Національна академія наук України
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
Нагібін Василь Сергійович
УДК 616.1 : 612.223 + 576.385 + 575.113.2 + 577.152.1
Дослідження механізмів загибелі неонатальних кардіоміоцитів щура в культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації:
роль протеасомного протеолізу
Спеціальність 14.03.04. - Патологічна фізіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ 2007
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця Національної Академії наук України (м. Київ)
Науковий керівник: |
доктор медичних наук, професор, академік НАН України
Мойбенко Олексій Олексійович,
Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,
завідувач відділу загальної та молекулярної патофізіології;
Офіційні опоненти:
|
доктор медичних наук
Маньковська Ірина Микитівна
Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,
завідувач відділу з вивчення гіпоксичних станів;
доктор медичних наук, професор
Братусь Віктор Васильович,
Національний науковий центр “Інститут кардіології ім. академіка М.Д. Стражеско” АМН України,
головний науковий співробітник лабораторії експериментальної кардіології.
Захист відбудеться 30.10.2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.
Автореферат розіслано 27.09.2007 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук
|
З.О. Сорокіна-Маріна
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Однією з основних причин смертності у світі на сьогодняшній день є різні форми ішемічної хвороби серця [Доповідь ВООЗ, 2003]. Головною ланкою патогенезу цього захворювання є тимчасове припинення кровопостачання ділянки серця (ішемія міокарду) з можливим подальшим його відновленням (реперфузія). При цьому відбувається загибель кардіоміоцитів, що може реалізуватися кількома шляхами: незапрограмованим (некроз) та запрограмованим (апоптоз, аутофагічна клітинна смерть). Поряд з некротичною загибеллю клітин під час ішемії-реперфузії досить вивченими на сьогодні є також ряд механізмів реалізації саме запрограмованих шляхів клітинної смерті у кардіоміоцитах. Більш широко описана апоптотична клітинна смерть, пов?язана, зокрема, з ушкодженням мітохондрій і відкриттям так званої мітохондріальної пори, що є особливо важливим при ішемічній хворобі серця [Zimmermann K.C., 2001, Scarabelli T.M., 2003, Сагач, В.Ф., 2005]. Цей шлях загибелі кардіоміоцитів спостерігається переважно в периішемічній ділянці та за умов хронічної ішемії. Іншим шляхом програмованої загибелі клітин є аутофагічна клітинна смерть (АКС), що хоча й вивчена досить детально, описана переважно в патогенезі нейродегенеративних захворювань, і практично не досліджувалася при патології серцево-судинної системи. Окремі роботи вказують на те, що аутофагічна деструкція клітин серця може розглядатися як один із важливих механізмів загибелі кардіоміоцитів при ремоделюванні міокарда під час гіпертрофії, при кардіоміопатіях та за умов дії кардіотоксичних антибіотиків [Семенов Д.Е., 2001, Shimomura H., 2001, Hein S., 2002, Kostin S., 2003, Aki T, 2003]. Що ж стосується значення АКС у патогенезі ішемічної хвороби серця, то прямі дані стосовно цього в літературі відсутні.
Розповсюдженість програмованих варіантів клітинної загибелі при ішемії-реперфузії міокарду, їх принципова оборотність та певний час, що необхідний для їх реалізації, дозволяє впливати на розвиток цих шляхів при ішемічній хворобі серця з терапевтичною та профілактичною метою. Одним з варіантів попередження загибелі кардіоміоцитів при ішемії-реперфузії є явища ендогенної кардіопротекції [Murry C.E., 1986, Schott R.J., 1990, ., 2005]. Розкриття механізмів їх реалізації та регуляції створює широкі можливості для розроблення методів профілактики та лікування ішемічної хвороби серця.
Важливе значення в регуляції життєдіяльності клітин в нормі та патології має внутрішньоклітинний убіквітин-залежний протеасомний протеоліз [Xie Y., 2000, Гольдберг А., 2001, Jesenberger V., 2002]. Роль протеасомного протеолізу в патогенезі серцево-судинних захворювань активно вивчається останніми роками Herrmann J., 2004, Kukan M., 2004, Goldberg А.L., 2005. Проте дані, щодо активності протеасоми під час аноксії-реоксигенації стосуються лише тканин, а не ізольованих клітин [Bulteau A.-L., 2001]. Дуже суперечливі дані існують в літературі з приводу впливу інгібіторів протеасомного протеолізу на виживання різних типів клітин. Роль протеасоми в реалізації феноменів ендогенної кардіопротекції виявилася абсолютно невивченою.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукової тематики відділу загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Дослідження ролі нових ендогенних біорегуляторів в розвитку патологічних процесів в серцево-судинній системі; розробка та впровадження нових методів лікування гострого інфаркту міокарда” (№ держреєстрації 0199U004033), “Дослідження механізмів розвитку та попередження порушень діяльності серцево-судинної системи при ішемічно-реперфузійному синдромі; розробка методів їх корекції” (№ держреєстрації 0102U000827), “Дослідження ендогенних механізмів кардіопротекції при захворюваннях серця” (№ держреєстрації 0105U003233).
Мета дослідження: Дослідження механізмів загибелі ізольованих кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації, вивчення процесів, що лежать в основі розвитку феноменів ендогенної кардіопротекції, та визначення участі протеасомного протеолізу в цих явищах.
Завдання дослідження:
1.Дослідити співвідношення живих та загиблих різними шляхами клітин в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура в контролі та за умов аноксії-реоксигенації;
2.Визначення активності протеасоми в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура в контролі та за умов аноксії-реоксигенації;
3.Вивчити дозозалежний вплив інгібіторів протеасомного протеолізу на співвідношення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів у культурі;
4.Дослідити ефективність відтворення ішемічного прекондиціонування та розробити методику відтворення посткондиціонування на первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів;
5.Визначити вплив інгібіторів протеасомного протеолізу на реалізацію явищ ендогенної кардіопротекції в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів;
6.Дослідити здатність біофлавоноїда кверцетина та його водорозчинної форми - лікарського препарату „Корвітин” - пригнічувати протеасомну активність in vitro та у культурі кардіоміоцитів;
7.Дослідити вплив біофлавоноїда кверцетина та його водорозчинної форми - лікарського препарату „Корвітин” – на співвідношення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів, а також на відтворення явищ ендогенної кардіопротекції у первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура.
Об’єкт дослідження – процес запрограмованої та незапрограмованої загибелі кардіоміоцитів у первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура при відтворенні аноксії-реоксигенації та його регуляція, а також механізми реалізації явищ ендогенної кардіопротекції.
Предмет дослідження – участь внутрішньоклітинного, убіквітин-залежного, протеасомного протеолізу в регуляції та реалізації механізмів клітинної смерті кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації та його роль у розвитку явищ ендогенної кардіопротекції.
Методи дослідження: виділення та культивування кардіоміоцитів 2-3-денних щурів; визначення живих клітин, клітин, що загинули шляхом некрозу та апоптозу цитологічним методом за допомогою флюорисцентних ядерних барвників „Hoechst” (біз-бензимід) і пропідіум іодид, а також клітин, що загинули шляхом АКС за допомогою флюорисцентного барвника монодансилкадаверин; визначення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів за допомогою електронно-мікроскопічних досліджень; визначення активності протеасомного протеолізу в культурі за допомогою спектрофлюориметричного методу з використанням специфічних флюорогенних субстратів протеасоми; методика моделювання аноксії-реоксигенації на культурі кардіоміоцитів і відтворення явищ прекондиціонування та посткондиціонування на цій культурі.
Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених експериментів отримані дані, що дозволяють певною мірою пояснити участь протеасоми в реалізації програм клітинної смерті та явищ ендогенної кардіопротекції. Нами вперше визначено всі три види протеолітичної активності протеасоми (трипсиноподібна, хімотрипсиноподібна та пептидилглутаміл-пептидгідролазна) в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура і продемонстровані їх зміни за умов відтворення аноксії та реоксигенації. Нами вперше виявлений дозозалежний ефект протеасомних інгібіторів на виживання та співвідношення різних варіантів клітинної смерті у первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура. Також нами вперше отримано дані, щодо впливу інгібіторів протеасомного протеолізу на розвиток явищ ендогенної кардіопротекції. Отримані нові дані про вплив біофлавоноїду кверцетину та його водорозчинної форми, лікарського засобу „Корвітин” на активність протеасоми в культурі кардіоміоцитів та на перебіг явищ ендогенної кардіопротекції.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані у даній роботі дані обумовлюють можливість використання інгібіторів протеасомного протеолізу в малих дозах (1.5 – 2.5 мкМ) як засобів для відтворення явищ ендогенної кардіопротекції, що відкриває перспективи для профілактики ішемічної хвороби серця. Крім того в ході даної роботи відпрацьована методика відтворення явища посткондиціонування на культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура за допомогою коротких періодів реоксигенації після довгого періоду аноксії. Ця методика дозволить проводити подальші дослідження цього феномену на культурі клітин і може отримати застосування у науковій роботі. Нами також отримані дані щодо нової властивості відомого лікарського препарату „Корвітин”, а саме встановлена його здатність пригнічувати протеасомний протеоліз. Це дозволяє використовувати його (або власне біофлавоноїд кверцетин) як порівняно дешевий та ефективний протеасомний інгібітор з лікувальною та профілактичною метою.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем виконано пошук літератури за темою дисертації, отримання та культивування ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура, відтворення явищ прекондиціонування та посткондиціонування на цій культурі, дослідження впливу інгібіторів протеасомного протеолізу, кверцетину і „Корвітину” на кардіоміоцити в контролі та при моделюванні аноксії-реоксигенації, а також статистична обробка отриманих результатів.
Апробація результатів дисертації.
Отримані в дисертаційній роботі дані були апробовані на:
1. Семінарі cектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (2007);
2. Конгресі товариства патофізіологів України (м. Чернівці, 2004 р.);
3. Засіданні сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (19 червня 2007 р.);
4. Піроговській студентській науковій конференції Російського державного медичного Університету (Москва, 20 березня 2003 р.);
5. Київській фармакологічній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного Університету ім. О.О. Богомольця (Київ, 12 квітня 2003 р.);
6. 58-ій науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця „Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 28-30 жовтня 2003 р.);
7. Конференції молодих вчених Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України “Перспективні напрями досліджень сучасної фізіології” (Київ, 17-18 листопада 2003 року);
8. Workshop in cardiovascular physiology “Signal trunsduction in cardio-vascular system” (Warsaw, 13-16 травня 2004 р.);
9. 59 Harden конференції європейського товариства молекулярної біології “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004);
10. Конференції Міжнародного товариства по вивченню серця (Dresden, 2004);
11. Конференціях Міжнародного товариства по вивченню серця (Tromso, 2005; Manchester, 2006);
12. Європейській конференції по вивченню апоптоза “Death next to the sea” (Chania, 17-20 вересня, 2004)
13. Європейській конференції по вивченню апоптоза “Survival on the Danube” (Budapest, 1-4 жовтня, 2005)
14. Європейській конференції по вивченню апоптоза “Death or Survival: fate on the Sardinia” (Cagliari, 29 вересня - 2 жовтня, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 21 робота, у тому числі 11 статей у наукових журналах.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 224 найменувань. Робота викладена на 123 сторінках, містить 9 таблиць та проілюстрована 20 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Експерименти виконано на первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів, отриманих із міокарда шлуночків 2-3-денних щурів лінії Вістар. Газові суміші для моделювання аноксії та реоксигенації виготовлялися та заправлялися в балони в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця. Всі реактиви, що використовувалися в процесі виконання роботи, виготовлені компанією Sigma Aldrich. Вимірювання флюорисценції проводилося на спектрофлюориметрі НІТАСНІ 4000. Мікроскопічне дослідження клітин проводилося на флюорисцентному мікроскопі МЛ-2. Електронно мікроскопічні дослідження проводилися на електронному мікроскопі Jem – 100 CX (Японія). Руйнування та диспергування клітин проводилося за допомогою ультразвукового диспергатора УЗД А. Виділення клітин проводилося за стерільних умов у ламінарній шафі. Культивування клітин відбувалося у СО2 - інкубаторі УЛІ 2.
Отримання та культивування ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура. Культура отримувалася за методикою, коротко викладеною у роботі Reinecke H. et al. (1998) з деякими модифікаціями. Шляхом цервікальної дислокації щури знерухомлювалися. Після цього через передній поздовжній розріз виймалося серце. Шлуночки відокремлювалися від передсердь, двічі відмивалися у стерильному буферному сольовому розчині (рН 7.4) та механічно подрібнювалися ножицями до отримання шматків тканини розміром близько 1мм3. Ці шматки міокарду підлягали ферментативному розщепленню у середовищі виділення, яке на основі зазначеного буферу містило колагеназу ІІ типу (95 ОД/мл) та панкреатин (0.6 мг/мл). Перетравлення відбувалося у п?ять циклів по десять хвилин кожний. Після кожного з циклів шматочкам міокарду давали осісти, а надосадове середовище зливали, клітини осаджували шляхом центрифугування при 400 g протягом 1 хвилини, після чого відмивали від залишків колагенази, шляхом такого ж центрифугування у чистому буфері. Отримані клітини додатково очищували від неміокардіальних елементів, нашаровуючи на заздалегідь підготовлений градієнтний розчин перкола, який складався з 3 шарів з відносною густиною 54 %, 45 % та 36 % відповідно. Центрифугування клітин у цьому градієнті проводили при 900 g, протягом 15 хвилин. При цьому кардіоміоцити виявлялися між другим і третім шаром. Кардіоміоцити збирали та, відмивши від перколу шляхом центрифугування у зазначеному буфері при 400 g протягом однієї хвилини, ресуспендували у живільному середовищі. Кількість живих та некротичних клітин визначалася за допомогою методу виключення 0.2 % розчину трипанового синього.
Отримані клітини розміщували на скельця, покриті 2 % розчином желатину із щільністю 120 000 на 1 см2. Культивування проводилося протягом 1 - 2 діб у живильному середовищі культивування при 37С у газовому середовищі - 5% СО2 та 95% атмосферного повітря.
Моделювання аноксії-реоксигенації та явищ прекондиціонування й посткондиціонування. Аноксія моделювалася шляхом аерації клітин безкисневою газовою сумішшю, що включала 5% СО2 та 95% Ar протягом 30 хвилин у ексикаторі з щільно притертою кришкою, куди зазначена газова суміш подавалася через стерилізуючий фільтр та шар стерильної води налитий на дно ексикатора. Для моделювання реоксигенації після аноксії проводилася заміна живильного середовища та культивування клітин за вихідних умов протягом 60 хвилин.
Для моделювання явищ ендогенної кардіопротекції ми також використовували аноксичну газову суміш та газову суміш, яка відтворювала звичайні умови (5% СО2 та 95% атмосферного повітря). Явище прекондиціонування відтворювалося шляхом піддання клітин трьом коротким періодам аноксії, що були розмежовані трьома періодами реоксигенації відповідної тривалості. Кожен з цих періодів тривав 3 хвилини.
Явище посткондиціонування відтворювалося на культурі кардіоміоцитів вперше. За аналогією з методикою відтворення прекондиціонування, ми проводили короткі періоди реоксигенації після звичайної, тридцятихвилинної аноксії. Між періодами реоксигенації відбувалися періоди аноксії відповідної тривалості. Після цих циклів проводилася звичайна реоксигенація тривалістю 60 хвилин. Для вибору найбільш ефективної методики та визначення необхідної тривалості періодів реоксигенації ми проводили досліди, в яких кожен з цих періодів тривав 5, 3 чи 1 хвилину.
Визначення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних клітин. Кількість живих, некротичних та апоптотичних клітин оцінювали цитологічно за допомогою забарвлення кардіоміоцитів біс-бензимідом (Hoeсhst 33342) та пропідіум йодидом в однаковій концентрації 8.75 мкМ/л. Для виявлення аутофагічних вакуолей застосовували специфічний барвник монодансилкадаверин в концентрації 50 мкМ (прижиттєве забарвлення клітин). Пофарбовані клітини вивчали за допомогою флюорисцентного мікроскопу МЛ-2. Для електронно-мікроскопічних досліджень використовувався рутинний метод заливки тканин в епоксидні смоли з фіксацією зразків в 2,5% глютаральдегіді на какодилатному буфері та постфіксацією 1 % осмієвою кислотою. Ультратонкі зрізи контрастувалися в уранілацетаті та цитраті свинцю. Матеріал вивчався на електронному мікроскопі Jem – 100 CX (Японія).
Вимірювання протеасомної активності. Для біохімічного дослідження клітини диспергували за допомогою скребка й руйнували шляхом озвучування в ультразвуковому диспергаторі УЗДН А з максимальною інтенсивністю протягом трьох хвилин. Клітини, що лишилися нелізованими, мембрани та ядра видалялися шляхом центрифугування при 900 g протягом 10 хвилин. Супернатант інкубувався у буфері з відповідним флюорогенним субстратом для визначення різних видів протеолітичних активностей протеасоми. Після цього проводилася реєстрація флюорисценції продуктів гідролізу (довжина хвилі збудження/емісії - 360/440) на спектрофлюориметрі Hitachi-4000. Специфичність протеасомного гідролізу підтверджувалася за допомогою специфічних інгібіторів протеасоми. Відсоток пригнічення активності гідролизу відповідних субстратів під дією цих інгібіторів трактували як протеасомну активність.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Співвідношення живих некротичних апоптотичних та аутофагічних кардіоміоцитів в контрольних умовах. При використанні методу подвійного фарбування клітин флюорисцентними барвниками „Hoechst” та пропідіум іодид було встановлено, що співвідношення живих, некротичних (пропідіум іодид позитивних) та апоптотичних (пропідіум іодид негативних з фрагментованим ядром) клітин у контролі становить 89.8 % ± 0.90, 3.2 % ± 0.33 та 5.8 % ± 0.73 відповідно (n = 10). При дослідженні культури з використанням специфічного для аутофагічних вакуолей флюорисцентного барвника монодансилкадаверину було з?ясовано, що кількість клітин з ознаками АКС у контролі становить 4.3 % ± 0.23 (n = 10) по відношенню до загальної кількості клітин (рис. 1).
Співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних кардіоміоцитів в умовах аноксії-реоксигенації. Після відтворення аноксії протягом тридцяти хвилин кількість живих клітин зменшувалася до 80 ± 1.31 % (Р < 0.05, у порівнянні з контролем, n = 10), некротичних зростала до 14 ± 0.74 % (Р < 0.05, n = 10), а кількість клітин, що вступили на шлях апоптозу вірогідно не змінювалася. Після відтворення аноксії-реоксигенації протягом тридцяти та шестидесяти хвилин відповідно кількість живих кардіоміоцитів зменшувалася до 79.1 ± 1.31 (P < 0.001, n = 10) а кількість некротичних та апоптотичних клітин становила 7.7 % ± 1.11 (P1 < 0.001, n = 10) та 11.9 % ± 1.04 (P < 0.001, n = 10) відповідно (рис. 1). Кількість клітин з ознаками АКС збільшувалася за цих умов порівняно з контролем до 14.2 % ± 0.96 (P < 0.001, n = 10) (рис. 1).
Дослідження співвідношення між різними типами загибелі кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації в умовах інгібування апоптозу та аутофагії. Для встановлення співвідношення різних видів клітинної смерті за умов аноксії-реоксигенації, а також для визначення ролі кожного з видів смерті кардіоміоцитів в патогенезі аноксічного пошкодження ми провели експерименти з інгібіторами різних видів загибелі клітин.
Виявилося, що інгібітор аутофагії N-3-метиладенін (100 мМ) викликає збільшення кількості некротичних клітин в 1.9 раза, у порівнянні з аноксією-реоксігенацією (P<0.001), а кількість живих клітин при цьому знижувалась на 5.5 %, P=0.03. Застосування інгібітора каспаз DEVD (100 мкM) під час аноксії-реоксигенації також призводило до збільшення кількості некротичних клітин у 2.8 рази, відносно аноксії-реоксігенації (P<0.001). Попередження як аутофагії так і апоптозу шляхом одночасного застосування N-3-метиладеніна та інгібітора каспаз призводило при аноксії-реоксігенації до значного підвищення числа клітин, що загинули шляхом некрозу (в 4.5 рази, P<0.001) і відповідному зниженню числа живих кардіоміоцитів на 9 % (Рис. 2).
Визначення активності протеасоми в первинній культурі кардіоміоцитів щура при відтворенні аноксії-реоксигенації. В результаті проведених досліджень вдалося з?ясувати, що активність протеасомного протеолізу в кардіоміоцитах змінюється за умов моделювання аноксії-реоксигенації.
Так встановлено, що трипсиноподібна активність протеасоми в контролі становить 7.64 ± 0.53 нМ амідометилкумаріна (АМК) на 106 клітин у хвилину (n = 7), хімотрипсиноподібна – 9.91 ± 1.76 нМ АМК на 106 клітин у хвилину (n = 7), а пептидилглутаміл-пептидгідролазна активність - 0.059 ± 0.001 нМ АМК на 106 клітин у хвилину (n = 7). Після відтворення аноксії протягом 30 хвилин відбулися такі зміни у протеасомній активності кардіоміоцитів: трипсиноподібна активність протеасоми зменшилася на 39.8% (P=0.006, порівняно з контролем, n = 7), хімотрипсиноподібна – на 34.7% (P=0.004, n = 7), а пептидилглутаміл-пептидгідролазна активність зменшувалася у 4.8 рази (P=0.004, n = 7). Шестидесятихвилинна реоксигенація призводила до часткового збільшення активності протеасоми: трипсиноподібна зростала на 8.7 % (Р = 0.75, порівняно з аноксією; n = 7), хімотрипсиноподібна збільшувалася порівняно з аноксією на 46.0 % (P=0.03; n = 7), а пептидилглутаміл-пептидгідролазна активність відновлювалася до контрольного, вихідного рівня і навіть перевищувала його, збільшуючись порівняно з аноксією у 5.4 рази (Р = 0.01; n = 7) (рис. 3).
Вплив інгібіторів протеасоми на співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних клітин в контрольних умовах. Нам вдалося встановити, що специфічний протеасомний інгібітор класто-лактацистін ?-лактон у дозі 5 мікроМ за 90 хвилин інкубації викликає загибель кардіоміоцитів шляхом апоптозу та аутофагії, майже не впливаючи при цьому на кількість некротичних клітин. Кількість апоптотичних клітин при цьому становила 8.16 1.39 % (P<0.05 у порівнянні з контролем, n=7), а некротичних – лише 3.92 1.56 % (P>0.05, n=7). Кількість живих кардіоміоцитів знижувалася до 76.12 ± 1.83 % (P<0.05, n=7). Рівень кардіоміоцитів з ознаками АКС при цьому сягав 12.5 ± 1.25 % (Р<0.05, n=7). Аналогічний ефект справляв і інший специфічний інгібітор протеасоми MG132. Враховуючи те, що він є більш слабким інгібітором протеасомного протеолізу ми застосували його в дозі 10 мкМ. При цьому за 90 хвилин інкубації він викликав такі зміни у співвідношенні живих та загиблих різними шляхами клітин: кількість кардіоміоцитів загиблих шляхом апоптозу сягала 9.5 1.37 % (P<0.05 у порівнянні з контролем, n=7), а кількість некротичних клітин при цьому становила 4.5 1.22 % (P<0.05, n=7). Відсоток живих клітин знижувався до 73.8 ± 1.47 % (P<0.05, n=7). Кількість клітин з ознаками АКС за умов застосування 10 мкМ MG-132 становила 21.3 ± 0.92 % (P<0.05, n=7).
Для підтвердження дії інгібіторів ми проводили визначення протеолітичних активностей протеасоми у кардіоміоцитах після інкубації їх із зазначеними інгібіторами у відповідних дозах протягом 90 хвилин. Результати цих вимірювань свідчать про те, що класто-лактацистін ?-лактон знижував трипсиноподібну активність протеасоми на 28.3 % (Р=0.016, n=5), хімотрипсиноподібну - на 71.1 % (Р=0.02, n=5), а пептидилглутаміл-пептидгідролазну – на 51.7 % (Р=0.038, n=5). Інший інгібітор протеасоми – MG-132 справляв аналогічний ефект. Крім того для підтвердження дії протеасомних інгібіторів ми провели визначення накопичення убіквітинізованих протеїнів у клітині. Для цього ми використовували вторинні антитіла, мічені золотом, і метод електронної мікроскопії. Дане дослідження показало, що при впливі протеасомних інгібіторів у клітині накопичуються убіквітинові кон?югати, що свідчить про наявність у клітині поліубіквітинізованих білків, а отже про пригнічення активності протеасоми.
Дослідження співвідношення між різними типами загибелі кардіоміоцитів при дії протеасомних інгібіторів в умовах інгібування апоптозу та аутофагії. Попередження аутофагічної клітинної смерті у випадку застосування інгібітора протеасоми призводило до двократного збільшення кількості некротичних клітин. Попередження апоптотичної загибелі клітин в умовах застосування класто-лактацистін бета-лактону призводило до збільшення кількості некротичних клітин до 41.2 %. Одночасне застосування N-3-метиладеніна і DEVD в цьому випадку призводило до збільшення кількості клітин, що загинули шляхом некрозу в 13.4 раза (P<0.001) (рис. 4)! Отримані дані дозволяють стверджувати, що селективне пригнічення запрограмованих варіантів клітинної загибелі, негативно відбивається на цілій клітинній популяції, оскільки кількість некротичних клітин різко збільшується.
Моделювання прекондиціонування та посткондиціонування в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів. При відтворенні феномена ішемічного прекондиціонування на культурі кардіоміоцитів нам вдалося встановити, що три цикли аноксії-реоксигенації по три хвилини кожний збільшують кількість живих клітин майже до контрольного рівня (таблиця 1). Кількість клітин, що гинули шляхом аутофагічної клітинної смерті під час аноксії-реоксигенації зменшувалась при відтворенні прекондиціонування менш виражено (таблиця 2). Після цього ми проводили відтворення явища посткондиціонування шляхом коротких періодів реоксигенації та аноксії, які мали місце після тридцятихвилинної аноксії та перед шестидесятихвилинною реоксигенацією. Враховуючи те, що така методика відтворення посткондиціонування на культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура проводилася нами вперше ми виконали перевірку ефективності циклів посткондиціонування різної тривалості: по п?ять, три та одній хвилині відповідно. Виявилося, що найбільш ефективним є явище посткондиціонування з найкоротшими циклами реоксигенації та аноксії. Крім того посткондиціонування є більш ефективним кардіопротективним явищем ніж прекондиціонування по відношенню до аутофагічної загибелі клітин.
Таблиця 1. Кількість живих, некротичних та апоптотичних клітин в контролі, при аноксії-реоксигенації та при відтворенні явищ прекондиціонування і посткондиціонування.
Експериментальні групи | Кількість клітин, %
Живі | Некротичні | Апоптотичні
Контроль n =12 | 90.0 ± 2.80 | 3.3 ± 1.09 | 5.5 ± 2.27
Аноксія-реоксигенація
(30-60 хв.) n = 13 | 78.5 ± 5.31
P1 <0.001 | 7.8 ± 3.06
P1 <0.001 | 12.8 ± 5.13
P1 <0.001 | Аноксія-реоксигенація
+ Постконд. 5 хв. x 3
n = 6 | 83.9 ± 4.01
P = 0.043
P1 = 0.002 | 6.3 ± 1.36
P = 0.28
P1 <0.001 | 9.4 ± 2.90
P = 0.15
P1 = 0.007 | Аноксія-реоксигенація
+ Постконд. 3хв. x 3
n = 6 | 85.3 ± 4.80
P = 0.02
P1 = 0.02 | 5.6 ± 1.27
P = 0.12
P1 <0.001 | 8.8 ± 3.81
P = 0.12
P1 = 0.007 | Аноксія-реоксигенація
+ Постконд. 1 хв. x 3
n = 6 | 87.6 ± 0.75
P = 0.002
P1 = 0.09
P2 = 0.006 | 4.7 ± 1.01
P = 0.05
P1 = 0.03
P2 = 0.04 | 7.4 ± 0.78
P = 0.04
P1 = 0.09
P2 = 0.002 | Аноксія-реоксигенація + Преконд. 3 хв x 3; n = 7 | 89.4 ± 1.02
P < 0.001
P1 = 0.81 | 3.41 ± 0.41
P = 0.007
P1 = 0.7 | 4.8 ± 0.48
P < 0.001
P1 = 0.31
Р – достовірність результатів по відношенню до аноксії-реоксигенації; Р1 - достовірність результатів по відношенню до контролю
Таблиця 2. Кількість аутофагічних клітин в контролі, при аноксії-реоксигенації та при відтворенні явищ прекондиціонування та посткондиціонування.
Експериментальні групи | Кількість аутофагічних клітин, %
Контроль n = 6 | 4.3 ± 0.80
Аноксія-реоксигенація (30-60хв.); n = 12 | 14.2 ± 0.96
P1 < 0.001
Аноксія-реоксигенація
+Постконд. 5хв. x 3; n = 5 | 7.5 ± 0.22
P < 0.001; P1 < 0.001
Аноксія-реоксигенація
+Постконд. 3хв. x 3; n = 5 | 5.8 ± 1.12
P < 0.001; P1 = 0.03
Аноксія-реоксигенація
+Постконд. 1хв. x 3; n = 5 | 4.3 ± 0.76
P < 0.001; P1 = 0.68
Аноксія-реоксигенація + Преконд. 3 хв x 3; n = 7 | 11.1 ± 0.51
P = 0.02; P1 < 0.001
Р – достовірність результатів по відношенню до аноксії-реоксигенації; Р1 - достовірність результатів по відношенню до контролю.
Вплив інгібіторів протеасоми на реалізацію явищ прекондиціонування та посткондиціонування при аноксії-реоксигенації кардіоміоцитів в культурі. Введення малих доз протеасомних інгібіторів до початку аноксії та перед початком реоксигенації здатне відтворити позитивні ефекти ішемічного прекондиціонування та посткондиціонування відповідно. При цьому зменшується кількість клітин, що гинуть шляхом апоптозу та некрозу, але не кількість кардіоміоцитів з ознаками АКС. В той же час реалізацію явищ ішемічного прекондиціонування та посткондиціонування можна попередити введенням інгібіторів протеасоми під час їх відтворення. Результати цих дослідів наведені в таблиці 3 та 4.
Таблиця 3. Кількість аутофагічних кардіоміоцитів в контролі, при аноксії-реоксигенації та при відтворенні прекондиціонування та посткондиціонування в умовах введення низьких доз протеасомних інгібіторів.
Експериментальні групи | Кількість аутофагічних клітин, %
Контроль n = 6 | 4.3 ± 0.80
Аноксія-реоксигенація(30-60хв.)
n = 12 | 14.2 ± 0.96
P1 < 0.001
Аноксія-реоксигенація + Преконд. 3 хв x 3; n = 7 | 11.1 ± 0.51
P = 0.02; P1 < 0.001
Аноксія-реоксигенація
+ Постконд. 1 хв. x 3; n = 5 | 4.3 ± 0.76
P < 0.001; P1 = 0.68
Clasto-lactacystin -lactone
(2.5 M) до A-Р; n = 7 | 17.8 ± 1.26
P = 0.39; P1 < 0.001
MG132 (5 M) до А-Р
n = 7 | 13.9 ± 0.66
P = 0.78; P1 < 0.001
Продовження таблиці 3
Clasto-lactacystin-lactone
(2.5M) перед реоксигенацією; n = 7 | 17.52 ± 1.89
P = 0.11; P1 < 0.001
Р – достовірність результатів по відношенню до аноксії-реоксигенації; Р1 - достовірність результатів по відношенню до контролю. А-Р – аноксія-реоксигенація.
Таблиця 4. Кількість живих, некротичних та апоптотичних клітин в контролі, при аноксії-реоксигенації та при відтворенні прекондиціонування та посткондиціонування в умовах введення низьких доз (2.5 мкМ та 5 мкМ) протеасомних інгібіторів (класто-лактацистін ?-лактон та MG132).
Експериментальні групи | Кількість клітин, %
Живі | Некротичні | Апоптотичні
Контроль n =12 | 90.0 ± 2.80 | 3.3 ± 1.09 | 5.5 ± 2.27
Аноксія-реоксигенація
(30-60 хв.) n = 13 | 78.5 ± 5.31
P1 <0.001 | 7.8 ± 3.06
P1 <0.001 | 12.8 ± 5.13
P1 <0.001 | Аноксія-реоксигенація + Преконд. 3 хв x 3; n = 7 | 89.4 ± 1.02
P < 0.001
P1 = 0.81 | 3.41 ± 0.41
P = 0.007
P1 = 0.7 | 4.8 ± 0.48
P < 0.001
P1 = 0.31 | Аноксія-реоксигенація
+ Постконд. 1 хв. x 3
n = 6 | 87.6 ± 0.75
P = 0.002
P1 = 0.09 | 4.7 ± 1.01
P = 0.05
P1 = 0.03 | 7.4 ± 0.78
P = 0.04
P1 = 0.09 | CL (2.5 M) перед A-Р
n = 7 | 85.9 ± 0.47
P < 0.001
P1 = 0.005 | 4.0 ± 0.42
P = 0.015
P1 = 0.18 | 6.57 ± 0.40
P < 0.001
P1 = 0.44 | MG132 (5 M) перед A-Р
n = 7 | 86.8 ± 1.64
P = 0.0022
P1 = 0.11 | 4.5 ± 0.32
P = 0.033
P1 = 0.013 | 6.2 ± 0.51
P < 0.001
P1 = 0.69 | CL (2.5 M) перед реоксигенацією
n = 785.2 ± 1.99
P = 0.018
P1 = 0.035 | 4.7 ± 0.61
P = 0.051
P1 = 0.034 | 7.2 ± 0.65
P = 0.004
P1 = 0.21 | A-Р + Преконд + CL
(2.5 M); n = 7 | 83.7 ± 1.45
P = 0.036
P3 = 0.007 | 4.1 ± 0.46
P = 0.02
P3 = 0.28 | 9.9 ± 0.77
P = 0.18
P3 < 0.001 | A-Р + Постконд + CL
(2.5 M); n = 7 | 82.6 ± 1.53
P = 0.11
P2 < 0.001 | 4.4 ± 0.45
P = 0.029
P2 = 0.37 | 9.7 ± 0.72
P = 0.14
P2 < 0.001 | A-Р + Постконд + MG132 (5 M)
n = 7 | 86.1 ± 1.27
P = 0.002
P2 = 0.048 | 3.6 ± 0.61
P = 0.011
P2 = 0.76 | 7.6 ± 0.59
P = 0.006
P2 = 0.049 | Р – достовірність результатів по відношенню до аноксії-реоксигенації; Р1 - достовірність результатів по відношенню до контролю; Р2 - достовірність результатів по відношенню до посткондиціонування; Р3 - достовірність результатів по відношенню до прекондиціонування. А-Р – аноксія-реоксигенація. CL - класто-лактацистін ?-лактон.
Вплив кверцетину та „Корвітину” на співвідношення живих, некротичних, апоптотичних та аутофагічних кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації. В концентрації 2.5 мкМ кверцетин та “Корвітин” в значному ступені нівелювали пошкоджуючу дію аноксії-реоксигенації на кардіоміоцити, зменшуючи кількість некротичних та апоптотичних клітин (таблиця 5). Тобто в малій концентрації як кверцетин так і його водорозчинна форма відтворювали явище прекондиціонування. Аутофагічні процеси в кардіоміоцитах, індуковані аноксією-реоксигенацією, не попереджалися ані інгібіторами протеасоми, ані препаратами біофлавоноїдів: кількість аутофагічних клітин при аноксії-реоксигенації становила 14.2 ± 0.96 %, при застосуванні 2.5 мкМ класто-лактацистін бета-лактону з метою моделювання прекондиціонування - 17.8 ± 1.26 %, а при впливі такої ж концентрації кверцетину та “Корвітину” 17.08 ± 0.97 та 17.05 ± 1.17 %.
Таблица 5. Кількість (%) живих, некротичних та апоптотичних кардіоміоцитів в контролі, при моделюванні аноксії-реоксигенації та впливі класто-лактацистін -лактона (2.5 мкМ), кверцетина (2.5 мкМ) та корвітина (2.5 мкМ). |
Живі | Некротичні | Апоптотичні
Контроль n =10 | 89.8 ± 0.90 | 3.2 ± 0.33 | 5.8 ± 0.73 | Аноксія-реоксигенація
(30-60 хв) n = 10 | 79.1 ± 1.31
P1 = 2.86 x 10-6 | 7.7 ± 1.11
P1 = 9.96 x 10-411.9 ± 1.04
P1 = 1.55 x 10-4Класто-лактацистін -лактон + аноксія-реоксигенація
n = 7 | 85.9 ± 0.47
P = 8.18 x 10-4
P1 = 0.0046 | 4.0 ± 0.42
P = 0.015
P1 = 0.18 | 6.57 ± 0.40
P = 0.78 x 10-4
P1 = 0.44 | Кверцетин + аноксія-реоксигенація
n = 5 | 88.3 ± 0.77
P = 4.2 x 10-4
P1 = 0.32
P2 = 0.02 | 4.3 ± 0.93
P = 0.07
P1 = 0.18
P2 = 0.69 | 5.1 ± 0.64
P = 8.3 x 10-4
P1 = 0.55
P2 = 0.07 | Корвітін + аноксія-реоксигенація
n = 5 | 89.1 ± 0.77
P = 1.9 x 10-4
P1 = 0.67
P2 = 0.003 | 4.9 ± 0.82
P = 0.11
P1 = 0.04
P2 = 0.3 | 5.3 ± 0.70
P = 0.001
P1 = 0.65
P2 = 0.12 | P – порівняння з групою аноксія-реоксигенація; P1 – порівняння з контрольною групою; P2 – порівняння з групою класто-лактацистін -лактон + аноксія-реоксигенація.
Вплив кверцетину та „Корвітину” на активність протеасоми в ізольованих неонатальних кардіоміоцитах. Кверцетин на 26 % (Р = 0.03) пригничував трипсиноподібну активність протеасоми, на 63.7 % (Р = 0.04) - хімотрипсиноподібну й на 34.2 % (Р = 0.16) – пептдилглутаміл-пептидгідролазну активність. Класто-лактацистін бета-лактон справляв більш виражений ефект ніж кверцетин, вірогідно знижуючи активність гідролізу всіх трьох видів флюорогенних субстратів (рис.8).
Обговорення результатів. Патофізіологічне обґрунтування терапії серцево-судинних захворювань пов’язане із з’ясуванням питань їх патогенезу і особливо з вивченням механізмів загибелі кардіоміоцитів. Останніми роками серед механізмів клітинної смерті велике значення надається так званим запрограмованим варіантам: апоптозу та аутофагічній клітинній смерті, що реалізуються завдяки активації ендогенних, генетично обумовлених механізмів ініціації, сигналізації та реалізації загибелі клітин, в тому числі й кардіоміоцитів, пов’язаних із змінами функції різних ферментів та енергетичного забезпечення. Цікаво, що в останні роки з’являється все більше відомостей про наявність ендогенних, генетично запрограмованих шляхів реалізації некротичних змін у клітині (Vereammen, 1998, Проскуряков, 2003, Halestrap 2004, Festjens, 2006). Ця концепція підтримується далеко не всіма дослідниками, і питання про ендогенні шляхи реалізації некрозу, взаємозв’язок між ними та механізмами реалізації інших видів клітинної смерті, а також взаємообумовленість їх лишаються недостатньо вивченими. Як показано нами, при аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів щура в культурі поряд з некротичною загибеллю клітин відбувається активація процесів апоптозу та аутофагії, що може збільшувати об’єм ішемічного пошкодження міокарду. Однак намагання обмежити патологічний вплив на міокард за допомогою інгібування запрограмованих механізмів загибелі клітин не є перспективними, оскільки блокада процесів апоптозу та, як вперше показано нами, аутофагічної клітинної смерті призводить до різкого багатократного збільшення загибелі кардіоміоцитів шляхом некрозу та зменшення кількості живих клітин в культурі. А як відомо значення некрозу в розвитку патологічного процесу визначається не лише втратою скоротливих елементів, а й розвитком інтенсивних прозапальних реакцій, активацією цілого ряду мембранотропних ферментів (фосфоліпази, ліпооксигенази та ін.) та утворенням таких патогенних метаболітів, як вільні радикали кисню, лізофосфоліпіди, лейкотрієни, тромбоксани та інші, які здатні значно погіршити перебіг патологічного процесу. Тому гальмування апоптозу та аутофагії при розвитку ішемічного процесу в серці є, вочевидь, небажаним, а їх роль в патогенезі ішемії-реперфузії підлягає подальшому уточненню.
Нами також була досліджена роль протеасомного протеолізу в розвитку різних видів клітинної смерті при аноксії-реоксигенації неонатальних ізольованих кардіоміоцитів у культурі, і вперше виміряні зміни відомих протеолітичних активностей протеасоми (трипсиноподібна, хімотрипсиноподібна та пептидилглутаміл-пептидгідролазна). З’ясовано, що активність протеасоми знижується під час аноксії та дещо підвищується, не досягаючи проте вихідного рівня, під час реоксигенації. Крім того встановлено, що при інгібуванні протеасоми в кардіоміоцитах запускаються переважно запрограмовані шляхи клітинної смерті, а кількість некротичних клітин збільшується мінімально. Застосування на цьому тлі інгібіторів апоптозу та аутофагічної клітинної смерті призводить до катастрофічного збільшення некротичних клітин. Ці дані дозволяють припустити патогенетичну роль протеасоми при аноксії-реоксигенації міокарда. На користь цього припущення свідчать вперше отримані нами дані про інгібуючий вплив на активність протеасоми такого відомого кардіопротектора, як біофлавоноїд кверцетин, та його водорозчинної форми – “Корвітин” (Мойбенко О.О. та ін., 2003, 2007).
В даній роботі також була досліджена роль протеасомного протеолізу в реалізації таких явищ ендогенної кардіопротекції, як прекондиціонування і посткондиціонування. Вдалося встановити, що відтворення цих явищ за допомогою малих доз протеасомних інгібіторів призводить до збільшення кількості живих клітин за рахунок попередження некрозу та апоптозу, але не АКС, що є свідченням того, що в умовах зниженої активності протеасоми в клітині обов’язково запускаються аутофагічні процеси. В той же час доказом участі протеасоми в реалізації пре- та посткондиціонування є факт відміни позитивних ефектів цих явищ за допомогою інгібіторів протеасомного протеолізу.
ВИСНОВКИ
1.За допомогою модифікованої нами методики отримання первинної культури ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура та вперше розробленої нами методики відтворення посткондиціонування на культурі клітин проведені детальні дослідження розвитку запрограмованих шляхів загибелі кардіоміоцитів (апоптозу та аутофагічної клітинної смерті), а також некрозу та їх взаємовідносин в умовах впливу аноксії-реоксигенації та при відтворенні явищ ендогенної кардіопротекції.
2. При відтворенні аноксії-реоксигенації в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура, поряд із збільшенням кількості некротичних клітин, спостерігається активація запрограмованих шляхів клітинної смерті, таких як апоптоз та аутофагічна клітинна смерть, що свідчить про їх участь в розвитку патології серця;
3. При інгібуванні
