КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ПРИЛУЦЬКА СВІТЛАНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 577.3+616.006+546.26.043

БІОХІМІЧНІ ЕФЕКТИ ФУЛЕРЕНІВ С60 ТА С60-КОМПОЗИТІВ

У КЛІТИНАХ РІЗНИХ ТИПІВ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Кучмеровська Тамара Муратівна,

Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів;

доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології

та радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України,

завідувач відділу радіобіології.

Захист відбудеться „ 24 ” грудня 2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий „ 20 ” листопада 2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Механізми підтримання прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в біологічних системах та наслідки її порушення привертають пильну увагу дослідників. Від рівня утворюваних у клітині активних форм кисню (АФК) (, , , Н2О2) залежать такі важливі процеси, як спрямування на шлях росту/диференціації, формування адаптаційної відповіді на дію зовнішніх чинників, вмикання програми загибелі для вибіркового видалення ушкоджених клітин. Вважається встановленим, що значне підвищення внутрішньоклітинної концентрації АФК призводить до розвитку окисного стресу та ушкодження компонентів клітини, хоча причинно-наслідкові зв’язки між цими процесами остаточно не з’ясовано. Припускають, що окисний стрес може виконувати роль індуктора безрецепторного шляху апоптозу, спричиняючи порушення структурно-функціонального стану мітохондрій та неконтрольоване посилення генерації АФК в електрон-транспортному ланцюгу, яке передує активації каспаз (Zhivotovsky B., 2005; Orrenius S., 2007).

Спрямований вплив на залежні від продукції АФК сигнальні шляхи вважається більш перспективним способом пригнічення пухлинного росту, ніж терапія на генетичному рівні, оскільки пухлинні клітини характеризуються значною нестабільністю геному. Для індукції загибелі онкотрансформованих клітин та подолання їх стійкості до лікарських препаратів перспективною є комбінована терапія, яка ґрунтується на поєднанні дії препаратів, що ушкоджують пухлинні клітини, не впливаючи на нормальні клітини.

На сьогодні значна увага приділяється фулеренам С60, як можливим ефективним регуляторам оксидантної рівноваги у біологічних системах. Фулерени С60 належать до нової алотропної форми вуглецю. Це гідрофобні молекули майже сферичної форми діаметром 1 нм з унікальними фізико-хімічними властивостями. З одного боку, молекули С60 характеризуються значним відновлювальним потенціалом і здатні вловлювати вільні радикали (Dugan L., 2001; Satoh M., 2006; Sun T., 2006). З іншого боку, при дії ультрафіолетового та видимого випромінювання молекула С60 переходить у збуджений стан, а при зворотньому переході у вихідний стан зі 100% ефективністю передає енергію на молекулярний кисень з утворенням синглетного кисню (1О2) (Da Ros T., 1999). За наявності у середовищі донорів електронів (наприклад, НАДН) збуджений фулерен може перетворюватись на аніон-радикал, який передає електрони на О2 з утворенням супероксид-аніону , або на ароматичні кільця третинних амінів, зокрема, гуанінових основ у складі нуклеїнових кислот, дестабілізуючи їх структуру (Yamakoshi Y., 1996).

Незважаючи на те, що у низці робіт (Ueng T., 1997; Huang Y., 1998; Lu C., 1998) продемонстровано біологічні ефекти фулеренів С60 та їх похідних, зокрема, вплив на сигнальні системи клітини, активність окремих ензимів, процеси ПОЛ тощо, однак їх здатність до продукції АФК у біологічних системах після опромінення та вплив фотозбуджених фулеренів С60 на біохімічні процеси на рівні плазматичної мембрани, мітохондрій і ядра є невстановленими.

Перешкодою у дослідженні впливу фулеренів С60 на клітинні процеси є їх нерозчинність у водному середовищі. Перспективним підходом до запобігання агрегації молекул С60 та підвищення їх гідрофільності є створення С60-композитів на основі сферичних наночастинок амінопропілаеросилу, який є хімічно-інертним матеріалом з амфіфільною поверхнею (Чуйко А., 2003; Golub O., 2003). До складу таких композитів можна також вводити структури, які здатні вловлювати світло (наприклад, порфірин, антраценаль) та підвищувати фотосенсибілізувальний ефект фулеренів С60.

У зв’язку з цим актуальним є порівняльне дослідження біохімічних ефектів фулеренів С60 і С60-вмісних композитів у контролі та за умови фотозбудження С60 у клітинах з нормальним та онкотрансформованим геномом.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках держбюджетної теми “Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції” (№ д/р 0106U005750) та теми “Біохімічні дослідження композитів на основі фулеренів та інших ароматичних поверхонь для розвитку біонанотехнології” (№ д/р 0103U003701). Робота підтримана грантом INTAS для молодих вчених “Супрамолекулярні композити на основі фулеренів для біонанотехнології” (№ 05-109-4328).

Мета і завдання роботи. Мета роботи - здійснити порівняльну оцінку біохімічних ефектів фулеренів С60 та С60-композитів у нормальних (тимоцити) та трансформованих клітинах (асцитна карцинома Ерліха і лейкоз L1210) у контролі та після опромінення в УФ-видимому діапазоні.

Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання:

- дослідити взаємодію фулеренів С60 з бішаровими ліпідними мембранами (БЛМ);

- для оцінки токсичності фулеренів С60 (10-6- 5·10-5 М) і С60-композитів з’ясувати їх вплив на накопичення ТБК-активних продуктів у гомогенатах тканин, стійкість еритроцитів до гемолізу та кількість життєздатних клітин у суспензії;

- визначити швидкість продукування АФК у розчині та у клітинних суспензіях за присутності фулеренів С60 і С60-композитів після опромінення в УФ-видимому діапазоні;

- дослідити вплив фулеренів С60 та С60-композитів на інтенсивність ПОЛ у клітинах у ранній період після опромінення;

- за результатами МТТ-тесту з’ясувати динаміку активності мітохондріального електрон-транспортного ланцюга в клітинах, опромінених за присутності фулеренів С60 та С60-композитів;

- за ступенем фрагментації ДНК оцінити віддалені наслідки впливу фотозбуджених фулеренів С60 та С60-композитів на клітини.

Об’єкт дослідження – біохімічні ефекти фулеренів С60 у контролі та після опромінення в УФ-видимому діапазоні у нормальних та у трансформованих клітинах.

Предмет дослідження – провідність штучних бішарових ліпідних мембран, гемоліз еритроцитів, продукування АФК, накопичення продуктів ПОЛ, активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, фрагментація ДНК, життєздатність клітин.

Методи дослідження – світлова мікроскопія, реєстрація трансмембранної провідності БЛМ, реєстрація АФК методом ЕПР, спектрофотометричні методи реєстрації кінетики гемолізу еритроцитів, визначення вмісту низькомолекулярних фрагментів ДНК, ТБК-активних продуктів, дієнових кон’югатів, МТТ-тест, флуориметричний метод оцінки вмісту шиффових основ.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне дослідження біохімічних ефектів немодифікованих фулеренів С60 та С60-вмісних композитів на основі амінопропілаеросилу у тимоцитах та у трансформованих клітинах (асцитна карцинома Ерліха та лейкоз L1210). Виявлено, що фулерени С60 (10-5 М) як у вільному стані, так і у складі композитів не впливають на кількість життєздатних клітин обох типів, на стійкість еритроцитів до гемолізу та на накопичення ТБК-активних продуктів у гомогенатах тканин, тобто не виявляють негативних біологічних ефектів. Показано, що у клітинних суспензіях після опромінення у діапазоні л = 320 - 580 нм за присутності фулеренів С60 посилюється продукція активних форм кисню. Найбільш ефективними продуцентами АФК є фулерени С60 у складі антраценальвмісного композиту.

Вперше показано вибірковість ушкоджувальної дії фотозбуджених фулеренів С60, яка виявляється у пухлинних клітинах і відсутня у тимоцитах. Вперше доведено, що біохімічні механізми ушкоджувальної дії фотозбуджених фулеренів С60 полягають у спричиненому АФК посиленні реакцій вільнорадикального переокиснення у мембранах, порушенні структурно-функціонального стану мітохондрій та ушкодженні структури ДНК трансформованих клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи розширюють уявлення про біохімічні механізми дії фулеренів С60 у контролі та після їх фотозбудження і сприяють розробці методів контрольованого продукування АФК, направленого на індукцію окисного стресу та загибель пухлинних клітин. Отримані дані свідчать, що створення С60-вмісних композитів на основі амінопропілаеросилу є перспективним напрямком посилення фотосенсибілізувальних ефектів фотозбуджених фулеренів С60 у клітинах.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук, аналіз та оцінку наукової літератури за темою дисертаційної роботи, виконано експериментальні дослідження та інтерпретацію отриманих результатів, підготовлено матеріали до друку. Дані розділу 3.1 отримано за участі к.б.н., н.с. О. Я. Шатурського (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ), розділів 3.4 та 3.7 – за участі д.б.н., ст.н.с. А.П. Бурлаки (Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ) та опубліковано у спільних роботах. Основні теоретичні та експериментальні ідеї було розроблено за участі наукового керівника д.б.н., проф. О.П. Матишевської.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи були представлені на: VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); 2-й Міжнародній конференції “Conference for Young Scientists, PhD-Students and Students on Molecular Biology and Genetics” (Kyiv, 2003); First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004); І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004); 7th Biennial International Workshop “Fullerenes and Аtomic Сlusters” (St. Petersburg, Russia, 2005), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006), Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology (Kyiv, 2006).

Публікація матеріалів. За темою дисертаційної роботи опубліковано 5 статей у фахових журналах і 7 тез у збірниках матеріалів вітчизняних та міжнародних конференцій і з’їздів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 125 сторінках друкованого тексту, містить 21 рисунок та 7 таблиць. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел (214 посилань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Тимоцити виділяли з тимусу щурів лінії Вістар вагою 120-150 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тимус (200-300 мг) перетирали через нейлонову сітку у буфер (мМ): Na2HPO4 - 3, KCl - 5, NaCl - 120, CaCl2 - 1, глюкоза - 10, MgSO4 - 1, NaHCO3 - 4, HEPES - 10, рН 7,4. Трансформовані клітини отримували шляхом внутрішньо-черевних перещеплень мишам відповідних штамів клітин від тварин донорів. Клітини асцитної карциноми Ерліха (АКЕ) перевивали безпородним мишам вагою 20 г, а клітини лейкозу L1210 - мишам гібридів F1DBA2, тварин утримували на стандартному раціоні віварію Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Є. Кавецького. При роботі з тваринами дотримувались Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин.

Інкубацію клітин (2-4?106 кл/мл) здійснювали у термостаті при 370 С у середовищі RPMI 1640, яке містило 5% ембріональну сироватку, стрептоміцин (10 мкг/мл) та пеніцилін (10 од/мл). Клітини інкубували у контролі та після опромінення без добавок, або у присутності фулеренів С60 чи С60-композитів. Кількість клітин підраховували у камері Горяєва після профарбовування 0,4 % розчином трипанового синього.

Фулерени С60 (ступінь очищення 95%) та їх колоїдні розчини (5?10-4 М) було отримано у Технічному університеті м. Ільменау (ФРН) під керівництвом проф. П. Шарфа (Scharff Р., 2002).

клітин фулеренів С60 та С60-композитів концентрація у пробі амінопропілаеросилу становила 0,02%, С60 - 10-5 М, антраценалю - 3•10-4 М.

Для фотозбудження фулеренів С60 проби опромінювали у скляних пробірках ртутною лампою ДРТ-1000 потужністю 24 кВт. Фулерени С60 або С60-композити вносили до клітинних суспензій за 5 хв до опромінення. Експериментально було підібрано експозиційні умови (л = 320 - 580 нм, тривалість - 2 хв, відстань - 5 см, інтенсивність світлового випромінювання – 6 кВт/м2 (1020 фотонів/м2?с)), за яких опромінення не впливало на життєздатність тимоцитів, клітин АКЕ і L1210 упродовж 24 год та не спричиняло змін у величинах досліджуваних біохімічних показників (вміст продуктів ПОЛ, швидкість відновлення МТТ, фрагментація ДНК).

Провідність штучних бішарових ліпідних мембран оцінювали за величиною трансмембранного струму, який реєстрували на приладі ХУ 307-1 (Росія). Планарні мембрани формували шляхом нанесення суміші фосфатидилхоліну та холестеролу (1:1) у гептані на отвір тефлонової камери. Експерименти проводили при 22 - 240 С у розчині 10 мМ Трис-НCl (рН 7,4) та 100 мМ NaCl, який симетрично омивав мембрану (Шатурский Я., 2003).

Стійкість еритроцитів щурів до гемолізу оцінювали за параметрами еритрограм та індексом стійкості (Терсков И., 1957). Еритроцити, отримані з гепаринізованої крові щурів лінії Вістар, інкубували протягом 1 год при 250 С, після чого додавали HCl до кінцевої концентрації 0,001 н. Вимірювання кінетики гемолізу проводили протягом 2 хв через кожні 10 с на спектрофотометрі Scinco (ФРН) при = 630 нм.

Реєстрацію АФК здійснювали методом ЕПР з використанням спінового вловлювача 1-гідрокси-2,2,6,6-тетраметил-піпередину-4-ОН (2·10-3 М) (Бурлака А., 1994). Вміст супероксидних аніонів у пробах визначали за відновленням нітросинього тетразолію (Чевари С., 1985).

Активність електрон-транспортного ланцюга оцінювали за швидкістю відновлення МТТ (3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифеніл тетразолій бромід). Реакцію проводили у 96-лунковому планшеті при 370 С. Вміст утвореного формазану визначали на спектрофотометрі ІФКО–2 (АВОТЕК, Росія) при = 570 нм (Carmichael J., 1987).

Вміст шиффових основ та дієнових кон’югатів визначали після обробки клітин сумішшю гептан/ізопропіловий спирт (1:1). Гептанову фазу відбирали для визначення вмісту шиффових основ на флуориметрі RF-510, Shimadzu (Японія) (збуд = 360 нм і еміс = 420 нм) (Колесова О., 1984). Для визначення дієнових кон’югатів до гептанової фази додавали 96% етиловий спирт (1:5) та вимірювали поглинання на спектофотометрі Scinco (ФРН) при =233 нм (Гаврилов В., 1988). Накопичення ТБК-активних продуктів у гомогенатах печінки та мозку визначали за інтенсивністю спонтанного, а у суспензіях клітин - за інтенсивністю спонтанного та неферментативного Fe2+/аскорбат-залежного переокиснення. Аліквоту гомогенату або суспензії клітин (5 мг білка у пробі) переносили у 0,025 М трис-HCl-буфер (pH 7,4), який містив 0,175 М KCl, та інкубували протягом 30 хв при 370 С. Вміст ТБК-активних продуктів оцінювали на спектрофотометрі Scinco (ФРН) за густиною оптичного поглинання при л = 532 нм, як описано у (Стальная И., 1977).

Кількість високомолекулярної та фрагментованої ДНК у клітинах визначали з використанням дифеніламінового реактиву за методом Бартона (Burton К., 1956). Вміст полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) визначали після лізису клітин у буфері, який містив (мМ): ЕДТА –10, трис-НСІ – 10, рН 7,4, 0,5% тритон Х-100.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский М., 1981). Розрахунки та побудову графіків виконували на комп’ютері з використанням прикладних програм „Microsoft Excel 98” та “Origin 7.0”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Взаємодія фулеренів С60 з бішаровою ліпідною мембраною. Взаємодія фулеренів С60 з клітинними мембранами є однією з важливих умов проявлення їх біологічної дії. Молекули фулеренів С60 характеризуються гідрофобними властивостями, завдяки чому мають виявляти спорідненість до ліпідних компонентів мембран. Мембранотропну дію фулеренів С60 досліджували у діапазоні концентрацій 10-7-10-5 М у модельних експериментах з використанням планарної бішарової ліпідної мембрани (фосфатидилхолін:холестерол).

Внесення фулеренів С60 у концентрації 10-7 М у буфер, що омиває цис-сторону мембрани, не спричиняло зміни мембранної провідності, а у концентрації 10-6 М призводило до її незначного тимчасового посилення (рис. 2, 1). Проте при збільшені концентрації фулеренів С60 до 10-5 М мембранна провідність значно зростала - до величини 600 пС (рис. 2, 2).

Рис. 2. Зростання транс-мембранної провідності після аплікації фулеренів С60 з цис–сторони бішарової ліпідної мембрани: 1 - 10-6 М С60; 2 - 10-5 М С60

Отже, фулерени С60 у концентрації 10-5 М здатні проникати у БЛМ, порушуючи структурну впорядкованість ліпідного бішару, внаслідок чого зростає його проникність для іонів буферного розчину.

Мембранотропність фулеренів С60 свідчить про можливість їх застосування як модуляторів біохімічних процесів у клітинах, зокрема, як фотосенсибілізаторів для індукції загибелі пухлинних клітин. Однак, для цього має бути встановлений діапазон концентрацій, за яких фулерени С60 не виявляють негативних біологічних ефектів у нормальних клітинах, але які в той же час є достатніми для того, щоб при фотозбуджені фулеренів С60 відбувалась продукція АФК на рівні, необхідному для ініціації ушкодження пухлинних клітин.

Дослідження біологічних ефектів фулеренів С60 залежно від їх концентрацій. Цитотоксичність фулеренів С60. Для з’ясування залежності біологічних ефектів фулеренів С60 від їх концентрацій було обрано діапазон 5·10-6 - 5·10-5 М. Цитотоксичність фулеренів С60 та С60-вмісних композитів на клітинному та тканинному рівнях оцінювали за такими показниками їх біологічної дії, як вплив на інтенсивність ПОЛ, зокрема, на накопичення малонового діальдегіду, що здатен виявляти мутагенні ефекти, гемолітична активність та вплив на життєздатність тимоцитів, клітин L1210 та АКЕ у суспензії.

Об’єктом дослідження впливу фулеренів С60 на процеси вільнорадикального окиснення було обрано гомогенати печінки та мозку – тканин, які характеризуються високим рівнем накопичення продуктів ПОЛ. Показано, що за присутності у середовищі інкубації 5·10-5 М С60 вміст накопичених упродовж 1 год ТБК-активних продуктів достовірно підвищувався у гомогенаті печінки (16,8 ± 0,7) порівняно з контролем (13,5 ± 0,8 нмоль/мг білку), хоча у гомогенаті мозку такого ефекту виявлено не було.

Результати дослідження впливу фулеренів С60 на стійкість еритроцитів до гемолізу представлено на рис. 3. Встановлено, що за умови преінкубації еритроцитів щура у присутності 510-5 М С60 (рис. 3 А, крива 4) процес гемолізу прискорювався - час максимального гемолізу скорочувався до 40 с, частка гемолізованих у цей період еритроцитів зростала до 28% порівняно з 14% у контролі, індекс стійкості знижувався (0,77 ± 0,06) порівняно з контролем (1,00 ± 0,10).

Рис. 3. Залежність стійкості еритроцитів щура від часу гемолізу. А - Еритроцити були преінкубовані без добавок (1) або у присутності 5?10-6 М (2), 1?10-5М (3) та 5?10-5 М (4) фулеренів С60. Б - Еритроцити були преінкубовані без добавок (1) або у присутності С60-композиту-1 (2) та С60-композиту-2 (3)

У випадку зниження концентрації фулеренів С60 у середовищі до 10-6 - 10-5 М не було виявлено їх негативного впливу на досліджувані процеси, а також на кількість життєздатних клітин упродовж 24 год.

Принциповим залишається питання щодо здатності фулеренів С60 продукувати АФК у біологічному середовищі. Як відомо, фулерени та їх похідні здатні продукувати АФК за умови опромінення в УФ ділянці спектру (200-300 нм) (Lu С., 1998; Rancan F., 2002).

Продукування АФК фотозбудженими фулеренами С60 у розчинах. Для того щоб підібрати умови фотозбудження фулеренів С60, були проаналізовані їх спектри поглинання за концентрацій 10-6-10-4 М у водному розчині. Найбільш інтенсивні смуги поглинання виявлено у діапазоні УФ (220 та 265 нм). Однак, такому УФ-опроміненню властивий ушкоджувальний вплив на біологічні об’єкти, ступінь якого корелює з кумулятивною дозою УФ (Young А., 1990). Оскільки в спектрах поглинання фулеренів С60 виявлено також смуги з максимумами у діапазоні ближнього УФ (345 нм) та видимого світла (450 та 600 нм), не виключено, що молекули С60 можуть переходити у збуджений стан при дії випромінювання у цьому діапазоні. Для перевірки цього припущення методом ЕПР з використанням спінової мітки з високою спорідненістю до синглетного кисню та супероксидного аніон-радикалу було досліджено продукування АФК у водному розчині фулеренів С60 за умови опромінення у діапазоні = 320 - 580 нм.

Швидкість утворення АФК фотозбудженими фулеренами С60 становила 1,1 0,9, 3,2 0,28 та 10,4 1,7 нмоль/хв за концентрацій 10-6, 10-5 та 10-4 М відповідно. Згідно з цими даними, підвищення на порядок концентрації фулеренів С60 у водному розчині не призводило до значного посилення продукції АФК. Ефективність продукування АФК може знижуватись внаслідок агрегації молекул С60, які утворюють кластери. Тому з метою оптимізації введення фулеренів С60 у водне середовище, запобігання їх агрегації та посилення фотосенсибілізувальної здатності, фулерени С60 були введені до складу композитів.

Швидкість продукування АФК у водному розчині за умови опромінення С60-композиту-1 та С60-композиту-2 становила 6,3 0,2 та 11,0 0,4 нмоль АФК/хв відповідно, тобто підвищувалась приблизно удвічі, якщо фулерени С60 було приєднано до поверхні амінопропілаеросилу, і утричі, якщо до складу композиту було введено антраценаль.

З використанням модельної донор-акцепторної системи НАДН-феназинметасульфат було показано, що за умови додавання НАДН у середовище інкубації продукування супероксидних аніонів у присутності С60-композитів після опромінення посилюється. Отже, молекули С60 у складі композитів здатні продукувати як синглетний кисень, так і супепроксидний аніон-радикал.

Подальші дослідження були спрямовані на обґрунтування доцільності використання С60-композитів для продукування АФК у біологічних системах.

Цитотоксичність С60-композитів та їх вплив на швидкість продукування АФК у клітинних суспензіях після опромінення. За умови внесення у середовище інкубації С60-композиту-1 рівень накопичених ТБК-активних продуктів у гомогенатах печінки та мозку не змінювався, внесення С60-композиту-2 у середовище інкубації незначно посилювало накопичення ТБК-активних продуктів, такий ефект спостерігався лише у гомогенаті печінки (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст ТБК-активних продуктів (нмоль/мг білка) у гомогенатах печінки та мозку щура за інкубації у присутності С60-композитів (M±m, n=6)

Умови експерименту | Гомогенат печінки | Гомогенат мозку

Базальний вміст (без інкубації) | 2,4 ± 0,2 | 3,5 ± 0,4

Спонтанне накопичення (інкубація, 60 хв) | 13,5 ± 0,8 | 8,1 ± 0,7

Добавки:

С60–композит-1

С60–композит-2 |

14,3 ± 1,1

15,9 ± 0,9* |

8,5 ± 1,0

9,0 ± 0,7

*Р<0,05 порівняно з пробою, інкубованою без добавок

Тут і далі: за умови внесення фулеренів С60 та С60-композитів у середовище інкубації концентрація фулеренів С60 у пробі становила 10-5 М

За умови преінкубації еритроцитів у присутності С60-композиту-1 не спостерігалося впливу на параметри гемолізу еритроцитів, у присутності С60-композиту-2 кількість гемолізованих еритроцитів зростала (з 22 до 28 % від загального вмісту), проте індекс стійкості достовірно не змінювався (0,90 ± 0,09) порівняно з контролем (1,00 ± 0,10) (рис. 3 Б, крива 3).

Внесення С60-композитів до середовища інкубації тимоцитів, клітин асцитної карциноми Ерліха (АКЕ) та лейкозу L1210 не впливало на кількість життєздатних клітин у суспензії упродовж 24-годинної інкубації. Одержані результати вказують на відсутність цитотоксичних ефектів досліджуваних С60-композитів.

Оскільки ефективність продукування АФК фотозбудженими фулеренами С60 та С60-композитами у водних розчинах і у біологічному середовищі може бути різною, досліджували швидкість продукування АФК у суспензіях клітин різних типів за умови опромінення (табл. 2).

Швидкість генерації АФК в опромінених суспензіях тимоцитів, клітин АКЕ та L1210 у присутності фулеренів С60 зростала удвічі порівняно з контролем, а за присутності С60-композиту-1 цей показник зростав ще більшою мірою - у 2,3, 4,4 та 4,6 разів відповідно. Найбільш значне посилення продукції АФК було зафіксовано у випадку опромінення суспензії трансформованих клітин (АКЕ та L1210) за присутності С60-композиту-2 - у 5,1 та у 5,6 разів відповідно.

Таблиця 2

Швидкість продукування АФК у клітинних суспензіях та життєздатність клітин, опромінених у присутності фулеренів С60 та С60-композитів (Mm, n=6)

Умови експерименту |

нмоль АФК/хв106 кл | Життєздатність клітин (%) через 24 год інкубації

Суспензія тимоцитів | 2,3 0,2 | 97 6

С60

С60-композит-1

С60-композит-2 | 4,3 0,3*

5,4 0,3*

7,8 0,4* | 100 3

90 5

88 3

Суспензія клітин L1210 | 1,2 0,1 | 98 2

С60

С60-композит-1

С60-композит-2 | 2,6 0,2*

5,5 0,6*

6,8 0,7* | 88 ± 3

77 6*

71 4*

Суспензія клітин АКЕ | 1,4 0,1 | 100 5

С60

С60-композит-1

С60-композит-2 | 3,0 0,2*

6,1 0,4*

7,2 0,2* | 80 6*

71 5*

66 7*

*Р<0,05 порівняно з відповідною неопроміненою пробою, що містила фулерени С60 або С60-композити

АФК, які продукуються за умови фотозбудження фулеренів С60, можуть негативно впливати на життєздатність клітин. Для перевірки цього припущення було оцінено кількість життєздатних клітин у суспензіях через 24 год інкубації, опромінених у присутності фулеренів С60 або С60-вмісних композитів. За таких умов кількість життєздатних тимоцитів не змінювалася порівняно з контролем, тоді як трансформованих клітин – знижувалася (табл. 2). За присутності С60-композиту-1 та С60-композиту-2 таке зниження складало відповідно 29 та 34% у суспензії клітин АКЕ, та 23 і 29% - у суспензії клітин L1210. Найбільший ушкоджувальний ефект виявлено після опромінення пухлинних клітин за присутності С60-композиту-2, що свідчить про посилення фотосенсибілізувальних властивостей цього композиту внаслідок введення антраценалю до його складу.

У літературі є дані, згідно з якими похідні фулеренів при дії УФ-опромінення проявляють цитотоксичні ефекти у суспензіях клітин різних типів. Так, виявлено ушкоджувальну дію фотозбуджених фулеренів С60 на клітини СНО АА8 (Kamat J., 2000), клітини лінії Jurkat (Т-лімфоцити) (Rancan F., 2002) та макрофаги мишей лінії RAW 26,47 (Chen Y., 2004).

Для з’ясування можливих механізмів виявленої ушкоджувальної дії фотозбуджених фулеренів С60 досліджували їх вплив на біохімічні показники метаболічного стану клітин.

Вплив фотозбуджених фулеренів С60 та С60-композитів на біохімічні показники метаболічного стану клітин різних типів. Накопичення продуктів ПОЛ у клітинах. Накопичення продуктів ПОЛ у клітинах упродовж їх 1-годинної інкубації оцінювали за такими показниками, як вміст первинних (дієнових кон’югатів), вторинних (ТБК-активних метаболітів реакцій неферментативного Fe2+/аскорбат-залежного переокиснення) та кінцевих (шиффових основ) продуктів (рис. 4).

Рис. 4. Вміст дієнових кон’югатів (А), ТБК-активних продуктів (Б) та шиффових основ (В) у клітинах через 1 год після опромінення у присутності фулеренів С60 або С60-композитів

*Р?0,05 порівняно з відповідною неопроміненою пробою, що містила фулерени С60 або С60-композити

У тимоцитах не виявлено змін у накопиченні дієнових кон’югатів та шиффових основ за інкубації після опромінення у присутності фулеренів С60 та С60-композиту-1 (рис. 4 А, В), хоча у пробах, що містили С60-композит-2, вміст ТБК-активних продуктів неферментативного ПОЛ підвищувався на 25% (рис. 4 Б).

У пухлинних клітинах спостерігалась більш значна інтенсифікація процесів ПОЛ, спричинена дією фотозбуджених фулеренів С60. Так, за інкубації клітин L1210, опромінених у присутності С60-композиту-2, виявлено підвищення вмісту як первинних, так і вторинних продуктів ПОЛ, хоча вміст шиффових основ залишався на рівні контролю (рис. 4 А, Б, В). Значне зростання вмісту кінцевих продуктів ПОЛ (шиффових основ) на фоні зниження вмісту первинних продуктів (дієнових кон’югатів) відбувалось у клітинах АКЕ (рис. 4 А, В). Ці зміни мали місце після фотозбудження як немодифікованих С60, так і С60 у складі обох композитів.

Отже, упродовж інкубації після опромінення за присутності фулеренів С60 у клітинах посилюється накопичення продуктів ПОЛ, найбільший прооксидантний ефект виявлено у випадку опромінення фулеренів С60 у складі композиту-2. У той же час отримані дані свідчать, що ступінь впливу фотозбуджених фулеренів С60 на процеси ПОЛ залежать від типу клітин. Так, активовані дією АФК ланцюгові реакції вільнорадикального переокиснення у тимоцитах та у клітинах L1210 можуть з часом пригнічуватись, тоді як у клітинах АКЕ має місце значний зсув прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, про що свідчить зниження вмісту дієнових кон’югатів за одночасного зростання вмісту шиффових основ.

Отримані результати щодо інтенсифікації процесів ПОЛ in vitro за присутності фотозбуджених фулеренів С60 узгоджуються з літературними даними, зокрема, щодо посиленого накопичення продуктів ПОЛ у мікросомальній фракції печінки через 5-30 хв після УФ опромінення у присутності похідних фулеренів, яке пригнічувалось антиоксидантами – аскорбіновою кислотою та б-токоферолом. Такий же ефект було виявлено у клітинах асцитної саркоми 180 (Kamat J., 2000).

До інтенсифікації процесів вільнорадикального переокиснення можуть бути залучені мітохондрії. У випадку порушення їх структурно-функціонального стану мітохондрії стають одними з головних генераторів АФК у клітині. Важливим показником функціонального стану мітохондрій є МТТ-тест, який дозволяє оцінити активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій.

Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій у клітинах. Швидкість відновлення МТТ у трансформованих клітинах була значно вищою (1,18 ± 0,08 та 0,74 ± 0,06 опт.од/106 кл за год у клітинах АКЕ та L1210 відповідно), ніж у тимоцитах (0,36 ± 0,20 опт.од/106 кл за год). Не виключено, що такі відмінності пояснюються тим, що в пухлинних клітинах, які характеризуються зниженим вмістом функціонально повноцінних мітохондрій (Лю Б., 2003; Windrem D., 1980), відбувається посилена експресія деяких ензимів – складових електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, зокрема, НАДН-дегідрогенази, за рахунок чого забезпечується швидкість дихання, необхідна для підтримання життєздатності трансформованого фенотипу (Engel М., 2004; Pelicano Н., 2006).

Щоб з’ясувати, чи відбуваються зміни у швидкості відновлення МТТ у клітинах за умови посиленої генерації АФК, спричиненої фотозбудженими фулеренами С60, клітини преінкубували упродовж різних проміжків часу після опромінення у присутності фулеренів С60 або С60-композитів, після чого у проби вносили МТТ. За 100% приймали відповідні показники у неопромінених пробах, які слугували контролем.

Незалежно від часу преінкубації достовірних змін у швидкості відновлення МТТ у тимоцитах, опромінених у присутності фулеренів С60 або С60-композитів, виявлено не було, тоді як у пухлинних клітинах такі зміни мали місце (рис. 5).

Встановлено негативний вплив опромінення клітин L1210 у присутності С60-композиту-1 та С60-композиту-2 на швидкість відновлення МТТ (зниження показника на 23 та 30% відповідно), який виявлявся за умови тривалої (5 год) інкубації клітин після опромінення (рис. 5).

Найбільш суттєві зміни в активності мітохондріального електрон-транспортного ланцюга були виявлені у клітинах АКЕ, які характеризуються високою швидкістю відновлення МТТ. Ці зміни були протилежно спрямованими залежно від часу інкубації після фотозбудження фулеренів С60 (рис. 5). У випадку короткочасної інкубації (30 хв) клітин АКЕ, опромінених у присутності С60-композиту-1 та С60-композиту-2, показник зростав на 32 та 40%, а після тривалої інкубації (5 год) – зменшувався на 28 та 45% відповідно (рис. 5).

Рис. 5. Залежність швидкості відновлення МТТ (% від контролю) від часу інкубації клітин після опромінення у присутності фулеренів С60 або С60-композитів

*Р?0,05 порівняно з відповідною неопроміненою пробою, що містила фулерени С60 або С60-композити

Виявлене зростання показника може бути зумовлене компенсаторним підвищенням швидкості окисно-відновних реакцій у дихальному ланцюгу у відповідь на ушкоджувальну дію АФК. У випадку значної продукції АФК відбуваються порушення структурно-функціонального стану мітохондрій, які внаслідок роз’єднання дихального ланцюга, витоку електронів та одноелектронного відновлення молекулярного кисню до , стають не лише мішенню дії АФК, але і їх головними генераторами, про що свідчить значне пригнічення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій у клітинах АКЕ у разі збільшення часу їх інкубації після опромінення у присутності С60-композитів.

Таким чином, фотозбуджені фулерени С60 можуть виконувати роль прооксидантів, під впливом яких в пухлинних клітинах певного типу інтенсифікуються процеси вільнорадикального переокиснення та формується замкнене коло продукування АФК за участі мітохондрій. Якщо інтенсивність продукування АФК перевищує активність антиоксидантних ензимів, експресія яких у пухлинних клітинах є підвищеною, такі клітини можуть зазнавати окисного цитолізу або апоптозу (Теплова В., 1999; Provinciali М., 2002; Wenzel U., 2005).

Показником деструктивних процесів у клітинах є фрагментація ДНК, яку оцінювали за вмістом низькомолекулярних фрагментів ДНК – полідезоксирибо-нуклеотидів (ПДН), що екстрагуються з хроматину у розчин з низькою іонною силою.

Фрагментація ДНК у клітинах. Вміст загальної ДНК у тимоцитах, клітинах L1210 та АКЕ складав 120 2,3, 60,5 7,2, 87,0 9,3 мкг на 107 клітин, а вміст фрагментованої ДНК (рівень ПДН) - 5,1 ± 0,5, 2,8 ± 0,3 та 3,1 ± 0,3% від загального вмісту ДНК відповідно. Через 20 год інкубації рівень ПДН у клітинах L1210 та АКЕ достовірно не змінювався, а у тимоцитах підвищувався до 16,1 ± 1,3, що може пояснюватись нестабільністю геному тимоцитів як недиференційованих клітин, схильних до спонтанного апоптозу (Quaglino D., 2001). У той же час нами не було виявлено змін у вмісті ПДН у тимоцитах, опромінених за присутності фулеренів С60 або С60-композитів. Достовірне посилення фрагментації ДНК через 5 та 20 год після фотозбудження С60 у складі композиту-2 виявлено у клітинах L1210 (рис. 6).

Значне посилення фрагментації ДНК спостерігалось у клітинах АКЕ, опромінених у присутності С60-композиту-1 та С60-композиту-2 - вміст ПДН був підвищеним порівняно з контролем через 5 год, а через 20 год складав відповідно 26 та 32% від загального вмісту ДНК (рис. 6).

Таким чином, віддалені ефекти дії фотозбуджених фулеренів С60 виявляються у порушенні структурної цілісності ДНК трансформованих клітин.

У літературі описано результати модельних експериментів in vitro щодо можливості окисного ушкодження ДНК під дією синглетного кисню, який утворюється при фотозбудженні фулеренів С60, зокрема, щодо перетворення суперспіральної ДНК плазміди pBR322 у лінійну внаслідок виникнення одноланцюгових розривів (Tokuyama H., 1993). Виявлене нами ушкодження структури ядерної ДНК у клітині може бути пов’язане з утворенням найбільш реакційноздатного гідроксильного радикалу () у реакціях за участі АФК (зокрема, Н2О2) та присутніх у хроматині іонів міді або заліза. Найбільш чутливими до дії є гуанінові основи, які перетворюються на 8-гідроксигуанін, дестабілізуючи найближчий до залишку гуанозину фосфодіефірний зв’язок, який легко піддається гідролітичному розщепленню (Саприн А., 1999).

Отже, можливою послідовністю біохімічних подій, які призводять до загибелі певної частини клітин у суспензії під дією АФК, які утворюються при фотозбудженні фулеренів С60, є посилення реакцій вільнорадикального переокиснення у клітині, насамперед, у ліпідній фазі плазматичної мембрани як первинній структурі – мішені дії молекул С60, порушення структурно-функціонального стану мітохондрій та їх залучення до посилення внутрішньоклітинного продукування АФК, деградація структури хроматину та фрагментація ДНК. Такі ефекти стають можливими лише за умови достатньо інтенсивної генерації АФК, оскільки виявляються переважно після фотозбудження фулеренів С60 у складі фулеренвмісного композиту-2, який є найбільш ефективним фотосенсибілізатором.

Аналіз отриманих даних дозволяє зробити висновок про вибірковість ушкоджувальної дії фотозбуджених фулеренів С60 в трансформованих клітинах та вказати можливі причини такої вибірковості. По-перше, у пухлинних клітинах створюються умови для посиленого генерування АФК, оскільки у внутрішніх гідрофобних ділянках мембран у надлишку накопичується О2, який не використовується для дихання через порушення функціонування мітохондрій (Лю Н., 2003; Windrem D., 1980), а тому може ефективно використовуватись як субстрат для утворення синглетного кисню у реакціях перенесення енергії від фотозбуджених молекул С60, які теж виявляють спорідненість до ліпофільних ділянок мембрани. По-друге, саме пухлинні клітини здатні більшою мірою накопичувати та довше, ніж нормальні клітини, утримувати екзогенні сполуки, особливо з великою молекулярною масою (Tabata, Y., 1997). Виявлені властивості фулеренів С60 та С60-композитів свідчать про перспективність їх використання для спрямованого впливу на залежні від продукції АФК сигнальні шляхи, що ведуть до вибіркової загибелі пухлинних клітин.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено вплив фулеренів С60 та С60-композитів (на основі амінопропілаеросилу) на життєздатність нормальних (тимоцити) та трансформованих клітин (асцитна карцинома Ерліха і лейкоз L1210) у контролі та після опромінення в УФ-видимому діапазоні. Показано вибірковість ушкоджувальної дії фотозбуджених фулеренів С60, яка виявляється лише у трансформованих клітинах і є наслідком посилення продукування АФК. Біохімічні ефекти фотозбуджених фулеренів С60 реалізуються через посилення реакцій вільнорадикального переокиснення у ліпідній фазі мембран, порушення структурно-функціонального стану мітохондрій та фрагментацію ДНК.

2. У модельних експериментах показано, що фулерени С60 (10-5 М) здатні проникати у бішарові ліпідні мембрани (фосфатидилхолін:холестерол), збільшуючи їх провідність.

3. Показано, що фулерени С60 за кінцевої концентрації у середовищі інкубації 10-5 М не виявляють цитотоксичних ефектів – не впливають на кількість життєздатних тимоцитів, клітин АКЕ та L1210 у суспензіях, на накопичення продуктів ПОЛ у гомогенатах печінки і мозку та стійкість еритроцитів до гемолізу.

4. З використанням методу ЕПР виявлено посилення продукування АФК у клітинних суспензіях, опромінених (л = 320 - 580 нм) у присутності фулеренів С60. Швидкість продукування АФК підвищувалась у послідовності С60 < С60-композит-1 < С60-композит-2. Встановлено посилення продукування супероксидного аніон-радикалу фотозбудженими С60-композитами після додавання НАДН у середовище інкубації.

5. Показано, що через 24 год після опромінення клітинних суспензій у присутності фулеренів С60 та С60-композитів кількість життєздатних тимоцитів не змінювалася, тоді як трансформованих клітин знижувалась. Найбільш значний ефект спостерігався у випадку фотозбудження фулеренів С60 у складі композиту-2 – вміст клітин L1210 у суспензії знижувався на 29%, а клітин АКЕ – на 34% відносно контролю.

6. Виявлено порушення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги (зниження вмісту первинних продуктів реакцій перекисного окиснення за одночасного підвищення вмісту їх кінцевих продуктів) у клітинах АКЕ вже через 1 год після опромінення у присутності фулеренів С60 та С60-композитів.

7. Встановлено пригнічення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій у клітинах L1210 та АКЕ через 5 год після опромінення у присутності С60-композитів.

8. Виявлено віддалені ефекти дії фотозбуджених фулеренів С60, які полягали у зростанні вмісту фрагментованої ДНК у клітинах L1210 через 20 год після опромінення у присутності С60-композиту-2, а у клітинах АКЕ –