ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ПАЛАГІНА ІРИНА АНАТОЛІЇВНА

УДК: 577.122 / 123.5: 615.9: 667.281

ВПЛИВ ДИСПЕРСНИХ АЗОБАРВНИКІВ

НА БІОСИНТЕЗ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ І БІЛКІВ

З УРАХУВАННЯМ ВІДДАЛЕНИХ ЕФЕКТІВ

03.00.04 - біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у лабораторії промислової токсикології Державного підприємства Харківський науково-дослідний інститут гігієни праці та профзахворювань Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Клименко Анатолій Іванович,

Харківський державний інститут фізичної культури

Міністерства освіти України та Державного комітету

України з фізичної культури та спорту,

завідувач кафедри біологічних основ

фізичного виховання та спорту.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Луговий Володимир Йосипович,

Інститут проблем кріобіології і

кріомедицини НАН України (м. Харків),

завідувач відділу кріопротекторів

доктор біологічних наук

Князєва Марина Владиславівна,

Харківський інститут удосконалення лікарів МОЗ України,

професор кафедри клінічної біохімії та

судово-медичної токсикології

Провідна установа: Інститут фармакології і токсикології АМН України

(відділ біохімічної фармакології), м. Київ

(рішенням спецради прот. № 2 від 3.03.99 р. змінена на

Львівський державний університет ім. I. Франка

Мiнiстерства освiти України (кафедра біохімії), м. Львiв).

Захист відбудеться “17 ” березня 1999 р. о 1515 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.17 при Харківському державному університеті за адресою: 310077, м. Харків, площа Свободи, 4, ауд. 3-15

(рішенням спецради прот. № 2 від 3.03.99 р. захист перенесено на 21 квітня 1999 р)

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету Міністерства освіти України за адресою: 310077, м. Харків, площа Свободи, 4

Автореферат розісланий “_5_” лютого 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат біологічних наук В.І. Падалко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Вивчення динаміки біосинтезу нуклеїнових кислот і білків, механізмів цих процесів та їх регуляції є однією з фундаментальних проблем біохімії. Останнім часом дослідження у цій галузі було спрямовано насамперед на вивчення біосинтезу ДНК, РНК і білків у нормальних клітинах тварин за різного фізіологічного стану (старіння, збудження та інші) [И.Ю.Хилобок и соавт., 1986; А.И.Клименко и соавт., 1987, 1988, 1991; А.Н.Котеров, 1994, 1997; Т.Г. Мозжухина и соавт., 1996, 1997; G.Almouzni, 1993]. На сучасному етапі розвитку біохімії актуальними є дослідження особливостей їх біосинтезу у клітинах при різних формах патології (пухлинний ріст, вірусні інфекції та ін.), а також за умов дії радіації, мутагенів та інших факторів. Така зміна спрямованості досліджень зумовлена зростанням реального навантаження на організм людини шкідливих чинників різної природи, переважно хімічних, внаслідок інтенсивного забруднення навколишнього середовища [Ю.И.Губський и соавт, 1993; А.М.Сердюк, 1996]. Вказані негативні явища суттєво відбиваються на показниках здоров’я населення. Так, в Україні за 1992-1997 рр. збільшилася на 16 % онкологічна захворюваність хімічної етіології. Це також стосується ряду інших захворювань, які пов’язані з пошкодженням генетичної інформації під час синтезу клітинних компонентів, тобто спадкових захворювань, порушень репродуктивної функції, ускладнень перебігу вагітності [А.М. Сердюк, 1997]. Всі ці форми патології найчастіше зумовлені дією на організм генетично активних чинників, у т.ч. ксенобіотиків. Серед останніх значний відсоток складають хімічні речовини, що мають мутагенні, канцерогенні, гонадо- та ембріотропні властивості [І.Р.Бариляк і співавт., 1996; Є.Г.Гончарук і співавт., 1996].

Відомо, що молекулярною основою віддалених наслідків, обумовлених впливом ксенобіотиків, є порушення структурно-функціонального стану генетичного апарату на різних рівнях його організації, включаючи їх взаємодію з ДНК, компонентами хроматинового комплексу та ядерним матриксом [Т.Г.Съяксте и соавт., 1991; F.Perera, 1991; A.Dipple, 1995]. Розвиток віддалених ефектів супроводжується значною перебудовою метаболічних процесів у клітинах, а першою ланкою у сплетінні таких перетворень є порушення обміну нуклеїнових кислот, зокрема їх біосинтезу [К.Ф.Сейц и соавт., 1986; М.А.Царцидзе, 1991; В.П.Иванов и соавт., 1996; E. Lee et al., 1989; T. Boulikas, 1992].

Однак, залишається нез’ясованим питання, які саме зміни динаміки процесів реплікації та транскрипції пов’язані з канцерогенезом, мутагенезом та іншими генетично зумовленими ефектами за умов дії на організм ксенобіотиків.

Недостатньо вивченою є також проблема механізмів порушень синтезу ДНК і РНК під впливом різних хімічних речовин. Зміни функціональної активності ядерного апарату в значній мірі впливають на біосинтез ядерних білків, в першу чергу гістонових і негістонових [С.Н.Голиков и соавт., 1986; Ю.И.Митрюхин и соавт., 1989; А.И.Клименко и соавт., 1991]. Зміни динаміки біосинтезу нуклеїнових кислот і білків, механізми порушень цих процесів за умов дії різних класів генотоксичних хімічних сполук можуть мати як загальні закономірності, так і певну специфічність. Тому вивчення біосинтезу ДНК, РНК і білків в умовах дії різних ксенобіотиків, які здатні спричиняти віддалені ефекти (мутагенний, канцерогенний гонадотропний та ін.), є вельми актуальним.

Однією з найбільш відомих груп генотоксичних канцерогенів є сполуки класу аміноазобензолів [H.Mori, 1990; K.Chung, 1992; IARC monographs, 1991, 1993; P. Shubik, 1995], до яких належить і нова, практично ще невивчена група ксенобіотиків - дисперсні азобарвники (похідні 4-нітро-4’-аміноазобензолу). Ці сполуки, як фактори ризику віддалених ефектів, становлять значний науковий інтерес у плані дослідження їх впливу на біосинтез нуклеїнових кислот і білків.

Все вище викладене засвідчує актуальність проведення досліджень біосинтезу нуклеїнових кислот і ядерних білків та оцінки зв’язку цих процесів з віддаленими ефектами під час моделювання канцерогенезу, мутагенезу та порушень сперматогенезу, зумовлених впливом нітроаміноазобензолів. Дослідження у цьому напрямку мають важливе наукове значення, з одного боку, для з’ясування патогенезу форм захворювань, пов’язаних з пошкодженням генетичного апарату, а з другого, для встановлення закономірностей генотоксичної дії дисперсних азобарвників з класу аміноазобензолів.

Актуальність досліджень впливу дисперсних азобарвників (ДАБ) на біосинтез нуклеїнових кислот і білків зумовлена ще й тим, що з цими сполуками контактують значні контингенти працівників, що створює реальну загрозу професійних захворювань [Н.М.Кузьменко, 1986; М.А.Ващук, 1989; В.Л.Стародумов, 1991]. Такі дослідження мають важливе значення для розв’язання прикладної проблеми розробки профілактичних заходів — удосконалення науково-методичних пiдходів до гiгiєнiчного регламентування сполук цього класу.

Зв'язок роботи з науковими програмами та темами. Матерiалами даної дисертацiйної роботи є результати дослiджень, одержанi автором під час виконання НДР "Вивчення токсикодинамiки i обгрунтування гiгiєнiчних регламентiв з урахуванням вiддалених ефектiв для iндивiдуальних i сумiшних марок дисперсних азобарвникiв", N державної реєстрацiї 01. 90.0016.666.

Мета роботи - аналiз особливостей біосинтезу та змін кількісного вмісту нуклеїнових кислот (ДНК, РНК) та різних класів ядерних білків (гістонових, негістонових, глобулінових) під впливом дисперсних азобарників з урахуванням віддалених наслідків та проявів токсичної дії.

Завдання дослiдження:

1. Вивчити вплив ряду ДАБ на бiосинтез, кiлькiсний вмiст та співвідношення ДНК і РНК у ядрах клітин печiнки, сiм'яників та кiсткового мозку щурiв in vivo за умов одно- та семиразової пероральної дії, а також хронічної інгаляції.

2. Провести дослідження особливостей біосинтезу гістонових, негістонових і глобулінових білків та змін їх кiлькiсного вмiсту у ядрах клітин печінки щурів in vivo за умов одноразової пероральної дії та хронічної інгаляції ряду ДАБ.

3. Оцiнити характер змін кількісних співвідношень між нуклеїновими кисло-тами та білками, та між різними білками у печінці щурів під впливом ряду ДАБ.

4. Встановити зв’язок змін біосинтезу ДНК, РНК і білків з віддаленими ефектами (мутагенним і гонадотропним) та проявами загальнотоксичної дії ДАБ.

5. На підставі отриманих результатів досліджень обгрунтувати гiгiєнiчнi регламенти у повiтрi робочої зони для вивчених дисперсних азобарвникiв.

Наукова новизна i теоретична значущiсть роботи.

1. Отримані дані з біохімії нового класу ксенобіотиків - дисперсних азобарвників які належать до групи промислових отрут і є чужорідними для нормальних метаболічних шляхів організму. Вперше вивчені особливості біосинтезу нуклеїнових кислот та різних класів білків, зміни їх кількісного вмісту та співвідношень між ними в ядрах клітин різних органів за умови дії ДАБ. Встановлено, що характер та ступінь вираженості вказаних процесів залежать від дози, шляху та кратності введення, часу експозиції, а також особливостей метаболізму у дослідженому органі. На фоні цих змін вперше досліджені можливі віддалені наслідки пошкоджуючого впливу цих сполук на організм, а також прояви їх загальнотоксичної дії.

2. Показано, що одним з механiзмів, що визначають генотоксичний, а також канцерогенний ефект аміноазобензолів, є зміни (переважно гальмування) бiосинтезу ДНК, гістонових та негістонових білків у ядрах клітин органів-мішеней (печінки та сім’яників). Гальмування біосинтезу ДНК, а також генетичні пошкодження у статевих клітинах самців можуть бути одним з механізмів порушення репродуктивної функції тварин. Встановлено, що головним елементом механiзму загальнотоксичної дiї ДАБ є їх пошкоджуючий вплив на еритроцити за рахунок здатностi iнактивувати гемоглобiн в мет- i сульфгемоглобiн з подальшим утворенням тiлець Гейнця i розвитком гемолiтичної анемiї.

3. Обгрунтовано комплекс пріоритетних дiагностичних критерiїв для оцінки вибірковості пошкоджуючої дії ДАБ на організм, який може бути використаний з метою гiгiєнiчного регламентування сполук класу ДАБ.

Практична значущiсть роботи.

1. Рекомендовано експериментально обгрунтований методичний пiдхiд до гiгiєнiчного регламентування сполук класу ДАБ, заснований на виявленнi змін біосинтезу нуклеїнових кислот та ядерних білків, специфiчних вiддалених ефектiв (мутагенного і гонадотропного) як прiоритетних критерiїв оцiнки їх пошкоджуючої дiї на органiзм.

2. Експериментально обгрунтовані гранично допустимі концентрації (ГДК) у повiтрi робочої зони для 4 азобарвникiв: Червоно-коричневого Ж (ДЧК-Ж), Червоного Ж (ДЧ-Ж), Темно-синього З (ДТС-3) i Червоного 2С (ДЧ-2С) дозволяють здiйснювати перебiжний i попереджуючий санiтарний нагляд за вмiстом цих барвникiв у повiтрi виробничих примiщень, що є важливим профілактичним заходом.

3. Одержані біохімічні, генетичні та токсикологічні дані бiологiчної дiї ДАБ використанi при складаннi профiлактичних рекомендацiй, спрямованих на оптимiзацiю умов працi і попередження розвитку професiйних захворювань працівників вiдповiдних виробництв.

4. Результати досліджень особливостей біосинтезу нуклеїнових кислот і білків під впливом ДАБ мають важливе значення для розробки ефективних антиканцерогенних препаратів, механізм дії яких заснований на блокуванні синтезу ДНК та білків у ядрах пухлинних клітин.

Впровадження результатів дослідження до практики.

1. Дані про генотоксичну і гонадотропну небезпеку вивчених ДАБ використано для складення нормативно-технічної документаціі на ці хімічні сполуки та технологічні процеси шляхом включення у розділи “Вимоги безпеки та охорони навколишнього середовища” (1994 р.). Ці вимоги було впроваджено на підприємствах анілінофарбової галузі промисловості України.

2. Відомості про особливості біологічної дії вивчених ДАБ включено до банку даних реєстру потенційно токсичних та небезпечних хімічних речовин РФ.

3.Для профілактики професійних захворювань у виробництві дисперсних азобарвників експериментально обгрунтовані величини ГДК у повітрі робочої зони, які затверджені та включені у доповнення № 4 до переліку ГДК (від 15.11.1989) для ДЧ-2С, № 8 для ДЧ-Ж і ДТС-З (від 1.06.1993) та № 9 (від 1.01.1994) для ДЧК-Ж.

Особистий внесок дисертанта в отримані наукові результати.

Автор особисто провів інформаційний пошук та критично оцінив наявну літературу за темою дослідження, визначив мету та завдання досліджень, шляхи їх розв’язання. Автором особисто та за його безпосередньою участю виконані всі етапи експериментальних досліджень особливостей біосинтезу ДНК, РНК та ядерних білків в різних органах під впливом ДАБ, а також віддалених наслідків та проявів токсичної дії цих сполук. Автором особисто виконано статистичну обробку одержаних результатів, особисто та у співпраці з науковим керівником проаналізовані результати досліджень. Вивчення мутагенного (методом домінантних летальних мутацій) і гонадотоксичного ефектiв здійснено з участю наук. співроб. лабораторії промтоксикології ДП Харківський НДІ гігієни праці та профзахворювань Д.М.Девейкiс. Консультативна допомога в інтерпретації результатів токсикологічних досліджень подана провідним науковим співробітником лабораторії промтоксикології означеного підприємства, канд. мед. наук В.І. Звездай.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Матерiали дисертацiї були представленi i обговоренi на конференцiї молодих вчених Харкiвського НДI гiгiєни працi i профзахворювань (1989, 1993, 1994, 1997), мiжнародному симпозiумi "Проблеми токсикологiї i прикладної екологiї" (Москва-Пермь, 1991), засiданнi Харкiвського вiддiлення Українського товариства фармакологiв i токсикологiв (1992), засiданнi секцiї "Промтоксикологiя" при проблемнiй комiсiї "Науковi основи гiгiєни працi i профпатологiї" (Москва, 1993), конференцiї до 100-рiччя з дня народження О.I. Черкеса "Школа акад. О.Черкеса: iдеї, розвиток, перспектива" (Київ, 1994), II з'їздi медичних генетикiв України (Львiв, 1995), нацiональному з'їздi гiгiєнiстiв України (Київ, 1997), 1 Мiжнародному медичному Конгресi студентiв i молодих вчених (Тернопiль, 1997), міжнародному симпозiумi "Безплiддя. Допомiжнi репродуктивнi технологiї" (Київ, 1997), науковій конференції “Актуальні проблеми гігієни праці і профпатології в машинобудуванні та хімічній промисловості” (Харків, 1998).

Публiкацiї. За матерiалами дисертацiї опублiкованi 22 науковi роботи (з яких 7 самостiйнi), в тому числi: 9 статей у наукових журналах, 4 статтi у збiрниках наукових праць, 9 робiт у матерiалах i тезах конференцiй.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацiя складається зі вступу, огляду лiтератури (роздiл 1), викладення i обговорення власних дослiджень, включаючи методичну частину (роздiли 2-7), заключення, висновкiв, списку лiтератури i додатку. Обсяг дисертацiї - 150 сторiнок, в тому числi 13 малюнкiв - 13 стор., 18 таблиць (3 - за текстом, 15 - у додатку) - 22 стор., список використаної лiтератури (196 джерел: 107 вiтчизняних та країн СНД i 89 іноземних) - 16 стор., додаток А - 18 сторінок.

МАТЕРIАЛИ I МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ

В роботi використано 1194 статевозрiлих білих щурiв обох статей популяції Вістар і 102 нелiнiйнi бiлi мишi. В експериментальних дослідженнях тварини зазнавали впливу азобарвникiв ДЧК-Ж, ДЧ-2С, ДТС-3, ДЧ-Ж, ДО-2К i ДР (похiдних 4-нiтро-4'-амiноазобензолу). Ці сполуки відрізняються між собою природою замісників у бензольних кільцях (бром-, хлор, ціан-, ацетаміно-, метокси-) та по аміногрупі (етил-, ціанетил-, оксиетил-, ацетоксиетил-, пропіонилоксиетил-).

Вплив ДАБ на особливості біосинтезу і кiлькiсного вмiсту ДНК і РНК, гiстонових (ГБ), негiстонових (НГБ) i глобулiнових (ГлБ) білків ядер досліджено в печiнцi, сiм'яниках та кiстковому мозку щурiв-самцiв у трьох незалежних постановках експериментів in vivo: за умов короткочасної дії ДАБ, тобто перорального одноразового введення ДТС-З, ДЧ-2С, ДО-2К і ДР (5 г/кг) i ДЧК-Ж (1,61 г/кг = 1/2 DL50) та 7-разового введення ДО-2К (1 г/кг) і ДЧК-Ж (0,32 г/кг = 1/10 DL50), а також в умовах хронiчної iнгаляцiї ДЧК-Ж (2,5 і 4 місяці; 25,4 і 5,3 мг/м3). Як позитивний контроль використовувалось введення еталонного мутагену циклофосфаміду. Тварин декапітували через 6, 24 і 48 год. після останнього введення сполук

З метою вивчення біосинтезу ДНК і РНК щурам за 2 години до забою, а для вивчення біосинтезу білка - за 1 годину вводили в черевну порожнину мічені попередники: 3Н-тімідін (2 Мбк/100 г м.т.), 3Н-урідін (1 МБк/100 г м.т.) і 14С-амінокислоти гідролізату білків хлорели (1 МБк/100 г м.т.). Ядра з гомогенату досліджених органів виділяли методом диференційного центрифугування у 0,25 М і 0,31 М розчинах сахарози з добавкою MgCl2х6H2O і тріс-HCl [Chauveau J. et all., 1956]. Концентрацiю ДНК i РНК визначали за методом Д.Шмiдта i С.Таннгаузера в модифiкацiї М.Г.Трудолюбової [1977] та спектрофотометрично [А.С.Спирін, 1960]. Глобулінову фракцію ядерних білків отримували в процесі промивки ядер 0,14 М розчином NaCl і центрифугування при 2500 g. Гістонову фракцію білків з осадів препаратів ядер отримували екстракцією за допомогою 0,25 N HСl і подальшим центрифугуванням при 2500 g. Екстракцію НГБ з препаратів ядер проводили у 0,1 N NaOH, далі білковий екстракт відділяли центрифугуванням (2500 g). Концентрацію ГлБ і ГБ визначали по оптичній щільності при довжині хвилі 280 нм на спектрофотометрі СФ-46; НГБ - за методом Д. Лоурi та спiвавт. [1951] та спектрофотометрично при двох хвилях 260 і 280 нм [Г.А. Кочетков, 1980] з попереднім їх переосаджуванням у 5 % трихлороцтовій кислоті.

Iнтенсивнiсть бiосинтезу ДНК, PНК i бiлкiв визначали радiоiзотопним рiдинно-сцинтиляцiйним методом [С.А.Остерман, 1983; Рук-во ВОЗ по КСТ, 1989]. Радіоактивність у пробах вимірювали на лічильнику Бета-I у рідинному сцинтиляторі, який містить на літр діоксану 100 г нафталіну, 5 г 2,5-діфенілоксазолу і 250 мг 1,4-ді-5-феніл-2-оксазолілбензолу. У флакон для рахування вносили 0,5 мл проби та 15 мл сцинтилятора.

Мутагенна активнiсть ДАБ вивчалася в системi короткочасних тестiв (КЧТ): тестi Еймса [Л.М.Фонштейн i спiвавт.,1985], цитогенетичним методом (урахування частоти хромосомних аберацiй (ХА) в клiтинах кiсткового мозку щурiв in vivo) i тесті на індукцію частоти домiнантних летальних мутацiй (ДЛМ) у щурів-самців [I.В. Саноцький та спiвавт., 1978; Рук-во ВОЗ по КСТ, 1989]. Токсичний вплив барвникiв на гонади самцiв щурiв дослiджувався з використанням комплекса функцiональних i морфологiчних показникiв стану сперматогенезу, а також морфо-структурного аналiзу сiм'яникiв [I.В. Саноцький, 1979; Н.Н. Литвинова, 1983].

Особливостi токсикодинамiки ДАБ вивчались за умови гострого (введення у шлунок 5 г/кг, для ДЧК-Ж - 1/2 DL50) і пiдгострого (30-кратне введення у шлунок 1 г/кг, для ДЧК-Ж - 1/5 i 1/20 DL50) експериментів, а у випадку ДЧК-Ж також в умовах хронічної iнгаляцiйної дії (4 мiс., 24,9 i 6,0 мг/м3) з урахуванням впливу на функціональний стан печінки і кров. Експериментальнi данi обробленi методом варiацiйної статистики з використанням t-критерiя Ст'юдента [Г.Ф. Лакiн, 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

В результатi вивчення впливу дисперсних азобарвників на біосинтез і кількісний вміст нуклеїнових кислот (ДНК, РНК) та різних класів білків ядер (ГБ, НГБ і ГлБ), встановлено, що ксенобіотики цього класу викликають різнохарактерні зміни зазначених біохімічних процесів в органах-мішенях в залежності від способу та тривалості введення сполук і часу експозиції після їх дії.

На першому етапі в умовах одноразової пероральної дії ДАБ досліджено біосинтез і кількісний вміст ДНК у трьох органах: печінці, сім’яниках і кістковому мозку щурів у динаміці. У ядрах клітин печінки за умови дії азобарвників ДР, ДТС-З і ДЧК-Ж спостерігались двоетапні зміни інтенсивності біосинтезу ДНК: гальмування включення 3Н-тімідіну в ДНК (через 6 і 24 години після введення), яке змінюється в подальшому (через 48 год.) стимуляцією цього процесу (рис. 1). На фоні цих змін відзначено підвищення кількісного вмісту ДНК у печінці через 24 години, згодом (48 год.) - різке зниження цього показника. Азобарвники ДО-2К і ДЧ-2С в аналогічних умовах досліду спричинювали лише виражену стимуляцію включення 3Н-тімідіну в ДНК ядер клітин печінки через 48 годин, а також зниження її кількісного вмісту (24 і 48 год. відповідно).

Гальмування біосинтезу ядерної ДНК з наступною стимуляцією може бути наслідком міцного ковалентного зв’язування високореактивних метаболітів азобарвників з нуклеофільними сайтами ДНК і подальшої її структурної модифікації, що є характерним для ряду виражених генотоксичних і канцерогенних азосполук, близьких за хiмiчною структурою до вивчених ДАБ [K.Srinivasan, 1987; J.Miller, 1988; M.Stiborova, 1992; A.Dipple, 1995;]. Проте не виключено, що ці ефекти можуть бути зумовлені впливом ДАБ на взаємодію ДНК з білками ядер, a також ДНК-полімеразну активність [Т.В. Кириллова та співавт., 1984; W. Schmidt, 1989 et all.; B. Strauss, 1992]. Тільки стимуляція синтезу ДНК в умовах короткочасної дії властива сполукам, які мають слабку генотоксичність або пухлинопромоторну активність [В.В. Резцова, 1989; R. Zito, 1992].

Первісне підвищення вмісту ДНК на фоні гальмування її синтезу у печінці за дії ряду ДАБ, можливо, зумовлено зниженням ДНКазної активності і є однією з регуляторних реакцій клітин на введення генетично активних ксенобіотиків цього класу. Відмічене пізніше різке падіння кількісного вмісту ДНК, очевидно, є наслідком пригнічення біосинтезу ДНК у попередній період дослідження, а також може бути пов’язаним з зменшенням стабільності ДНК і підвищенням її чутливості до нуклеазної атаки ДНКазою внаслідок специфічної модифікації біомолекули.

Поряд з пригніченням біосинтезу ДНК у клітинах печiнки, ДАБ (ДР, ДЧК-Ж) в умовах одноразового введення здатні також спричиняти гальмування включення 3Н-тімідіну у ДНК ядер клітин сім’яників (через 6 і 24 год.). Разом з тим, цей ефект у клітинах сім’яників був менш виражений, ніж у печінці (рис. 1). Зазначені зміни у сім’яниках щурів, очевидно, зумовлені здатністю ДАБ проникати через захисний гемотестикулярний бар'єр i вступати у специфiчнi ковалентнi взаємодiї з ДНК гонад. Останнє може призвести до появлення генетично неповноцiнних статевих клітин i розвитку спадково обумовленої патологiї. Отже, одержанi данi свідчать про генотоксичну небезпеку ДАБ для потомства. У ядрах клiтин кiсткового мозку прояви порушення динаміки біосинтезу ДНК не виявлені (рис. 1).

Одержані дані вказують на те, що однією з критичних мішеней пошкоджуючої дiї ДАБ на рівні клітинного ядра є ДНК, бiосинтез і вміст якої потерпiли вираженi i закономiрнi змiни. Найбiльш значні порушення біосинтезу ДНК та зміни її кількісного вмісту під впливом ДАБ виявилися в печінці, якiй належить провiдна роль в метаболічній активації вихiдних нiтроамiноазобензолiв шляхом метаболiчних перетворень з формуванням генетично активних метаболiтiв (гiдроксиламiнiв, ариламiнiв, похiдних бензидину). Менш чутливим органом до генотоксичної дії цих сполук є сім’яники і нечутливим - кістковий мозок. З урахуванням критеріїв, які характеризують порушення обміну ДНК, барвники ДР, ДТС-З і ДЧК-Ж можуть бути віднесені до сполук, що мають сильний та помірно виражений генотоксичний ефект в умовах одноразового введення, а ДО-2К і ДЧ-2С - до сполук з слабкою генотоксичною активністю.

Подальші дослідження впливу ДАБ на біосинтез та вміст ДНК, РНК і ядерних білків проводились тільки на печінці щурів у різних постановках експериментів. В умовах 7-разового перорального введення, на прикладi двох марок азобарвникiв ДО-2К i ДЧК-Ж виявлено: гальмування біосинтезу ДНК у ядрах клітин печінки через 24 години з подальшим його відновленням (ДО-2К); стимуляцію через 48 годин (ДЧК-Ж); тенденцію до зниження кількісного вмісту ДНК (6 і 24 год. після дії ДО-2К і ДЧК-Ж відповідно) з подальшим (48 год.) його підвищенням у печінці.

Для хронічної інгаляції ДЧК-Ж є характерною виражена дозозалежна активація бiосинтезу ДНК та зростання її вмісту у ядрах клітин печінки, що свiдчить про посилення клiтинної пролiферацiї i властиво генотоксичним, канцерогенним амiноазобензолам в умовах тривалої дiї у малих дозах [Б.Л.Рубенчик, 1977; C. Rusov, 1995]. Отже, зазначенi змiни можуть бути ознакою не тiльки генотоксичної активностi, але й потенцiйної канцерогенної небезпечностi сполук цього класу за умови їх тривалого введення.

На вiдмiну вiд закономiрних змiн бiосинтезу i вмiсту ДНК в органах-мiшенях, ДАБ не викликають суттєвих змін цих параметрів РНК в умовах одно- та семиразового введення. Збiльшення кількісного вмісту РНК у печiнці через 6 годин після одноразової дії ДАБ (крім ДО-2К) і у меншій мірі через 24 години (для ДЧК-Ж і ДЧ-2С) може бути зумовлено зниженням на деякий час РНКазної активності і у зв’язку з цим оцінено, як одну з компенсаторних реакцій клітин у відповідь на введення ксенобіотиків. Цей ефект в окремих випадках також пов’язано з активацією біосинтезу РНК (24 год.), можливо, за рахунок підвищення транскрипційної активності переважно тих генів, які відповідальні за синтез низькомолекулярних РНК, та/або за рахунок стимуляції РНК-полімеразної активності. Це припущення грунтується на тому, що, як відомо [Т.Г.Съяксте, 1991; D. Clavson, 1992], більшість аддуктів генотоксичних аміноазосполук розташовується на ділянках ДНК, які збагачені високоповторювальними послідовностями (переважно Г-Ц-повторами), що виконують регуляторні функції. У зв’язку з цим, під впливом ДАБ може значно посилюватися синтез низькомолекулярних РНК, тоді як синтез високомолекулярних РНК може бути пригніченим на деякий час. В умовах хронічної інгаляції ДЧК-Ж спостерігалась дозозалежна активація біосинтезу РНК у ядрах клітин печінки, пов’язана зі стимуляцією біосинтезу ДНК. Цей ефект може бути ознакою підвищення активності системи транскрипції при тривалій дії ксенобіотиків цього класу

Відповідно до змін кількісного вмісту ДНК і РНК під впливом ДАБ встановлено динамічність співвідношеня РНК/ДНК у печінці щурів. В умовах одноразової дії ДАБ виявлено підвищення РНК/ДНК через 6 і 48 годин. За умов 7-разового введення ДАБ спостерігалось підвищення РНК/ДНК через 6 і 24 години та його зниження через 48 годин. За хронічної дії ДЧК-Ж (25,3 мг/м3) відзначено зниження цього показника.

Вивченi ДАБ також здатнi викликати специфічні зміни біосинтезу та вмісту різних класів ядерних білків (рис. 2). В умовах одноразового введення всіх ДАБ через 6 і 24 години спостерігалась активація біосинтезу гістонів у ядрах клітин печінки (для ДО-2К - у вигляді тенденції) у поєднанні з підвищенням їх загального вмісту та вмісту відносно ДНК, а також зниженням співвідношення НГБ/ГБ (крім ДО-2К і ДЧ-2С). Зазначені зміни можуть посередньо вказувати на підвищення структуризації хроматинового комплексу. Останнє, певно, може призводити до зміни ступеня ковалентної взаємодії генотоксичних сполук з ДНК у складі хроматинових структур. Ці зрушення, які спостерігались паралельно з накопиченням кількісного вмісту ДНК та РНК, також можна оцінити як компенсаторно-пристосовчі реакції клітин у відповідь на пошкоджуючу дію ДАБ, зокрема у вигляді пригнічення біосинтезу ДНК. Через 48 годин після одноразової дії ДАБ відмічалося зниження вмісту гістонів (за винятком ДР) та інтенсивності їх біосинтезу (для ДЧ-2С як слабка тенденція) на фоні падіння вмісту ДНК у печінці (рис. 2) Однією з причин такого ефекту є попереднє (6 і 24 год.) гальмування біосинтезу ДНК. Не виключена також можливість модифікації цих білків внаслідок ковалентної взаємодії з азобарвниками, оскільки, як відомо [W.Schmidt, 1989], генотоксичні аміноазосполуки здатні найбільш інтенсивно взаємодіяти з ГБ серед інших класів ядерних білків. Ознакою останнього може служити падіння вмісту ГБ у печінці. В умовах хронічної дії ДЧК-Ж (25,4 і 5,3 мг/м3) виявлено активацію біосинтезу ГБ, взаємопов’язану з інтенсифікацією біосинтезу ДНК і РНК у печінці.

Біосинтез НГБ у ядрах клітин печінки за умови одноразової дії ДАБ через 6 годин не змінювався і тільки у випадку ДР спостерігалась його активація. Через 24 години всі ДАБ викликали гальмування біосинтезу НГБ (для ДЧ-2С - у вигляді слабкої тенденції) на фоні зростання кількісного вмісту цих білків у печінці (рис. 2). Перше зрушення, можливо, могло виникнути внаслідок блокування генів, які відповідальні за синтез НГБ, виходячи з встановленого факту гальмування біосинтезу ДНК на цьому ж етапі досліджень. Але оскільки гальмування синтезу НГБ не у всіх випадках відбувалося паралельно з пригніченням синтезу ДНК, то цей ефект також може бути зумовленим порушенням процесу трансляції. Підвищення вмісту НГБ і співвідношення НГБ/ГБ, можливо, виникає за рахунок зниження активності процесів катаболізму відповідного класу білків і відносно цього має компенсаторний характер. Через 48 годин після одноразової дії ДАБ синтез НГБ відновлювався, а у випадку ДО-2К і ДТС-З відмічено його слабку стимуляцію (рис. 2). Поряд з вищеозначеними змінами, спостерігалось падіння вмісту НГБ у печінці через 6 годин після дії ДР і ДТС-З та 48 годин - ДЧК-Ж і ДО-2К, що може бути ознакою пошкоджуючого впливу цих сполук на обмін НГБ. В умовах хронічної інгаляції ДЧК-Ж не впливає на біосинтез білків цього класу.

Для дії вивчених ДАБ є характерним гальмування біосинтезу глобулінів у ядрах клітин печінки, яке спостерігалось на різних етапах досліджень після одноразового введення сполук. Цей ефект виявлено за умов дії ДР і ДЧК-Ж через 6, а ДТС-З також і через 24 год. з подальшим його відновленням (24 і 48 год. для ДР і ДТС-З відповідно) або стимуляцією (24 год. для ДЧК-Ж). Під впливом ДЧ-2С гальмування біосинтезу ГлБ спостерігалось через 24 і 48 годин, а для ДО-2К - лише 48 годин з попереднім підвищенням його інтенсивності (6 і 24 год. відповідно). На першому етапі (6 год.) гальмування синтезу ГлБ встановлено тільки для тих азобарвників, які у той же час гальмували біосинтез ДНК (тобто ДР, ДТС-З і ДЧК-Ж), пізніше - для решти сполук (ДО-2К і ДЧ-2С), які стимулювали синтез ДНК через 48 годин (рис. 1, 2). В аналогічних умовах досліду також виявлено різке зниження кількісного вмісту ГлБ у печінці через 24 год. після дії ДТС-З, та підвищення - через 48 год. під впливом всіх ДАБ (для ДТС-З і ДР - у вигляді тенденції). Останнє, очевидно, зумовлено порушенням процесів катаболізму цих білків. Хронічна дія ДЧК-Ж (5,3 мг/м3) призводила до активації біосинтезу ГлБ у печінці.

ДАБ в умовах одноразової дії також обумовлювали специфічні зміни кіль-кісних білок-білкових і білок-нуклеїнових співвідношень. Спостерігались зміни співвідношення НГБ/ГБ: зниження через 6 годин (ДР, ДТС-З і ДЧК-Ж) та підвищення через 24 під впливом всіх ДАБ і 48 годин у випадку ДТС-З і ДЧ-2С; ГБ/ДНК: підвищення через 6 і більш різко - через 48 годин (крім ДО-2К); ГБ/РНК: падіння через 6 годин (крім ДО-2К), зростання через 24 (для ДР і ДТС-З) та зменшення через 48 годин (у випадку ДЧ-2С і ДО-2К). Для короткочасної дії ДАБ також є характерним значне зростання співвідношення НГБ/ДНК і у більшій мірі ГлБ/ДНК через 48 годин після їх введення.

Виявлені під впливом ДАБ порушення біосинтезу та зміни кількісного вмісту і співвідношень ДНК і різних класів білків ядер (ГБ, НГБ і ГлБ) у печінці та сім’яниках щурів у динаміці свідчать про генотоксичну активність цих сполук. Зазначені критерії можуть використовуватись для оцінки генотоксичних властивостей нових сполук цього класу (похідних нітроаміноазобензолу).

Порушення біосинтезу ДНК та ядерних білків в значній мірі можуть бути пов’язані з мутагенною активністю ДАБ, яка встановлена у різних категоріях короткочасних тестів (КЧТ). Вивченi ДАБ виявили мутагенність у тестi Еймса, iндукуючи переважно фрейм-шифт геннi мутацiї на штамi S. typhimurium ТА-98, в меншiй мiрi мутацiї замiни пари нуклеотидних основ на штамi ТА-100 як в системi з метаболiчною активацiєю, так i без неї. Виходячи з отриманих даних цитогенетичного аналізу клітин кісткового мозку щурів in vivo, ДАБ в умовах 6-разової пероральної дiї (ДЧК-Ж, ДТС-3, ДЧ-Ж i ДР) та хронiчної інгаляції (ДЧК-Ж) спричиняють структурнi пошкодження хромосом в соматичних клiтинах. Генетичнi порушення у статевих клiтинах щурiв-самцiв виявленi на прикладі ДЧК-Ж, дослідженого в умовах хронiчної дiї на рiвнi 25,4 i 5,3 мг/м3. Цей азобарвник зумовлював дозозалежну iндукцiю ДЛМ у статевих клiтинах на пiзнiх стадiях сперматогенезу, про що свiдчить пiдвищення загальної ембрiональної смертностi переважно за рахунок постiмплантацiйних i в меншiй мiрi доiмплантацiйних втрат. Решту ДАБ по аналогiї з ДЧК-Ж i ранiше вивченим ДО-2К [С.Є.Хипко, 1992], якi мають мутагенну активнiсть у тестi ДЛМ, також можна вiднести до потенцiйно небезпечних речовин по пошкоджуючiй дiї на генетичний апарат статевих клiтин. Азобарвники класифіковані в залежностi вiд ступеню мутагенного ефекту у різних КЧТ [Л.I.Фонштейн і спiвавт.,1977; В.B.Саноцький,1979; Н.П.Бочков, 1989].

ДАБ виявляють специфiчну дiю на репродуктивну систему щурів-самцiв. Цей ефект проявляється у вигляді гальмування біосинтезу ДНК і мутацій у статевих клітинах, як показано вище, а також дистрофiчних i некробiотичних змiн сiм'яних канальцiв, що закiнчувались зпустошенням значної їх частини. Виявленi також змiни функцiональних i морфометричних показникiв, що свiдчать про порушення процесу сперматогенезу.

Особливiстю токсикодинамiки ДАБ є порушеня функціонального стану печiнки. Характерним проявом загальнотоксичної дiї азобарвників також є враження еритроцитів у виглядi мет- i сульфгемоглобiнемiї з наступною деструкцiєю гемоглобіну та утворенням тiлець Гейнця i, як наслiдок, розвитку анемiї.

Специфічні зміни біосинтезу і вмісту ДНК і ядерних білків (ГБ, НГБ), поряд з критеріями мутагенності та гонадотропності, були використанi з метою обгрунтування ГДК вивчених ДАБ у повiтрi робочої зони.

Для азобарвника ДЧК-Ж, нормованого за повною програмою токсикологiчних дослiджень, в умовах хронiчної iнгаляцiї поріг шкідливої дії за критерiями загальної токсичностi (гепато- i нейротоксичний ефект) - Limch перевищує 6 мг/м3, проте поріг віддалених ефектів за критеріями генотоксичності і гонадотропності - Limch sp знаходиться значно нижче 5 мг/м3. Враховуючи бiльш вираженi гонадотропнi i особливо генотоксичнi властивостi цього барвника порiвняно з ДО-2К - родоначальником ряду ДАБ, нормованого з урахуванням вiддалених ефектiв на рiвнi 0,5 мг/м3 [М.А. Ващук, 1989], як ГДК для ДЧК-Ж рекомендована i затверджена величина 0,3 мг/м3 (аерозоль, II клас небезпечностi).

Визначена на прикладi ДЧК-Ж бiльш висока iнформативна значущiсть критерiїв пошкоджуючої дiї на генетичний апарат i репродуктивну систему у порiвняннi з критерiями загальної токсичностi пiдтверджена також на прикладi решти ДАБ, нормованих з використанням прийому аналогiї у рядах сполук, близьких за хiмiчною структурою та бiологiчною дiєю. Спершу гiгiєнiчнi регламенти для ДТС-3, ДЧ-Ж, ДЧ-2С i ДР були обгрунтованi тiльки з урахуванням загальнотоксичних критерiїв (в основному гемотоксичного ефекту). Однак одержанi нами данi, якi свiдчать про їх генотоксичну активнiсть, обгрунтовують необхiднiсть коригування затверджених для них величин ГДК у бiк зниження. Оскiльки азобарвники ДТС-3 i ДР близькi по ступеню вираженостi генотоксичного і гонадотропного ефекту до ДЧК-Ж, для них рекомендована така ж величина ГДК, що i для ДЧК-Ж, тобто 0,3 мг/м3 (II клас небезпечностi). Для ДЧ-Ж i ДЧ-2С з урахуванням ступеня вираженостi специфiчних вiддалених ефектiв (в основному генотоксичного) ГДК рекомендованi на рiвнi 0,5 мг/м3 по аналогiї з ДО-2К.

Враховуючи встановлену нами ступiнь вираженостi генотоксичного i гонадотропного ефектів в ряду вивчених ДАБ, серед критерiїв специфiчної дiї прiоритетними визнанi критерiї генотоксичності: зміни бiосинтезу ДНК, ГБ і НГБ у ядрах клiтин печiнки та сім’яників, iндукцiя рiзних типiв ХА в клiтинах кiсткового мозку, iндукцiя ДЛМ. Друге мiсце по iнформативностi займають критерiї гонадотропної дiї (морфоструктурнi змiни текстикулярної тканини та комплекс морфометричних показникiв). На цій основі експериментально обгрунтовано удосконалений методичний пiдхiд, який може бути використаний для виявлення вiддалених ефектiв (пошкоджуючої дiї на генетичний апарат і порушень репродуктивної системи) i гiгiєнiчного регламентування ДАБ.

ВИСНОВКИ

1. Різноспрямовані зміни динаміки біосинтезу компонентів хроматину та порушення його регуляції за умов дії генетично активних ксенобіотиків обумовлюють порушення метаболічних процесів у клітинному ядрі та, зрештою, процесів регуляції клітинного гомеостазу в органах і тканинах.

2. ДНК-синтезуюча активність ядерного апарату клітин печінки та сім’яників під впливом ряду похідних 4-нітро-4’-аміноазобензолу (дисперсних азобарвників) після короткочасної їх дії пригнічується продовж доби та стимулюється на 48 годину; за умов хронічної дії відбувається дозозалежна активація біосинтезу ДНК. Найбільші зміни біосинтезу ДНК спостерігаються у печінці, менш виражені у сім’яниках та не виявляються у кістковому мозку.

3. Динаміка біосинтезу та кількість РНК у ядрах клітин печінки за короткочасної дії нітроаміноазобензолів на зазнає суттєвих змін, проте в умовах їх хронічної дії біосинтез РНК корелює з динамікою біосинтезу ДНК за цих же умов.

4. Біосинтез гістонових білків у ядрах клітин печінки під короткочасним впливом нітроаміноазобензолів стимулюється через 6 і 24 години після їх введення та пригнічується через 48 годин, тоді як біосинтез негістонових білків за цих же умов гальмується через 24 години з подальшим його відновленням (для окремих сполук - стимуляцією). Хронічна дія вивчених нітроаміноазосполук спричиняє активацію біосинтезу гістонових білків при відсутності змін синтезу НГБ. Зазначені зрушення свідчать про зміни структури та функціональної активності хроматинового комплексу під впливом нітроаміноазобензолів.

5. Динаміка біосинтезу глобулінових білків у ядрах клітин печінки за умови короткочасної дії є специфічною для кожного вивченого похідного 4-нітро-4’-аміноазобензолу. Для ДР і ДЧК-Ж біосинтез ГлБ гальмується через 6, а ДТС-З також і через 24 години з подальшим (48 год.) його відновленням або стимуляцією; для ДЧ-2С - через 24 і 48 годин, а для ДО-2К - тільки 48 годин з попереднім підвищенням його інтенсивності. Проте всі нітроаміноазосполуки через 48 годин обумовлюють зростання кількості ГлБ у печінці.

6. Зміни кількісних білок-білкових та білок-нуклеїнових співвідношень у ядрах клітин печінки за короткочасної дії нітроаміноазобензолів характеризуються зниженням (через 6 год.) та підвищенням (24 год.) НГБ/ГБ, підвищенням (48 год.) ГБ/ДНК, НГБ/ДНК та ГлБ/ДНК.

7. Короткочасна дія нітроаміноазобензолів призводить до різноспрямованих змін біосинтезу нуклеїнових кислот і білків з порушенням кореляції динаміки цих процесів. На відміну від неї, хронічний вплив цих сполук обумовлює співпадаючі зміни (активацію) динаміки біосинтезу. Ці процеси пов’язані відповідно з ініціацією та розвитком виявлених віддалених ефектів (мутагенного та гонадотропного), зумовлених дією нітроаміноазосполук.

8. На підставі отриманих результатів запропоновано комплекс найбільш iнформативних критеріїв оцінки пошкоджуючої дії нітроаміноазобензолів на організм та гiгiєнiчного регламентування сполук цього класу. Такими критеріями є зміни біосинтезу ДНК, ГБ і НГБ у ядрах клітин печінки та сім’яників; індукція хромосомних аберрацій у клітинах кісткового мозку; підвищення частоти ДЛМ; критерії гонадотропної дії. З їх використанням рекомендовано зниження ГДК у повітрі робочої зони