ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

КОСТЮКОВ Віктор Валентинович

УДК 577.113:577.32

Стабільність коротких шпилькових структур нуклеїнових кислот І їх комплексів з ароматичними сполуками

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському національному технічному університеті Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник доктор фізико-математичних наук,

доцент Євстигнєєв Максим Павлович,

Севастопольський національний технічний

університет, доцент кафедри фізики.

Офіційні опоненти:

- доктор фізико-математичних наук, професор Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної біофізики;

- доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Шестопалова Ганна Вікторівна, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, завідувач відділом біофізики.

Захист відбудеться “22” лютого 2008 р. о 15.00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою:

61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розіслано “17” січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з важливих задач сучасної молекулярної біофізики є вивчення конформаційної змінюваності нуклеїнових кислот. Молекули рібонуклеїнової (РНК) та дезоксирібонуклеїнової (ДНК) кислот характеризуються in vivo різноманітністю форм структурної організації. Крім класичної подвійної спіралі, нуклеїнові кислоти у водно-сольовому розчині можуть знаходитися в одноланцюжкових структурах, які були виявлені у деяких бактеріофагах та є обов’язковою проміжною формою (матрицею) під час синтезу як ДНК, так і РНК, або формувати шпилькові структури, які знайдені в організмах різних вірусів, бактерій, а також тварин і людини, та беруть участь у взаємодії з регуляторними білками, та ін. Іншою важливою проблемою є встановлення фізичних механізмів взаємодії нуклеїнових кислот з ароматичними біологічно активними сполуками (БАС) у розчині. Багато ароматичних БАС, що мають різні медично-біологічні властивості, діють, зв’язуючись з ядерною чи з мітохондріальною ДНК шляхом інтеркаляції. Взаємодія БАС як з двоспіральними, так і з шпильковими формами ДНК впливає на особливості їх просторової організації, та, відповідно, на біологічні функції.

На даний час встановлено, що найбільш коротка неканонічна шпилькова структура утворюється на рівні гептамеру ДНК d(GCXYZGC) з триплетною петлею XYZ та дінуклеотидним стеблом d(GC)2. Також відомо, що найбільш коротка петля може формуватися з двох нуклеотидів XY, але з триплетним стеблом d(CGC/GCG). Існують підстави вважати, що гептамер ДНК не є нижньою межею для утворення шпилькових структур – згортання в шпильку також можливе на рівні гексамеру ДНК d(GCXYGC) з дінуклеотидною петлею XY і стеблом d(GC)2. Таким чином, дослідження можливості утворення коротких шпилькових структур ДНК та їх комплексоутворення з ароматичними БАС грає велику роль в усвідомленні конформаційної змінюваності нуклеїнових кислот та механізмів медично-біологічної дії БАС.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у рамках держбюджетної наукової тематики “Нуклеотид” Міністерства освіти і науки України (№ держ. реєстр. 0104U000568) “Гідротропний та сінергетичний ефекти при утворенні гетерокомплексів ароматичних біологічно активних молекул та їх взаємодії з ДНК у водному розчині”, 2003-2006; частково у рамках наукової тематики “Ліганд-3” Міністерства освіти і науки України (№ держ. реєстр. 0107U001331) “Термодинаміка комплексоутворення ароматичних лігандів з ДНК”, 2007-2009; угоди щодо науково-технічного співробітництва на 2003-2008 рр. між Беркбек коледжем Лондонського університету (Великобританія) і СевНТУ.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є встановлення можливості та умов утворення шпилькових форм у коротких дезоксирібоолігонуклеотидах (гекса- та гептамери ДНК) і особливостей їх комплексоутворення з ароматичними біологічно активними сполуками.

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі:

1.

2.

3.

4.

Об’єкт дослідження – формування коротких шпилькових структур ДНК та особливості їх комплексоутворення з ароматичними БАС у водно-сольовому розчині.

Предмет дослідження – структурні і термодинамічні характеристики утворення шпилькових структур на рівні гекса- та гептамеру ДНК та їх комплексоутворення з ароматичними БАС у водно-сольовому розчині.

Методи дослідження – одномірна і двомірна (2М-TOCSY, 2М-NOESY) гомоядерна 1H-ЯМР-спектроскопія (500 МГц) – для аналізу рівноважних форм олігомерів ДНК у розчині та їх комплексів з ароматичними БАС; моделювання молекулярної динаміки на ЕОМ – для отримання структурних і енергетичних параметрів олігомерів ДНК та їх комплексів з БАС у водному середовищі.

Наукова новизна одержаних результатів. Методом 1Н-ЯМР-спектроскопії і молекулярної динаміки вперше вивчено умови утворення неканонічних шпилькових структур на рівні гексамеру ДНК. Показано, що наявність термінальних d(GC)-сайтів при довільних нуклеотидних послідовностях центральних дінуклеотидних сайтів d(XY) у гексануклеотидах сімейства d(GCXYGC) створює необхідні умови для формування ними шпилькових структур ДНК. На прикладі ізомерних гексануклеотидів d(GCATGC) і d(GCTAGC) встановлено, що стабільність шпилькової структури на рівні гексамеру ДНК визначається факторами конформаційної гнучкості остову мономерної форми і інтенсивності вертикального стекінгу основ у шпильці. Проведено порівняльний аналіз структурних і термодинамічних параметрів комплексоутворення антипухлинного антибіотику дауноміцину (DAU) з дезоксигексануклеотидами d(GCTAGC) і d(GCATGC).

Вперше проведено порівняльний структурний і енергетичний аналіз дезокси- та рібогептамерної шпильки GCGAAGC, що має біологічне значення; виявлено фактори, які є відповідальними за їх різну стабільність. Вперше досліджено комплексоутворення антипухлинного антибіотика новантрону (NOV) з дезоксигептануклеотидом d(GCGAAGC) у водно-сольовому розчині. Побудовано найбільш імовірну структуру комплексу NOV зі шпильковою формою гептамеру d(GCGAAGC) та отримано термодинамічні параметри реакції комплексоутворення. Вперше показано, що найбільш імовірною причиною зниження температури плавлення шпильки d(GCGAAGC) при зв’язуванні з ароматичними БАС (мутагенами і антибіотиками) є зменшення загальної кількості внутрішньомолекулярних водних містків, що стабілізують шпилькову структуру гептамеру в розчині.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати формують наукову основу для передбачення утворення коротких шпилькових структур ДНК з дінуклеотидними петлею та стеблом. Розроблені методики аналізу результатів моделювання молекулярної динаміки разом з даними одно- і двомірної ЯМР-спектроскопії можуть бути використані у конформаційних дослідженнях олігонуклеотидних послідовностей різної первинної і вторинної структури.

В цілому, одержані результати можуть мати застосування в галузі молекулярної біофізики (конформаційний аналіз молекул нуклеїнових кислот у розчині та їх комплексів з лігандами), молекулярної біології (функціонування ДНК у клітині) та біотехнології (розробка речовин із заданими медично-біологічними властивостями).

Особистий внесок здобувача. У роботах [1-4,6,7] – участь у розробці моделей самоасоціації олігонуклеотидів та їх комплексоутворення з ароматичними БАС, проведення розрахунків за запропонованими моделями, визначення структурних і термодинамічних параметрів комплексоутворення молекул; у роботах [3,4,6,8,10,12,14,15] – участь у розшифровці і віднесенні сигналів протонів, що не обмінюються, у двомірних спектрах 2M-NOESY і 2M-TOCSY, побудування найбільш імовірних структур комплексів за знайденими міжмолекулярними контактами; у всіх роботах без винятку – аналіз літературних даних, аналіз та обговорення одержаних результатів, написання наукових статтей.

Апробація отриманих результатів. Основні результати досліджень, що увійшли до дисертації, було представлено та обговорено на: III Міжнародній конференції “Фізика рідких середовищ”, Київ, Україна, 2005; I и III Всеукраїнській науково-технічній конференції “Актуальні питання теоретичної і прикладної фізики і біофізики”, Севастополь, Україна, 2005, 2007; XVII Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”, Берегове, Україна, 2005; V і VI Харківській конференції молодих вчених “Радіофізика і НВЧ електроніка” (секція біофізики), Україна, 2005, 2006; IV з’ізді Українського біофізичного товариства, Донецьк, Україна, 2006; VI Європейському біофізичному конгресі, Лондон, Великобританія, 2007. Тези перелічених доповідей опубліковано.

Публікації. За результатами досліджень, що увійшли до дисертації, опубліковано 15 наукових праць, у тому числі 7 статтей у наукових журналах і 8 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура дисертації. Робота складається з вступу, чотирьох розділів, висновків і трьох додатків. Повний обем дисертації складає 207 с., з них додатки займають 18 с., список використаних джерел – 389 найменувань – 26 с. Дисертація містить 44 рисунки і 33 таблиці, в тому числі на 6 окремих сторінках.

Основний зміст РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, зв’язок дисертації з науковими програмами і темами, сформульовано мету і задачі дослідження, показано новизну і практичну значущість одержаних результатів, вказано особистий внесок здобувача в опубліковані з співавторами роботи.

У розділі 1 проведено аналіз сучасних уявлень щодо біологічної ролі шпилькових форм ДНК. Зроблено висновок про те, що вивчення шпилькових структур уявляється важливим для розуміння функціонування нуклеїнових кислот і білків у клітині. Огляд літератури показав, що, хоч розміри петель і стебел шпилькових форм ДНК можуть варіювати у достатньо широких межах, виявлені in vivo біологічно значущі шпильки містять від одної до п’яти основ у петлі та від двох до десяти пар основ у стеблі, при цьому найменш дослідженими є шпилькові форми коротких дезоксиолігонуклеотидів. Виявлено також, що біологічно важливі шпилькові структури ДНК, як правило, характеризуються й високою стійкістю до дії високих температур і нуклеаз, причому стійкість шпилькових форм ДНК у розчині істотно залежить як від характеру внутрішньомолекулярних взаємодій, так і від взаємодії з навколишнім середовищем. Зокрема, важливим фактором, що впливає на структуру та функції ДНК у клітині, є їх взаємодія з ароматичними біологічно активними сполуками. Разом з тим, механізми звязування БАС з шпильковими структурами ДНК є мало вивченими.

Розділ 2 присвячено аналізу методів дослідження шпилькових структур нуклеїнових кислот у розчині. Показано, що для детального вивчення структурних і термодинамічних параметрів шпилькових форм ДНК найбільш відповідними є методи ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і молекулярної динаміки (МД). Розглянуто фізичні основи одномірної та двомірної ЯМР-спектроскопії, а також практичні методики ЯМР-експерименту. Викладено методику приготування розчинів, умови проведення експерименту і віднесення сигналів у 1Н-ЯМР спектрах. Описано методику моделювання молекулярної динаміки молекул та їх комплексів.

У розділі 3 проведено дослідження шпилькових структур на рівні гексамеру ДНК та комплексоутворення дуплексів гексамерів d(GCTAGC) и d(GCATGC) з антрацикліновим антибіотиком дауноміцином.

Дослідження самоасоціації дезоксигексануклеотиду d(GCTAGC) методом 1М і 2М 1Н-ЯМР-спектроскопії. Екстраполяція концентраційних залежностей хімічних зсувів протонів гексануклеотиду d(GCTAGC) до нульової концентрації при T1=298 K (рис. 1а) дає суттєво більш низькі значення хімічних зсувів деяких протонів у порівнянні з тими ж значеннями залежностей (T) при максимальній температурі вимірювань (рис. 1б), коли можна вважати, що практично весь гексамер знаходиться у одноланцюжковому стані.

Рис. 1. Залежності хімічних зсувів протонів гексамеру d(GCTАGC) у 0.1 М фосфатному буфері від концентрації гексамеру при Т=298 K (а) та від температури розчину при N0=3.82 мМ (б)

Аналіз показав, що причиною такого ходу експериментальних кривих при низькій температурі є формування у розчині шпилькової структури (рис. 2), магнітне екранування протонів в якій близьке до того, що спостерігається у дуплексі гексамеру.

Рис. 2. Схематичне зображення реакції утворення шпилькової структури дезоксигексануклеотиду d(GCTAGC) з мономерної форми

При більш високих температурах шпилька руйнується, що обумовлює у цілому “стандартний” хід відповідних кривих на рис. 1б. У цілому, зазначені особливості рівноважного стану гексамеру d(GCTAGC) виявляються схожими з дослідженим раніше методом ЯМР-спектроскопії ізомерним гексануклеотидом d(GCATGC), також здатним утворювати шпильку у розчині. Таким чином, інвертування центральної пари основ не вплинуло на утворення шпилькової форми гексамеру.

Для визначення рівноважної константи і термодинамічних параметрів реакції утворення шпилькової форми гексамеру d(GCTAGC) використано температурні та концентраційні залежності протонних хімічних зсувів (див. рис. 1) у рамках моделі трьох станів – мономер (N), дуплекс (N2) и шпилька (NL):

(1)

де Кd і Kc – рівноважні константи реакцій утворення дуплексної і шпилькової форм гексамеру, відповідно. Згідно цієї моделі, результуючий хімічний зсув протонів гексамеру може бути представлено у вигляді:

, (2)

де m(T), d, с – хімічні зсуви протонів гексамеру при температурі T у мономерній, дуплексній і шпильковій формах, відповідно;

д0=(дm+дcKc)/(1+Kc);

z=Kd/(1+Kc)2.

Розрахунок термодинамічних параметрів реакції утворення дуплексу (ентропії та ентальпії ) проводився з використанням співвідношення

(3)

Значення Kd, , та температури плавлення Tm представлено у табл. 1.

Таблиця 1

Термодинамічні параметри утворення дуплексної і шпилькової форм гексануклеотиду d(GCTAGC)

Параметри | d(GCTAGC)

Tm, K | 311.6±1.8–

, кДж/моль | 182.09.4–

, Дж/(моль·К) | 53127–

, кДж/моль | 23.80.9

Kd, 103 л/моль | 17.2±9.1

Кс, л/моль | 0.7±0.2

Порівняльний аналіз розрахункових параметрів з опублікованими раніше параметрами самоасоціації гексамеру d(GCATGC) свідчить про меншу стабільність дуплексної і шпилькової форм гексамеру d(GCTAGC) у порівнянні з d(GCATGC). Дослідження причин різної стабільності шпилькових форм даних гексануклеотидів було проведено методом МД. При цьому було враховано, що стабільність шпилькової структури може визначатися не тільки параметрами самої шпильки, але й умовами її формування з лінійного мономеру (див. рис. 2).

Дослідження мономерних і шпилькових форм дезоксигексануклеотидів d(GCATGC) и d(GCTAGC) методом молекулярної динаміки. З аналізу розрахункових траєкторій випливає, що мономер d(GCATGC) у цілому виявляється конформаційно більш рухливим, ніж d(GCTAGC), при цьому основний внесок у вказану відмінність дають остови олігомерів. Тому можна припустити, що виявлена відмінність у гнучкості мономерів є наслідком більшої гнучкості цукрово-фосфатного остову однониткової послідовності d(GCATGC) у порівнянні з d(GCTAGC). Отже, ймовірність утворення шпильки з послідовності d(GCATGC) повинна перевищувати ймовірність утворення шпильки d(GCTAGC), що знаходиться у відповідності зі значенням рівноважної константи Kc (див. табл. 1). Таким чином, термодинамічна гнучкість мономерної форми дезоксигексануклеотиду є одним з факторів, що визначають стабільність гексамерної шпилькової структури в розчині.

Стебла розрахункових шпилькових структур є добре сформованими правоспіральними дінуклеотидними дуплексами з уотсон-кріковським спарюванням основ G:C стебел (рис. 3).

Рис. 3. Схеми розташування азотистих основ шпилькових форм гексануклеотидів d(GCАТGC) (а) та d(GCTAGC) (б). Водневі звязки між основами показано пунктиром

Однак конформації петель шпильок є суттєво різними. У гексамері d(GCATGC) має місце значне змінення орієнтації цукрового кільця у нуклеотиді Т4 відносно азотистої основи у порівнянні з В-формою (глікозидний зв’язок практично перпендикулярний дезоксирібозному циклові), що, ймовірно, обумовлено стеричними перешкодами щодо розміщення метильної групи тімідину усередині молекули. При такій конформації для даної послідовності між петлевими азотистими основами не утворюється водневих звязків (див. рис. 3а). Для шпильки d(GCTAGC) має місце зміщення петлевих азотистих основ від вісі спіралі стебла у бік 5?-кінця гексамеру (див. рис. 3б). У петлі даної шпилькової структури спостерігається один водневий звзок між атомами О2(Т3) та N6(A4).

Аналіз розрахункових енергій (дані не приведено) показує, що відносна відмінність у енергії внутрішньомолекулярних взаємодій двох шпильок більша, ніж відмінність у енергії взаємодії шпильок з водним середовищем; у той самий час, сумарна енергія горизонтального стекінгу (G1-C6 та C2-G5) приблизно однакова в обох гексамерах. Найбільшу відмінність з усіх видів внутрішньомолекулярних взаємодій мають енергії вертикального стекінгу, що наочно продемонстровано на рис. 3. Звідси випливає, що другим фактором, який визначає різну стабільність шпильок, є вертикальний стекінг основ стебла та основ петлі, що примикають до нього.

Таким чином, результати проведеного дослідження дозволяють зробити висновок про можливість утворення компактної шпилькової структури на рівні самокомплементарного гексамеру ДНК, а також виявити фактори, що відповідають за це. У принципі, це дає підставу для передбачення можливості утворення шпильок й іншими гексамерними послідовностями ДНК з двома нуклеотидами у петлі та стеблом, що містить усього лише дві пари основ G:C.

Дослідження шпилькових форм дезоксигексануклеотидів сімейства d(GCXYGC) методом молекулярної динаміки. Згідно проведеному вище аналізу, дослідження умов утворення шпилькових форм повинно проводитися як на рівні самої шпильки, так і на рівні лінійного мономеру, з якого утворилася шпилька. Початкові конформації петлевих нуклеотидів шпилькових форм гексамерів d(GCXYGC) задавалися як у анти- (ч=144?), так і у сін-конформаціях (ч=324?) з метою одержання максимального набору можливих структур дінуклеотидних петель. При цьому дуплекси стебел шпильок d(GC)2 відповідали В-формі ДНК. Таким чином, початковими для моделювання МД були 16 мономерних d(GCXYGC) та 64 шпилькових структури гексамерів d(GC-Xanti/synYanti/syn-GC) (результати моделювання не приведено).

Найбільше значення при утворенні шпилькової форми короткого дезоксиолігонуклеотиду з мономеру мають наступні фізичні фактори: гідрофобні взаємодії та гідратація; горизонтальні стекінг-взаємодії між азотистими основами у стеблі шпильки; вертикальні стекінг-взаємодії між усіма основами шпилькової форми; змінення енергії внутрішньомолекулярних взаємодій у дезоксигексануклеотиді при переході мономер-шпилька; водні містки шпилькової структури; конформаційна гнучкість цукрово-фосфатного остову мономеру. Аналіз розрахункових енергетичних параметрів мономерів та шпильок сімейства d(GCXYGC) з урахуванням вказаних факторів дозволив провести послідовне виключення найменш стабільних структур. У результаті встановлено, що вигідність утворення шпилькових структур послідовностями d(GC-XY-GC) спадає у ряду XY=(CT, AG, AT, AA, TT, CA, TC, CC, AC, TA). Отже, наявність гуанозинової основи у третьому і (або) четвертому нуклеотиді гексамеру є перешкодою для утворення шпильки. Можливою причиною цього є стеричні обмеження конформації петлі, що накладаються розміщенням у ній об’ємної гуанозинової основи. Важливо відзначити, що проведене у даній роботі моделювання МД шпилькових форм гексамерів сімейства d(GCXYGC) показало відсутність принципових стеричних обмежень щодо утворення таких структур при довільній нуклеотидній послідовності петлі XY. При цьому конформаційні параметри стебла та петлі таких шпилькових структур добре узгоджуються з отриманими раніше експериментально та теоретично для шпильок з різними дінуклеотидними петлями та більш довгими стеблами. У той самий час, проведене також у даній роботі моделювання не виявлених у експерименті шпилькових форм гексамерів d(CGCGCG), d(CGTACG) та d(TACGTA) зі зміненою нуклеотидною послідовністю у стеблі виявило для них значно гірші у порівнянні зі шпильками сімейства d(GCXYGC) параметри внурішньомолекулярних взаємодій, що є можливою причиною їх дуже низької стабільності у розчині.

Дослідження комплексоутворення дезоксигексануклеотидів d(GCATGC) та d(GCTAGC) з антрацикліновим антибіотиком дауноміцином. Наявність ідентичних термінальних d(GpC) сайтів у гексамері d(GCTAGC) та d(GCATGC) дає можливість визначити вплив А:Т чи Т:А пар основ на особливості зв’язування DAU з триплетними ділянками олігомерів. Проведений розрахунок методом МД комплексоутворення DAU з d(GCATGC) та d(GCTAGC) дозволив одержати структурні та енергетичні параметри комплексів антибіотику з дуплексами гексамерів.

Аналіз розрахункових структур (рис. 4) свідчить про збільшення кута спірального обертання Щ між другою та третьою парами основ дуплексу d(GCATGC) (Щ?40?) у порівнянні з d(GCTAGC) (Щ?32?).

Рис. 4. Розрахункові просторові структури комплексів дауноміцину з дуплексними формами гексамерів d(GCATGC) (а) та d(GCTAGC) (б). Міжмолекулярні водневі зв’язки показано пунктиром

Для розрахунку параметрів комплексоутворення DAU з дезоксигексануклеотидом d(GCTAGC) було використано наступну модель молекулярної рівноваги у розчині:

(4)

де D і N – мономери DAU і гексамеру;

KD і KN – рівноважні константи дімеризації антибіотика і гексануклеотиду, відповідно;

K1…K4 – рівноважні константи утворення 1:1 (DN), 1:2 (DN2), 2:1 (D2N) та 2:2 (D2N2) комплексів, відповідно.

Хімічний зсув протонів антибіотику DAU, що спостерігається, у такій моделі може бути представлено у вигляді

дDAU=(D/D0)(дm+2дdKDD+д1K1N+д2K2KNN2+2д3K1K3ND+2д4K2K4KNN2D), (5)

де дm та дd - протонні хімічні зсуви антибіотику в мономерній та дімерній формах, відповідно;

д1…д4 - граничні значення хімічних зсувів протонів DAU у складі комплексів DN, DN2, D2N и D2N2, відповідно;

D0 – початкова концентрація ліганду.

Порівняльний аналіз отриманих значень для d(GCTAGC) (табл. 2) з опублікованими раніше параметрами для d(GCATGC) показує, що реакція комплексоутворення ліганду з d(GCATGC) ентропійно більш вигідна у порівнянні із зв’язуванням з d(GCTAGC).

Таблиця 2

Термодинамічні параметри комплексоутворення дауноміцину з дезоксигексануклеотидом d(GCTAGC) у 0.1 М фосфатному буфері, pD 7.1

Реакція | Ki,

103 л/моль– | G0,

кДж/моль– | H0,

кДж/моль– | S0,

Дж/(мольK)

7421 | 27.80.7 | 1066 | 26316

50601220 | 38.20.6 | 1344 | 32115

26090 | 30.90.9 | 1218 | 30119

220170 | 30.51.9 | 959 | 21621

Мабуть, це обумовлено вже зазначеним підвищеним локальним закручуванням дуплексу d(GCATGC) та особливостями укладання аміноцукрового кільця DAU в малу канавку ДНК, що призводить до більшого витіснення молекул води найближчої гідратної оболонки атомів канавки гексамеру та аміноцукрового кільця антибіотику у розчин при інтеркаляції. У той самий час, ентальпійно більш вигідною є реакція зв’язування DAU з d(GCTAGC), що пов’язано з підвищеною гідрофільністю цього комплексу. Однак для досліджених комплексів гідрофобний (ентропійный) фактор виявляється переважаючим, і споріденість DAU до дуплексу самокомплементарного гексамеру d(GCATGC) виявляється вище у порівнянні з дуплексною формою ізомерного дезоксигексануклеотиду d(GCTAGC).

У розділі 4 досліджено шпилькові форми ДНК на рівні гептамеру d(GCGAAGC) та його комплексоутворення з ароматичними лігандами.

Порівняльний аналіз шпилькових форм гептануклеотидів d(gcgaagc) та r(gcgaagc) методом молекулярної динаміки. Відомо, що шпильки дез-оксирібо- і відповідних рібоолігонуклеотидів мають суттєво різну стійкість. Так, шпилька d(GCGAAGC) з петлею GAA (температура плавлення Tm?77 ?C) набагато більш стабільна, ніж шпилька r(GCGAAGC) (Tm?27 ?C). З розрахукових структур на рис. 5 видно, що шпилька ДНК приймає винятково компактну конформацію, у той час як шпилькова форма рібогептануклеотиду має вельми “рихлу”, неупорядковану структуру, що проявляється у менших значеннях енергій внутрішньомолекулярних взаємодій. Крім того, порівняння величин середньоквадратичних відхилень (дані не приведено) показує, що, в цілому, мономер та шпилька r(GCGAAGC) мають значно меншу конформаційну рухливість.

Рис. 5. Схематичне зображення розрахункових шпилькових структур гептамерів d(GCGAAGC) (а) та r(GCGAAGC) (б). Стрілками вказано вертикальні стекінг-взаємодії

Враховуючи висновки розділу 3 даної роботи, а також результати інших авторів, можна зробити висновок, що знижена конформаційна гнучкість нитки r(GCGAAGC) обумовлює розрихленість її структури та, отже, меншу термічну стабільність у порівнянні зі шпилькою d(GCGAAGC).

Структурні характеристики інтеркаляційного комплексу шпилькової форми дезоксигептануклеотиду d(GCGAAGC) з дауноміцином. Розрахунки показали, що стабілизація комплексу (рис. 6) відбувається, в основному, за рахунок вертикальної стекінг-взаємодії між хромофором антибіотика та азотистими основами стебла шпильки, а також міжмолекулярних водневих зв’язків.

Рис. 6. Розрахункова просторова структура комплексу шпилькової форми гептамеру d(GCGAAGC) з дауноміцином

Конформаційні параметри стебла шпильки у комплексі з DAU залишаються у межах В-форми ДНК, при цьому розкручування пар основ на ділянці інтеркаляції складає ДЩ?18?. Основні зміни у структурі шпильки при інтеркаляції ліганду відбуваються, головним чином, за рахунок конформаційних перебудов більш рухливої кінцевої пари азотистих основ. У той самий час петля, яка містить неканонічну G:A пару, при вбудовуванні хромофору антибіотику в стебло шпильки характеризується високою стабільністью.

Комплексоутворення антипухлинного антибіотику новантрону зі шпильковою структурою дезоксигептануклеотиду d(gcgaagc). У спектрах 2М-NOESY змішаного розчину спостерігаються міжмолекулярні кросс-піки між протонами антибіотику та гептамеру. Аналіз значень міжпротонних відстаней, які відповідають міжмолекулярним контактам NOE, що спостерігаються (до 5 Е), показав, що найбільш адекватним їм є комплекс, у якому хромофор NOV вбудовується у стебло шпильки з боку великої канавки (рис. 7).

Рис. 7. Розрахункова просторова структура комплексу новантрону зі шпильковою формою d(GCGAAGC). Міжмолекулярний водневий зв’язок показано пунктиром

Згідно ррозрахунків, між атомами N12(NOV) та О1Р(G6) утворюється водневий зв’язок, який, у певній мірі, фіксує положення хромофору ліганду у сайті інтеркаляції під кутом Ш?16? між хромофором NOV та великою віссю пари основ C2:G6.

Модель, яка описує взаємодію молекул у розчині, включає наступні рівноважні реакції:

(6)

де N та D – мономери гептамеру та NOV, відповідно;

KL, KN – рівноважні константи реакцій утворення шпильки та дуплексу дезоксигептануклеотиду, відповідно;

KD – рівноважна константа самоасоціації ліганду;

K1…K3 – рівноважні константи реакцій утворення комплексів антибіотику з мономерною (DN), шпильковою (DNL) та дімерною (DN2) формами гептамеру, відповідно.

Враховуючи особливість антибіотику сильно агрегувати у розчині, хімічний зсув протонів молекул NOV може бути представлено наступним чином:

(7)

де д1…д3 – граничні хімічні зсуви протонів ліганду в складі комплексів DN, DNL и DN2, відповідно.

На підставі концентраційних та температурних залежностей хімічних зсувів протонів антибіотику за моделлю (6), (7) отримано термодинамічні параметри реакцій комплексоутворення (табл. 3).

Таблиця 3

Термодинамічні параметри комплексоутворення новантрону з дезоксигептануклеотидом d(GCGAAGC) у 0.1 М фосфатному буфері, pD 7.1

Реакція | Ki,

103 л/моль– | G0, кДж/моль– | H0, кДж/моль– | S0, Дж/(мольK)

230±50 | 30.6±0.3 | 57±3 | 88±10

72±15 | 27.7±0.3 | 69±3 | 138±20

1640±400 | 35.4±0.4 | 64±4 | 96±15

Аналіз розрахункових значень термодинамічних параметрів свідчить про інтеркаляційне звязування NOV з гептамером. Співвідношення між величинами ДH та ДS реакцій зв’язування NOV з гептамером d(GCGAAGC) якісно виявляються схожими з такими для комплексоутворення даного дезоксигептануклеотиду з DAU (ДH1<ДH2>ДH3, ДS1<ДS2>ДS3), однак відрізняються від того, що раніше спостерігалося для барвників бромістого етидію (EB) та профлавіну (PF). Аналіз показує, що вказана схожість ентальпійного та ентропійного факторів при взаємодії антибіотиків з гептамером d(GCGAAGC) пояснюється “компенсацією” несприятливої у порівнянні з NOV стекінг-взаємодії хромофору DAU з азотистими основами сайту інтеркаляції, сприятливим гідрофобним внеском від об’емного позитивно зарядженого аміноцукрового кільця DAU та додаткових міжмолекулярних Н-зв’язків у комплексі з DAU.

Термічна стабільність комплексів шпилькової форми дезоксигептануклеотиду d(GCGAAGC) з ароматичними лігандами. У даній роботі, а також раніше іншими авторами було показано, що при зв’язуванні з ароматичними лігандами (DAU, EB, NOV и PF) стабільність шпилькової структури d(GCGAAGC) зменшується (табл. 4). У той самий час, при звязуванні цих лігандів з регулярними дуплексами ДНК стабільність останніх зростає. З метою інтерпретації цих фактів у даній роботі методом МД проведено порівняльний аналіз комплексів цих БАС зі шпилькою d(GCGAAGC) та з регулярним дуплексом ДНК.

Аналіз даних табл. 4 показує, що спостерігаються порівняльно невеликі відмінності величин енергій взаємодій для комплексів, що розглядаються, при цьому коефіцієнт кореляції з Tm має відносно невелике значення (r?0.75).

Таблиця 4

Розрахункові параметри шпилькової структури гептамеру d(GCGAAGC) та комплексів з

ароматичними лігандами

d(GCGAAGC) | d(GCGAAGC) + DAU | d(GCGAAGC)

+ EB | d(GCGAAGC)

+ NOV | d(GCGAAGC)

+ PF | r

Температура плавлення Tm, ?C

76.5 | 48.3 | 58.9 | 60.7 | 52.2

Енергія внутрішньомолекулярних взаємодій Eintratotal, ккал/моль | 0.73

(612±11)– | (572±16)– | (552±10)– | (571±11)– | (570±12)

Загальний гідратаційний індекс | 0.67

65 | 55 | 65 | 64 | 63

Кількість внутрішньомолекулярних водних містків | 0.96

10 | 3 | 6 | 5 | 5

Отже, малоймовірно, що між- та внутрішньомолекулярні взаємодії у комплексах БАС зі шпилькою ДНК є основними факторами, які визначають зменшення термічної стабільності шпилькової структури d(GCGAAGC) при зв’язуванні з ароматичними лігандами.

Іншим фактором, що може впливати на термічну стабільність вторинних структур нуклеїнових кислот, а також на їх звязування з БАС, є їх взаємодія з водним оточенням. З таблиці 4 випливає, що загальний гідратаційний індекс шпильки при зв’язуванні з ароматичними БАС істотно не змінюється (за винятком DAU). Це означає, що вказаним фактором також не можна пояснити змінення величини Tm (r?0.67). Гідратаційний індекс комплексу шпильки d(GCGAAGC) з DAU (55) значно нижче у порівнянні з такими для неінтеркальованої шпильки (65), що може бути обумовлено відомим витіснням молекул води з малої канавки ДНК об’емним аміноцукровим кільцем антибіотику при зв’язуванні з дуплексом.

Розрахунки показують, що внутрішньомолекулярні водні містки у випадку зв’язування даних БАС зі шпилькою d(GCGAAGC) дають суттєво більший внесок у стабілізацію комплексів у порівнянні з міжмолекулярними. З табл. 4 випливає, що інтеркаляція лігандів у шпильку призводить до зменшення числа внутрішньомолекулярних водних містків приблизно вдвічі у випадку інтеркаляції EB, NOV і PF, та приблизно у три рази – для DAU. Оскільки кількість водних містків, що руйнуються при комплексоутворенні зі шпильковою структурою d(GCGAAGC), добре корелює зі зменшенням значень Tm (r ? 0.96, див. табл. 4), є підстава припустити, що саме зниження кількості внутрішньомолекулярних водних містків визначає зменшення термічної стабільності даної шпильки. Для підтвердження даного припущення нами також було проведено дослідження комплексоутворення цих лігандів (DAU, EB, NOV, PF) з самокомплементарним гексамером d(GTCGAC)2, обраним у якості моделі регулярних дуплексів ДНК, зв’язування ароматичних БАС з якими призводить до зростання величини Tm. Вибір даної послідовності продиктовано відомою специфічністю зв’язування лігандів з ДНК, а також вимогою конформаційної стабільності дуплексу при інтеркаляції. Усі лиганди, що розглядаються, у процесі моделювання вбудовувалися у центральний d(CpG) сайт гексамеру. Аналіз результатів дозволив зробити висновок про те, що відносні змінення гідратаційних індексів комплексів ДНК з ароматичними лігандами малі у порівнянні з обчисленими для шпилькової структури. При цьому кількість водних містків, що стабілізують вторинну структуру, при звязуванні БАС з дуплексом ДНК змінюється незначно. Таким чином, ефект руйнування значного числа водних містків при звязуванні БАС зі шпилькою d(GCGAAGC) є специфічною особливістю саме шпилькової структури. У зв’язку з цим, можна заключити, що кількість водних містків є ключовим фактором, який визначає термічну стабільність комплексів шпильки ДНК d(GCGAAGC) з ароматичними БАС у розчині.

ВИсновки

У даній роботі методами одно- і двомірної 1Н-ЯМР-спектроскопії та молекулярного моделювання вперше досліджено короткі шпилькові структури на рівні гекса- та гептамеру ДНК та їх комплексоутворення з ароматичними лігандами. Встановлений у роботі факт, а також умови утворення коротких шпильок ДНК у розчині суттєво розширює сучасні уявлення про конформаційні властивості нуклеїнових кислот. Отримані результати можуть бути використані в галузі молекулярної біофізики, молекулярної біології та біотехнології.

Основні результати роботи можуть бути сформульовані наступним чином:

1. На підставі даних 1Н-ЯМР-спектроскопії встановлено, що дезоксигексануклеотид d(GCTAGC), разом з дуплексною, утворює також шпилькову структуру з петлею d(TA) і стеблом d(GC)2 у водному розчині. Отримано структурні та термодинамічні параметри реакції самоасоціації d(GCTAGC).

2. Порівняльний аналіз структурних і енергетичних параметрів мономерних, дуплексних та шпилькових форм ізомерних гексануклеотидів d(GCATGC) і d(GCTAGC) дозволив зробити висновок про те, що інверсія центральної пари d(AT)>d(TA) знижує загальну термодинамічну стабільність шпилькової форми. При цьому як мінімум два фактори є відповідальними за стійкість гексамерної шпильки у розчині: ентропійний фактор – конформаційна гнучкість остову мономерної форми та ентальпійний фактор – вертикальний стекінг азотистих основ петлі та стебла.

3. Дослідження методом молекулярної динаміки шпилькових форм гексамерів сімейства d(GCXYGC) з дінуклеотидною петлею d(XY) довільного складу дозволило зробити висновок про відсутність принципових стеричних обмежень щодо утворення таких шпильок у розчині. Встановлено, що найбільш імовірним є формування шпилькових структур з центральною парою основ, яка не містить гуанін. У той самий час, інверсія або заміна пар нуклеотидів стебла, що фланкують петлю, робить шпилькову структуру нестабільною.

4. Методами 1Н-ЯМР-спектроскопії і молекулярного моделювання вивчено комплексоутворення дезоксигексануклеотиду d(GCTAGC) з антипухлинним антибіотиком дауноміцином. На підставі порівняльного аналізу структурних та енергетичних параметрів комплексоутворення DAU з дуплексами гексамерів d(GCATGC) і d(GCTAGC) показано, що найбільш імовірною причиною різної спорідненості антибіотику до d(GCATGC)2 у порівнянні з d(GCTAGC)2 є різний ступінь гідрофобної взаємодії аміноцукру DAU у малій канавці подвійної спіралі гексамерних дуплексів.

5. Методом молекулярної динаміки проведено порівняльний аналіз шпилькових форм гептамерів d(GCGAAGC) та r(GCGAAGC). Встановлено, що причиною зниженої термічної стабільності шпильки r(GCGAAGC) у порівнянні з d(GCGAAGC) є її невпорядкована структура, обумовлена зниженою конформаційною гнучкістю остову рібогептамеру.

6. Структурний та енергетичний аналіз комплексу шпилькової форми дезоксигептануклеотиду d(GCGAAGC) з дауноміцином показав, що основні зміни у структурі шпильки при інтеркаляції ліганду відбуваються, головним чином, за рахунок конформаційних перебудов кінцевої пари основ. У той же час петля при вбудовуванні хромофору антибіотику у стебло шпильки характеризується высокою стабільністю.

7. Методом 1Н-ЯМР-спектроскопії і молекулярного моделювання вивчено взаємодію гептамеру d(GCGAAGC) з антипухлинним антибіотиком новантроном, отримано структурні та термодинамічні параметри реакцій комплексоутворення. Встановлено, що зв’язування NOV зі всіма формами гептамеру d(GCGAAGC) у розчині відбувається по типу інтеркаляції. При вбудовуванні антибіотику в стебло шпильки утворюється комплекс, який стабілізується, додатково до стекінгу основ та хромофору, міжмолекулярним водневим звязком.

8. Методом молекулярної динаміки проведено дослідження термічної стабільності шпилькової структури дезоксигептануклеотиду d(GCGAAGC) при зв’язуванні з ароматичними лігандами: антибіотиками – дауноміцином і новантроном, та мутагенами – профлавіном і бромістим етидієм. Вперше показано, що найбільш імовірною причиною зниження температури плавлення шпильки d(GCGAAGC) при зв’язуванні з БАС є зменшення загального числа внутрішньомолекулярних водних містків, що стабілізують структуру гептамеру в розчині.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Костюков В.В. Семанин А.В., Дымант Л.Н. Структурные характеристики шпилечных конформаций дезоксигексануклеотидных последовательностей 5?-d(gcatgc) и 5?-d(gctagc): анализ методами молекулярной динамики // Вестник СевГТУ (серия “Физика и математика”).–2005.–№ 70.–С. 30–39.

2. Костюков В.В., Пахомов В.И., Дымант Л.Н. Структурные характеристики интеркаляционного комплекса шпилечной формы дезоксигептануклеотида d(GCGAAGC) с антрациклиновым антибиотиком дауномицином // Биополимеры и клетка.–2006.–Т.22.–С. 339–349.

3. Костюков В.В., Рогова О.В., Пахомов В.И., Евстигнеев М.П. Структурный и термодинамический анализ конформационных состояний самокомплементарных дезоксигексануклеотидов 5-d(GpCpApTpGpC) и 5-d(GpCpTpApGpC) в водном растворе // Биофизика.–2007.– Т.52.–С. 625635.

4. Костюков В.В., Рогова О.В., Евстигнеев М.П. Термодинамический и структурный анализ комплексов самокомплементарных дезоксигексануклеотидов 5-d(GpCpApTpGpC) и 5-d(GpCpTpApGpC) с антрациклиновым антибиотиком дауномицином // Вестник ХНУ.– Биофизический вестник. 2006.–Вып. 17(1).–С. 15–23.

5. Костюков В.В. Сравнительный анализ шпилечных форм гептануклеотидов d(GCGAAGC) и r(GCGAAGC) методами молекулярной динамики // Вестник СевГТУ (серия “Физика и математика”).–2007.–№ ХХ.–С. ХХ–ХХ.

6. Kostjukov V.V., Pahomov V.I., Andrejuk D.D., Davies D.B., Evstigneev M.P. Investigation of the complexation of the anti-cancer drug novantrone with the hairpin structure of the deoxyheptanucleotide 5?-d(gpcpgpapapgpc) // J. Mol. Struct.2007.Vol.843.P. 78–86.

7. Kostjukov V.V., Lantushenko A.O., Davies D.B., Evstigneev M.P. On the origin of the decrease in stability of the DNA hairpin d(GCGAAGC) on complexation with aromatic drugs // Biophys. Chem.–2007.–Vol.129.–P. 56–59.

8. Djimant L.N., Kostjukov V.V., Rogova O.V., Semanin A.V., Pahomov V.I., Davies D.B. Distinctive features of the self-association of deoxyhexanucleotide d(GpCpTpApGpC) in aqueous solution // Proc. III International Conf. Physics of Liquid Matter: Modern Problems. – Kyiv (Ukraine), 2005.–P. 195.

9. Костюков В.В., Дымант Л.Н., Семанин А.В. Структурные характеристики шпилечных конформаций дезоксигексануклеотидных последовательностей 5?-d(GCATGC) и 5?- d(GCTAGC): анализ методами молекулярной динамики // Тр. I Всеукр. науч.-техн. конф. аспирантов и молодых ученых “Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики. Физика. Биофизика–2005”–Севастополь: Изд-во СевНТУ, 2005.–С. 39–41.

10. Djimant L.N., Zubchonok O.V., Rogova O.V., Kostjukov V.V., Pahomov V.I., Davies D.B. Complexation of daunomycin with the selfcomplementary deoxyhexanucleotide, d(GCTAGC), in aqueous solution: 1D- and 2D-NMR analysis // Proc. XVII International School-Seminar on Spectroscopy of Molecules and Crystals.–Beregove.–2005.–P. 262–263.

11. Костюков В.В., Дымант Л.Н., Пахомов В.И. Структурные характеристики интеркаляционного комплекса шпилечной формы дезоксигептануклеотида d(GCGAAGC) с антрациклиновым антибиотиком дауномицином // Тр. V Харьковской конф. молодых ученых “Радиофизика и СВЧ электроника”, секция биофизики.–Харьков: Изд-во ИРЭ, 2005.–С. 57–58.

12. Костюков В.В., Пахомов В.И., Андреюк Д.Д., Евстигнеев М.П. Исследование комплексообразования антрацендионового антибиотика новантрона со шпилечной структурой дезоксигептануклеотида 5?-d(GpCpGpApApGpC) // // Тр. VI Харьковской конф. молодых ученых “Радиофизика и электроника”, секция биофизики.–Харьков: Изд-во ИРЭ, 2006.–С. 47.

13. Костюков В.В., Евстигнеев М.П. Термическая стабильность комплексов шпилечной формы дезоксигептануклеотида d(GCGAAGC) с ароматическими лигандами // Тр. IV съезда Укр. биофиз. об-ва.–Донецк: Изд-во ДонНУ, 2006.–С. 306–307.

14. Костюков В.В., Евстигнеев М.П. Структурный и термодинамический анализ шпилечных форм коротких дезоксирибонуклеотидов и их комплексообразования с биологически активными ароматическими соединениями // Тр. III Всеукр. науч.-техн. конф. аспирантов и молодых ученых “Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики. Физика. Биофизика–2007–Севастополь: Изд-во СевНТУ, 2007.–С. XX–XX.

15. Kostjukov V.V., Ovchinnikov D.V., Davies D.B., Evstigneev M.P. Formation of hairpin structures for DNA hexamers // Eur. Biophys. J.–2007.–Vol.36.–Suppl. 1.–S. 201.

АНОТАЦІЯ

Костюков В.В. Стабільність коротких шпилькових структур нуклеїнових кислот і їх комплексів з ароматичними сполуками. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2008.

Методами 1Н-ЯМР-спектроскопії і молекулярної динаміки проведено дослідження шпилькових форм коротких дезоксирібонуклеотидів та їх комплексоутворення з біологічно активними ароматичними сполуками (БАС) – дауноміцином, бромистим етидієм, новантроном і профлавіном. Отримано структурні і термодинамічні параметри самоасоціації дезоксигексануклеотиду d(GCTAGC). Виявлено умови утворення шпилькових структур гексамерами ДНК з довільною послідовністю дінуклеотидної петлі. Розраховано структурні і енергетичні параметри комплексоутворення дуплексу гексамеру d(GCTAGC) з дауноміцином. Отримано структурні характеристики комплексу гептамерної шпильки d(GCGAAGC) з дауноміцином. Розраховано структурні і термодинамічні параметри зв’язування різних конформерів дезоксигептануклеотиду d(GCGAAGC) з новантроном. Встановлено причини зниження температури плавлення шпильки d(GCGAAGC) при зв’язуванні з БАС.

Ключові слова: шпилькова форма ДНК, ароматичний ліганд, комплексоутворення, термодинамічні і структурні параметри, ЯМР-спектроскопія, молекулярна динаміка.

АННОТАЦИЯ

Костюков В.В. Стабильность коротких шпилечных структур нуклеиновых кислот и их комплексов с ароматическими соединениями. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, г. Харьков, 2008.

Методами 1Н-ЯМР-спектроскопии и молекулярной динамики