МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Корсак Аліна Вадимівна

УДК 616.833-089.85-003.93:[615.31:577.115.3

РЕГЕНЕРАЦІЯ ПЕРИФЕРІЙНОГО
НЕРВА ЗА УМОВ ЗАСТОСУВАННЯ
ОМЕГА-3-ПОЛІНЕНАСИЧЕНИХ ЖИРНИХ

КИСЛОТ

14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті імені
О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України Чайковський Юрій Богданович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач кафедра гістології та ембріології.

Офіційні опоненти

доктор медичних наук, професор Скибо Галина Григорівна, Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу цитології;

доктор медичних наук, професор Геращенко Сергій Борисович, Івано-Франківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології.

Захист відбудеться 08.05.2008 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 у Національному медичному університеті імені О. О. Богомольця МОЗ України (01601, м. Київ-601, бульвар Шевченка, 13; тел. 234-60-63).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий 06.04.2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор О.М. Грабовий

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Проблема вивчення регенерації нервових волокон обумовлена широким колом патологічних станів, в які залучені периферійні нерви [89] – це травми (Бадалян Л.О. та співавт., 1980), демієлінізуючі захворювання (Скибо Г.Г., 1995), ішемія нервових стовбурів, системний розлад метаболізму, інтоксикація, побічна дія ліків, спадкова патологія, хвороби обміну (Берснєв В.П. та співавт., 1998). Тому пошук стимуляторів регенерації периферійних нервів є актуальним завданням нейрофармакології та неврології. Серед чинників, що обумовлюють патологію периферійної нервової системи, одне з провідних місць належить травмі (Кардаш К.А., 2003), яка частіше буває у пацієнтів працездатного віку, серед яких більш ніж 60% стають інвалідами (Баюн Ю.В., 2002). Тому доцільним завданням медицини є пошук ефективних методів лікування наслідків травматичних пошкоджень периферійних нервів. Успіх вирішення цієї проблеми залежить як від професіоналізму надання першої медичної допомоги та лікування в гострий період постраждалих, так і від оптимального вибору терміну, виду оперативного втручання та дії наступного комплексу фармако-фізичних впливів. Незважаючи на великі технічні досягнення і досвід у діагностиці та лікуванні ушкоджень нервів кінцівок, результати лікування травматичних ушкоджень периферійних нервів вважаються все ще не достатньо задовільними. Наявність нових методик накладання мікрохірургічного шва нерва з використанням під час оперативного втручання біологічного клею, ембріональної нервової тканини, лазерного опромінення створює необхідні умови для процесів регенерації нерва та реінервації м’язів (Лузан Б.Н., 2001; Раскалєй Д.В., 2006). Але своєчасно та вдало накладений шов нерва не забезпечує повного відновлення функцій нервово-м’язового апарату (Шудло Н.А., 2006). Особливо це представлено в умовах клініки, де на відміну від експерименту немає ідеальних умов. Понад 25% хворих з відкритим ушкодженням периферійних нервів оперуються в термін, що перевищує 6 місяців після травми, хоч найбільш ефективним в плані відновлення функції нервово-м’язового апарату є термін одразу після пошкодження, в крайньому випадку 1 місяць після травми. В умовах клініки пошкодження периферійних нервів може супроводжуватись артеріальною ішемією, венозною недостатністю, гнійним процесом, сахарним діабетом та ін., що створює локальні та загальні, природні або набуті умови які ускладнюють процес регенерації травмованих периферійних нервів (Гончарук О.О., 2005). Тому при розробці нових методів покращення регенерації нервових стовбурів та реінервації м’язів бажано наближення ситуації експерименту до клінічних випадків. У більшості експериментальних робіт в якості моделі для вивчення ефективності дії лікарських засобів та інших хімічних або біологічних речовин використовувалась загальноприйнята модель – перерізка та зшивання нервового стовбура (Челышев Ю.А., Харазьянова Р.Х., 2000; Adelson P. et al., 2004; Tyrgut M. et al., 2005). Це дає підставу створити нову експериментальну модель травми периферійного нерва. Лікування наслідків травматичного ушкодження периферійних нервів на сучасному рівні є комплексним (Цимбалюк В.І., 2005). Однією з важливих ланок комплексу лікувальних заходів наслідків травматичного ушкодження периферійних нервів є патогенетично обумовлена фармакотерапія. Способи медикаментозної терапії травм периферійних нервів дуже різноманітні. В експерименті вивчено вплив на відновлення нервових стовбурів окремих препаратів, поєднання фармакологічних засобів та речовин різної хімічної та біологічної природи. Сучасні літературні дані свідчать про те, що у клініці застосовується комплекс препаратів, які включають речовини з різним спектром дії (Нечипуренко Н.И., 1997). Це насамперед, засоби, які стимулюють ріст новоутворених нервових волокон, поліпшують процеси обміну речовин у регенеруючих нервових волокнах, процеси нервово-м’язової передачі, сприяють зменшенню посттравматичного набряку, поліпшують мікроциркуляцію в ділянці травми (Челышев Ю.А., Черепнев Г.В., 2001). Значно менше літературних джерел містять інформацію про речовини, що мають спрямований вплив на сполучну тканину регенераційної невроми для запобігання її фіброзним змінам, а також про речовини, що специфічно діють на процес мієлінізації, стимулюючи його за рахунок прискорення початкового етапу даного процесу, який проявляється збільшенням кількості лямел мієлінової оболонки регенеруючих мієлінових нервових волокон (Сокуренко Л.М., 2003; Геращенко С.Б., Дєльцова О.І., Коломійцев А.К., Чайковський Ю.Б., 2005). У літературі відсутні відомості про патогенетично обумовлений вплив на регенерацію периферійних нервів, речовин, механізм дії яких направлений на заключний етап процесу мієлінізації, а саме на прискорення диференціації новоутвореного мієліна, від успіху якого залежить швидкість проведення нервового імпульсу та відновлення функції травмованого нерва. Враховуючи наведені дані можна прийти до висновку, що виражені побічні ефекти фармакологічних препаратів, наявність супутньої патологіЇ у постраждалих, медикаментозна перенасиченість організму сучасної людини створює необхідність пошуку стимуляторів регенерації периферійних нервів, які ефективно впливали б одночасно на декілька ключових ланок процесу регенерації нервових стовбурів та підтримували захисні сили організму в цілому, включаючи покращення мікроциркуляції, протизапальну дію, імуномодулюючий ефект.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках планової комплексної науково-дослідної роботи кафедри гістології та ембріології НМУ: “Вивчити морфологічні зміни нервової системи за умов дії фізичних та хімічних чинників та можливості корекції”. Номер держреєстрації №0106U002345.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи – встановити особливості процесів де- та регенерації нервового стовбура за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот. Досягнення цієї мети базувалось на вирішенні наступних задач:

1. Розробити експериментальну модель тяжкого ушкодження периферійного нерва, що супроводжується появою грубого сполучно-тканинного рубця.

2. Вивчити та порівняти морфологічні та морфометричні показники стану сідничого нерва щурів в різні терміни після ушкодження при відтворенні стандартної травми периферійного нерва та за умов відтворення запропонованої експериментальної травми периферійного нерва.

3. Вивчити та порівняти морфологічні та морфометричні показники стану сідничого нерва щурів в різні терміни після ушкодження за умов відтворення запропонованої експериментальної травми периферійного нерва з застосуванням та без застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот.

4. Визначити основні механізми впливу омега-3-поліненасичених жирних кислот на процеси регенерації ушкодженого периферійного нерва.

Об’єкт дослідження: реактивні властивості нервових стовбурів.

Предмет дослідження: сідничий нерв щура в умовах стандартної та запропонованої експериментальної моделі травми периферійного нерва, з використанням та без використання омега-3-поліненасичених жирних кислот.

Методи дослідження: загальногістологічні, нейрогістологічні, електронномікроскопічні та морфометричні, які дозволили виявити ключові ланки процесу регенерації сідничого нерва.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено відновлення нервового стовбура в умовах запропонованої експериментальної моделі травми периферійного нерва, що приводить до формування щільного сполучнотканинного рубця, наближуючи ситуацію експерименту до клінічних випадків.

Вперше в умовах запропонованої експериментальної моделі травми периферійного нерва було вивчено стан нервових волокон, що про-ростають у периферійний відрізок нервового стовбура, та їх мієлінізацію під впливом омега-3-поліненасичених жирних кислот. Отримані дані дозволили з’ясувати закономірності процесів регенерації та мієлінізації нервових волокон в різні терміни після ушкодження залежно від впливу омега-3-поліненасичених жирних кислот за умов відтворення запропонованої експериментальної моделі травми периферійного нерва.

Ці результати дають змогу створити передумови удосконалення методики медикаментозної терапії травм нервових стовбурів у людини, а також надати теоретичне обґрунтування для розробки рекомендацій щодо вибору тактики реабілітаційних засобів при тяжких формах пошкодження нерва, які приводять до формування щільного сполучнотканинного рубця.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані є передумовою для розробки в клінічній практиці способів покращення процесів відновлення периферійних нервів після їх пошкодження. Матеріали роботи розширюватимуть уявлення дослідників та практикуючих лікарів про репаративні властивості нервових стовбурів та способів впливу на ці процеси.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проводились вивчення наукової літератури, виконання експериментів, мікро-морфологічні та морфометричні дослідження, аналіз та узагальнення отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на другій всеукраїнській морфологічній науковій конференції “Карповські читання” (Дніпропетровськ, 2005); Міжнародній спеціалізованій виставці “Індустрія охорони здоров’я-2005” (Київ, 2005); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 2006); IV Національному конгресі АГЕТ України (Алушта, 2006); ІІІ Національному з’їзді Фармакологів України (Одеса, 2006); всеукраїнській науково-практичній та навчально-методичній конференції “Фундаментальні науки – хірургії” (ІІІ Скліфосовські читання) (Полтава, 2007); IV міжнародному конгресі з інтегративної антропології (Вінниця, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, з них 5 журнальних статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 тез доповідей на наукових конгресах та конференціях,
1 участь в міжнародній спеціалізованій виставці.

Обсяг та структура дисертації. Матеріали дисертації викладені на 179 сторінках машинописного тексту, текстова частина займає 140 сторінок. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи досліджень”, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел. Список цитованої літератури містить 318 джерел (вітчизняних та іноземних). Дисертація ілюстрована 77 рисунками та 4 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні спостереження були проведені на 100 білих щурах вагою 150-200 г. Тварини цього виду найчастіше використовуються для вивчення регенерації периферійних нервів. Сідничі нерви людини і білого щура за принципом внутрішньої будови є ізоморфними формаціями периферійної нервової системи (Старченко І.І., 2000), а відмінності між ними полягають у кількісному складі нервових пучків. Всіх тварин, що були використані в роботі, утримували у стандартних умовах віварію (в одному приміщенні, на стандартному брикетованому харчуванні).

Експериментальні тварини були розподілені на 5 груп (табл. 1).

Таблиця 1

Розподіл тварин за групами залежно від термінів дослідження |

Термін дослідження (тижні) | Всього

3 | 6 | 12

Інтактні тварини

Група І | 5 | 5

“Псевдооперовані” тварини

Група ІІ | 5 | 5

Стандартна модель травми периферійного нерва

Група ІІІ | 10 | 10 | 10 | 30

Запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва

Група ІV | 10 | 10 | 10 | 30

Запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот

Група V | 10 | 10 | 10 | 30

Всього | 100

Перша група (І) – інтактні тварини (5 щурів), показники будови яких були використані для оцінки стану сідничого нерва “псевдооперованих” тварин.

Друга група (ІІ) “псевдооперовані” тварини (5 щурів), показники будови яких були використані для оцінки відновлення травмованих нервів (контроль).

Третя група (ІІІ) 30 щурів, яким була відтворена стандартна травма периферійного нерва.

Четверта група (ІV) 30 щурів, яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва.

П’ята група (V) 30 щурів, яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот.

Всі оперативні втручання проводили з дотриманням правил асептики та антисептики. Використовували тіопенталовий наркоз.

В якості контролю експериментів були використані так звані “псевдооперовані” тварини другої групи. У цих тварин, як і в експерименті, проводили доступ до правого сідничого нерва, потім його мобілізували, але не перетинали. Рану пошарово ушивали. Показники будови сідничого нерва цих тварин були використані для оцінки відновлення травмованих периферійних нервів.

Стандартну модель травми периферійного нерва тваринам третьої групи здійснювали в такий спосіб: виконували оперативний доступ до правого сідничого нерва, останній мобілізували і перетинали в ділянці середньої його третини із фіксацією центрального та периферійного відрізків на відстані 2-3 мм епіневральними швами ниткою поліамід 6/0 на атравматичній голці. Здійснювали ретельний гемостаз, рану зашивали наглухо.

Тваринам четвертої та п’ятої груп була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва в такій спосіб: виконували оперативний доступ до правого сідничого нерва, останній мобілізували і в ділянці середньої його третини спочатку розчавлювали, в цьому ж місці перев’язували ниткою кетгут №1, а потім перетинали вище місця перев’язки. Центральний та периферійний відрізки фіксували епіневральними швами ниткою поліамід 6/0 на атравматичній голці на відстані 2-3 мм. Здійснювали ретельний гемостаз, рану зашивали наглухо.

Застосовували хірургічні інструменти: пінцети, ножиці, голкотримач, зажим типу москіт.

Усі рани тварин після операції загоїлись первинним натягом. Тварини знаходились у віварії на звичайному раціоні, летальних випадків не спостерігали.

Тваринам четвертої групи відразу після оперативного втручання щодобово, протягом 21 доби, вводили масляний розчин кукурудзяної олії у дозі 1 мл всередину.

Тваринам п’ятої групи відразу після оперативного втручання щодобово, протягом 21 доби, вводили масляний розчин омега-3-поліненасичених жирних кислот у дозі 0,04 г/кг всередину на кукурудзяній олії.

Матеріалом для дослідження були регенераційні невроми з прилеглими відрізками (проксимальним і дистальним) ушкодженого сідничого нерва через 3, 6, 12 тижнів після відтворення моделі травми периферійного нерва. Перед забором матеріалу тваринам вводили надлишкову дозу тіопенталу (200 мг/кг), а для електронної мікроскопії летальну дозу ефіру.

Для світлооптичної мікроскопії матеріал фіксували у 10%-му розчині формаліну, промивали та отримували зрізи на заморожуючому мікротомі, які потім імпрегнували азотнокислим сріблом за швидким методом імпрегнації азотнокислим сріблом елементів периферійної нервової системи (Коломийцев А.К. та співавт., 1981) з подальшим золотінням. Для вивчення сполучної тканини препарати забарвлювали азур II-еозином. Для аналізу результатів світлооптичної мікроскопії за допомогою морфометрії використовували комп’ютерну програму UTHSCSA Image Tool for Windows (version 2.00) та стандартну окулярну вставку. Були визначені такі показники: щільність розподілу нервових волокон та середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва в ділянці регенераційної невроми.

Для аналізу результатів використовували також напівтонкі поперечні та поздовжні зрізи нервів, виготовлені на ультратомі LКB і забарвлені толуїдиновим синім. Морфометричні дослідження проводили за допомогою напівавтоматичного пристрою для обробки графічних зображень. У даному дослідженні визначали такі величини: кількість овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва, об’єм овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва та розміри овоїдів дегенерації нервових волокон, а саме – середній периметр та середню площу.

Препарати тонких і напівтонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопу “Олімпус”.

Для електронномікроскопічного дослідження невеликі фрагменти дистальних відрізків сідничого нерва фіксували в 1%-му розчині чотирьохокису осмію за Колфільдом протягом 2 годин при температурі 4С. Об’єкти зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, в ацетоні і заливали в суміш епону з аралдитом за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи одержували на ультратомі LKB-8800 (Швеція) в поздовжній та поперечній проекціях нерву, контрастували їх 2%-м розчином уранілацетату в 50 70%-му етанолі протягом 15 хвилин і азотнокислим свинцем стільки ж часу, а потім зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ЭМВ 125К.

Для аналізу результатів електронної мікроскопії за допомогою морфометрії використовували напівавтоматичний пристрій для обробки графічних зображень. Були визначені такі показники: товщина мієлінової оболонки нервових волокон, кількість пластин мієліну на одиницю товщини мієлінової оболонки нервових волокон.

При статистичному аналізі морфометричних даних обчислювали середні значення величин, середнє квадратичне відхилення, похибку середньої, коефіцієнт варіації і коефіцієнт точності визначення середньої у відповідності з рекомендаціями, що містяться в підручниках з математичної статистики. Порівняння отриманих результатів проводили за допомогою непараметричного критерію Манна-Вітні-Вілкоксона (Мінцер О.П., 2003) .

Результати досліджень та їх обговорення. Основною причиною незадовільного ефекту лікування ушкоджень периферійних нервів є утворення грубого сполучнотканинного рубця в ділянці нейрального анастомозу або травми, наявність якого уповільнює регенерацію нервових волокон та відновлення функції ушкодженого периферійного нерва (Чайковський Ю.Б., 1999). Але розробка нових методів лікування пошкоджень периферійних нервів проводиться, як правило, на загальноприйнятій моделі – перерізка та зшивання нервового стовбура, що викликає більш рівномірне дозрівання сполучної тканини в ділянці травми і не відповідає в цих випадках умовам клініки. Для створення умов наближення ситуації експерименту до клінічних випадків нами було запропоновано нову експериментальну модель травми периферійного нерва.

Наші досліди свідчать, що запропонована експериментальна травма периферійного нерва сприяє утворенню щільного сполучнотканинного рубця і зниженню якості та темпів регенераціїї ушкодженого нервового стовбура.

Дані імпрегнації нітратом срібла, золотіння та дофарбування азур ІІ-еозином доводять, що в третій групі тварин (яким була відтворена стандартна модель травми периферійного нерва) в ділянці регенераційної невроми в усіх термінах спостереження виявляється неоднорідність дозрівання сполучної тканини та невпорядкованість розташування регенеруючих нервових волокон. В даній групі тварин новоутворені нервові волокна, які прямують крізь регенераційну неврому розташовані помірно невпорядковано та мають або паралельний хід, або відхиляються від поздовжньої осі нерва. Лише незначна частина осьових циліндрів має поперечний або рекурентний хід. Це обумовлено більш рівномірним дозріванням сполучної тканини цієї ділянки у вигляді наявності невеликої кількості помірного розміру острівців фіброзу із зниженим вазальним забезпеченням та щільним розташуванням колагенових волокон.

Дані імпрегнації нітратом срібла, золотіння, та дофарбування азур ІІ-еозином свідчать, що через 3 тижні після пошкодження на кінцях багатьох осьових циліндрів в ділянці регенераційної невроми в четвертій групі тварин (яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва) виявляються в значній кількості затримані колби, на відміну від тварин із стандартною травмою периферійного нерва, де затримані колби спостерігаються в меншій кількості.

В усіх термінах спостереження, в четвертій групі тварин, в ділянці регенераційної невроми виявляється неоднорідність дозрівання сполучної тканини та невпорядкованість розташування регенеруючих нервових волокон, але виражені вони набагато сильніше, ніж у тварин із стандартною травмою периферійного нерва. Особливо це помітно в даній ділянці через 12 тижнів після пошкодження, у вигляді наявності чисельних зон фіброзу із зниженим вазальним забезпеченням та значним скупченням колагенових волокон, в результаті чого нервові волокна, складені у пучки, що прямують з центрального до периферійного відрізка, зустрічаються з острівцями фіброзу, оминають їх по периферії або змінюють свій прямолінійний хід, чим обумовлюють невпорядкованість свого розташування в регенераційній невромі. Це проявляється тим, що більша частина осьових циліндрів цієї ділянки проходить косо, поперечно або рекурентно.

За даними літератури відомо, що чим більше новоутворених нервових волокон та чим впорядкованіше їх розташування в регенераційній невромі, тим якісніше проходить відтворення структур нерва та функції денервованих органів (Чайковський Ю.Б., 1999).

За даними морфометрії, щільність розподілу нервових волокон в ділянці регенераційної невроми в терміни 3, 6 та 12 тижнів статистично достовірно менша в групі тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва, ніж у тварин із стандартною травмою периферійного нерва (рис. 1).

Рис. 1. Показники щільності розподілу нервових волокон в ділянці регенераційної невроми, 1/мм2.

Середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва в ділянці регенераційної невроми статистично достовірно більше в групі тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва, ніж у тварин із стандартною травмою периферійного нерва. Розміри овоїдів дегенерації, а саме середнього периметру та середньої площі статистично достовірно більші в групі тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва, ніж у тварин із стандартною травмою периферійного нерва. Це вказує на те, що вторинна дегенерація проходить повільніше в групі тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва, ніж у тварин із стандартною травмою периферійного нерва. Результати нашого дослідження співзвучні з даними літератури про те, що тяжкість травми залежить від розташування та кількості регенеруючих нервових волокон в ділянці регенераційної невроми. Тому можна вважати запропоновану ними модель травми, де виявлено більш невпорядковане розташування регенеруючих нервових волокон регенераційної невроми та зниження їх кількості, на відміну від стандартної травми, тяжкою і адекватною клінічним умовам. Тому запропонована експериментальна модель дає можливість досліджувати вплив дії різних чинників на процес регенерації периферійних нервів, створюючи умови структурної перебудови тканинних елементів близькі до тих, що зустрічаються в клініці.

Наслідки тяжких травм периферійних нервів потребують комплексного тривалого відновлювального лікування, важливою ланкою якого є послідовне чергування різних препаратів у відповідності до стадій та ключових ланок процесу регенерації.

Фармакологічний вплив на пошкоджений нервовий стовбур, з метою відновлення, відповідно до його морфології та етапів процесу регенерації, повинен бути спрямований на прискорення ліквідації наслідків дегенерації; стимуляцію росту аксонів; стимуляцію процесу мієлінізаціїї новоутворених аксонів, що включає активізацію синтетичної та проліферативної діяльності клітин Шванна, сам процес утворення мієлінової оболонки та її диференціювання; запобігання розвитку грубого сполучнотканинного рубця; запобігання пост-травматичному апоптозу нейронів та клітин Шванна (Чайковський Ю.Б., 1996; Нечипуренко Н.И., 1997; Челышев Ю.А., 2001).

Оскільки омега-3-поліненасичені жирні кислоти мають здатність вбудовуватись в ліпідний каркас плазматичної мембрани, мають вплив на стан ліпідного обміну, показники гемостазу, імунної системи та перебіг запального процесу (Фещенко Ю.И., 1996), нами було зроблено припущення, що дана речовина може впливати одночасно на декілька ключових ланок регенерації периферійного нерва. Враховуючи особливості будови та утворення мієліну було вирішено вивчити механізм впливу омега-3-поліненасичених жирних кислот на процес мієлінізації регенеруючого нервового волокна за допомогою морфометричних досліджень.

Дані імпрегнації нітратом срібла, золотіння та дофарбування азур ІІ-еозином свідчать, що в п’ятій групі тварин (яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва та застосовувались омега-3-поліненасичені жирні кислоти) і в четвертій групі тварин травма сідничого нерва ініціює вторинну дегенерацію у периферійному відрізку та призводить до утворення регенераційної невроми між його центральним та периферійним відрізками. В ділянці регенераційної невроми виявляються елементи сполучної тканини, новоутворені кровоносні судини та регенеруючі нервові волокна.

За результатами дослідження встановлено, що нейро-тканинна взаємодія в ділянці регенераційної невроми в групах тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот та без проходить не однаково.

В динаміці експерименту кількість регенеруючих нервових волокон збільшується у тварин п’ятої і четвертої групи. Однак у тварин четвертої групи регенеруючі нервові волокна в ділянці невроми розташовуються невпорядковано: значна їх частина відхиляється від поздовжньої осі нерва і проходить косо, поперечно або рекурентно. Вазальне забезпечення та дозрівання сполучної тканини регенераційної невроми в цій групі тварин проходить нерівномірно. В динаміці експерименту через 12 тижнів в найбільшій кількості виявлені значні зони фіброзу із зниженим вазальним забезпеченням та значним скупченням колагенових волокон.

У тварин п’ятої групи регенеруючі нервові волокна в ділянці невроми розташовуються відносно впорядковано: більша їх частина практично не відхиляється від поздовжньої осі нерва і проходить прямолінійно з центрального до периферійного відрізка і лише окремі осьові циліндри розташовані косо або поперечно. Вазальне забезпечення та дозрівання сполучної тканини регенераційної невроми в цій групі тварин проходить досить рівномірно. В динаміці експерименту через 12 тижнів більше, ніж в попередні терміни зустрічаються зони фіброзу, але кількість їх значно менше, ніж у тварин четвертої групи в даний термін спостереження.

Описані відмінності в будові регенераційних невром обумовлюють отримані дані морфометричного дослідження. За даними морфометрії щільність розподілу нервових волокон в ділянці регенераційної невроми статистично достовірно зростає в динаміці експерименту, та в терміни 3, 6 та 12 тижнів статистично достовірно більша в п’ятій групі тварин, ніж у тварин четвертої групи. Кількісні показники щільності розподілу нервових волокон в ділянці регенераційної невроми через 12 тижнів після пошкодження нервового стовбура в п’ятій групі тварин наближуються до показників щільності розподілу нервових волокон в ділянці середньої третини сідничого нерва контрольної групи тварин. Середній кут відхилення нервових волокон від поздовжньої осі нерва в ділянці регенераційної невроми залишається статистично достовірно не змінним в динаміці експерименту, але статистично достовірно менше у всіх термінах спостереження в п’ятій групі тварин, ніж у тварин четвертої групи.

Наші досліди довели, що в групі тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот в ділянці травми формується менш щільний, однорідний за будовою сполучнотканинний рубець, який сприяє прискоренню проростання більшої кількості новоутворених нервових волокон.

Встановлено, що швидкість протікання процесів вторинної дегенерації периферійного відрізка травмованого нерва не однакова в групах тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва з застосуванням омега-3-поліненасичених жирних кислот та без. У тварин четвертої групи аналіз напівтонких зрізів периферійного відрізка сідничого нерва щура, забарвлених толуїдиновим синім, виявив присутність овоїдів дегенерації великих розмірів в значній кількості. Однак у тварин п’ятої групи овоїди дегенерації нервових волокон виявлені в значно меншій кількості та невеликих розмірів. Це підтверджено даними морфометрії, які свідчать, що кількість овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва, об’єм овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва та розміри овоїдів дегенерації нервових волокон а саме середнього периметру та середньої площі статистично достовірно більші в четвертій групі тварин, ніж у тварин п’ятої групи. Наші досліди довели, що процес вторинної дегенерації протікає швидше у п’ятій групі тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот.

Встановлено, що темп регенерації, включаючи процес мієлінізації регенеруючих нервових волокон проходить не однаково в групах тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот та без.

Дані електронної мікроскопії свідчать, що в п’ятій та четвертій групах тварин в термін 12 тижнів виявляються регенеруючі новоутворені та зрілі нервові волокна різного діаметру. У тварин четвертої групи регенеруючі нервові волокна виглядають деформованими з патологічними змінами мієлінової оболонки та осьових циліндрів. Це проявляється неповноцінністю мієлінової оболонки у вигляді порушення її конфігурації з утворенням випинань та інвагінацій, але лямелярна будова та неперервність її збережені. У багатьох регенеруючих мієлінових та безмієлінових нервових волокнах спостерігається набряк аксоплазми у вигляді її просвітлення та наявність залишкових тілець, що включають фрагменти нейротрубочок та нейрофіламентів, іноді зустрічається відрив аксоплазми від мієлінової оболонки. В цитоплазмі клітини Шванна у патологічно змінених новоутворених мієлінових нервових волокнах збільшено число включень у вигляді залишкових тілець та лізосомоподібних структур. Однак у тварин п’ятої групи виявляється значно менше регенеруючих нервових волокон з ознаками деформації. Більшість з них мають округлу або овальну форму з добре вираженою мієліновою оболонкою, яка утворена впорядкованими концентрично розташованими неперервними пластинами мієліну. У регенеруючих мієлінових та безмієлінових нервових волокнах в аксоплазмі виявляються нейротрубочки, нейрофіламенти та мітохондрії. Клітини Шванна у новоутворених мієлінових нервових волокнах, які виявлені в значній кількості, знаходяться в активному функціональному стані, про що свідчить добре розвинена цитоплазма з органелами метаболічного плану.

Дані електронної мікроскопії також свідчать, що в п’ятій і четвертій групах тварин у всіх термінах виявляються сполучнотканинні елементи. Серед клітин спостерігаються переважно фібробласти та макрофаги, чисельність яких в динаміці експерименту зменшується на користь появи більшої кількості колагенових волокон. У тварин четвертої групи виявляються активні фібробласти із значною кількістю органел метаболічного характеру. Однак у тварин п’ятої групи знижена фібробластична реакція. Сполучнотканинні елементи виявляються в меншій кількості та спостерігається порушення структури колагенових волокон у вигляді зміни звичайної періодичності чергування темних та світлих ділянок в бік переваги темних. Можна припустити, що зменшення клітинних елементів сполучної тканини та порушення структури колагенових волокон пов’язано з низькою активністю фібробластів за рахунок малої кількості органел метаболічного плану, розширення перинуклеарного простору, накопичення в цитоплазмі таких клітин мієліноподібних структур. Наявність апоптично змінених фібробластів, також може сприяти зменшенню кількості міжклітинної речовини.

Дані електронної мікроскопії також свідчать, що в п’ятій і четвертій групах тварин виявляються кровоносні мікросудини переважно у термінах 6 та 12 тижнів після пошкодження. У тварин четвертої групи спостерігається реактивність ендотелію у вигляді збільшення мікровор-синок плазматичної мембрани ендотеліоцитів. Окрім цього, виявляється розходження міжендотеліальних контактів та розшарування базальної мембрани. В термін 12 тижнів після пошкодження в посткапілярному руслі спостерігається сладж формених елементів крові. Однак у тварин п’ятої групи виявлено ознаки покращення мікроциркуляції. Спостеріга-ється витончення ендотеліального вистелення судин та зниження реактивності ендотелія у вигляді зменшення кількості мікровиростів плазматичної мембрани ендотеліоцитів. В термін 12 тижнів після пошкод-ження в посткапілярному руслі сладж формених елементів крові відсутній.

Описані відмінності в будові регенеруючих мієлінових волокон обумовлюють отримані дані морфометричного дослідження. За даними морфометрії товщина мієлінової оболонки зростає в динаміці експерименту як у тварин четвертої, так і п’ятої груп. Однак у тварин п’ятої групи в термін 12 тижнів після ушкодження товщина мієлінової оболонки статистично достовірно більше, ніж у тварин четвертої групи. Кількість пластин мієліну на одиницю товщини мієлінової оболонки в динаміці експерименту залишається незмінною. Однак у тварин п’ятої групи в термін 6 та 12 тижнів після ушкодження кількість пластин мієліну на одиницю товщини мієлінової оболонки статистично достовірно більша, ніж у тварин четвертої групи (рис. 2).

Рис. 2. Кількість пластин мієліну в 1 мм товщини мієлінової оболонки нервових волокон.

Наші досліди довели, що процес мієлінізації краще протікає в групі тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот.

Наші досліди свідчать, що застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот в разі відтворення запропонованої експериментальної травми периферійного нерва покращує процес регенерації пошкодженого нервового стовбура. Проведене дослідження дозволяє припустити, що основними механізмами впливу омега-3-поліненасичених жирних кислот на процеси регенерації периферійного нерва є прискорення елімінації продуктів вторинної дегенерації; попередження розвитку щільного сполучнотканинного рубця в ділянці невроми, що сприяє проростанню більшої кількості новоутворених нервових волокон; покращення процесу мієлінізації.

ВИСНОВКИ

В дисертації представлено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає в вивченні закономірностей регенерації периферійного нерва, за умов його експериментальної тяжкої травми та застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот.

1 Розроблена експериментальна модель травми периферійного нерва сприяє утворенню щільного сполучнотканинного рубця внаслідок зміни нейро-тканинної взаємодії в регенераційній невромі, що проявляється затримкою росту новоутворених осьових циліндрів та збільшенням середнього кута відхилення аксонів від поздовжньої осі нерва на відміну від стандартної моделі травми. Це підтверджується тим, що у віддалений термін після пошкодження (12 тижнів) в групі тварин, яким була відтворена запропонована експериментальна модель травми периферійного нерва щільність розподілу нервових волокон в ділянці регенераційної невроми складає 7148±154/мм2, а середній кут відхилення аксонів від поздовжньої осі нерва - 45,22±2,590, що статистично достовірно відрізняється від групи тварин зі стандартною моделлю травми нерва, де щільність розподілу в ділянці регенераційної невроми складає 8459±152/мм2, а середній кут відхилення аксонів від поздовжньої осі нерва - 36,24±2,090.

2 У тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот спостерігається прискорення процесу вторинної дегенерації, на відміну від групи тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва без застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот. Це підтверджується прискоренням елімінації продуктів вторинної дегенерації у вигляді достовірного зменшення об’єму овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва (1,17±0,19%), зменшення кількості овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва
(2,38±0,37Ч10-2/мкм3)і зменшення їх розмірів, а саме площі та периметру, на відміну від групи тварин з експериментальною травмою периферійного нерва без застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот, де об’єм овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва складає 5,67±0,09%, кількість овоїдів дегенерації нервових волокон в одиниці об’єму нерва складає 4,24±0,53Ч10-2/мкм3.

3 У тварин з запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот спостерігається утворення менш щільного, однорідного за будовою нейрального рубця внаслідок зміни нейро-тканинної взаємодії в регенераційній невромі, що проявляється збільшенням щільності розподілу волокон (9634±171/мм2) та зменшенням середнього кута відхилення аксонів від поздовжньої осі нерва (34,78±2,150) в ділянці регенераційної невроми в термін 12 тижнів після ушкодження в порівнянні з тваринами із запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва яким омега-3-поліненсичені жирні кислоти не вводились, де щільність розподілу волокон складає 7148±154/мм2 та середній кут відхилення аксонів від поздовжньої осі нерва складає 45,22±2,590 в ділянці регенераційної невроми.

4 У тварин із запропонованою експериментальною травмою периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот спостерігається прискорення процесу мієлінізації, що полягає в підвищенні якості новоутвореного мієліна за рахунок не тільки збільшення товщини мієлінової оболонки, але і збільшення кількості пластин мієліну на одиницю товщини останньої. Це характеризується тим, що у віддалений термін спостереження (12 тижнів) у групі із запропонованою експериментальною моделлю травми периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненсичених жирних кислот більша товщина мієлінової оболонки, яка складає 0,71±0,03 мкм та більша кількість пластин мієліна, яка складає 66,85±0,90/мм товщини мієлінової оболонки на відміну від групи із запропонованою експериментальною моделлю травми периферійного нерва, де омега-3-поліненсичені жирні кислоти не застосовувались та у термін 12 тижнів товщина мієлінової оболонки становить 0,50±0,02 мкм, а кількість пластин мієліну - 63,80±0,72/мм товщини мієлінової оболонки.

5 Отримані результати дають змогу припустити, що основними механізмами впливу омега-3-поліненсичених жирних кислот на процеси регенерації периферійних нервів є прискорення елімінації наслідків дегенерації, попередження розвитку грубого сполучно-тканинного рубця в ділянці регенераційної невроми, прискорення процесу мієлінізації та, можливо, стимуляції росту аксонів.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. В лікувальній тактиці ведення хворих з тяжким пошкодженням периферійних нервів слід враховувати патоморфологічні зміни в ділянці регенераційної невроми, а також процес мієлінізації, від яких залежить повнота відновлення нервового стовбура та відновлення функції денервованого органа. З метою попередження розвитку щільного сполучнотканинного рубця та пришвидшення процесу мієлінізації варто окрім проведення мікрохірургічного оперативного втручання проводити фармакологічне лікування одразу ж після нейрорафії препаратами, що запобігають утворенню щільного сполучнотканинного рубця, покращують процес мієлінізації.

2. Виправданим з етіопатогенетичної точки зору є застосування препаратів комплексної дії. Омега-3-поліненсичені жирні кислоти, покращуючи мікроциркуляцію, маючи протизапальну та мембранопротекторну дію запобігають утворенню щільного сполучнотканинного рубця в ділянці нейрорафії та покращують процес мієлінізації регенеруючих нервових волокон.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ
ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Корсак А.В., Чайковський Ю.Б., Козак Г.І., Городенко Л.К. Ультраструктурна організація дистального відрізка сідничного нерва щура за умов відтворення експериментальної моделі травми периферійного нерва та застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот // Таврический медико-биологический вестник. – 2006. – Т.9.
– №3. – С. 83-86. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз отриманих даних і написання фрагменту роботи).

2. Корсак А.В., Стеченко Л.О., Куфтирева Т.П., Козак Г.І. Морфологічні зміни периферійного нерва щура за умов його пошкодження та застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот // Вісник наукових досліджень. – 2006. – №3. – С. 133-135. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз отриманих даних і написання фрагменту роботи).

3. Корсак А.В., Чайковський Ю.Б. Морфологічна характеристика процесу регенерації пошкодженого периферійного нерва та за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот // Вісник морфології. – 2007. – №2. – С. 236-239. (Автором самостійно проаналі-зована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз отриманих даних і написання роботи).

4. Корсак А.В., Чайковський Ю.Б., Куфтирева Т.П., Козак Г.І. Ультраструктурна характеристика процесу мієлінізації за умов експериментальної моделі травми периферійного нерва та застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот // Світ медицини та біології.
– Полтава, 2007. – №1. – С. 11-14. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз отриманих даних і написання фрагменту роботи).

5. Корсак А.В., Чайковський Ю.Б., Грабовий О.М., Скибінська Т.Р. Морфологічна характеристика регенераційної невроми периферійного нерва за умов його пошкодження та застосування омега-3-поліненасичених кислот // Морфологія. – Дніпропетровськ, 2007. – Т.1,
№3. – С. 50-53. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз отриманих даних і написання роботи).

6. Чайковський Ю.Б., Корсак А.В. Вплив омега-3-поліненасичених жирних кислот на регенерацію периферійного нерва. ІІ наукова конференція “Карповські читання”. – Дніпропетровськ, 2005.
– С. 72-73.

7. Корсак А.В., Чайковський Ю.Б. Регенерація периферійного нерва за умов застосування омега-3-поліненасичених жирних кислот. Міжнародна спеціалізована виставка “Індустрія охорони здоров’я – 2005”. – Київ, 2005. – С.19.

8. Корсак А.В., Чайковський Ю.Б. Морфологічні дослідження уоллерівської дегенерації за умов експериментальної моделі травми периферійного нерва та застосування омега-3-поліненасичених жирних