МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Hетюхайло Лiлiя Гpигоpiвна
УДК 616.5-001.17-085.262
МЕХАНІЗМИ ОПІКОВОЇ ХВОРОБИ ТА ОБГРУНТУВАННЯ
ЗАСТОСУВАННЯ ПРЕПАРАТУ “КРІОХОР”
ДЛЯ ЇЇ ЛІКУВАННЯ
14.03.04 – патологічна фізіологія
Автореферат
дисертацiї на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
Харків – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України.
Наукові консультанти: доктор медичних наук, професор
Клименко Микола Олексійович,
Харківський державний медичний університет
МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології;
доктор біологічних наук, професор
Субота Ніна Павлівна,
Харківський національний педагогічний університет
ім. Г.С.Сковороди МОН України, завідувач кафедри валеології,
Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України,
професор кафедри клінічної лабораторної діагностики.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, старший науковий співробітник Коляда Тетяна Іванівна, Харківський міський імунологічний центр МОЗ України, завідувач міського імунологічного центру;
доктор медичних наук, професор Дегтяренко Тетяна Володимирівна, Південноукраїнський державний педагогічний університет ім. К.Д.Ушинського МОН України (м. Одеса), завідувач кафедри спеціальної педагогіки і психології; завідувач науково-дослідної лабораторії диференціальної психофізіології та адаптивної корекції;
доктор медичних наук, доцент Березнякова Марина Євгеніївна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України (м.Харків), професор кафедри клінічної лабораторної діагностики.
Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, (м. Київ) кафедра патологічної фізіології.
Захист відбудеться “26” квітня 2007 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64. 600. 03 при Харківському державному медичному університеті
(61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Харківського державного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).
Автореферат розісланий “ 15 ” березня 2007 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат медичних наук, професор Терещенко А.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальнiсть теми. Актуальною і недостатньо розробленою проблемою сучасної медицини є патогенез і лікування опіків. Вони виникають на виробництві, в побуті і досить часто мають летальні наслідки. Зростаюча енергоозброєність сучасного виробництва та побуту, широке використання хімічних речовин, які легко запалюються, вогненебезпечних газів, створення нових видів зброї значно збільшили частоту опіків у всьому світі.
Глибокі поширені опіки характеризуються не лише пошкодженням покривних тканин, а й викликають різноманітні, тривалі і своєрідні загальні морфологічні й функціональні зміни всіх органів і систем організму, які об’єднуються нозологічним поняттям “опікова хвороба” (Кочетыгов Н.И., 1973; Сивцова Н.Л., 1994; Волков К.С., 1995; Андріїшин О.П., 2001).
За даними ВООЗ, питома вага опіків серед травм мирного часу складає від 5,6 до 10%; вони займають третє місце в структурі загального травматизму (Сивцова Н.Л., 1994; Волков К.С., 1995; Легкий В.М., 1996).
Проте, актуальність цієї проблеми визначається не тільки частотою, але й важкістю ураження, складністю і довготривалістю лікування, частотою, різноманітністю і тяжкістю ускладнень та високою смертністю. Разом з тим, опікова хвороба – це не тільки важлива медична проблема, а й проблема великого державного значення, бо соціальні збитки, що супроводжують її, залишаються значними.
Зрозуміло, що опіки викликають значні зміни, насамперед, шкіри. Пошкодження шкірного покриву вважається головним патогенетичним механізмом, який зумовлює розвиток опікової хвороби (Сивцова Н.Л., 1994).
Припускається, що в складному і недостатньо вивченому патогенезі опікової хвороби одне з головних місць належить ендогенній інтоксикації, яка є результатом протеолізу пошкоджених поверхневих тканин і альтерації гістогематичних бар’єрів (Волков К.С., 1995; Пасечка Н.В., 1996; Петрюк Б.В., 2001; Андріїшин О.П., 2001).
Можна припустити, що в патогенезі опікової хвороби істотну роль відіграє вираженість опікового запалення як визначальної ланки патогенезу та результуючого показника цієї хвороби, у тому рахунку і ендогенної інтоксикації, а в патогенезі останньої – загальні розлади обміну речовин, особливо білкового і ліпідного, взаємопов'язані зі структурно-функціональними порушеннями різних органів і систем. Вони відбивають "ендогенізацію" процесу та утворення "вадних кіл" патогенезу опікової хвороби. Важливими інтегративними показниками зазначених явищ є стан таких систем, як прооксидантно-антиоксидантна, протеоліз-інгібітори протеолізу, сполучної тканини. Вказані механізми опікової хвороби вивчені недостатньо.
Оскільки опікова хвороба характеризується порушенням імунологічних механізмів внаслідок аутоінтоксикації та повільним темпом репаративної регенерації, то доцільно апробувати природні препарати фетальних тканин, які характеризуються підвищеною проліферативною та зниженою антигенною активністю, вмістом факторів росту, антибактеріальних та анальгезуючих факторів (Суббота Н.П., 1999, 2000, 2002; Грищенко В.И., 2004). В Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків) розроблено біотехнологічний процес отримання кріоконсервованих препаратів з хоріона людини (Суббота Н.П., 1999) і отримано препарат, який одержав назву “кріохор” (КХ) і вже використовується для лікування патологічних станів жіночої статевої сфери (Пітько В.А., 2001).
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Харківського державного медичного університету МОЗ України і є самостійним фрагментом у рамках наукового напрямку університету “ Вивчення загальних закономірностей патологічних процесів і розробка способів їх корекції” та кафедри патологічної фізіології. Комплексні теми кафедри “Міжклітинні взаємодії в патогенезі запалення та їхні механізми”, ”№ держреєстрації 0103U004546, 2003-2005рр., та “Гематологічні механізми хронізації запалення”, 2006-2008рр. Автор виконувала дослідження стосовно теми дисертації.
Мета і задачі дослідження – з’ясувати низку нових механізмів опікової хвороби та експериментально обгрунтувати застосування препарату “кріохор” для її лікування.
Завдання дослідження:
1. Докладно дослідити в динаміці при експериментальній опіковій хворобі (ЕОХ):
1.1. Морфологічні та гістохімічні зміни шкіри;
1.2. Клітинні реакції вогнища ураженої шкіри та периферичної крові;
1.3. Активність процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та антиоксидантного захисту;
1.4. Функціональний стан сполучної тканини;
1.5. Обмін білків;
1.6. Обмін ліпідів;
1.7. Обмін вуглеводів.
2. Вивчити вказані механізми опікової хвороби на тлі застосування препарату “кріохор”.
Об’єкт дослідження – опікова хвороба.
Предмет дослідження – механізми та патогенетична терапія опікової хвороби.
Методи дослідження: патофізіологічні, біохімічні, гематологічні, гістологічні, гістохімічні, фармакологічні, статистичні.
Наукова новизна отриманих результатів. На підставі широкого комплексного систематичного вивчення закономірностей опікової хвороби та їхнього взаємозв’язку в усі періоди хвороби вперше встановлена низка нових механізмів опікової хвороби; зокрема, особливості клітинних реакцій ділянки опікового запалення ушкодженої шкіри та периферичної крові порівняно з неопіковим запаленням. Методом кореляційного аналізу встановлений взаємозв’язок між клітинними реакціями ушкодженої шкіри та системними біохімічними змінами. Показані закономірності порушень прооксидантно-антиоксидантної системи упродовж опікової хвороби. Виявлено тісні кореляційні взаємовідношення кількості клітин ушкодженої шкіри та периферичної крові із показниками ПОЛ та АОС. Встановлено, що при опіковій хворобі порушується стан сполучної тканини в організмі, свідченням чого є збільшення рівня вільного оксипроліну, гексозаміну, гексуронових (ГК) та нейрамінових кислот (НК) в крові. Встановлений потужний зв’язок між показниками стану сполучної тканини та ПОЛ - АОС в крові. Показано значення загальних розладів білкового, вуглеводного та ліпідного обмінів у патогенезі опікової хвороби; зокрема, про порушення обміну білків та наявність синдрому “ендогенної метаболічної інтоксикації” свідчить підвищення у сироватці крові рівня “середніх молекул” (СМ), гаптоглобіну, церулоплазміну (ЦП), оксипроліну, загальної протеолітичної активності та зниження загальної антипротеолітичної активності. Суттєво порушується вуглеводний обмін, що проявляється збільшенням вмісту лактату, зниженням пірувату, підвищенням активності лактатдегідрогенази (ЛДГ) в крові; спостерігається порушення ліпідного обміну, а саме зниження рівня фосфоліпідів (ФЛ), тригліцеридів (ТГ) та підвищення вільних жирних кислот (ВЖК) в крові. Виявлений кореляційний зв’язок порушень сполучної тканини та обмінів речовин зі змінами клітинної динаміки вогнища опікового запалення та периферичної крові. На підставі вивчення механізмів опікової хвороби вперше експериментально обгрунтована можливість застосування препарату КХ для терапії опікової хвороби. Показано, що КХ володіє протизапальною дією, пригнічує процеси ПОЛ, активує АО систему, нормалізує стан сполучної тканини, корегує різні види обміну речовин.
Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати розширюють існуючі уявлення про патогенез опікової хвороби і можуть бути використані в подальшій науково-дослідній роботі і викладанні. Дані про нові механізми опікової хвороби будуть сприяти оптимізації її патогенетичної терапії. Крім того, експериментальне обгрунтування застосування препарату КХ для лікування опікової хвороби дозволяє рекомендувати його для подальшого дослідження та можливого впровадження з метою включення до комплексу протиопікової терапії і, таким чином, розширити арсенал засобів комплексної терапії опікової хвороби. Запропонований новий ефективний експериментальний метод лікування опікової хвороби, заснований на використанні КХ, патент 2002097487 UA, 56043 А, А 61 К 35/50 “Спосіб лікування опікової хвороби у експериментальних тварин”, який нагороджений дипломом та золотою медаллю Міжнародного салону винаходів та нових технологій “Новий час” (Севастополь, 2006) та дипломом і гран-прі “AGEPI” державного агентства з інтелектуальної власності (Молдова, 2006).
Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес кафедр патологічної фізіології Харківського державного медичного університету та Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава).
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведений патентно-інформаційний пошук, результати якого свідчать про відсутність аналогів наукових розробок, сформульовано мету та задачі дослідження, проаналізовано наукову літературу за темою дисертації. Самостійно вибрані методи дослідження та проведені експерименти, обробка і аналіз матеріалів досліджень. Теоретичні узагальнення, обгрунтування висновків, написання й оформлення всіх розділів дисертації автор зробив самостійно. Впроваджено результати досліджень в навчальний процес. Основною є участь автора в підготовці статей до друку та наукових розробок для оформлення патенту. У тій частині актів упровадження, що стосується наукової новизни, наводяться дані, що були отримані автором у процесі виконання роботи.
Апpобацiя результатів дослідження. Матеpiали дисеpтацiї були оприлюднені i обговоpювались на III Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003), I Міжнародній науково-практичній конференції “Науковий потенціал світу 2004” (Дніпропетровськ, 2004), III Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “ Актуальні питання невідкладної та відновлювальної медицини” (Ялта, 2004), на IV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної біохімії” (Тернопіль, 2004), 59-й Міжнародній науково-практичній конференції молодих учених “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2005), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005), Всеукраїнській науково-практичній та навчально-методичній конференції “II Скліфософські читання” (Полтава, 2006), засіданнях Харківського товариства патофізіологів (2002-2006), наукових сесіях ХДМУ (2002-2006), науковій конференції “Актуальні питання патофізіології” (Симферополь-Ялта, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 32 наукові праці, з них 28 статей (16 без співавторів) у фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України, 3 тез у матеріалах конгресів і конференцій, отримано 1 деклараційний патент України.
Структура та обсяг дисертації. Дисеpтацiя викладена на 294 стоpiнках друкованого тексту i складається iз наступних розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи дослідження, 2 pоздiли (15 підрозділів) власних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих результатів, висновки, перелік викоpистаних джерел, який містить 451 назву: 390 робіт вiтчизняних авторiв та 61 iноземних. Фактичнi данi наведенi у 30 таблицях i iлюстpованi 55 рисунками (загальний обсяг 17 сторінок).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал та методи дослідження. Експерименти виконанi на 286 статевозpiлих щуpах-самцях лiнiї Вiстаp масою 200-220 г. Дослідження здійснювали відповідно до національних “Загальних етичних принципів досліджень на тваринах” (Україна, 2001), які узгоджені з положеннями “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1986.). Всі болючі та стресові маніпуляції проводили на фоні анестезії ефіром. Умертвіння тварин здійснювали шляхом декапітації під ефірним наркозом.
Тваpин утpимували на звичайному pацiонi в стандаpтних умовах вiваpiю. З метою виключення впливу циpкадних pитмiв та клiматичних фактоpiв аналiз одноpiдних показникiв пpоводили по сеpiях. Кожнiй сеpiї експеpиментiв вiдповiдала гpупа контрольних тваpин, яких утримували в аналогічних умовах.
Опікову хворобу моделювали за методом А.П. Довганського (1971) шляхом занурення епільованої поверхні шкіри задньої кінцівки експериментальних тварин в гарячу воду (t 70-750С) під легким ефірним наркозом, протягом 7 сек. Розмір ділянки пошкодження визначали в залежності від площі шкіряного покриву, яка в середньому становила 12-15% поверхні тіла тварини. Площу ураження розраховували за допомогою спеціальної таблиці Н.И Кочетыгова (1973).
Гістологічне дослідження пошкодженої шкіри свідчило, що за вищезазначених умов утворювався опік IIIA-Б ступеня, що, згідно до сучасних уявлень, є стандартною моделлю розвитку опікової хвороби в експерименті (Пасечка Н.В., 1996). Щурів декапітували через 1,6,12 годин та 1,2,3,5,7,10,14,21,28 діб, що, за сучасними уявленнями (Пасечка Н.В., 1996), відповідає стадіям шоку, ранньої і пізньої токсемії і септикотоксемії. Одночасно забирали матеріал від інтактних щурів.
Для вивчення гістологічних змін шматочки шкіри з вогнища опікового запалення фіксували у 10% розчині формаліну, заливали в парафін, готували зрізи товщиною 5 мкм і забарвлювали гематоксилiном-еозином за загальноприйнятою методикою і за ван Гізоном, а також за Малорі. Вивчали гістологічні та гістохімічні зміни, визначали відносний вміст нейтрофілів (НФ), моноцитів-макрофагів (МФ), незрілих і зрілих фібробластів (ФБ), фіброцитів (Меркулов Г.А., 1961; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981). Пiсля пpотоколювання хаpактеpнi дiлянки пpепаpатiв фотогpафували за допомогою "Мiкpофото - Rathenow - 200".
Лейкоцитарну реакцію периферичної крові визначали шляхом підрахунку загальної кількості лейкоцитів (ЗКЛ) у крові та лейкоцитарної формули за стандартними методами (Меньшиков В.В., 1987).
Iнтенсивнiсть пpоцесiв ПОЛ оцiнювали на пiдставі вмісту в сироватці крові дієнових кон’югатів (ДК) та ТБК-pеактантiв (Камышников В.С., 2000), а стан АОС - на підставі показників її ферментативної ланки: активності супеpоксиддисмутази (СОД) (Mirsa H.P., Fredovich Y., 1972), каталази (Королюк М.А., 1988) та фероксидази (ЦП) (Камышников В.С., 2000), а також неферментативної ланки: концентрації аскоpбiнової кислоти (АК) (Roe I.H., Kuether С.А., 1943) та ?-токоферолу (Камышников В.С., 2000).
Стан сполучної тканини оцінювали на підставі вмісту оксипроліну (Тетянец С.С., 1985), НК (Камышников В.С., 2000), ГК (Dishe Z., 1947) та гексозаміну (Архипова О.Г., 1988) в сироватці крові.
Для оцінки стану обміну білків визначали вміст в сироватці крові гаптоглобіну (Камышников В.С., 2000), СМ (Архипова О.Г., 1988), загальної протеолітичної та антипротеолітичної активності (Веремеенко К.Н., 1988).
Стан ліпідного обміну вивчали на основі наступних показників в сироватці крові: загальних ФЛ за вмістом фосфору (Камышников В.С., 2000), ТГ (Архипова О.Г., 1988) та ВЖК (Меньшиков В.В., 1987).
Стан вуглеводного обміну оцінювали на підставі рівня молочної кислоти (МК) (Камышников В.С., 2000), піровиноградної кислоти (ПВК) (Камышников В.С., 2000) та активності ЛДГ (Меньшиков В.В., 1987) у сироватці крові.
Препарат КХ був отриманий з Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків). Для зберігання біоматеріалу використовували посудину Дюара. Контейнери з препаратом відігрівали на водяній бані при температурі +37?С і постійному обертанні.
КХ вводили внутрішньом’язово в дозі 1 мл, який містить 1,20 мг/моль білка. Введення препарату здійснювали відразу після моделювання опікової хвороби. На теперішній час проведено його широке доклінічне фармакологічне вивчення і отримано дозвіл МОЗ України на клінічну апробацію (дозвіл № 206/92-а, від 19.02.96 р.) та центру імунобіологічних препаратів МОЗ України (лист № 03.72-а, від 20.12.2000р.).
Математико-статистичний аналіз результатiв дослiдження пpоводили, використовуючи t - критерій Ст'юдента та кореляційний аналіз. Коефіціент кореляції (r) обраховували за допомогою програми “Статистика”. Враховували зміни кожного з досліджуваних показників протягом усього дослідження ( з 1-ї години до 28-ї доби), а також усіх досліджуваних показників в окремі терміни дослідження.
Результати дослідженя та їхній аналіз. Так як основним показником запалення та реактивності організму є інтенсивність та динаміка клітинних реакцій системи крові ( Клебанов Б.М., 1992; Клименко Н.А., Шевченко А.Н., 2003, 2004; Постернак Г.И., 2004), нами було проведене дослідження клітинних реакцій обпеченої шкіри та периферичної крові. В ділянці ушкодженої шкіри у стадію опікового шоку, на 6-у та 12-у години переважаючими клітинами були НФ, які очищали рану від продуктів розпаду тканин. Вони становили 30 % загальної кількості клітин. До кінця 1-ї доби їхня кількість різко зменшувалася за рахунок масової загибелі й розпаду, на 5-у добу їх було 3,72%, а на 10-ту добу 2 % від загальної кількості клітинних елементів. Кількість МФ зростала на 3-тю і особливо 5-у добу. В період з 1-ї до 5-ї доби МФ переважали у вогнищі запалення. Основна функція останніх на данному етапі процесу полягає в очищені рани від фібрину, деградованих НФ та утворенні фібробластичного фактора, який стимулює проліферацію. З дозріванням грануляційної тканини, появою колагенових структур кількість МФ зменшувалася, але дуже повільно - з 42,44% (5-та доба) до 37,9% (10-та доба). До кінця 3-ї доби ділянка запалення очищується від клітинного та тканинного детриту, запальні явища зменшуються, кількість ФБ збільшується, що свідчить про репарацію тканини.
При опіковому запаленні клітинні реакції характеризуються, порівняно з неопіковим, іншою вираженістю, більшою тривалістю, зсувом піків на пізніші терміни. Так, кількість НФ є меншою (30% замість більш 90% при інфекційному запаленні), МФ переважають вже на 1-у добу замість 2-ї - 3-ї, пік МФ зсувається з 3-ї на 5-у добу, незрілих ФБ з 7-ї на 10-у добу, водночас максимум зрілих ФБ при опіковому і неопіковому запаленні спостерігається на 7-у добу. Макрофагальна і фібробластична реакції подовжуються до 28-ї доби замість 10-ї (Клименко М.О., та співав. 2001, 2003, 2004).
ЗКЛ в крові при опіку досягає максимуму вже в першу добу після травми, що відповідає стадії опікового шоку. Надалі спостерігається спад цієї первинної хвилі до 3-ї доби. Вторина хвиля починається на 7-у добу після опіку і триває до 28-ї доби. Піки збільшення кількості сегментоядерних (СЯН) та паличкоядерних (ПЯН) НФ спостерігалися через 12 годин після опіку, еозинофіли з крові в початкові терміни ЕОХ зникали і знову з’являлися, починаючи з 3-ї доби. Кількість моноцитів досягала свого максимуму на 14-у добу, в стадію пізньої токсемії; вона була більшою за контроль в 36,5 рази. Число лімфоцитів має як пік збільшення - на 1-у добу показник був більшим в 1,8 рази проти контролю, так і пік зменшення - в 2,42 рази, що спостерігався на 3-ю добу.
Найбільший ступінь лейкоцитозу спостерігався в перші дні після опіку. Зміна кількості лейкоцитів в першу добу, певно, має перерозподільний характер - за рахунок швидкого виходу в кров зрілих (готових) лейкоцитів із резервного (постмітотичного) пулу кісткового мозку. Вона здійснюється досить швидко, в перші години запалення, так як її механізм – рефлекторний і гуморальний (за рахунок вазодилятаторних медіаторів запалення – простагландинів, оксиду азота, гістаміну та інших). Виникає прискорення кровотоку в кістковому мозку та посилене вимивання лейкоцитів до крові. Одночасно розвивається активація гемопоезу. Також, певно, причиною раннього лейкоцитозу є гіперадреналінемія. Рівень гормонів - адреналіну та норадреналіну, за даними Д.О. Попова (2003), при термічних ураженнях максимально підвищується в гіпоталамусі, нирках, наднирниках та плазмі крові, особливо в початковий період опікової травми. Адреналін викликає перерозподільний лейкоцитоз не стільки за рахунок надходження клітин із кісткового мозку, стільки за рахунок перерозподілу лейкоцитів в самій крові: зменшує кількість клітин в судинному пристінковому пулі (тих, що прилипли до стінки, тобто ендотелію) і, таким чином, збільшує їх кількість в циркулюючому (вісьовому) пулі. Дані літератури свідчать (Довганский А.П., 1971), що вже в перші дні, а особливо у другому періоді опікової хвороби лейкоцитоз пов’язаний з подразненням кісткового мозку, на що вказує збільшення вмісту промієло-, мієло- та метамієлоцитів, що відмічалось при підрахунку загальних мієлограм, в парціальних гранулоцитограмах були присутні переважно молоді форми нейтрофільних гранулоцитів. Вторинний лейкоцитоз при опіковій хворобі, можливо, пояснюється стійким підсиленням гемопоезу (розвитком гіперплазії кісткового мозку), це типова реакція кісткового мозку при запаленні і, мабуть, на будь-який інший гемопоезстимулюючий вплив (Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992).
При опіках із крові зникають еозинофіли. Певно, це пов’язане з тим, що підвищення вмісту кортикоїдів в крові призводить до зниження кількості еозинофілів (Шмидт Р., Тевса Г., 1986), а відомо (Сааков Б.А., Бардахчьян Э.А., 1979; Сиворіг Л.О., 1999; Kao C.C., Garner W.L., 2000; Anchez R., 2002; Canalis E., Delany A.M., 2002; Попов Д.О., 2003), що при опіках рівень цих гормонів підвищується максимально, особливо в початковий період опікової травми. Відновлення кількості еозинофілів на 10-у добу, певно, відображає інтенсивність гранулоцитопоезу взагалі, тобто, як і лімфоцитоз, мабуть, пов’язане з гіперплазією кісткового мозку.
Закономірності вказаних реакцій є типовими для запалення взагалі, однак при опіковому запаленні спостерігаються сильна перша фаза (яка відповідає перерозподілу лейкоцитів та активації гемопоезу) і, мабуть, відповідно, виразна та тривала гіперплазія кісткового мозку, так як вона має неспецифічний стресорний характер. Це, у свою чергу, певно, пов’язане зі значною інтенсивністю і розповсюдженістю опікового ураження і запалення, тривалістю процесу, сильним стресом. При опіковому запаленні зміни в крові набагато триваліші, спостерігаються до 28-ї доби, в той час як при неопіковому запаленні закінчуються, головним чином, протягом 10 діб, це доводиться в роботах Н.А. Клименко, А. Н. Шевченко (2003, 2004), присвячених інфекційному та асептичному карагіненовому запаленню. Зазвичай при запаленні нейтрофільоз спостерігається в перші 1-2 доби, пік моноцитів – на 3-ю добу, гіперпластичний пік – на 7-у добу (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Маянский Д.Н., 1991; Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Лещенко В.А., 1995 ).
Методом кореляційного аналізу встановлені функціонально повноцінні зв’язки між клітинами периферичної крові та ушкодженої шкіри, а також між вказаними клітинами та системними біохімічними змінами. Лейкоцитарна інфільтрація залежить від кількості лейкоцитів в периферичній крові, і, в свою чергу, надходження лейкоцитів з кісткового мозку до крові, інтенсивність гемопоезу та інші системні реакції при запаленні перш за все визначаються активацією лейкоцитів крові та вогнища. Разом з тим, при опіковому запаленні мають місце вищенаведені особливості клітинних реакцій ушкодженої шкіри і периферичної крові, порівняно з неопіковим запаленням. Це дозволяє стверджувати, що патогенез опікової хвороби багато в чому визначається особливостями опікового запалення.
Виявлено наявність взаємозв’язку клітин ушкодженої шкіри між собою. Отримані дані відбивають вірогідні клітинні залежності та міжклітинні взаємодії при запаленні. Так, наприклад, переважна більшість МФ вогнища запалення є результатом перетворення на них моноцитів, що емігрували; гранулоцити, моноцити-макрофаги, лімфоцити та ФБ взаємно регулюють (стимулюють або пригнічують в залежності від етапу запалення) одне одне. Разом з тим, отримані дані конкретизують ці зв’язки (їхню вираженість та переважність), показують їх у всій динаміці запалення, в даному випадку при ЕОХ. Наприклад, у динаміці опікового запалення особливо прямо пов’язані між собою МФ та ФБ, лімфоцити та ФБ, що вказує на виражену і тривалу репарацію. Як відомо, МФ та лімфоцити активують проліферацію, міграцію, зізрівання та секрецію ФБ, а ФБ у свою чергу регулюють активність МФ та лімфоцитів.
Проведені морфологічні та гістохімічні дослідження виявили також, що характерними для різних стадій ЕОХ є наступні зміни: в стадію опікового шоку спостерігаються гіперемія, набряк, тромби, фібриноїдний некроз дерми та деяких м’язових волокон, їхня лейкоцитарна інфільтрація. В стадію ранньої токсемії - розростання грануляційної тканини, лейкоцитарна інфільтрація навколо некротизованих м’язів. В стадію пізньої токсемії відбувається формування молодої сполучної тканини. В стадію септикотоксемії характерним є дозрівання молодої сполучної тканини, з’являються волокнисті структури, навколо некротизованих м’язів наявна незначна лейкоцитарна інфільтрація.
Значна роль процесів ПОЛ у розвитку багатьох патологічних станів організму не підлягає сумніву і беззаперечно доведена цілим рядом досліджень (Бобирєва Л.Є., 1997; Барабой В.А., Олійник С.А., Туманов В.А., Горчакова Н.О., 2000; Галкина О.В., Путилина Ф.Е., Ещенко Н.Д., 2003; Григорова И.А., Дубовская С.С., Наврузов М.Б., 2004; Григорова И.А., Некрасова Н.А., 2004).
Активація процесів ПОЛ у обпечених є експериментально і клінічно доведеним фактом численних досліджень ( Бабская Ю.Е., Лавров В.А., Омонина Н.А, 1985; Вальдман Б.М., Волчегорский В.А., Пужевский А.С., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И., 1991). Проте в проведених раніше дослідженнях це питання вивчене недостатньо докладно.
Нами встановлено, що при опіковій хворобі показники ПОЛ в крові щурів значно підвищувалися і досягали свого максимуму через добу: концентрація ДК зростала в 1,66 рази порівняно з вихідною, а ТБК-реактантів – в 2,75 рази. Через 3 доби показники вмісту ДК і ТБК-реактантів знижувались, проте були більшими за вихідні. На 7-у добу спостерігався другий пік підвищення показників ПОЛ: вміст ДК був збільшений у 1,57 рази, ТБК-реактантів – у 2,61 рази. З 10-ї доби відзначалась поступова нормалізація показників, але вміст ТБК-реактантів все ж таки залишався вищим у 2 рази до кінця дослідження.
Таким чином, при опіковій хворобі ПОЛ значно зростало, зміни його були тривалими (аж до 28-ї доби), двофазними, піки досліджуваних показників приходилися на 1-у та 7-у добу.
З отриманих даних видно, що фазність в певній мірі корелює зі стадійністю опікового процесу і яскраво відбиває сутність біохімічних змін в організмі, що відбуваються на різних стадіях опікового процесу.
Далі досліджували активність АОС. Перш за все був досліджений стан ферментативної ланки АОС – активність СОД, каталази та ЦП. Встановлено, що активність СОД зменшувалась через 12 годин після опіку - в 2 рази порівняно з контролем. Далі показник зменшувався до 14-ї доби включно, а на 21-у і 28-у добу дещо відновлювався, проте контрольних значень не досягав. Спостерігалось також зниження активності каталази через 6 год після опіку, вона залишалась такою до 2-ї доби, на 3-ю добу спостерігався другий пік спаду активності каталази, після чого вона підвищувалась, але не досягала рівня контролю до 28-ї доби.
Основним антиоксидантом плазми крові є ЦП. Аналізуючи показники вмісту ЦП в крові щурів з ЕОХ, відзначено збільшення активності цього ферменту, проте, слід зазначити, що підвищення цього показника тривало лише до 14-ї доби, після чого він почав знижуватися, навіть нижче контрольних значень, що свідчить про виснаження АОС. Зменшення вмісту ЦП в ці терміни також, певно, вказує на зменшення запальної реакції, тобто відповіді печінки на вплив інтерлейкіну-6 із вогнища запалення.
Каталаза – геммісткий фермент, який здійснює розщеплення перекису водню до кисню і води (Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е., 1988; Li P.F., Fang Y.Z., Lu X., 1993; Ray G., Batra S., Shukla N.K., 2000; Лифшиц В.М., 2002; Шумко Г.І., Тодоріко Л.Д., 2005; Сухаель С. М., 2005). Зниження активності каталази може свідчити про те, що опікова хвороба викликає значні зрушення в оксидантно-антиоксидантному стані організму. Воно призводить до нагромадження в тканинах пероксиду водню. Останній при одноелектронному відновленні генерує гідроксильний радикал, який викликає активацію ПОЛ клітинних мембран і окиснювальну модифікацію білків, що в кінцевому рахунку призводить до загибелі клітин.
На той час як СОД, каталаза та ЦП забезпечують ферментативний шлях зв’язування радикалів і розщеплення проміжних продуктів пероксидації, ?-токоферол та АК – неферментативний шлях (Лизин М.А., Клименко А.О., Гудивок І.І. та ін., 2000; Кучма І.Л., 2004; Кравчук Е.А., 2004). АК є водорозчинною, а ? -токоферол гідрофобною сполуками, дія яких призводить до зниження швидкості утворення вільних радикалів і зменшення концентрації продуктів реакцій, що протікають з участю радикалів (Roe I.H., Kueter C.A., 1943; Кучма І.Л., 2004; Савинова Н.В., Бутолин Е.Г., 2004). Вміст АК суттєво зменшувався лише на 2-у та 5-у добу після опіку (стадія опікового шоку). Вміст ?-токоферолу зазнавав більш суттєвих змін, він знижувався протягом довшого періоду, а саме із 6-ї години після відтвореня опіку (стадії опікового шоку) і залишався на тому ж рівні до 14-ї доби включно (стадії токсемії та септикотоксемії), при цьому слід відмітити 2 піки зниження – на 5-у та 14-у добу досліджень.
Отже, має місце зниження активності неферментативної ланки антиоксидантної системи крові, особливо вмісту ? -токоферолу.
Отримані результати свідчать, що розвиток опікової хвороби зумовлює одночасне підвищення активності одних факторів антиоксидантного захисту, а саме ЦП, та зниження інших - СОД, каталази, що вказує на напруженність та розбалансованність в АОС захисту і є показником дезадаптації компенсаторних механізмів.
Показники ПОЛ мають кореляції із кількістю клітин вогнища запалення ушкодженої шкіри та периферичної крові. Зокрема, виявлений кореляційний зв’язок між кількістю НФ вогнища опікового запалення шкіри та вмістом ДК і ТБК-реактантів, очевидно, оскільки ці клітини є джерелом активних форм кисню. Цілком можливо, що частина циркулюючих в крові продуктів ПОЛ утворюється в тканинах, як побічні інтермедіати мітохондріального окислення, і робить внесок в ліпопероксидзалежну регуляцію НФ.
Методом кореляційного аналізу встановлено, що між показниками ПОЛ-АОС найбільш суттєвими є наступні зв’язки: між активністю СОД і каталази, рівнями АК та ?-токоферолу, вмістом ДК і активністю СОД, активністю СОД та рівнем ? -токоферолу.
Звертає на себе увагу те, що мається багато потужних зв’язків показників ПОЛ-АОС з кількістю фіброцитів і МФ у вогнищі запалення, які свідчать про те, що продукти ПОЛ можуть не тільки руйнувати клітини, а й стимулювати репарацію при ЕОХ.
Наступним завданням дослідження було вивчення стану сполучної тканини при опіковій хворобі. Встановлено, що рівень ГК в крові збільшувався на 1-у - 3-ю добу з максимумом на 3-ю, що відповідає стадії шоку. Слід відзначити два піки збільшення вмісту гексозаміну - на 1-у - 3-ю (в стадію опікового шоку) та 7-у добу, яка відповідає стадії раньої токсемії. Відмічалось підвищення рівня вільного оксипроліну, насамперед в стадію опікового шоку, збільшувався вміст НК з максимумом на 5-у добу, коли показник зростав в 8 разів.
На основі кореляційного аналізу були встановлені наступні суттєві кореляційні взаємовідносини: між вмістом гексозаміну в крові і кількістю МФ ушкодженої шкіри; між рівнем оксипроліну і кількістю ПЯН в крові; рівнем ГК і активністю ЦП; між рівнем НК та ? -токоферолу; рівнем ДК та активністю СОД. Отримані дані свідчать, що руйнування сполучної тканини якраз і може відбуватися продуктами ПОЛ або безпосередньо активними формами кисню, які утворюються при активації лейкоцитів, а АО попереджають руйнування сполучної тканини.
Як вказувалося, при опіках активуються симпато-адреналова та гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникова системи (Вихриев Б.С., Бурмистров В.М., 1986; Попов Д.О., 2002). В свою чергу, різке підвищення рівня кортикостероїдних гормонів пригнічує процеси проліферації клітин та біосинтезу біополімерів сполучної тканини (Слуцкий Л.И., 1969), фізіологічні функції якої забезпечують її залучення до комплексу неспецифічних захисно-пристосувальних реакцій при опіках.
В літературі є дані про вплив кортизолу та його аналогів на вміст колагену (Слуцкий Л.И., 1969). Показано, що гормон та його аналоги здатні, з одного боку, знижувати активність пролінгідроксилази, викликаючи тим самим пригнічення синтезу колагена, а з іншого – прискорювати катаболізм колагену, особливо молодих, новосинтезованих форм. Останнє здійснюється через систему лізосоми-стероїди, яка регулює розпад білків сполучної тканини.
Оксипролін – амінокислота, яка утворюється внаслідок гідроксилювання проліну після включення його до поліпептидного ланцюга білка. Ця амінокислота входить головним чином до складу колагену, є для нього специфічною і з’являється в крові тільки внаслідок катаболізму.
Відомо, що кількість вільного оксипроліну в крові відображає розпад колагену (Слуцкий Л.И., 1969; Мазуров В.И., 1974). Це дозволяє припустити, що в обміні колагену при ЕОХ переважають процеси розпаду.
Метаболізм колагену визначається взаємодією процесів біосинтезу і розпаду даного біополімеру. На перевагу катаболічних процесів при ЕОХ вказує збільшення вмісту вільного оксипроліну порівняно з контролем. Деструкція колагену може відбутися під дією активних форм кисню, надалі цей механізм може індукувати деградацію колагену за рахунок дії протеаз і інших лізосомальних ферментів. Як зазначають (Самохіна Л.М., Коваль С.М., Старченко Т.Г., 2004), такі протеїнази, як катепсин G, еластаза тощо, руйнують компоненти сполучної тканини. Отже, зміни в обміні колагену у щурів носять однонаправлений характер. ЕОХ призводить до значного зниження швидкості синтетичних процесів і до активації процесів розпаду в обміні колагену. По мірі прогресування хвороби порушується динамічна рівновага між процесами деградації і біосинтезу колагену в бік переважання розпаду.
До складу сполучної тканини входять глікопротеїни – речовини, які містять білковий та вуглеводний компоненти. До глікопротеїнів відносяться НК та їх оцтово-кислі ефіри, які називаються сіаловими кислотами. Однією з причин підвищення вмісту НК в крові при опіковій хворобі, певно, можна вважати підвищення активності нейрамінідази, ферменту, що приймає участь у розпаді глікопротеїнів. Підвищення рівня НК також свідчить про інтенсивний процес розпаду глікопротеїнів. Глюкоза, глюкозамін, ГК – обов’язкові компоненти багатьох глікопротеїнів. Різке підвищеня вмісту гексозаміну в крові є одною із ознак підсиленого розпаду білків сполучної тканини.
Об’єктом дії продуктів ПОЛ, перш за все, є крупномолекулярні структури, до яких у складі сполучної тканини відносяться протеоглікани. Внаслідок збільшення концентрації супероксиданіон-радикала пошкоджуються біологічні макромолекули і надмолекулярні комплекси всіх основних класів. Утворення окиснених білків сприяє їх розщепленню протеїназами, протеолітичні ферменти швидше розщеплюють окисненні білки, ніж нативні (Веремеенко К.Н., 1998). Порушення структури біополімерів сполучної тканини в умовах надлишку продуктів ПОЛ при ЕОХ обумовлено недостатністю її АОС, оскільки сполучна тканина менш здатна до АО захисту внаслідок відносно меншої кількості клітинних елементів, які синтезують АО ферменти. Отже, ЕОХ супроводжується змінами стану сполучної тканини, що може порушувати її трофічну функцію і сприяти розвитку гіпоксії тканин. Деструктивні процеси, що розвиваються внаслідок термічного пошкодження, викликають ланцюг патофізіологічних реакцій, які супроводжуються підсиленням катаболізму, порушенням багатьох видів обміну. Як відомо (Hawley R.G., Sobieski D.A., 2002), метаболізм компонентів сполучної тканини залежить від функціонального стану генетичного апарату та балансу гормональних і негормональних регуляторів. На метаболічні процеси в сполучній тканині впливають такі гормональні фактори, як гормони щитоподібної, паращитоподібних, підшлункової залоз, наднирників. Серед негормональних регуляторів обміну білків сполучної тканини називають іони магнію, міді, цинку, АК, також відмічають участь кальцію в обміні як самого колагену, так і факторів, які його регулюють. Відомо, що певна роль у руйнуванні сполучної тканини відводиться деструктивним ферментам – лізосомальним протеазам, нейтральним металопротеїназам.
Таким чином, при опіках переважно в стадії шоку та токсемії підвищується вміст вільного оксипроліну, ГК, НК, гексозаміну у крові. Ці біохімічні показники можуть бути використані в якості тестів при оцінці ступеня реакції організму на опік в різні стадії опікової хвороби.
З’ясуванню патогенетичної ролі, в тому числі й при опіковій хворобі, стану ендогенної інтоксикації, яка має негативний вплив на перебіг опікової хвороби, в останні роки приділяється все більша увага. Інтоксикація може бути пов’язаною, зокрема, з активацією процесів ПОЛ, що проявляється збільшенням рівня ДК та кінцевого продукту - ТБК-активних продуктів, а також недостатньою функцією АОС, одним із важливих неспецифічних чинників якої є ЦП (Che Mee-ryung, Kim Il-Han, 1999; Денисенко О.І., 2004; Нагоев Б.С., Маржохова М.Ю., 2004). Причиною підвищення рівня ПОЛ в органах і тканинах може бути як підсилення генерації активних кисневих метаболітів клітинами, так і недостатня ефективність антиоксидантів.
Виявлені зміни показників АОС крові при ЕОХ в цілому є відображенням активації процесів ПОЛ з наростанням явищ ендогенної інтоксикації на тлі недостатньої активності ЦП, тільки в стадію септикотоксемії.
Можна припустити, що однією із причин зниження активності ЦП з 14-ї по 28-у добу в умовах ЕОХ може бути окисна модифікація білків внаслідок дії на ферменти надлишку активних форм кисню, що і призводить до повної або часткової втрати ними каталітичної здатності.
В умовах стресу, який має місце при ЕОХ, та надлишкової генерації активних форм кисню розвиваються процеси неконтрольованої модифікації білків, які викликають фрагментацію білків, їх денатурацію, а також утворення первинних амінокислотних радикалів, які потім вступають у другу взаємодію із сусідніми амінокислотними залишками, що в цілому утворює досить складну картину пошкоджуючої дії активних форм кисню на білкові макромолекули. Все це призводить до втрати білками їх біологічної активності і пошкодження обмінних процесів, інтоксикації організму (Oliver C.N., Bong-Whan Ahn, Moerman E.J., 1987; Li P.F., Fang Y.Z., Lu X., 1993; Дубініна О.Ю., 2001; Карімов І.З., 2005; Вавилова Г.П., Гусарова Ю.А., 2005; Воронцова Л.Л., Михеев А.А., 2006).
До білкових продуктів, які мають значення у виникненні інтоксикації, відносяться: гаптоглобін, ЦП, СМ, протеолітичні ферменти.
Відомо (Воронцова Л.Л., Михеев А.А., 2006 ), що окисній модифікації білків в першу чергу підлягають металоензими, які мають в активному центрі металозв’язуючу ділянку та містять іони металів із змінною валентністю, до яких відноситься ЦП.
Гаптоглобін становить собою один із компонентів реактивних білків активної фази. Концентрація його в крові постійна в нормі і змінюється при різній патології.
Вивчення гаптоглобіну викликає великий інтерес дослідників. Багато важливих питань, пов’язаних із значенням цього білка в патології, з його фізіологічними функціями та молекулярними механізмами їх здійснення, ще далеко не вияснені.
В умовах ЕОХ збільшується вміст гаптоглобіну в крові, особливо у
