування лікарськостійких варіантів штамів стафілококу. Вивчення впливу різних умов, які здатні підвищувати або зменшувати протимікробні властивості антисептиків, дає змогу використовувати одержані відомості для наукових і практичних завдань.

Протимікробну дію антисептиків визначали при різній концентрації водневих іонів в поживних середовищах (рН 6,0; 7,2; 8,0), в присутності 5%, 10% білків сироватки крові, 103;106;109 КУО в мл. Проведено вивчення особливостей адгезивної здатності у мікроорганізмів під впливом антисептичних препаратів. В якості тест-мікроорганізмів використовували музейний штам S. aureus АТСС 25923 та виділені від хворих з гнійно-запальними процесами. В дослідженні використовували лікарські форми досліджувальних антисептичних препаратів (палісепт, декасан). Показник адгезії в контрольній системі (інтактні еритроцити) приймали за 100%. Підраховували ступінь зменшення адгезії в експериментах відносно контролю.

Згідно із вимогами Державного фармакологічного наукового центру МОЗ України лікарські антисептичні препарати проходять експериментальне доклінічне, клінічне дослідження. Тому було проведено фармакологічні і токсикологічні дослідження на тваринах. Досліди виконували на статеводозрілих безпородних білих мишах. Вивчали гостру токсичність, максимально переносиму дозу, смертельні дози препаратів (LD10, LD50, LD90) шляхом розрахунку параметрів токсичності за допомогою методики, розробленої Г.М. Першиним.

Усього для виконання роботи використано 120 білих мишей, 76 гвінейських свинок, 15 білих щурів. Досліди на тваринах виконували у відповідності з “Європейською конвенцією по захисту хребетних тварин, що використовують з експериментальною та іншою метою”.

Всі числові результати підлягали статистичній обробці за загальноприйнятими методами математичної варіаційної статистики STATISTICA V 5. 5A (C) STATSOFT.

Результати досліджень та їх обговорення. Результати отриманих власних досліджень викладено у третьому – шостому розділах. Встановлено, що антимікробна активність препарату з шифром № 1, який відноситься до солей четвертинного амонію і містить л-ментол, виявився високоактивним до S.aureus ATCC 25923 (7,8 мкг/мл), S. epidermidis 57 (7,8 мкг/мл), S. albus Wood 46 (31,2 мкг/мл), S. albus 138 (7,8 мкг/мл), ешеріхій (62,5 мкг/мл), S. faecalis ATCC 27853 (31,2 мкг/мл), B. subtilis (31,2 мкг/мл), B. cereus (31,2 мкг/мл), C.albicans (62,5 мкг/мл). Сполуки з шифром №1, № 2 є аналогами декаметоксину, що містять ментол. Як видно з наведених даних, досліджувана речовина № 2 проявляла протимікробні властивості на тест-штами мікроорганізми (табл.1).

Встановлено, що до препарату № 2 виявились, в порівнянні з речовиною № 1, більш чутливими S. aureus ATCC 25923 (7,8 мкг/мл), S. albus Wood 46 (15,6 мкг/мл), S. albus (7,8 мкг/мл), E. coli M-17 (31,2 мкг/мл), E. coli O-111 (31,2 мкг/мл), P. vulgaris (250,0 мкг/мл), B. subtilis ATCC 6633 (15,6 мкг/мл), B.cereus ATCC 669 (15,6 мкг/мл), B. megaterium ATCC 6542 (31,2 мкг/мл), B.anthracoides 1312 (62,5 мкг/мл), Y. enteritidis (31,2 мкг/мл), P. morgani 1707 (125,0 мкг/мл), C. albicans ATCC 10231 (15,6 мкг/мл), C. albicans 669/1080
(15,6 мкг/мл). Препарат декаметоксин, який використовували для порівняння з активністю сполук з шифрами № 1; № 2, переважав їх мікробоцидну активність по відношенню до стафілококів, кишкової палички, протею, синьогнійної палички.

Нові синтетичні речовин з шифром № 3; і №4, які містять в своєму складі хінолін, проявляли мікробоцидну дію на штами стафілокока (31,2–59,0±10,2 мкг/мл). Штами кишкової палички були чутливі до цих препаратів (120,2±8,2 мкг/мл). Всі інші представники сімейства ентеробактерій (протеї, палочки синьозеленого гною та ін.) виявились малочутливими до 1000 мкг/мл препаратів № 3; 4. Дріжджоподібні гриби роду Candida були стійкими до нових синтетичних речовин 3; 4 із вмістом хіноліну (>1000 мкг/мл).

Препарати порівняння декамін, нітазол проявляли мікробоцидну дію на грампозитивні, грамнегативні бактерії (стафілокок, ешерихії, фекальний стрептокок, сальмонели, єрсинії, антракоїд) та дріжджоподібні гриби роду Candida.

Встановлено, що МІК речовини № 1 для штамів стафілокока знаходилась в межах від 7,8 мкг/мл до 31,2 мкг/мл. Так, 78 штамів стафілокока з 85 були чутливі до МІК препарату № 1 в межах 7,8–15,6 мкг/мл; МБцК знаходилась в цих межах для 76 штамів стафілокока. Доведено, що препарат № 2 мав МІК та МБцК в аналогічному діапазоні, що виявили для сполуки з шифром № 1 (рис.1). Отже, досліджувані антибіотикорезистентні клінічні штами стафілококу мають високу чутливість до нових четвертинних амонієвих сполук (№ 1; № 2). тому заслуговують на подальше поглиблене вивчення.

Таблиця 1

Порівняльна протимікробна активність нових препаратів, що містять хінолінй, чотирьохвалентній азот, ментол з декаметоксином, декаміном, нітазолом і полідеканітом

Мікроорганізми | МБцК препаратів (мкг/мл) | № 1 | № 2 | ДКМ | № 3 | № 4 | декамін | нітазол | ПДК | S. aureus ATCC 259237,8 | 7,80,2462,531,215,67,831,2S. albus Wood 4631,215,60,4862,562,57,815,631,2S. albus 1387,8 | 7,80,9831,262,515,67,831,2S. epidermidis 577,87,80,4831,231,215,67,831,2E. coli M-1762,531,215,612512562,515,631,2E. coli O-11162,531,215,612525062,531,231,2E.coli ATCC 2592262,562,515,6250 | 250 | 62,5 | 15,6 | 31,2 | P. vulgaris 8950015062,5>1000 | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | K. pneumoniae NCTC 505562,562,531,225025012531,262,5P. aeruginosa ATCC 27853250250125>1000>1000>1000>1000>1000E. faecalis ATCC 678331,262,51,952502501257,815,6P. aeruginosa ATCC 9027500250125>1000>1000>1000>1000>1000B. subtilis ATCC 663331,215,60,4862,562,531,27,815,6S. enterіtidis Rostov 195712512562,525025012562,5 | 62,5B. cereus ATCC 66931,215,6 | 3,912512562,515,631,2B. megaterium ATCC 654262,531,231,262,512531,27,815,6B. anthracoides 131212562,531,262,512531,27,831,2Y. enterecolitica 1562,531,215,612512562,531,231,2P. morgani 170725012562,5>1000>1000>1000>1000>1000C. albicans ATCC 1023162,515,63,9>1000>100031,2 | >1000>1000 | C. albicans 669/108062,515,63,9>1000>100031,2 | >1000>1000

Одержані дані свідчать про те, що клінічні антибіотикорезистентні штами стафілококу зберігають високу чутливість до декаметоксину, препаратів № 1; № 2. Зазначимо, що досліджувані штами стафілококу на тлі антибіотикорезистентності залишаються високочутливими до препаратів четвертинного амонію, які містять молекулу рослинного л-ментолу.

Рис. 1. Кількісна характеристика антибіотикорезистентних стафілококів, які чутливі до діючих концентрацій ДКМ, препаратів № 1; № 2

Встановлено, що клінічні антибіотикорезистентні штами стафілококу не мають в клітинах маркерів стійкості до ДКМ, препаратів № 1; № 2. Відкритий новий важливий факт дає сприятливу перспективу для застосування нових вітчизняних антисептиків, в тому числі, в першу чергу ДКМ для профілактики, лікування гнійно-запальних захворювань, викликаних антибіотико-резистентними штамами стафілококу.

У присутності 5% сироватки крові в МПБ мало місце зниження протимікробної дії препаратів № 1; № 2 та декаметоксину по відношенню до клінічних штамів стафілококу. Так, МІК препарату № 1 зросла у середньому 2,7 рази в порівнянні з контролем (P<0,05). МБцК до препарату № 1 збільшилась у 2,9 разів. Для препарат № 2 МІК зросла в середньому у 2,4 рази, а МБцК у 2,6 разів у порівнянні з контролем (p<0,05). У декаметоксину в присутності 5% сироватки крові в поживному середовищі МІК зросла у 2,5 рази, МБцК зросла у 3,6 рази у порівнянні з контролем (p<0,05).

На МПБ з 10% сироватки МІК, МБцК препарату № 1 збільшилась у 2-16 разів в порівнянні з контролем (p<0,05). Доведено, що МІК препарату № 1 в цих експериментах з сироваткою дорівнювала 62,5 мкг/мл; МБцК – 125,0 мкг/мл; у препарату № 2 МІК 15,6-62,5 мкг/мл, МБцК – 31,2-125,0 мкг/мл.

У схожих дослідах зниження протимікробної дії декаметоксину було значно меншим на МПБ з 10% сироватки крові (МІК 0,24-7,8 мкг/мл, МБцК – 7,8-62,5 мкг/мл).

МІК препарату № 1 знизилась в слабокислому середовищі (рН 6,0) в двоє у 18 штамів стафілококу (p<0,05) і не змінилась у 3 штамів цих бактерій. В слабокислому середовищі МБцК препарату не змінилась в порівнянні з активністю антисептика в середовищі з рН 7,2.

Антисептичний препарат № 2 мав МІК в слабокислому середовищі аналогічну з рН 6,0 у 7 штамів стафілококу. У 14 штамів стафілококу МІК при цій реакції середовища знизилась у 2 рази. МБцК препарату № 2 залишилась аналогічною як з рН 7,2 у всіх штамів.

Встановлено, що МІК декаметоксину в слабокислому середовищі не змінилась у 6 штамів в порівнянні з поживним середовищем з рН 7,2. МБцК ДКМ знизилась у 2 рази у 19 штамів стафілококу і залишилась без змін в порівнянні з рН 7,2 у 2 штамів стафілококу. Отже, встановлено, що рН 6,0 поживного середовища зменшувала МІК препаратів № 1, № 2 та збільшувала МІК у декаметоксину 2 рази (р<0,05).

У науковій літературі не виявлено робіт по порівняльному вивченню впливу посівної дози музейних та клінічних полірезистентних штамів стафілокока на антибактеріальну активність антисептиків четвертинного амонію, які містять ментол, похідних хіноліну, нітазолу нами було проведено дослідження в умовах зміни посівної кількості КУО в 1000 разів в напрямі її зменшення або збільшення.

Як видно з даних рис.2, зменшення в 100 разів посівної дози (103 КУО) в порівнянні з стандартом (106 КУО) супроводжувалось підвищенням у 4 рази чутливості до мінімальної бактерицидної концентрації препаратів № 1, № 2, ДКМ, препаратів № 3, № 4, декаміну, нітазолу. В умовах дослідів з посівною дозою 109 КУО стафілококів встановлено, що мінімальна бактерицидна активність антисептичних препаратів (№№ 1; 2; 3; 4; ДКМ. декамін, нітазол) знизилась у 4 рази і знаходилась в межах 12,2-128,1 мкг/мл.

Таким чином, викладене вище дало підставу віднести антисептичні препарати №№ 1; 2; 3; 4, ДКМ, декамін, нітазол до антисептиків, які володіють вираженими протистафілококовими властивостями, що позитивно відрізняє їх від інших груп антисептиків.

Формування резистентності стафілококу до препарату №1 було повільним і після 40 пасажу дорівнювало 125 мкг/мл, це у 16 разів більше в порівнянні з вихідним рівнем чутливості (рис. 3). Формування резистентності стафілококу до ДКМ. Після 40 пасажу діюча доза дорівнювала 15,6 мкг/мл, що у 64 разів більше в порівнянні з вихідним рівнем чутливості. Формування резистентності стафілококу до препарату №3 було повільним і після 40 пасажу дорівнювало 125 мкг/мл, що у 8 разів більше в порівнянні з вихідним рівнем чутливості. Формування резистентності стафілококу до декаміну було повільним і після 40 пасажу дорівнювало 125 мкг/мл, що у 8 разів більше у порівнянні з вихідним рівнем чутливості. Формування резистентності стафілококу до нітазолу було повільним і після 40 пасажу дорівнювало 62,5 мкг/мл, це у 8 разів більше в порівнянні з вихідним рівнем чутливості.

Рис. 2. Антимікробна активність препаратів четвертинного амонію з вмістом ментолу в умовах різного мікробного навантаження (КУО - 103, 106, 109).

Потрібно відзначити, що повільне формування резистентності стафілококів до антисептичних синтетичних препаратів надає цим засобам позитивні переваги перед антибіотиками, які застосовують місцево.

Нами доведено, що у процесі формування резистентності до антисептиків стафілококи утворюють поліморфні клітини у порівнянні з контролем. Резистентні варіанти стафілококів втрачали здатність утворювати пігмент на спеціальному твердому поживному середовищі. Значно сповільнювалось утворення колоній на твердих поживних середовищах, розміри яких були менше в порівнянні з контролем. Стафілококи в процесі набуття резистентності до антисептиків втрачали здатність утворювати гемолізин, лецитовітелазу, плазмокоагулазу.

Діючі концентрації декаметоксину, декаміну, нітазолу, які застосовують для лікування захворювань, в у багато разів переважають ті дози цих лікарських засобів, до яких стафілококи набули резистентність після 40 пасажів в присутності ДКМ, декаміну, нітазолу. На нашу думку, пригнічення біологічної активності стафілококів в процесі формування резистентності обумовлено змінами, які виникають у функціональній активності ряду ферментів бактеріальної клітини (рис.3).

Рис. 3. Динаміка формування резистентності Staphylococcus aureus ATCC 25923 до антимікробних препаратів.

На рис.4, наведено дані про адгезію штамів стафілококу під дією антисептичних препаратів.

Аналіз наведених даних показав, що МБцК препаратів № 1, 3, декаметоксину, декаміну, нітазолу суттєво впливали у S. aureus ATCC 25923 на відсоток його адгезії на поверхні еритроцитів (35,5 – 60,2%) в порівнянні з контролем (100%) (p<0,05). Відповідно в цих дослідах ІА складав 1,72 – 3,10 в залежності від антисептичного препарату. Так, ІА в присутності декаметоксину був найнижчим (1,72), а в присутності препарату № 3 з вмістом хіноліну був найвищим (3,10). Встановлено, що МБцК препаратів проявляли більш виражену дію на адгезію S.aureus ATCC 25923.

Рис. 4. Показники адгезії у S. aureus ATCC 25923 під дією антисептичних препаратів.

Необхідно відмітити, що вітчизняний антисептик декаметоксин, препарат № 1 найкраще впливають на адгезивну здатність музейного та клінічних штамів стафілококів. Одержані дані по впливу на адгезію бактерій мають клінічне підтвердження. Сучасний антисептичний препарат декасан, що містить декаметоксин має високу лікувальну ефективність у хворих з гнійно-запальними захворюваннями різної локалізації.

Гостра токсичність препаратів декаметоксину, ДКМ - рц, і препаратів №1, 3 при підшкірному та внутрішньошлунковому введенні суттєво не відрізнялася у цих препаратів. На нашу думку, л-ментол, рц-ментол помітно не впливали на показники гострої токсичності декаметоксину.

Встановлено, що 0,02% розчини ДКМ, ДКМ - рц викликали нормалізуючий вплив на клітинну структуру епітелію трахеї. За рахунок протимікробної активності препаратів наступало зниження інтенсивності запальної реакції. Препарати ДКМ, ДКМ – рц не проявляли подразнюючої дії на слизову оболонку трахеї, яка цілком адаптувалася до їх впливу на сьомий день введення антисептика.

Мазь палісепт (декаметоксину 0,1%) володіла лікувальним ефектом в експериментальних тварин з гнійною стафілококовою інфекцією ран. У процесі лікування тварин першої групи спостерігали кращу ліквідацію перифокального запалення (38±4 год.), очищення поверхні ран від некротичних мас (52±3 год.). Грануляція ран починалася через 50±2 год. Рани виповнювалися грануляціями через п’ять діб. Крайова епітелізація з’являлася на шостий день. У другій групі експериментальних тварин із гнійними ранами, обумовленими золотистим стафілококом АТСС 25923, виявлено статистичну вірогідну (p<0,05) лікувальну дію 0,1% мазі ДКМ – рц, що дозволило зробити висновок, що наявність рацемату ментолу в складі молекули декаметоксину не впливало на антимікробну, лікувальну активність цього препарату (p=0,071.).

Декаметоксин із вмістом рацемату ментолу доцільно рекомендувати для проведення його клінічного дослідження в умовах клініки. Лікування тварин з гнійною раною 0,5% маззю декаміну (третя група) показало, що цей препарат має гарні лікувальні властивості по відношенню захворювань викликаних стафілококом. Проте, 0,5% мазь декаміну поступається своєю ефективністю мазі палісепт (декаметоксин 0,1%) та 0,1% мазі ДКМ – рц. Порівняння результатів дослідних груп з даними у тварин контрольної групи підтвердило їх вірогідність (р<0.05).

Хіміотерапевтичні властивості препаратів, що містять чотирьохвалентний азот і ментол досліджували при лікуванні хворих гострим гнійним маститом. Клінічне спостереження проводили на 18 хворих гострим гнійним маститом. Дослідження мазі палісепт та антисептичного препарату декасан (0,02% розчин декаметоксину) виконували згідно з інструкціями по клінічному вивченню препаратів, затверджених Фармакологічним комітетом МОЗ України.

Лікування хворих було комплексним. У залежності від фази ранового процесу у комплексі лікувальних заходів при гострих гнійних маститах місцево в рану застосовували декасан (0,02% розчин декаметоксину) та палісепт (0,1% мазь декаметоксину). Використання цих антисептиків місцево сприяло швидкому зникненню бактерій з гнійника (4-5 доба). У хворих із гострим гнійним маститом у яких як збудник виділяли стафілокок, рани заживали на 6-7 добу. Середня тривалість лікування хворих з гострим гнійним маститом, яких лікували загально вживаними лікувальними засобами складала 13,5 доби. Лікування таких хворих із застосування антисептичного розчину декасану, мазі палісепт (0,1%) тривало 10,2 доби (p<0,05).

Всебічне експериментальне доклінічне вивчення антимікробної активності, фізико-хімічних, лікувальних властивостей показало, що лікарські форми ДКМ, ДКМ – рц (мазі, розчини), нові хімічні сполуки, які містять чотирьохвалентний азот, хіноліній, ментол мають сприятливу перспективу для медичного застосування.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичні узагальнення і вирішення наукового завдання щодо дослідження антимікробних властивостей антисептичних препаратів із вмістом чотирьохвалентного азоту, хінолінію та ментолу. Досліджено особливості формування резистентності до препаратів, які містять чотирьохвалентний азот, хіноліній та ментол музейних та клінічних штамів стафілококу. Встановлено ефективність антиадгезивної дії антисептичних препаратів із вмістом чотирьохвалентного азоту, хінолінію, ментолу та нітазолу до стафілококів. Проведено розробку нових ефективних препаратів для лікування стафілококової гнійної інфекції, гострих гнійних маститів.

1 Лівообертовий ментол рослинного походження, синтетичний оптично неактивний рацемат ментолу проявляють мікробоцидну дію по відношенню до стафілококу. МБцК л-ментолу до S.aureus АТСС 25923 становить 15,6 мг/мл. МБцК рацемату дорівнює 31,2 мг/мл для цього мікроорганізму. МБцК л-ментолу для умовно - патогенних ентеробактерій знаходиться в межах 62,5 - 500 мг/мл. По відношенню до умовно – патогенних ентреобактерій МБцК рацемату ментолу становить 62,5 - 500 мг/мл. Рацемат ментолу доцільно використовувати на рівні з л-ментолом для створення нових антисептичних лікарських препаратів.

2. Нові похідні сполуки (№ 3; 4) із вмістом хіноліну, декамін, нітазол та полідеканіт володіють високою антимікробною активністю по відношенню до широкого спектру грампозитивних, грамнегативних мікроорганізмів. МБцК для клінічних штамів стафілококів проявляється у декаміну (28,4±4.4 мкг/мл), препарату №3 (58,8±0.6 мкг/мл), препарату №4 (59±10,2 мкг/мл), нітазолу (11,2±6,5 мкг/мл). МБцК для ешеріхії становить у декаміну (60,6 мкг/мл), препарату №3 (12,2±4,8 мкг/мл), препарату №4 (120±0,8 мкг/мл), нітазолу (36,6±4.5 мкг/мл).

3. Клінічні штами стафілококів проявляють високу чутливість до декаметоксину (МІК 0,24 – 7,8 мкг/мл), до препарату №1 (МІК 7,8 – 31,2 мкг/мл), до препарату №2 (МІК 7,8 – 15,6 мкг/мл). Кишкові палички мають високу чутливість до нових антисептичних препаратів. МБцК декаметоксину знаходиться в межах від 15,6 мкг/мл до 62,5 мкг/мл (ДКМ-рц 15.6 мкг/мл; препарату №1 62,5 мкг/мл; препарату №2 31,2 - 62,5 мкг/мл).

4. Антисептичні препарати четвертинного амонію з вмістом ментолу (препарат №1, №2, декаметоксин) у різних несприятливих умовах зберігають високу антимікробну активність:

- наявність 5%; 10% сироватки у поживному середовищі знижує бактерицидну концентрацію препаратів №1,2, ДКМ у 2 -16 разів (0,98 – 125 мкг/мл);

- препарат №1, №2, ДКМ проявляють високу протимікробну активність у кислому та лужному поживних середовищах;

- мікробне навантаження клінічних штамів стафілококу (103, 106,
109 КУО) не впливає на бактерицидну активність препаратів №№ 1; 2; 3; 4, ДКМ, декаміну та нітазолу.

5. У присутності антисептиків (препарату №1;№3, декамін, ДКМ, нітазол) повільно формується резистентність у музейного та клінічних штамів стафілококу до цих препаратів, яка не досягає високого рівня. Декаметоксинорезистентні, декамінорезистентні варіанти стафілококів зберігають вихідну чутливість до антибіотиків. У резистентних варіантів стафілококів до препаратів №№ 1; 3, декаміну, ДКМ, нітазолу спостерігають поліморфізм, уповільнення їх росту на поживних середовищах, зниження життєздатності цих мікроорганізмів.

6. Препарати №№ 1; 3, ДКМ, декамін, нітазол, проявляють антиадгезивну дію на музейний на клінічні штами стафілококів. Інгібуючий адгезію ефект мають препарат №1 (53,1 – 56,2%), ДКМ (33,2 - 35,5%), препарат №3 (58,6 - 64,6%), декамін (50 - 58,6%), нітазол (60,2 -64,6%).

7. Комплексне ефективне лікування антисептиками (палісепт, декасан) гнійних ран, гострих гнійних маститів, обумовлених стафілококом забезпечено мікробоцидною дією лікарських препаратів на збудників захворювання, спостерігалось швидке припинення виділення патогенних мікроорганізмів з гнійних ран на 4 – 5 добу лікування. Доведено, що у суббактеріостатичній, бактеріостатичній концентраціях декаметоксину, декаметоксину – рацемату підвищують у 95% випадків чутливість до антибіотиків антибіотико резистентних штамів стафілококів.

Практичні рекомендації

1. АНД. Decamethoxinum®. Декаметоксин. Наказ МОЗ України від 09.10.2002р. № 367. Реєстраційне посвідчення № П.10.02/05401.

2. АНД. Decasanum®. Декасан. Наказ МОЗ України від 27.12.2001р. № 523. Реєстраційне посвідчення № Р.12.01/04161.

3. Тимчасову фармакопейну статтю 42 У - 60 - 191 - 96 ”Мазь палісепт” (Unguentum Paliseptum) рекомендовано для використання у медичній промисловості в Україні. Інструкцію по медичному застосуванні препарату палісепт затверджено Фармакологічним Комітетом МОЗ України 29 червня 1995р. (протокол № 6).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Застосування антимікробних композицій на основі декаметоксину для лікування захворювань сечостатевої системи / Палій В.Г., Зарицький О.М., Цвігун В.Я., Кваснєвський Ю.А., Сьомко А.В., Липко П.М. // Biomedical and Biosocial anthropology. – 2005. – №5. – С.107-111. (Липко П.М. провів вивчення антимікробної активності декаметоксину до клінічних штамів).

2. Досвід антибактеріальної терапії нозокоміальних пневмоній в умовах відділення інтенсивної терапії / Дмитрієв Д.В., Откаленко Ю.К., Откаленко Н.Ю., Дмитрієва К.Ю., Липко П.М., Липко М.Р. // Biomedical and Biosocial anthropology. – 2006. – №6. – С.46-48. (Липко П.М. вивчив чутливість виділених штамів стафілокока до антибіотиків).

3. Вивчення віруліцидної активності деяких дезінфектантів у відношенні до збудників гепатитів В та С / Кузь Т.В., Литвиненко К.Л., Маційчук П.В., Липко П.М., Гречаний Л.А., Дубинська Г.М. //Вісник проблем біології і медицини. – 2006. - №2. – С.116-118. (Липко П.М. провів вивчення віруліцидної активності сучасних дезінфектантів до збудників гепатиту В та С).

4. Литвиненко К.Л., Липко П.М. Вивчення антимікробної активності деяких модифікованих протимікробних препаратів // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник медичної стоматологічної академії. – 2006. - Т.6, Вип. 4 (16). - С. 161-162. (Липко П.М провів мікробіологічне обстеження стоматологічних хворих і вивчив чутливість виділених штамів до антибіотиків).

5. Дослідження протимікробної активності нових протимікробних препаратів / Палій В.К., Мороз В.М., Бойко В.М., Липко П.М. //Biomedical and Biosocial anthropology. – 2006. – №6. – С.88 – 91. (Липко П.М. визначив чутливість 20 штамів до антисептиків).

6. Литвиненко К.Л., Липко П.М. Профілактика парентеральних вірусних інфекцій у стоматологічній практиці // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник медичної стоматологічної академії. – 2006. – Т.6, Вип. 4 (16). - С. 115-116. (Липко П.М. досліджував віруліцидну активність дезінфектантів, які застосовують для обробки стоматологічного інструментарію).

7. Синтез та прогнозування біологічної активності сульфопохідних 6 – фтор – хінолонів – 4 / Спиридонова Н.В., Сілін О.В., Коваленко С.М., Казмірчук В.В., Сорокоумова Л.К., Липко П.М. // Biomedical and Biosocial anthropology. – 2006. – № 6. - С. 248-249. (Липко П.М. дослідив 2 сполуки хінолінів на клінічних штамах стафілококу).

8. Липко П.М. Мікробіологічна характеристика чутливості клінічних штамів бактерій до антимікробних препаратів //Всеукраїнський студентський медичний журнал Хист. – 2000. - №2. – С. 94-105.

9. Липко П.М. Вивчення чутливості клінічних штамів бактерій до антимікробних препаратів //Актуальні проблеми клінічної, експериментальної та профілактичної медицини: Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (11-12 квітня 2002р.). – Донецьк, 2002. – С. 206-207.

10. Липко П.М. Мікробіологічна характеристика чутливості клінічних штамів до протимікробних препаратів. //V Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих учених (10-12 травня 2001р.). – Тернопіль, 2001. – С.243.

11. Бойко В.М., Липко П.М. Протимікробна дія антисептиків у профілактиці нозокоміальних інфекцій // Матеріали ХI університетської (ХХХХI вузівської) науково-практичної конференції молодих вчених та фахівців (18 травня 2005р.). – Вінниця, 2005.– С. 11-12. (Липко П.М. вивчив чутливість 15 штамів стафілококу до антисептиків).

12. Липко П.М. Чутливість збудників нозокоміальних інфекцій до протимікробних препаратів //Біопсихосоціальні аспекти здоров`я: Матеріали науково-практичної конференції (13-14 жовтня 2005р.). – Вінниця, 2005. – С.41-42.

13. Lypko P. Antibacterial activity of a modern antimicrobial drug //Integrating microbial knowledge into human life: 2nd FEMS congress of European microbiologists (July 4-8, 2006). – Spain, Madrid, 2006. – P. 106.

14. Липко П.М., Бойко В.М. Антимікробна активність нового протимікробного препарату // Матеріали ХII університетської (ХХХХII вузівської) науково-практичної конференції молодих вчених та фахівців (18 травня 2006 р.). – Вінниця, 2006.– С. 22. (Липко П.М. дослідив чутливість клінічних штамів стафілококу до нового антисептика)

15. Greechany L., Lypko P., Lypko K. Study of Efficacy Some Disinfectants to Liquidate Sequences of Bioterrorism //2007 ASM Biodefense & Emerging Diseases research meeting (February 27 - March 2, 2007). – Washington, DC, 2007. – P.42. (Липко П.М. вивчив чутливість бактерій до дезінфекційних препаратів).

16. Липко П.М. Вивчення протимікробної активності нових антимікробних препаратів //Молодь та перспективи сучасної науки: Матеріали IV-ї Міжнародної наукової конференції студентів та молодих вчених (4-6 квітня 2007 р.). – Вінниця, 2007. – С.43-44.

17. Липко П.М. Дослідження протимікробних властивостей антисептичних препаратів //Новітні підходи до лікування в сучасній медицині: Матеріали 5-тої Міжнародної науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (17-19 квітня, 2007) – Ужгород, 2007. – С.83-84.

18. Липко П.М. Вивчення ефективності деяких протимікробних препаратів //Матеріали ХIIІ університетської (ХХХХIII вузівської) науково-практичної конференції молодих вчених та фахівців (24 травня 2007 р.). – Вінниця, 2007.– С. 36.

АНОТАЦІЯ

Липко П.М. Антимікробні, біологічні властивості препаратів, що містять чотирьохвалентний азот, хіноліній і ментол. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07-мікробіологія. – ДУ “Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України”. – Харків, 2007

У дисертацій наведені дані мікробіологічного, фізико–хімічного фармакологічного дослідження синтетичних антимікробних препаратів чотирьохвалентного азоту, що містять ментол (5 сполук), хіноліній (3 сполуки). В дослідах використано 234 музейних і свіжевиділених клінічних штамів мікроорганізмів.

Визначено, чутливість антибіотикорезистентних штамів золотистого стафілококу до нових антисептичних препаратів. Досліджено вплив несприятливих факторів (вміст білка, різне рН середовища, мікробне навантаження) на антимікробні властивості нових лікарських антисептичних препаратів. Отримані результати впливу антимікробних препаратів на адгезивну здатність мікроорганізмів, як початкову (пускову) ланку розвитку інфекційного процесу. Одержані дані однакової ефективності природного л-ментолу та синтетичного рацемату ментолу, що здешевить собівартість виробництва синтетичних протимікробних препаратів з вмістом ментолу.

Вивченні фармакологічна дія, хіміотерапевтична ефективність антисептиків при гнійно-запальних захворюваннях, в експерименті на тваринах і лікуванні гострих гнійних маститів.

Ключові слова: адгезія, антисептика, декаметоксин, гнійні рани, ментол, чотирьохвалентний азот, хіноліній.

АННОТАЦИЯ

Липко П.М. Антимикробные, биологические свойства препаратов содержащих четырехвалентный азот, хинолиний и ментол.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07-микробиология. - ГУ “Институт микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова АМН Украины”. – Харьков, 2007

В диссертации представлены результаты микробиологического, физико-химического, фармакологического исследований синтетических препаратов четырехвалентного азота содержащих ментол (5 веществ), хинолиния (3 вещества). В исследованиях было использовано 234 музейных и свежевыделенных клинических штаммов микроорганизмов. Показана одинаковая противомикробная активность синтетического рацемату ментола в сравнении с природным л-ментолом. Полученные данные позволяют использовать синтетический рацемат ментола для синтеза противомикробных препаратов содержащих ментол. Изучена чувствительность антибиотико-резистентных штаммов золотистого стафилококка к препаратам, содержащим четырехвалентный азот, хинолиний и ментол. Установлено, высокий уровень антистафилококковой активности у исследуемых препаратов.

В диссертационной работе изучены физико-химические свойства новых синтетических соединений. Выполнены исследования по изучению влияния неблагоприятных факторов: изменение концентраций ионов водорода (рН 6.0; 7.2; 8.0), белковой (5%; 10%), микробной (103;106;109 КОЕ) нагрузки в питательной среде, на противомикробную активность препаратов, содержащих четырехвалентный азот, хинолиний и ментол. Изучены особенности формирования резистентности микроорганизмов к исследуемым антисептикам. Формирование устойчивости у микроорганизмов к антисептикам происходило медленно и не достигало клинически значимых уровней. Показано, влияние новых антисептических препаратов на адгезивные свойства стафилококков. Проведен сравнительный анализ влияния этих препаратов на адгезию микроорганизмов. Наибольшее влияние на адгезивные свойства у золотистого стафилококка оказывали препараты, содержащие четырехвалентный азот и ментол.

В работе представлены результаты исследования острой токсичности, максимально переносимой дозы, LD10,LD50,LD90, при введении в желудок и подкожном введении экспериментальным животным. Проведены исследования химиотерапевтической эффективности антисептических препаратов в лечение гнойных ран у экспериментальных животных. В клинических исследованиях доказано эффективность использования препаратов содержащих