НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

ПАНОВ Денис Олександрович

УДК 547.918:543.422

ТРИТЕРПЕНОВI ГЛIКОЗИДИ КАЛОПАНАКСА
СЕМИЛОПАТНОГО

KALOPANAX SEPTEMLOBUM (THUNB.) KOIDZ.

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Одеса – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фізичної та аналітичної хімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: | доктор хімічних наук, професор

Гришковець Володимир Іванович,

Таврійський національний університет
ім. В.І. Вернадського, завідувач кафедри фізичної та аналітичної хімії

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, професор

Чирва Василь Якович

Таврійський національний університет
ім. В.І. Вернадського, завідувач кафедри органічної та біологічної хімії

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник

Гаразд Мирослав Михайлович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач лабораторії синтезу фізіологічно-активних сполук

Провідна установа: | Київський національний університет ім. Тараса Шевченка (кафедра органічної хімії), м. Київ

Захист відбудеться “ 15 ” травня 2007 року о “ 12-й ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 у Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України за адресою: 65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Фізико-хімічного інституту
ім. О.В.Богатського НАН України.

Автореферат розісланий “ 10 ” квітня 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат хімічних наук Литвинова Л.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вплив сучасної цивілізації на організм людини сприяє значному підвищенню кількості різних захворювань, у тому числі й збільшенню грибкових інфекцій. Незадовільна активність та індивідуальне несприйняття синтетичних препаратів веде до пошуку нових лікарських засобів, у тому числі й природного рослинного походження. Такими природними біологічно активними сполуками можуть виступати глікозиди тритерпенової природи. Для глікозидів, виділених з Kalopanax septemlobum (Araliaceae), дотепер вивчені – протидіабетична, протималярійна, протизапальна, протиревматична й протипухлинна активності.

Представники роду Kalopanax, поширені на північному сході Азії – від Сахаліну і Японії до Китаю й Кореї, вже досить широко вивчалися (радянськими вченими у середині 60-х років й у період з 1989 до 1992 р. декількома групами азіатських дослідників). Незважаючи на це, у дисертаційній роботі було виконано детальне вивчення глікозидного складу різних органів двох різновидів Kalopanax septemlobum (Thunb.) Koidz. – K. Septemlobum var. maximowiczii (Van Houtte) Hara та K. septemlobum var. typicum (Nakai) Pojark., інтродукованих на Південному березі Криму (Нікітський ботанічний сад), із залученням сучасних високоефективних методів структурного аналізу – різних варіантів одно- й двовимірної спектроскопії ЯМР. Крім того, раніше не вивчався глікозидний склад плодів (перикарпію та насіння) калопанакса, а робіт з протигрибкової активності (щодо патогенного виду Candida albicans) глікозидів із калопанакса семилопатного дотепер не було.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Вивчення глікозидного складу калопанакса семилопатного проведено в рамках науково-дослідних робіт хімічного факультету Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського за програмами "Нові біологічно активні речовини на основі мурамоїлдипептиду та природних тритерпеноїдів" (№ держ. реєстрації 234/03 – 2000-2005 рр.) і "Розвиток основ хімії розчинів, удосконалення хіміко-технологічних процесів. Вивчення структури, фізико-хімічних властивостей та методів аналізу природних сорбентів, біополімерів, глікозидів, продуктів харчування, виноробства та харчових домішок" (№ держ. реєстрації 0106U003194 – 2006-2010 рр.).

Мета дослідження. Виділення і встановлення повної структури індивідуальних тритерпенових глікозидів із різних органів двох різновидів калопанакса, вивчення їх гемолітичної та протигрибкової активностей, а також встановлення хемотаксономічних відмінностей цих різновидів.

Основні завдання дослідження:

1. Виділення індивідуальних тритерпенових глікозидів з кори стебел, листя, перикарпію плодів і насіння калопанакса семилопатного.

2. Встановлення будови виділених тритерпенових глікозидів комплексом хімічних і біохімічних методів і з використанням різних варіантів одно- й двовимірної спектроскопії ЯМР.

3. Порівняльний якісний та кількісний фітохімічний аналіз тритерпенових глікозидів із різних органів калопанакса семилопатного.

4. Виявлення особливостей глікозидного складу двох різновидів калопанакса і порівняння їх між собою та з іншими представниками родини аралієвих.

5. Виявлення глікозидів, що мають високу гемолітичну та протигрибкову активності.

Об’єкт дослідження. Різновиди Kalopanax septemlobum (Thunb.) Koidz. – Kalopanax septemlobum var. maximowiczii (Van Houtte) Hara та Kalopanax septemlobum var. typicum (Nakai) Pojark. (родини Araliaceae Juss.).

Предмет дослідження. Тритерпенові глікозиди та їхня гемолітична й протигрибкова активність.

Методи дослідження. Тритерпенові глікозиди аналізували та препаративно розподіляли хроматографічними методами. Будову індивідуальних глікозидів установлювали хімічними (кислотний та лужний гідроліз, деацетилювання й метилування діазометаном), біохімічними (ферментативні гідролізи) і методами спектроскопії ЯМР (одновимірні 1H та 13С і двовимірні COSY, TOCSY, ROESY, HSQC та HMBC). Гемоліз контролювали спектрофотометрично.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне вивчення глікозидного складу різних органів двох різновидів калопанакса семилопатного (Kalopanax septemlobum var. maximowiczii та K. septemlobum var. typicum) – кори стебел, листя, перикарпію плодів і насіння. Виділено та однозначно встановлено будову 40 тритерпенових глікозидів
в-аміринового ряду, 16 з яких вперше знайдені в калопанаксі (5 з яких – у родині Araliaceae), а 13 є новими тритерпеновими глікозидами. Для всіх виділених глікозидів однозначно встановлені й наведені хімічні зсуви 1Н та 13С. Вперше в родині Araliaceae виділені тритерпенові глікозиди, що містять ацильний фрагмент транс-кофейної кислоти та новий тип глікозидів із залишком глюкуронової кислоти по карбоксильній групі аглікону.

Результати досліджень дають можливість на фітохімічному рівні оцінити таксономічну спорідненість калопанакса семилопатного з іншими видами родини аралієвих. Рід Kalopanax ближчий роду Hedera, але, окрім того простежуються зв'язки з іншими родами родини аралієвих – Acanthopanax, Fatsia, Cussonia, Aralia, Panax, Polyscias та Tetrapanax.

Практичне значення одержаних результатів Проведено порівняльне фітохімічне вивчення двох різновидів калопанакса, яке показало, що в різних органах різновиду Kalopanax septemlobum var. maximowiczii містяться виключно глікозиди хедерагеніну, а глікозидний склад K. septemlobum var. typicum включає, як глікозиди хедерагеніну, так й олеанолової та ехіноцистової кислот. Запропоновано підвищити таксономічний ранг цих різновидів до самостійних видів роду Kalopanax та використати вже існуючі синонімічні назви – Kalopanax pictum (Thunb.) Nakai, для різновиду K. septemlobum var. maximowiczii й Kalopanax septemlobum (Thunb.) Koidz. для різновиду K. septemlobum var. typicum.

У результаті вивчення біологічної активності низки виділених глікозидів показано їхню високу активність (щодо патогенного виду Candida albicans) у порівнянні із синтетичними препаратами, що використовуються в сучасній медицині. Показано зв'язок між гемолітичною та антифунгальною активностями глікозидів. Отримані дані можуть бути використані для подальших більш глибоких досліджень біологічної дії як екстрактів, так й індивідуальних очищених глікозидів із калопанакса семилопатного.

Доведено, що калопанакс семилопатевий є природним джерелом біологічно активних тритерпенових глікозидів олеананового типу. Глікозидний склад роду Kalopanax найбільш близький до роду Hedera, різні види якого описано в сучасних фармакопеях різних країн. Це може служити передумовою для створення на основі калопанкса різних фармакологічних препаратів.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено аналіз наукової літератури, обрані загальна методика та основні методи дослідження, самостійно проведено виділення, розподіл та очищення тритерпенових глікозидів і попереднє визначення будови на основі хімічних і біохімічних методів аналізу, виконана підготовка зразків тритерпенових глікозидів для біологічних випробувань.

Спектри ЯМР глікозидів були отримані співробітниками Інституту органічної хімії ім. М.Д. Зелінського РАН (м. Москва) д.х.н., професором О.С. Шашковим та к.х.н. В.В. Качалою. Інтерпретацію спектрів ЯМР виконано сумісно з науковим керівником д.х.н., професором
В.І. Гришковцем. Вивчення протигрибкової активності було проведено сумісно зі співробітниками кафедри мікробіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгіївського
(м. Сімферополь, Крим, Україна) д.мед.н., професором Ю.Л. Криворутченко і аспіранткою
М.О. Кірсановою. Гемолітична активність вивчалась сумісно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VI науково-практичному семінарі "Научные основы создания лекарственных средств" (Гурзуф, 2005), Шостій Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Сучасні проблеми хімії” (Київ, 2005), Всеукраїнській науково-технічній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика – 2005”” (Севастополь, 2005), Сьомій Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Сучасні проблеми хімії” (Київ, 2006), Міжнародному симпозіумі із сучасними напрямками в органічній хімії (Судак, 2006), III Міжнародній науково-технічній конференції “Актуальні проблеми сучасних наук: теорія та практика – 2006” (Дніпропетровськ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 9 статей,
1 публікація в матеріалах науково-практичного семінару та тези 5 доповідей симпозіумів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, трьох розділів, висновків, списку використаних джерел і двох додатків. Дисертація викладена на 184 сторінках машинописного тексту, містить 8 таблиць та 11 рисунків. Бібліографія містить 251 джерело, 174 з яких на іноземних мовах.

Скорочення та умовні позначення. ТШХ – тонкошарова хроматографія; ЯМР – ядерний магнітний резонанс; ПМР – протонний магнітний резонанс; КССВ – константа спін-спінової взаємодії; Ас – ацетил; Me – метил; Ara – б-L-арабінопіранозил; Rha – б-L-рамнопіранозил; Xyl – в-D-ксилопіранозил; Glc – в-D-глюкопіранозил; GlcUA – в-D-глюкуронопіранозил; OleanA – олеанолова кислота; EchinA – ехіноцистова кислота; Hed – хедерагенін; St – стебла; L – листи; P – перикарпій плодів; S – насіння.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, визначено мету та завдання дослідження, розкрито наукову й практичну новизну отриманих результатів, особистий внесок здобувача, наведено інформацію про апробацію та публікації результатів дослідження.

У першому розділі проведено аналіз використаних джерел відповідно до тритерпенових глікозидів із калопанакса семилопатного. Показано, низкою радянських, японських, китайських, корейських, в'єтнамських і німецьких дослідників, що зі стебел і листя калопанакса семилопатного виділено 16 тритерпенових глікозидів, широко поширених і в інших видах родини Araliaceae. Проаналізовано дані літератури по етерифікованим тритерпеновим глікозидам із видів різних родин.

У другому розділі описано використані матеріали й методи дослідження.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

1. Виділення, поділ та очищення тритерпенових глікозидів. Для екстракції тритерпенових глікозидів рослинний матеріал попередньо висушили при кімнатній температурі, а потім ретельно подрібнили, знежирили бензолом. Далі вичерпно екстрагували ізопропиловим спиртом при 37–40 °С. Після випарювання спиртових екстрактів суму отриманих речовин розчинили в бутанолі, насиченому водою, і промили водою (або водяним розчином аміаку) для видалення супутніх фенольних сполук, вільних цукрів, солей та інших сильнополярних речовин. Промивання водяним розчином аміаку більш ефективно, однак це приводить до повного зняття нативиних ацильних груп, тому даний варіант використали лише при виділенні глікозидів зі стебел обох різновидів калопанакса й плодів, тому що за даними ТШХ вони не містили ацильованих глікозидів. Отримані очищені суми глікозидів поділяли препаративною хроматографією на силікагелі. Для остаточного очищення й поділу вузьких фракцій додатково проводили рехроматографію на мікросферичному силікагелі “Silpearl” з високим співвідношенням адсорбент/адсорбат.

У результаті з кори стебел K. septemlobum var. maximowiczii було виділено 11 глікозидів (сумарний вміст, яких склало 5,6% у перерахуванні на суху масу сировини), з листя – 15 глікозидів (6,5%). З кори стебел K. septemlobum var. typicum було виділено 18 (4,8%), з листя – 16 глікозидів (8,2%). При поділі суми глікозидів перикарпію плодів K. septemlobum var. typicum було виділено 6 глікозидів (1,8%), а з насіння – 7 (5,4%).

2. Встановлення будови тритерпенових глікозидів

Попередні дані про будову всіх глікозидів були отримані з використанням комплексу хімічних і біохімічних методів аналізу, а остаточне підтвердження будови було зроблено з використанням спектроскопії ЯМР – одновимірні 1H та 13С і двовимірні експерименти COSY, TOCSY, ROESY, HSQC та HMBC і в порівнянні з даними літератури хімічних зсувів сигналів 1H та 13C.

2.1. Установлення будови раніше виділених і вперше знайдених глікозидів

У табл. 2.1 наведено будову глікозидів, що раніше виділялися (і виділених у ході дисертаційної роботи), так і вперше знайдених із двох різновидів калопанакса семилопатного.

Встановлення будови вищевказаних глікозидів можна продемонструвати на прикладі сполук 6, 25 та 27. За даним повного кислотного гідролізу в складі 6 був ідентифікований аглікон – олеанолова кислота, а в 25 та 27 – хедерагенін і моносахариди – арабіноза, рамноза, ксилоза й глюкоза, ідентичні за ТШХ відомих зразків цукрів та агліконів.

Таблиця 2.1

Тритерпенові глікозиди, виділені з двох різновидів
Kalopanax septemlobum

№ | Замінник по атому аглікону С-3 | Аглікон | Замінник по атому аглікону С-28

1 | Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | H

2† | Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | Glc6 Glc

3 | Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | Glc6 Glc4 Rha

4† | Xyl 3Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | H

5† | Xyl 3Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | Glc6 Glc4 Rha

6' | Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | H

7† | Glc | 3 OleanA 28 | H

8' | Glc | 3 OleanA 28 | Glc6 Glc

9† | Glc 2Glc | 3 OleanA 28 | H

10† | Glc 2Glc | 3 OleanA 28 | Glc6 Glc

11† | Rha 2Ara | 3 EchinA 28 | H

12† | Rha 2Ara | 3 EchinA 28 | Glc6 Glc4 Rha

13† | H | 3 Hed 28 | Glc

14 | H | 3 Hed 28 | Glc6 Glc4 Rha

15 | Ara | 3 Hed 28 | H

16† | Ara | 3 Hed 28 | Glc6 Glc

17 | Ara | 3 Hed 28 | Glc6 Glc4 Rha

18 | Ara | 3 Hed 28 | Glc6 (Glc6OAc)4 Rha

19 | Rha 2Ara | 3 Hed 28 | H

20' | Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc

21† | Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 Glc

22 | Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 Glc4 Rha

23 | Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 (Glc6OAc)4 Rha

24 | Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | H

25' | Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc

26 | Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 Glc4 Rha

27' | Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | H

________

Примітка: † – вперше знайдені в калопанаксі;

' – вперше знайдені в родині Araliaceae.

У результаті лужного гідролізу з 25 був отриманий прогенін, ідентичний за хроматографічною рухливостю в різних системах розчинників з 24. Глікозид 24 виділявся раніше й додатково його структура була підтверджена хімічними методами та з використанням одно- й двовимірної спектроскопії ЯМР. Отже, по атому аглікону С-3 знаходиться трисахаридний фрагмент Xyl3Rha2Ara. Тому що глікозид 25 за хроматографічною рухливостю не збігся з жодним наявним відомим зразком, а його хроматографічна поведінка вказувала на вміст однієї глюкози по карбоксильній групі аглікону, ми отримали його зразок із глікозиду 26 (структура якого була підтверджена аналогічно 24). Для цього використали комбінацію ферментів: ферментний препарат із міцелію гриба Mukor spp. (який містить экзорамнозідазу) і емульсин (розщеплюючий
в-(1>6)-глікозидний зв'язок у генціобіозі), у результаті чого одержали відомий зразок 28-О-в-D-глюкопіранозилового естеру 3-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозиду хедерагеніну (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Схема ферментативних гідролізів.

Хімічні зсуви сигналів у спектрі ЯМР 13С глікозиду виявилися повністю ідентичні даним літератури для відповідних фрагментів. Таким чином, 25 являє собою 28-О-в-D-глюкопіранозиловий естер 3-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозиду хедерагеніну.

Глікозиди 6 та 27 не змінювалися в умовах лужного гідролізу, але метилувалися естерним розчином діазометану, що підтверджує їхню монодесмозидну природу. Обробка 6 та 27 ферментним препаратом з гепатопанкреатичного соку виноградного равлика (Helix pomatia), відщеплюючим кінцеві залишки глюкоз, дозволила одержати глікозиди 4 та 24, відповідно. Отже, додатковий кінцевий залишок глюкози знаходиться у вуглеводному ланцюзі по атому аглікону C-3.

Підтвердження природи аглікона в 6 та 27 виконано шляхом віднесення сигналів аглікону в спектрі ЯМР 13С у порівнянні з даними літератури. Для 6 та 27 були виконані повні та однозначні віднесення сигналів у спектрах ЯМР 1Н та 13С з використанням комбінації двовимірних методик COSY, TOCSY, ROESY, HSQC і HMBC. Віднесення сигналів скелетних протонів моносахаридних залишків у спектрі ПМР були виконані на основі спільного аналізу спектрів COSY й TOCSY, починаючи від не перекриваючихся й розташованих у низькопольній області спектра сигналів аномерних Н-атомів і від розташованого у високопольній області сигналу метильної групи залишку рамнози. Мультіплетність і величини КССВ сигналів скелетних протонів моносахаридних залишків підтвердили їхню приналежність до залишків б-арабіно-, б-рамно-,
в-ксило- і в-глюкопіраноз для 27 (аналогічно й для 6) (Рис. 2.2).

Рис. 2.2. Фрагмент спектра ПМР глікозиду 27.

Повні віднесення сигналів атомів 13С моносахаридних залишків виконані за допомогою двовимірної методики HSQC на основі величин хімічних зсувів сигналів скелетних протонів. Послідовність з'єднання моносахаридних залишків і типи зв'язків підтверджуються як із результатів ферментативного гідролізу, ефектів глікозилювання на відповідних атомах моносахаридів, так і зі спектра ROESY, у якому ідентифіковані структурно-інформативні крос-піки між Н-1 залишку рамнози й Н-2 арабінози, між Н-1 ксилози й Н-3 рамнози й між Н-1 кінцевої глюкози й Н-4 ксилози, а також між Н-1 арабінози й Н-3 аглікону. Вищевикладене дозволяє однозначно визначити будову 6 та 27 як 3-О-в-D-глюкопіранозил-(14)-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозиди олеанолової кислоти й хедерагеніну, відповідно.

2.2. Установлення будови нових тритерпенових глікозидів

Глікозиди, будову яких наведено в табл. 2.2, є новими тритерпеновими глікозидами.

Таблиця 2.2

Нові тритерпенові глікозиди, виділенні з
двох різновидів Kalopanax septemlobum

№ | Замінник по атому
аглікону С-3 | Агликон | Замінник по атому аглікону С-28

28 | Ara | 3 OleanA 28 | Glc6 Glc

29 | Xyl 3Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | Glc6 (Glc6OAc)4 Rha

30 | Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | Glc6 Glc4 Rha

31 | Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 OleanA 28 | Glc6 (Glc6OAc)4 Rha

32 | H | 3 Hed 28 | GlcUA

33 | H | 3 Hed 28 | Glc6 Glc

34 | Glc 2Ara | 3 Hed 28 | Glc

35 | Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 (Glc6OAc)4 Rha

36 | Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 Glc4 Rha

37 | Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 (Glc6OAc)4 Rha

38 | Caff-O 6Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | H

39 | Caff-O 6Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 Glc4 Rha

40 | Caff-O 6Glc 4Xyl 3Rha 2Ara | 3 Hed 28 | Glc6 (Glc6OAc)4 Rha

2.2.1. Глікозид 32. Повний кислотний гідроліз 32 призвів до аглікону хедерагеніну й до глюкуронової кислоти. У продуктах лужного гідролізу 32 був знайдений хедерагенін. Для додаткового хроматографічного очищення 32 був попередньо переведений у метиловий естер (32а) обробкою естерним розчином CH2N2. Аналіз спектра ЯМР 13С 32а після віднесення сигналів агліконної частини, показав наявність додаткових семи С-атомів, один з яких при 52,0 м.ч. є
С-атомом уведеної групи –O-CH3. Шість сигналів, що залишилися, безсумнівно, належать залишку глюкуронової кислоти, два з яких однозначно віднесені до карбоксильного атома С-6 (170,2 м.ч.) і до аномірного атома С-1 (95,6 м.ч.). Віднесення сигналів, що залишилися, атомів Н-2–Н-5 та С-2–С-5 було виконано шляхом спільного аналізу набору двовимірних спектрів – COSY (рис. 2.3) й HSQC (рис. 2.4), починаючи з аномірного протона Н-1 при 6,29 м.ч. Таким чином, глікозид 32 є 28-О-в-D-глюкуронопіранозиловим естером хедерагеніну. Наявність в-D-глюкуронопіранозильного залишку по карбоксильній групі аглікону вперше знайдено в природних тритерпенових глікозидах.

Рис. 2.3. Фрагмент спектра COSY глікозиду 32а.

Рис. 2.4. Фрагмент спектра HSQC глікозиду 32a.

2.2.2. Глікозиди 28 та 33. Лужний гідроліз 28 призвів до прогеніну – 3-О-б-L-арабінопіранозиду олеанолової кислоти, а 33 – до хедерагеніну. Отже, 28 є бісдесмозидним глікозидом, а 33 – монодесмозидним, що містить вуглеводний ланцюг тільки по карбоксильній групі аглікону. Обробка глікозидів 28 та 33 емульсином (в-глюкозидазою з насіння розоцвітних, КФ 3.2.1.21), призвела до розщеплення цих глікозидів, що підтверджує наявність в-1>6-типу зв'язку (генціобіозного залишку). Після віднесення сигналів у спектрі ЯМР 13С 28 та 33 для агліконної частини й вуглеводного фрагмента по атому аглікону С-3 (для 28) було знайдено сигнали ще двох гексозних залишків, ідентифікованих як дисахаридний фрагмент <Glc6<Glc (залишок генціобіози), будову якого було додатково підтверджено звичайним аналізом набору двовимірних спектрів (COSY, TOCSY, ROESY, HSQC й HMBC), і в порівнянні з даними літератури. Таким чином, 28 являє собою 28-О-в-генціобіозиловий естер 3-О-б-L-арабінопіранозиду олеанолової кислоти, а 33 –28-О-в-генціобіозиловий естер хедерагеніну.

2.2.3. Глікозид 34. Лужний гідроліз 34 призвів до відомого прогеніну
3-O-в-D-глюкопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозиду хедерагеніну, виділе-ному раніше, наприклад із Fatsia japonica. Хроматографічна поведінка 34 вказувала на вміст додаткового моносахаридного залишку, приєднаного по карбоксильній групі аглікону. Структура глікозиду 34 була підтверджена й аналізом спектрів ЯМР 1Н та 13С. Глікозид 34 являє собою 28-О-в-D-глюкопіранозиловий эфір 3-O-в-D-глюкопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопірано-зиду хедерагеніну.

2.2.4. Глікозиди 29 та 35. Аналіз спектрів ЯМР 1Н та 13С глікозидів 29 та 35 у порівнянні з 5 та 26, відповідно, показав наявність додаткової ацетильної групи, локалізованої по атому С-6 внутрішнього залишку глюкози. Глікозиди 29 та 35 являють собою 28-О-б-L-рамнопіранозил-(14)-О-(6-O-ацетил-в-D-глюкопіранозил)-(16)-О-в-D-глюкопіранозилові естери 3-О-в-D-ксилопірано-зил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозидів олеанолової кислоти й хедерагеніну, відповідно.

2.2.5. Глікозиди 30, 31, 36 та 37. Обробка 30 та 36 ферментним препаратом із гепатопанкреатичного соку виноградного равлика (Helix pomatia), дозволила отримати з них відомі глікозиди 5 та 26, відповідно. Цікаво відзначити, що ці ж продукти були отримані й у результаті ферментолізу глікозидів 31 та 37, оскільки у ферментному препараті окрім суми глюкозидаз містяться й естеразні ферменти, що відщеплюють просторово не утруднені ацильні фрагменти. Для 30, 31, 36 та 37 були виконані повні й однозначні віднесення сигналів у спектрах ЯМР 1Н та 13С як це зазначено вище для 6 та 27. У спектрах ЯМР 13С ідентифікували типові для глікозидів рослин родини Araliaceae трисахаридні фрагменти Glc6Glc4Rha й Glc6(Glc6 OAc)4Rha, приєднані по карбоксильній групі агліконів. Таким чином, 30 та 36 являють собою 28-О-б-L-рамнопіранозил-(14)-в-D-глюкопіранозил-(16)-О-в-D-глюкопіранозилові естери 3-О-в-D-глюкопіранозил-(14)-О-в-D-ксило-піранозил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозидів олеано-лової кислоти й хедерагеніну, відповідно. Глікозиди 31 та 37 – 28-О-б-L-рамнопіранозил-(14)-О-(6-O-ацетил-в-D-глюкопіранозил)-(16)-О-в-D-глюко-піранозилові естери 3-О-в-D-глюкопіранозил-(14)-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозидів олеанолової кис-лоти та хедерагеніну, відповідно.

2.2.6. Глікозиди 38, 39 та 40. Лужний гідроліз 38 призвів до 27, що дозволило попередньо встановити структуру вуглеводного фрагмента по атому аглікону С-3 в 38. В умовах м'якого лужного гідролізу з 38 був отриманий той же прогенін, отже, ацильний фрагмент знаходиться в тетрасахаридному фрагменті по атому аглікону С-3. Для наступного аналізу глікозид 38 був переведений у метиловий естер глікозиду (38а). Після виконання віднесень сигналів агліконної й вуглеводної частини 38a з'ясувалося, що в області спектра від 110 до 170 м.ч. (область ароматичних або олефінових С-атомів) знаходяться ще вісім вуглецевих сигналів. За спектром ЯМР 13С с АРТ-редагуванням три із цих сигналів належать четвертинним, а інші – третинним С-атомам. Більше того, у спектрі ПМР 38a в області сигналів ароматичних або олефінових протонів (від 6 до 8 м.ч.) присутні чотири групи сигналів, що відповідають по інтегральній інтенсивності п'яти протонів. Далі на основі двовимірного спектра HSQC були знайдені й відповідні їм сигнали вуглецевих атомів. Аналіз величин хімічних зсувів сигналів цих С- та Н-атомів, характер розщеплення сигналів відповідних протонів і величина КССВ дозволили зробити висновок, що вони становлять несиметрично заміщений транс-олефіновий фрагмент R–СН=СН–R', причому R' належить четвертинному С-атому карбоксильній групі (при 167,4 м.ч.), а R входить до складу ароматичного кільця, як і ще два, що лишилися, четвертинних С-атоми ацильного фрагмента. Таким чином, у ароматичному кільці присутнє три замінника – залишок акрилової кислоти (-СН=СН-СООН) і два фенольних гідроксили. Для остаточного встановлення взаємного зв'язку цих фрагментів був проаналізований двовимірний спектр HMBC (рис. 2.6). Від сигналу карбоксильного С-атома при 167,4 м.ч. у спектрі HMBC простежено крос-піки з протонами при подвійному зв'язку – слабкий з протоном при 6,63 м.ч. (б-вуглецевий атом відносно карбоксильної групи) і значно більш інтенсивний з протоном при 7,97 м.ч. (в-вуглецевий атом). Тоді однозначно відносяться й раніше знайдені за допомогою спектра HSQC відповідні їм сигнали вуглецевих атомів при 116,1 м.ч. (б-С) і 145,5 м.ч. (в-С). Наявність кросів-піків через три зв'язка від сигналів протонів метоксильних груп (при 3,81 та 3,74 м.ч.) із четвертинними С-атомами, відповідно, при 150,3 і 152,1 м.ч. підтверджує локалізацію груп –O-CH3 у цих атомів і правильність віднесень до атомів С-3' і С-4'. Далі, аналогічно, були простежені усі кореляції в спектрі HMBC, в результаті чого вдалося встановити структуру метильованого ацильного фрагмента, що являє собою залишок (Е)-3-(3,4-диметоксифеніл)-2-пропенової кислоти, інакше транс-3,4-диметокси-коричної кислоти (рис. 2.7).

Рис. 2.6. Фрагмент спектра HMBC глікозиду 38a.

Будова ацильного фрагмента в нативному 38 було встановлено аналізом оглядових спектрів ЯМР 1Н та 13С. Так, у зазначених спектрах 38 відсутні сигнали протонів метоксильних груп (область 3,5–4,0 м.ч.), так само як і відсутні сигнали С-атомів метоксильных груп (область 55–57 м.ч.), отже, це виключає наявність ферулової або ізоферулової кислот і однозначно визначає нативний ацильний фрагмент як залишок транс-кофейної кислоти (рис. 2.8).

Рис. 2.7. Схема знайдених кореляцій для залишку транс-3,4-диметоксикоричної кислоти в спектрі HMBC глікозиду 38а. | Рис. 2.8. Залишок транс-кофейної кислоти глікозидів 38–40.

Залишок транс-кофейної кислоти етерифікує первинноспиртову групу кінцевого залишку глюкози в тетрасахариді, приєднаному по атому аглікону С-3. Таким чином, 38 являє собою 3-О-(6-О-кофеіл-в-D-глюкопіранозил)-(14)-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозид хедерагеніну.

За спектрами ЯМР 13С встановлено, що глікозиди 39 та 40 додатково містять трисахаридні фрагменти Glc6Glc4Rha й Glc6(Glc6 OAc)4Rha, відповідно, приєднані по карбоксильній групі агліконів. Отже, глікозид 39 являє собою 28-О-б-L-рамнопіранозил-(14)-в-D-глюкопіранозил-(16)-О-в-D-глюкопіранозиловий естер 3-О-(6-О-кофеіл-в-D-глюкопіранозил)-(14)-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамнопіранозил-(12)-О-б-L-арабі-нопіранозида хедерагеніну, а 40 – 28-О-б-L-рамнопіранозил-(14)-О-(6-O-ацетил-в-D-глюкопіранозил)-(16)-О-в-D-глюкопіранозиловий естер 3-О-(6-О-кофеіл-в-D-глюкопіранозил)-(14)-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамно-піранозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозида хедерагеніну. Наявність тритерпе-нових глікозидів, етерифікованих залишком транс-кофейної кислоти вперше виявлено в родині Araliaceae.

3. Розподіл тритерпенових глікозидів за органами двох різновидів калопанакса – Kalopanax septemlobum var. maximowiczii та Kalopanax septemlobum var. typicum

Детально вивчив глікозидний склад різних органів двох різновидів калопанакса семилопатного, ми виконали порівняльну оцінку вмісту й розподілу в них глікозидів (табл. 3.1).

Аналіз розподілу глікозидів олеанолової, ехіноцистової кислот і хедерагеніну двох різновидів калопанакса показав, що в корі стебел різновиду K. septemlobum var. maximowiczii містяться виключно глікозиди хедерагеніну. Переважаючими є два бісдесмозидні глікозиди 22 (близько 33% від суми всіх виділених глікозидів кори стебел) і 26 (~45%). У той час як глікозидний склад кори стебел K. septemlobum var. typicum включає глікозиди олеанолової, ехіноцистової кислот та хедерагеніну, причому переважаючим також є 22 (~84%). Вуглеводний фрагмент нового тритерпенового глікозиду 34, виділеного із цього різновиду представлений не типовим для калопанакса дисахаридом Rha>2Ara>, а фрагментом – Glc>2Ara>, характерним для видів родів Polyscias, Cussonia й Fatsia (Araliaceae). Вуглеводні фрагменти по карбоксильній групі аглікона представлені не типовим для родини Araliaceae трисахаридним Glc6Glc4Rha фрагментом, а залишками генціобіози, однієї глюкози або навіть глюкуронової кислоти. Окрім того, у корі стебел обох різновидів калопанакса семилопатного повністю відсутні ацильовані тритерпенові глікозиди, знайдені в листях цих різновидів.

Порівняння вуглеводних фрагментів у глікозидах, виділених із листя обох різновидів показує, що їхні структури повністю ідентичні. Однак у листях різновиду K. septemlobum var. maximowiczii містяться тільки глікозиди хедерагеніну, тоді як у різновиді K. septemlobum var. typicum присутні глікозиди як олеанолової кислоти (~57%), так і хедерагеніну (~43%). У листях
K. septemlobum var. typicum міститься близько 8% ацильованих глікозидів, а в різновиді K. septemlobum var. maximowiczii – ~39%. Більш того, лише з цього різновиду ми виділили 38–40 етеріфіковані залишком транс-кофейної кислоти.

Таблиця 3.1

Розподіл тритерпенових глікозидів за органами двох різновидів
калопанакса – Kalopanax septemlobum var. maximowiczii та
K. septemlobum var. typicum

Глікозид | maximowiczii | typicum | Глікозид | maximowiczii | typicum

1– | St, L, P | 21†– | St

2†– | St | 22 | St, L | St, L, P, S

3– | St, L, P | 23 | L–

4†– | L | 24 | St, L | L, P

5†– | L | 25' | St–

6'– | L | 26 | St, L | L, P, S

7†– | S | 27' | L | L

8'– | S | 28*– | St

9†– | S | 29*– | L

10†– | S | 30*– | L

11†– | St | 31*– | L

12†– | St | 32*– | St

13† | St | St | 33* | St | St

14 | St | St | 34*– | St

15 | St, L | St | 35* | L | L

16†– | St | 36* | St, L | L

17 | St, L | St | 37* | L | L

18 | L– | 38* | L–

19 | St, L | St, L, P, S | 39* | L–

20'– | St | 40* | L–

___________

Примітка: * – нові сполуки;

† – вперше знайдені в калопанаксі;

' – вперше знайдені в родині Araliaceae.

Глікозиди з дисахаридним Rha2Ara і трисахаридним Xyl3Rha2Ara фрагментами по атому аглікону С-3 раніше вже виділялися з калопанакса й з інших видів родів родини Araliaceae, наприклад, родів Hedera і Acanthopanax, а глікозиди з фрагментом Glc4Xyl3Rha2Ara уперше знайдені в рослинах родини Araliaceae. Поряд із цим вуглеводні фрагменти по карбоксильній групі агліконів у глікозидах листя обох різновидів представлені винятково – Glc6Glc4Rha й Glc6(Glc6OAc)4Rha ланцюгами.

У перикарпії плодів і насінні Kalopanax septemlobum var. typicum нами знайдені як глікозиди хедерагеніну, так і олеанолової кислоти. У перикарпії плодів глікозиди хедерагеніну переважають і становлять близько 69%, а в насінні навпроти переважними є глікозиди олеанолової кислоти (~74%). Вуглеводні фрагменти глікозидів із перикарпію плодів виявилися типовими для листя і кори стебел калопанакса. Однак глікозиди насіння 7, 8, 9 та 10 вперше виявлені нами в калопанаксі, раніше ці глікозиди часто виділялися з насіння інших видів родів Hedera й Fatsia (Araliaceae).

Таким чином, дані про розподіл глікозидів по органах двох різновидів і отримані хемотаксономічні висновки з урахуванням істотних зовнішньо-морфологічних розходжень (різновиди калопанакса семилопатного K. septemlobum var. maximowiczii й K. septemlobum var. typicum різняться, насамперед, формою листя – глибоко пальцеворозділені, з шипами на черешках для першої й неглибоко пальцеволопатеві для другої) дозволяють запропонувати підвищити таксономічний ранг цих різновидів до самостійних видів роду Kalopanax і використати вже існуючі синонімічні назви – Kalopanax pictum (Thunb.) Nakai, для різновиду K. septemlobum var. maximowiczii й Kalopanax septemlobum (Thunb.) Koidz. для різновиду K. septemlobum var. typicum.

4. Біологічна активність тритерпенових глікозидів із калопанакса семилопатного

Для низки монодесмозидних тритерпенових глікозидів, виділених із калопанакса семилопатного – 1, 4, 6, 7, 9, 11, 19, 24, 27, 34а, ми вивчили протигрибкову (щодо музейного штаму Candida albicans) і гемолітичну активності (табл. 4.1).

У результаті проведених експериментів встановлено, що найбільш перспективними для подальших більш поглиблених досліджень є глікозиди 1, 11 та 19, для яких значення мінімальної інгібуючої концентрації склало 69–102 мкмоль/л. Це навіть менше, ніж діючі концентрації поширених у цей час протикандидозних препаратів і нової сполуки – лупінінового естеру
2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (269 мкмоль/л). Наявність додаткової гідроксильної групи в агліконах (ехіноцистова кислота й хедерагенін) приводить до незначного зниження гемолітичної активності в порівнянні з глікозидами олеанолової кислоти. Так само встановлено, що глікозиди, що містять дисахаридний фрагмент по атому аглікону С-3, більш активні, ніж глікозиди, що містять три чи більше мносахаридних залишків. Глікозид 34а проявив найнижчу гемолітичну активність, очевидно це пов'язане з тим, що дисахарид Glc2Ara має іншу природу кінцевого моносахариду в порівнянні з вищеописаними біозидами. У той же час в експериментах in vitro низка монодесмозидних глікозидів, що містять один або два цукрових залишків (7, 9 та 34а), не виявляли протигрибкової активності в діапазоні досліджених концентрацій, хоча вони й проявляли невисоку гемолітичну активність.

Таблиця 4.1

Мінімальні інгібуючі концентрації (МІК) тритерпенових глікозидів з Kalopanax septemlobum у відношенні Candida albicans й концентрації, що викликають 50%-вий гемоліз (НС50) еритроцитів

Сполука | Структура глікозиду | МІК,

мкмоль/л | НС50,

мкмоль/л

1 | Rha2Ara | 3 OleanA 28 | H | 69 | 3

11 | Rha2Ara | 3 EchinA 28 | H | 82 | 5

19 | Rha2Ara | 3 Hed 28 | H | 102 | 6

4 | Xyl3Rha2Ara | 3 OleanA 28 | H | 161 | 9

24 | Xyl3Rha2Ara | 3 Hed 28 | H | 173 | 10

6 | Glc4Xyl3Rha2Ara | 3 OleanA 28 | H | 194 | 8

27 | Glc4Xyl3Rha2Ara | 3 Hed 28 | H | 206 | 10

7 | Glc | 3 OleanA 28 | H– | 12

9 | Glc2Glc | 3 OleanA 28 | H– | 10

34а | Glc2Ara | 3 Hed 28 | H– | 20

"Ламізил"* | 220–

"Saponin"– | 8

___________

Примітка: ‘*’ – МІК вказана за даними літератури;

Таким чином, проведені експерименти добре узгодяться з ранніми дослідженнями й висновками про необхідність наявності у складі глікозидів вільної карбоксильної групи для прояву їхньої біологічної дії, а так само про те, що наявність додаткових вільних ОН-груп в агліконі й/або збільшення довжини вуглеводного фрагмента веде до зниження активності глікозиду. Більш того, простежується явний зв'язок між протигрибковою та гемолітичною активностями, що також добре узгодиться з даними літератури.

ВИСНОВКИ

1. Методами хімічного, біохімічного аналізу та спектроскопії ЯМР встановлено будову 40 глікозидів в-аміринового ряду, виділених з різних органів (стебел, листя, перикарпію плодів і насіння) двох різновидів калопанакса семилопатного (Kalopanax septemlobum
var. maximowiczii та K. septemlobum var. typicum), 13 з яких виявилися новими, а 16 – вперше знайдені в калопанаксі (5 з котрих – в родині Araliaceae).

2. Показано, що низка нових тритерпенових глікозидів у своєму складі містить транс-кофейну кислоту та являє собою 3-О-(6-О-кофеіл-в-D-глюкопіранозил)-(14)-О-в-D-ксилопіранозил-(13)-О-б-L-рамнопіра-нозил-(12)-О-б-L-арабінопіранозид хедерагеніну та його 28-О-б-L-рамнопіранозил-(14)-в-D-глюкопіранозил-(16)-О-в-D-глюкопірано-зиловий і 28-О-б-L-рам-нопіранозил-(14)-О-(6-O-ацетил-в-D-глюко-піранозил)-(16)-О-в-D-глюко-піранозиловий естери хедерагеніну.

3. Методами одно- й двовимірної спектроскопії ЯМР доведено будову тритерпенового глікозиду, який містить в-D-глюкуронопіранозильний залишок по карбоксильній групі аглікону.

4. Проведено порівняльну оцінку розподілу і вмісту глікозидів у різних органах двох різновидів калопанакса семилопатного. Встановлено принципові фітохімічні розбіжності між ними.

5. Запропоновано підвищити таксономічний ранг двох різновидів калопанакса семилопатного до самостійних видів роду Kalopanax на підставі отриманих хемотаксономічних висновків з урахуванням істотних зовнішньо-морфологічних розходжень цих різновидів.

6. Встановлено високу гемолітичну й протигрибкову (щодо Candida albicans) активності для низки тритерпенових глікозидів, виділених із калопанакса семилопатного.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Панов Д.А., Гришковец В.И. Тритерпеновые гликозиды разновидностей калопанакса семилопатного Kalopanax septemlobum // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия “Биология, химия”. – 2005. – Т. 18 (58), № 2. – С. 58-61. (Виділення глікозидів та встановлення їх будови).

2. Гришковец В.И., Панов Д.А., Качала В.В., Шашков А.С. Тритерпеновые гликозиды Kalopanax septemlobum I. Гликозиды А, В, C, F, G1, G2, I2, H и J из листьев Kalopanax septemlobum var. maximowiczii, интродуцированного в Крыму // Химия природ. соедин. – 2005. – № 2. – С. 156-159. (Участь у виділенні та хроматографічному поділі глікозидів, встановленні їх будови).

3. Панов Д.А., Гришковец В.И., Качала В.В., Шашков А.С. Тритерпеновые гликозиды Kalopanax septemlobum II. Гликозиды E, K, и L из листьев Kalopanax septemlobum var. maximowiczii, интродуцированного в Крыму // Химия природ. соедин. – 2005. – № 3. – С. 260-262. (Виділення суми глікозидів, проведення гідролізів, участь в інтерпретації спектральних даних).

4. Гришковец В.И., Панов Д.А., Палий Е. А., Качала В.В., Шашков А.С. Тритерпеновые гликозиды Kalopanax septemlobum III. Гликозиды D2, I1 и K1 из листьев Kalopanax septemlobum var. maximowiczii, интродуцированного в Крыму // Химия природ. соедин. – 2005. – № 3. – С. 263-267. (Участь у виділені суми глікозидів, поділі та очищенні, проведення гідролізів та ТШХ, участь в інтерпретації спектральних даних).

5. Панов Д.А., Гришковец В.И. Тритерпеновые гликозиды Kalopanax septemlobum IV. Гликозидный состав плодов растения, интродуцированного в Крыму // Химия природ. соедин. – 2005. – № 4. – С. 388-389. (Виділення глікозидів, встановлення їх будови).

6. Панов Д.А., Гришковец В.И. Тритерпеновые гликозиды Kalopanax septemlobum V. Гликозиды стеблей Kalopanax septemlobum
var. maximowiczii и Kalopanax septemlobum var. typicum // Химия природ. соедин. – 2005. – № 4. –