НІКОНОВА Валентина Миколаївна

УДК 575.281.2:633.855.55

Мікрогаметофітний добір на стійкість

до фузаріозу у рицини

03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Одеса – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті олійних культур УААН

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

ЛЯХ Віктор Олексійович,

Запорізький національний університет

Міносвіти і науки України,

завідувач кафедри садово-паркового

господарства та генетики рослин

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

САМОВОЛ Олексій Петрович,

Інститут овочівництва і баштанництва УААН,

головний науковий співробітник сектора

прикладної генетики

кандидат сільськогосподарських наук,

Волощук Сергій Іванович,

Миронівський інститут пшениці ім. В.М. Ремесла УААН,

завідувач відділу біотехнології селекційного процесу

Захист відбудеться 11 квітня 2008 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.363.01 при Селекційно-генетичному інституті – Національному центрі насіннєзнавства та сортовивчення за адресою: 65036, м. Одеса, Овідіопольська дорога, 3

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Селекційно-генетичного інституту – Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення за адресою: 65036, м. Одеса, Овідіопольська дорога, 3

Автореферат розісланий 7 березня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради З.В. Щербина

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Рицина ? цінна олійна культура, яка впродовж багатьох років вирощувалась на території України. Площа посівів була доведена майже до 120 тис.га. Незважаючи на те, що нині рицина в нашій країні практично не вирощується, у світі площі під рициною сягають 1169 тис.га. Вартість 1 т технічної олії на світовому ринку становить $ 1100-1600, лікарської ? $ 1750-2100. Високі врожаї в більшості залежать від стійкості культури проти ураження хворобами і в першу чергу найбільш небезпечною з них ? фузаріозним в'яненням, збудником якої є грунтовий гриб Fusarium oxysporum.

Фузаріоз є небезпечною хворобою не тільки для рицини, але й інших сільськогосподарських культур, таких, як льон, соя, соняшник, різні злаки, які широко культивуються в Україні, котрий може призводити до значних втрат і, навіть, повної загибелі посівів.

В умовах зростаючої енергетичної кризи все гостріше постає проблема розширення посівних площ під рициною, адже ця культура є джерелом високоякісної біосировини. Фактором, що обмежує продуктивний процес рицини, є висока інфікованість посівів, яка виникає через порушення сівозмін і агротехніки вирощування сільськогосподарських культур.

Агротехнічні та хімічні прийоми боротьби з фузаріозним в'яненням не завжди дають бажані результати, тому створення сортів, стійких до даної інфекції, є актуальним.

Одним з ефективних заходів підвищення результативності селекційно-генетичних досліджень є розробка методів мікрогаметофітної оцінки та добору. Вони можуть бути інструментом швидкого добору цінних генотипів на ранніх етапах розвитку рослин і насичення популяції необхідним генетичним матеріалом.

Можливість добору генетично цінних гамет заснована на експресії частини генів спорофітного геному в гаметофітній фазі життєвого циклу рослини. Завдяки пилковому добору відбувається заміна природної нерегульованої елімінації гамет штучно регульованим добором. Ефективність методу мікрогаметофітного добору на стійкість до різних абіотичних факторів показана на багатьох культурах, у тому числі й на рицині. В літературі робіт з оцінки ефективності добору стійких до біотичних стресів генотипів на мікрогаметофітному рівні недостатньо. Тому актуальним є вивчення можливостей мікрогаметофітного добору на стійкість до хвороб, у тому числі й до фузаріозу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в лабораторії селекції та генетики льону в 2001-2003 рр., у 2004 р. – в лабораторії генетики та електрофорезу Інституту олійних культур Української академії аграрних наук (ІОК УААН) в межах науково-технічної програми УААН “Зернові і олійні культури”. згідно із завданням 04.04.01. “Вивчити вплив добору в гетерогенних за стійкістю до біотичних стресів популяціях мікрогаметофітів на ознаки отриманого спорофітного покоління” (№ ДР 0101U003992).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – встановлення впливу добору в гетерогенних популяціях мікрогаметофітів, стійких до токсинів Fusarium oxysporum, на структуру спорофітного покоління рицини.

Для виконання поставленої мети розглядалися такі наукові задачі:

- виявити відмінності між генотипами рицини за ознакою проростання пилку на середовищі з токсинами фузаріуму;

- оцінити зв'язок між здатністю проростання пилку на середовищі з токсинами Fusarium oxysporum і стійкістю до фузаріозу на спорофітному рівні;

- одержати гібриди F1 від схрещування сортів рицини, контрастних за стійкістю пилку до метаболіту гриба, та провести мікрогаметофітну селекцію за цим фактором;

- оцінити стійкість спорофітного покоління F2 до фузаріозу після проведення мікрогаметофітного добору в F1;

- вивчити вплив мікрогаметофітного добору в F1 на структуру популяції F2 за морфологічними маркерними ознаками та кількісними ознаками вегетативної й генеративної сфер;

- виявити характер генетичного контролю стійкості рицини до фузаріозу.

Об’єкт дослідження – генетична мінливість у гаметофітному та спорофітному поколіннях рицини.

Предмет дослідження – керування формоутворювальним процесом за рахунок установлення зв'язку між стійкістю гаметофіта до токсинів Fusarium oxysporum і стійкістю спорофіта до фузаріозного в'янення.

Методи дослідження. У роботі використовували методи пророщування пилку
in vitro та світлову мікроскопію для оцінки мікрогаметофітів за стійкістю до токсинів гриба Fusarium oxysporum. Польовим і лабораторним методами визначали стійкість рослин рицини до фузаріозу на спорофітному рівні. Успадкування стійкості до фузаріозу рицини вивчали гібридологічним методом. Достовірність результатів встановлювали статистично на комп’ютері за програмою MSTAT – C.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на рицині встановлено суттєву різницю між сортами за здатністю пилку проростати на середовищі з токсинами Fusarium oxysporum. Виявлено позитивний зв'язок між стійкістю пилку рицини до токсинів Fusarium oxysporum (культуральний фільтрат) і стійкістю рослин сортового матеріалу до фузаріозу.

Показано ефективність методу мікрогаметофітного добору як засобу цілеспрямованої зміни складу наступної популяції спорофітів у бік збільшення кількості особин, стійких до фузаріозу.

Встановлено, що добір в F1 стійких до впливу токсинів фузаріуму мікрогаметофітів викликає збільшення в F2 частки осіб з морфологічними ознаками, характерними для більш стійких батьків.

Визначено, що стійкість до фузаріозного в'янення контролюється трьома генами. При цьому всі три гени неалельні, а фенотип гібридів визначається їхньої епістатичною взаємодією.

Виявлено, що штучне внесення інфекції в ґрунт негативно впливає на рослини як сприйнятливих, так і стійких генотипів на ранніх етапах розвитку.

Практичне значення одержаних результатів. Визначення здатності проростання пилку на середовищі з токсинами фузаріуму може знайти успішне застосування як експрес-метод оцінки якості спорофіта за стійкістю до даного патогену.

Мікрогаметофітний добір у гібридів призводить до змін структури наступного покоління спорофітів як за стійкістю до фузаріозу, так і за іншими ознаками вегетативної та генеративної сфер. Це дозволяє використовувати його як засіб цілеспрямованої зміни генетичної структури популяції у бік підвищення кількості рослин з бажаними фізіологічними та морфологічними характеристиками.

Новизна розробленого методу добору на мікрогаметофітному рівні стійких до фузаріозу генотипів рицини на селективному рідкому живильному штучному середовищі захищена патентом України. – № 64841; Заявл. 16.10.2001; Надрук.15.03.2004, Бюл. №3.

Особистий внесок здобувача. Здобувачка особисто виконала досліди, провела обробку й аналіз даних, сформулювала основні положення та висновки дисертації. Разом з науковим керівником були проведені вибір батьківських компонентів схрещування та методик досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на засіданнях ученої ради ІОК УААН (2001-2005), Міжнародній науковій конференції “Адаптивная селекция культивируемых растений”, Харків (2001); Міжнародній конференції “Сучасні питання створення й використання сортів і гібридів олійних культур”, Запоріжжя (2002); II Міжнародній конференції молодих учених і спеціалістів “Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур”, Краснодар (2003); Всеукраїнській конференції молодих учених “Современные проблемы экологии”, Запоріжжя (2004).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 10 наукових робіт, у тому числі 6 – у фахових виданнях ВАК України, 2 – тези доповідей конференцій, 1 – державний патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, 3 розділів експериментальної частини, висновків та списку використаної літератури. Робота викладена на 110 сторінках, містить 45 таблиць, 25 рисунків,
1 додадок. Список літератури вміщує 181 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Наведено літературні дані щодо господарського значення рицини, ботанічної класифікації виду, особливостей екології, біології цвітіння та запилення, етапів розвитку чоловічого гаметофіта. Розглянуто видовий склад збудника фузаріозного в'янення у рицини та заходи боротьби з ним, анатомічні та біохімічні фактори стійкості до фузаріозу. Проведено огляд літератури з питань мікрогаметофітного добору, а саме: ефективності, галузі використання. Узагальнено відомості про вплив мікрогаметофітного добору за стійкістю до абіотичних факторів на генетичну структуру популяції та можливість використання пилку для оцінки рослин за стійкістю до хвороб (біотичних факторів).

МАТЕРІЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальні дослідження проводилися в лабораторії селекції та генетики льону в 2001-2003 рр. і в лабораторії генетики та електрофорезу в 2004 р. Інституту олійних культур УААН.

Матеріалом дослідження були районовані сорти рицини та їхні гібриди, що отримані від схрещування контрастних за стійкістю до фузаріозу на спорофітній стадії розвитку форм. Досліджувані сорти різнилися також за деякими морфологічними ознаками вегетативної й генеративної сфер, а також за термінами проходження основних етапів вегетації.

Для оцінки стійкості гаметофіта до токсинів Fusarium oxysporum (культурального фільтрату) свіжозібраний пилок рицини культивували на поживному середовищі з додаванням середовища Чапека при 25 0С упродовж п'яти годин (контроль). У дослідних варіантах пилок культивували на поживному середовищі із середовищем Чапека, у яке додавали 10%-й культуральний фільтрат (концентрація визначалась експериментально). Стійкість чоловічого гаметофіта до токсинів Fusarium oxysporum виявляли за зниженням відсотка пророслих пилкових зерен у досліді у порівнянні з контролем.

Оцінку зразків рицини в умовах штучного клімату та в польових умовах на стійкість до фузаріозу проводили шляхом внесення чистої культури гриба в ґрунт перед посівом. Виділення збудника фузаріозу та приготування інокулюма готували за загальноприйнятими методиками. Cтійкість до фузаріозу визначали у кожну конкретну фазу за кількістю здорових рослин і виражали у відсотках до загальної кількості рослин, що зійшли. Далі хворі рослини знищували і спостереження вели відносно рослин, що залишилися.

Для проведення мікрогаметофітного добору в F1 на стійкість до токсинів Fusarium oxysporum на приймочки жіночих квіток наносили 100%-й культуральний фільтрат (на основі середовища Чапека) – дослід. Контролем слугували варіанти з нанесенням на приймочки середовища без культурального фільтрату. Після підсихання приймочок жіночих квіток проводили запилення сумішшю пилку різних квіток в межах одного генотипу. Після кастрації та після запилення на період запліднення та зав'язування коробочок суцвіття ізолювали.

При вивченні впливу мікрогаметофітного добору на структуру популяції спорофітів використовували два фони: 1) інфекційний (внесення чистої культури гриба перед посівом) і 2) без інфекції. На інфекційному фоні проводили оцінку стійкості рослин до фузаріозу. На звичайному фоні вивчали вплив мікрогаметофітного добору на якісні та кількісні ознаки спорофіта, а також на тривалість проходження рослинами деяких етапів вегетації. Ефективність добору оцінювали через порівняння даних контрольного варіанта (відсутність культурального фільтрата) і дослідного (присутність культурального фільтрату) на обох фонах.

Вплив гаметофітного добору в F1 на структуру популяцій F2 визначали за зміною: а) частки рослин, стійких до фузаріозу; б) середніх значень деяких кількісних ознак рослин; в) розподілу популяції рослин F2 на класи за деякими кількісними ознаками вегетативної та генеративної сфер; г) частоти рослин, що зустрічалися, з різними темпами розвитку в період фаз сходів і цвітіння; д) співвідношення розщеплення рослин за деякими якісними ознаками вегетативної сфери.

Cутність відмінностей дослідних даних від контрольних при мікрогаметофітному доборі оцінювали за критерієм Ст`юдента. При аналізі розщеплення в поколінні F2 використовували критерій Х2. Коефіцієнт кореляції визначали як непараметричний (ранговий) показник зв'язку.

Статистична обробка даних проводилася на комп’ютері за програмою
MSTAT – C.

Велике генетичне різноманіття рицини, особливості її чоловічої (велика кількість пилку, який легко піддається різноманітним маніпуляціям) і жіночої (достатньо довгі приймочки, які мають високу спроможність змочування) генеративних сфер дозволили розглядати дану культуру в якості зручного модельного об'єкта при розробці методів мікрогаметофітного добору на стійкість до патогенів.

РЕЗУЛЬТАТИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

МІКРОГАМЕТОФІТНИЙ ДОБІР ЗА СТІЙКІСТЮ ДО

ФУЗАРІОЗУ У РИЦИНИ

Реакція гаметофіта на вплив токсинів Fusarium oxysporum і чутливість спорофіта до фузаріозу. Ефективний добір в F2 потребує правильного підбору батьківських форм схрещування, який забезпечував би необхідну генетичну гетерогенність дослідного матеріалу. З метою досягнення цих умов генотипи рицини диференційовано за чутливістю чоловічого гаметофіта до токсинів гриба Fusarium oxysporum, а саме здатністю проростання пилку in vitro, та виявлено певну контрастність між генотипами. Група генотипів з відносним відсотком проростання пилку на фоні токсинів (ВПП) 50% і більше віднесена до стійких генотипів на рівні чоловічого гаметофіта, а 30% і менше – до сприйнятливих.

Оцінка спорофітів цих сортів за стійкістю до фузаріозу не тільки дозволила розподілити їх по групах стійкості, а й встановити ступінь цієї чутливості у різних генотипів. Стійкі генотипи мали ураження в середньому за три роки від 0,0 до 15,9%, а сприйнятливі – від 75,0 до 86,7%. Одержані дані дали можливість ранжирувати досліджувані сорти в залежності від ступеня стійкості як спорофіта, так і гаметофіта (табл.1).

Кореляційний аналіз дозволив зробити висновок, що ознака стійкості рослин до фузаріозу і зміна кількості пророслого пилку на фоні культурального фільтрату є взаємозалежними (r=0,95 при Р<0,01), й умовно досліджувані генотипи можна розподілити таким чином: стійкі до фузаріозу – ВНИИМК 165 поліпшений, Хортицька 1, Громада, сприйнятливі – Донська крупнокистна, Небраска, Гібрид ранній. Крім того, з'являється можливість оцінки селекційного матеріалу рицини на стійкість до фузаріозу за чутливістю пилку до токсинів патогена. Це дозволяє швидко та надійно оцінити вивчений матеріал ще до зав`язування насіння, не пошкодивши всієї рослини, а потім, знаючи результати лабораторних досліджень, виділити від найбільш перспективних зразків насіння. Це надасть змогу суттєво прискорити процес створення резистентних сортів.

Таблиця 1

Рангова характеристика стійкості рицини до фузаріозу на різних стадіях життєвого циклу

Генотип | СВУ | Ранг | ВПП | Ранг

ВНИИМК 165 поліпшений | 0,0 | 1 | 54,3 | 2

Хортицька 1 | 15,9 | 2 | 61,9 | 3

Громада | 20,8 | 3 | 72,2 | 1

Донська крупнокистна | 75,0 | 4 | 26,5 | 5

Небраска | 76,5 | 5 | 30,3 | 4

Гібрид ранній | 86,7 | 6 | 18,9 | 6

Примітки: 1. СВУ – середній відсоток ураженості спорофіта.

2. ВПП – відносний відсоток проростання пилку на середовищі з токсинами.

На підставі встановленої кореляції між проростаючим пилком на середовищі з токсичним агентом і показником стійкості сорту на рівні спорофіта передбачена можливість успішного пилкового добору на стійкість до Fusarium oxysporum.

Вплив добору в F1 пилку, стійкого до токсинів Fusarium oxysporum, на склад спорофітного покоління у рицини. Зважаючи на результати з генотипової відмінності за реакцією пилку рицини на біотичний стрес, а також на ефективність робіт з гаметофітної селекції до абіотичних факторів, зроблено припущення, що добір в гетерогенній популяції зрілих пилкових зерен до токсинів гриба може бути успішним для підвищення стійкості до фузаріозного в`янення спорофітного покоління, що утворюється.

Мікрогаметофітнитй добір в F1 проводили шляхом попереднього нанесення культурального фільтрату на приймочку жіночої квітки (дослід), що створює селективний фон для проростання пилку. Початкова гетерогенність популяції чоловічих гаметофітів гібридів F1 за ознакою стійкості до токсинів Fusarium oxysporum обумовлена тим, що гібриди одержували від схрещування контрастних за стійкістю до фузаріозного в`янення батьківських форм.

Аналіз популяції F2 показує, що при проведенні добору у гібридів F1, структура популяції F2 змінюється у бік збільшення кількості стійких до фузаріозу рослин (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив добору в F1 стійкого до токсинів Fusarium oxysporum пилку на стійкість рослин популяцій F2 до фузаріозу

Варіант | Кількість хворих рослин, %

Тривалість періоду від посіву, днів

60 | 70 | 90 | в кінці вегетації

3-5 справжніх листків | початку цвітіння | закінчення цвітіння

Хортицька 1 Гібрид ранній

Контроль | 2,8±1,59 | 21,2±3,93 | 5,2±2,14 | 26,8±4,26

Дослід | 4,1±1,78 | 7,6±2,39** | 5,6±2,07 | 16,2±3,32*

Хортицька 1 Небраска

Контроль | 19,3±5,23 | 54,3±6,59 | 35,3±6,53 | 73,6±5,83

Дослід | 21,3±5,97 | 27,0±6,48** | 20,8±5,92 | 53,2±6,91*

ВНИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна

Контроль | 3,2±2,20 | 4,8±2,67 | 3,5±2,30 | 10,9±3,89

Дослід | 3,8±1,87 | 5,0±2,14 | 2,2±1,44 | 10,6±3,02

Примітка. *,** – відхилення дослідного варіанту від контрольного суттєві при Р<0,1 і 0,01 відповідно.

При цьому ураження фузаріозом упродовж вегетації проходить нерівномірно. Мікрогаметофітний добір призводить до суттєвої різниці між контрольною та дослідною популяціями у фазі початку цвітіння (13,6-27,3%) та збільшує загальну кількість стійких до фузаріозу рослин – від 10,6% до 20,4%. Ефект спостерігається в комбінаціях схрещування Хортицька 1 Небраска та Хортицька 1 Гібрид ранній. Крім того, аналіз успадкування стійкості в комбінації Хортицька 1 Небраска показує, що після гаметофітного добору (дослідний варіант) спостерігається зрушення від класичного співвідношення 3:1 до 1:1 (53,2%). У комбінації Хортицька 1 Гібрид ранній також спостерігається зрушення від очікуваного співвідношення. Однак, враховуючи домінантний характер ознаки стійкості, після проведення гаметофітного добору, замість очікуваних 100% стійких до фузаріозу рослин, в дослідному варіанті було виділено 16,2% хворих рослин. Можливо, в даному випадку не всі нестійкі пилкові зерна елімінували. У комбінації ВНИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна зрушення популяції не відмічено, на наш погляд, у зв`язку з дуже високою початковою стійкістю генотипу ВНИИМК 165 поліпшений. Нагадаємо, що цей сорт найменше уражувався патогенним мікроорганізмом при попередній оцінці. Відсоток хворих рослин у популяції F2 даної комбінації схрещування за весь період не перевищує 10,6%. В цілому ефективність добору виявилася генотипоспецифічною та залежала від ступеня стійкості вихідних батьківських форм.

Зважаючи на такі дані, можна зробити висновок, що в результаті мікрогаметофітного добору на стійкість до токсинів Fusarium oxysporum у поколінні F2 збільшилась частка рослин, стійких до фузаріозу. Це свідчить, що мікрогаметофітний добір, завдяки значному перекриванню в гапло-диплоїдній експресії генів, дозволяє варіювати генетичною мінливістю наступного спорофітного покоління.

Відбір гамет з певними характеристиками (у нашому випадку – стійких до токсинів гриба) серед популяції мікрогаметофітів гібридів F1 може змінювати структуру популяції F2 також за деякими іншими ознаками, що контролюються генами, які, хоча б частково, зв`язані з генами, що відповідають за стійкість до фузаріозу.

Використані нами генотипи рицини, які є контрастними за стійкістю до фузаріозу, відрізняються також за рядом кількісних ознак спорофіта.

Результати досліджень показали, що гаметофітний добір в F1 за стійкістю до токсинів Fusarium oxysporum суттєво не впливає на середні значення багатьох кількісних ознак в популяції F2. Однак за деякими ознаками в ряді комбінацій схрещування спостерігається суттєва різниця між дослідним і контрольним варіантами.

У комбінації схрещування Хортицька 1 Гібрид ранній та ВНИИМК 165 поліпшений Небраска добір зачепив таку ознаку, як довжина китиці. У першому випадку середня довжина китиці зменшилась у бік фузаріозостійкого генотипу Хортицька 1, а в іншому – збільшилась на користь стійкої форми ВНИИМК 165 поліпшений. Достовірна різниця спостерігається також за висотою рослини, кількістю вузлів і довжиною плодоніжки як у цих комбінаціях, так і в інших.

Таким чином, у ряді випадків добір пилку, стійкого до токсинів гриба, призводить до змін середніх значень деяких кількісних ознак у напрямку, характерному для більш стійкої до фузаріозу батьківської форми.

У дослідних популяціях цих комбінацій виявляються також зрушення при аналізі розподілу рослин F2 за даними ознаками. Зрушення в структурі популяції свідчать про зменшення кількості генотипів з проявом ознак, характерних для сприйнятливих форм типу Небраска і Гібрид ранній та збільшення частки стійких рослин типу Хортицька 1 і ВНИИМК 165 поліпшений (рисунок).

Так, у комбінації схрещування ВНИИМК 165 поліпшений Небраска добір призвів у дослідній популяції до збільшення кількості рослин з довжиною китиці понад 20 см і кількості вузлів більше 9 шт., що характерно для стійкого сорту ВНИИМК 165 поліпшений. У комбінації Хортицька 1 Гібрид ранній поява рослин з висотою понад 150 см і довжиною китиці менше 15 см свідчить про ефективність проведеного добору на користь стійкого батька Хортицька 1.

ВНИИМК 165 поліпшений Небраска

Хортицька 1 Гібрид ранній

Рис. Розподіл популяції рослин в F2 за деякими
морфологічними ознаками

Навіть у тих випадках, де не відмічається суттєвої зміни середніх значень кількісних ознак, спостерігається зрушення дослідної популяції F2 у бік збільшення кількості стійких рослин, на користь яких здійснювався добір.

Отримані дані показують, що добір в F1 комбінації ВНИИМК 165 поліпшений х Небраска викликає зменшення в F2 частки низькорослих потомків і збільшення високорослих рослин типу форми ВНИИМК 165 поліпшений. У комбінації схрещування ВНИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна в дослідному варіанті збільшується кількість рослин з висотою 170-230 см, а в комбінації ВНИИМК 165 поліпшений Небраска ? кількість рослин з висотою штамба 71-100 см. Відмічена поява в популяції F2 Хортицька 1 Гібрид раннй на фоні токсинів рослин з більшою довжиною міжвузля ? від 13,1 до 14,6 см, які в контрольному варіанті не спостерігаються. Усі ці приклади свідчать про ефективність проведеного добору, який призводить до збільшення в F2 частки рослин з характерними для стійких батьківських форм морфометричними ознаками.

Враховуючи отримані результати, можна зробити висновок, що гени, які відповідають за прояв деяких кількісних морфометричних ознак, частково зв`язані з генами стійкості до фузаріозу.

Крім кількісних ознак досліджувані генотипи відрізняються ще й за довжиною проходження основних етапів вегетації. Тому, враховуючи полігенність ознак, що аналізуються (і скоростиглість, і стійкість до фузаріозу), можлива зміна структури популяції F2, отриманої в результаті цілеспрямованого добору певних генотипів у F1.

Результати досліджень свідчать, що добір в F1 стійких мікрогаметофітів забезпечує в потомстві зміни за довжиною проходження рослинами деяких етапів вегетації (табл. 3).

Суттєві відхилення виявляються вже на ранніх етапах розвитку рослини (два справжніх листка) і спостерігаються на подальших етапах (чотири справжніх листка, цвітіння, закінчення цвітіння). Так, у комбінації схрещування ВНИИМК 165 поліпшений х Донська крупнокистна добір викликає зменшення на 30,3% кількості рослин з двома справжніми листками, на 9,2% ? з чотирма листками та призводить до зменшення кількості рослин на 21,1-15,0% на стадії цвітіння та закінчення цвітіння. Разом з цим подібна ефективність мікрогаметофітного добору не є абсолютною. Так, в комбінації ВНИИМК 165 поліпшений Небраска зрушення популяції на фоні токсинів спостерігаються лише на етапі двох справжніх листків і закінчення цвітіння, що теж вказує на ефективність добору на користь рослин типу стійкого до фузаріозу зразка ВНИИМК 165 поліпшений.

Таким чином, гаметофітний добір у F1 на стійкість до токсинів фузаріуму значно змінює структуру дослідних популяцій F2 у бік збільшення в них частки рослин з довжиною проходження деяких етапів вегетації, характерних для фузаріозостійкого батька.

Добір на будь-яку ознаку діє на організм у цілому й призводить до змін інших характеристик генетичної системи. З метою діагностики ефективності добору певний інтерес представляє виявлення кореляції між стійкістю до хвороб і якісними ознаками, тобто виявлення своєрідних маркерів.

Враховуючи позитивні результати, одержані в попередніх роботах щодо гаметофітного добору на стійкість рицини до підвищеної температури при дослідженні якісних морфологічних ознак, нами проведено аналіз популяції F2 і за цими ознаками.

Таблиця 3

Проходження деяких етапів вегетації рослинами популяції F2 при наявності
та відсутності мікрогаметофітного добору в F1

Комбінація схрещування | Етап вегетації | Кількість рослин, %

Контроль

(без токсину) | Дослід

(на фоні токсину)

ВНИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна | Сходи | Формування коліна | 6,3 | 11,8

Сім`ядольні листки | 93,7 | 88,2

2 справжніх листка | 92,4 | 62,1***

3 справжніх листка | 69,9 | 68,5

4 справжніх листка | 19,3 | 10,1*

Цвітіння | Відсутність цвітіння | 30,5 | 51,6

Цвітіння | 69,5 | 48,4**

Закінчення цвітіння |

76,5 | 61,5**

ВНИИМК 165 поліпшений Небраска | Сходи | Формування коліна | 8,1 | 4,7

Сім`ядольні листки | 91,9 | 95,2

2 справжніх листка | 83,5 | 94,7*

3 справжніх листка | 62,8 | 75,8

4 справжніх листка | 25,6 | 19,2

Цвітіння | Відсутність цвітіння | 44,2 | 54,3

Цвітіння | 55,8 | 45,7

Закінчення цвітіння | 62,8 | 47,3**

Примітка. *, **,*** ? відхилення суттєві при Р<0,1 і 0,01; 0,001, відповідно.

Батьківські форми відрізняються не тільки стійкістю до фузаріозу, але й якісними морфологічними ознаками. У використаних нами комбінаціях схрещування (Хортицька 1 Гібрид ранній, Хортицька 1 Небраска, ВНИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна, ВНИИМК 165 поліпшений Небраска) добір за стійкістю до фузаріозу суттєво не впливає на структуру дослідних популяцій потомків за такими ознаками, як забарвленість стебла та наявність воскового нальоту. Це свідчить про відсутність зв'зку між генами, які детермінують досліджувані морфологічні ознаки та стійкість до фузаріозу рослин рицини.

Успадкування стійкості рослин рицини до фузаріозу. Створення стійких сортів не можливе без вивчення успадкування стійкості рослин до хвороб, і це є одним із найважливійших завдань генетики.

Проведеними дослідженнями встановлено, що крім двох відомих генів Suf1 і suf2, які контролюють сприйнятливість, передбачається ще і участь третього гена, умовно позначеного як А. При цьому усі три гени неалельні, а фенотип гібридів визначається їхньою епістатичною взаємодією. Домінантний алель А, який контролює сприйнятливість, епістатичний по відношенню до гена стійкості Suf2, який у свою чергу пригнічує прояв гена Suf1, який відповідає за сприйнятливість, тобто А› Suf2 › Suf1. Тому стійкими до фузаріозу комбінаціями є аа Suf1 Suf1 Suf2 Suf2 та аа suf1 suf1 Suf2 Suf2. Враховуючи це, можна уявити генотипи вивчених сортів таким чином:

Хортицька 1 - аа Suf1 Suf1 Suf2 Suf2 (стійкий),

ВНИИМК 165 поліпшений - аа suf1 suf1 Suf2 Suf2 (стійкий),

Донська крупнокистна - аа Suf1 Suf1 suf2 suf2 (сприйнятливий),

Гібрид ранній - аа Suf1 Suf1 suf2 suf2 (сприйнятливий),

Небраска – АА Suf1 Suf1 Suf2 Suf2 (сприйнятливий).

У результаті в комбінації схрещування Хортицька 1 Небраска (генотипи відрізняються тільки за геном А) спостерігається домінування сприйнятливості внаслідок того, що домінантний алель А перешкоджає прояву домінантного алеля Suf2. При цьому гібриди першого покоління мають генотип Аа Suf1 Suf1 Suf2 Suf2, а в потомстві F2 з проаналізованих 121 рослин спостерігається 76,2%, уражених фузаріозом, і 23,8% здорових рослин.

У випадку, коли батьківські форми відрізняються алельністью лише за генами Suf1 Suf2 та є гомозиготними за аа, в другому поколінні спостерігається перевага стійких форм. Так, у комбінації ВНИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна в F2 стійкими були 82%, що відповідає розщепленню 13:3.

У комбінації Хортицька 1 Гібрид ранній батьківські форми відрізняються лише за алельністю гена Suf2, що призвело до розщеплення популяції F2 у співвідношенні 3:1.

Таким чином, у результаті отриманих даних встановлено існування третього гена А, домінантний алель якого відповідає за контролювання сприйнятливості рослин рицини до фузаріозу. Новий ген А виявлений у закордонному сорті Небраска (США) (табл. 4).

Таблиця 4

Успадкування ознаки стійкості до фузаріозу у різних комбінаціях схрещування у рицини

Комбінація схрещування | Фенотип Р | Кількість вивчених рослин, шт. | Відношення фенотипових класів у F2 | Розще-плення | Х2

+ | > | здо-рових | ура-же-них

Хортицька 1 Небраска | Ст | Сп | 121 | 33 | 88 | 1:3 | 0,40

ВНИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна | Ст | Сп | 121 | 99 | 22 | 13:3 | 0,25

Хортицька 1 Гібрид ранній | Ст | Сп | 212 | 155 | 57 | 3:1 | 1,00

Примітки: 1. Ст – стійкий.

2. Сп – сприйнятливий.

3. Х20,05/k=1/=3,84.

Тобто, характер успадкування стійкості до фузаріозу у рицини визначається складною взаємодією трьох неалельних генів.

При цьому розглянуті нами лінії відрізняються за алельністю усіх генів: А, Suf1, Suf2. Тому результати схрещування в різних комбінаціях визначаються вихідним генотипом батьківських форм, а іноді виявляються протилежними ? від переваги в F2 стійких форм у співвідношенні 13:3 або 3:1 (комбінація ВНИИИМК 165 поліпшений Донська крупнокистна й Хортицька 1 Гібрид ранній відповідно) до переваги сприйнятливих – співвідношення 1:3 (у комбінації Хортицька 1 Небраска).

Вплив метаболіту Fusarium oxysporum на морфометричні ознаки рослин рицини. Зважаючи на те, що в більшості відомих із літератури робіт відображено негативний вплив захворювання на показники продуктивності рослин і лише незначна кількість їх торкається впливу патогена на морфометричні показники, проведено дослідження впливу патогена на такі ознаки, як висота рослини, довжина китиці, довжина міжвузлів, довжина плодоніжок, кількість вузлів, розмір коробочок. Для спостережень використовували рослини популяцій F2, які не мали явних ознак захворювання і в яких мікрогаметофітний добір не проводився.

У 2003 році, який характеризувався високими температурами і відсутністю опадів у період проростання насіння, а в період появи сходів і до початку цвітіння – рясними опадами, спостерігали слабкий прояв агресивності фузаріуму. Це, у свою чергу, призвело до того, що патоген менше викликав загибель рослин, а більше інгібував деякі морфометричні ознаки (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив штучного інфекційного фону на деякі морфометричні

ознаки у рослин рицини

Комбінація схрещування | Варіант | Висота рослини, см | Висота штамбу, см | Довжина міжвузлів, см

ВНИИМК 165 поліпшений Небраска | ІФ | 74,5±6,01*** | 44,5±5,12*** | 6,7±0,48***

ВНИИМК 165 поліпшений Небраска | БІФ | 139,0±5,12 | 91,5±4,23 | 10,9±0,37

Хортицька 1 Гібрид ранній | ІФ | 110,5±3,70*** | 48,0±3,10*** | 6,3±0,38***

Хортицька 1 Гібрид ранній | БІФ | 137,0±4,11 | 71,5±7,00 | 10,6±0,23

Гібрид ранній Громада | ІФ | 124,0±6,03*** | 65,5±4,13*** | 9,6±0,35***

Гібрид ранній Громада | БІФ | 145,0 ±2,24 | 87,0±3,04 | 12,6±0,19

Примітки: 1. *** ? відхилення суттєві при Р<0,001.

2. ІФ ? інфекційний фон.

3. БІФ – безінфекційний фон.

Найбільш уразливими були рослини комбінації схрещування ВНИИИМК 165 поліпшений Небраска, де зниження таких показників як висота рослин, штамбу, довжина міжвузлів на інфекційному фоні становить від 1,6 до 1,9 раза. Слабкіше відреагували рослини комбінації Хортицька 1 Гібрид ранній (зниження склало 1,3-1,7 раза). Менш за все інгібуюча дія була виявлена в комбінації Гібрид ранній х Громада (зміна показників склала 1,2-1,3 раза).

Однак патоген не торкнувся інших ознак: довжини китиці, довжини плодоніжки, розміру коробочок, кількості вузлів. У цілому в залежності від природи батьківських форм гетерогенні популяції у різному ступені відреагували на хворобу.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення й нове вирішення наукового завдання з вивчення ефективності методу мікрогаметофітного добору в F1 на стійкість до патогена Fusarium oxysporum у рицини. Це дозволяє підвищити стійкість до фузаріозу популяцій спорофітів F2 за рахунок збільшення кількості стійких рослин, завдяки встановленню зв'язку між чутливістю гаметофита до токсинів гриба й стійкістю спорофіта до фузаріозу.

За результатами досліджень зроблені такі основні висновки:

1. Виявлені розходження між генотипами рицини за стійкістю пилку до токсинів Fusarium oxysporum і стійкістю до фузаріозу на спорофітному рівні. У стійких генотипів на середовищі з культуральним фільтратом проростало більше ніж 50% пилкових зерен від кількості можливих.

2. Встановлено позитивний зв`язок між проростанням пилку на середовищі з токсинами і стійкістю рослин до фузаріозу (r= 0,95 ? ранговий коефіцієнт).

3. У результаті проведеного добору в гетерогенній популяції мікрогаметофітів шляхом нанесення культурального фільтрату на приймочки жіночих квіток гібридів F1 спостерігається підвищення стійкості до фузаріозного в`янення популяції F2 за рахунок збільшення в них частки фузаріозостійких генотипів. Найбільш суттєве зрушення має місце на стадії початку цвітіння та в кінці вегетації. Різниця в кількості фузаріозостійких рослин між порівнюваними варіантами становить 10,6-20,4%.

4. Гаметофітний добір в F1 на стійкість до токсинів суттєво впливає на середні значення ряду кількісних ознак рослин у популяціях в F2, а саме: на висоту рослини, довжину китиці, кількість міжвузлів, довжину плодоніжок і достовірно не впливає на структуру популяції за такими морфометричними якісними ознаками, як забарвлення стебла й наявність воскового нальоту.

5. Мікрогаметофітний добір у гібридів F1, отриманих від схрещування контрастних за стійкістю до фузаріозу батьківських форм, викликає зміни в розподілі рослин F2 за рядом кількісних ознак. При цьому зрушення складу популяції спостерігається у бік стійкої до фузаріозу батьківської форми.

6. Мікрогаметофітний добір в F1 на стійкість до токсинів метаболіту Fusarium oxysporum суттєво впливає на проходження деяких етапів вегетації потомками популяції F2 в напрямку, характерному для стійкого сорту, що вказує на підвищення стійкості популяції F2 та може бути використане в селекційній практиці.

7. Встановлено, що сприйнятливість рицини до фузаріозу контролюється, крім двох відомих генів Suf 1 і suf2, ще й третім геном А, який виявлений у закордонному сорті Небраска (США). У результаті складної взаємодії трьох неалельних генів і залежно від генотипу батьківської форми в F2 спостерігається як перевага стійких форм у співвідношенні 13:3 або 3:1, так і перевага сприйнятливих форм у співвідношенні 1:3.

8. На ранніх етапах розвитку (стадія сходів) патоген інгібуюче діє як на сприйнятливі, так і на стійкі до фузаріозу генотипи. При цьому рослини стійких зразків можуть реагувати активніше на інфекцію, ніж сприйнятливі.

9. Встановлено, що інфекційний фон сутєво впливає на проявлення ряду кількісних ознак, таких, як висота рослин, висота штамбу і довжина міжвузлів та ін. При цьому в залежності від ступеня агресивності патогена змінюються різні кількісні ознаки.

РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Встановлений позитивний зв'язок між стійкістю чоловічого гаметофіта до токсинів Fusarium oxysporum і стійкістю спорофіта до фузаріозу дозволяє рекомендувати методичний підхід, заснований на здатності проростання пилку на середовищі з токсинами, як экспрес-метод оцінки якості спорофітного покоління за стійкістю до фузаріозного в'янення.

2. Добір мікрогаметофітів, стійких до токсинів гриба, що призводить до збільшення кількості стійких до фузаріозу рослин, дозволяє підвищити стійкість селекційного матеріалу й прискорити процес утворення стійких до фузаріозу форм.

3. Метод мікрогаметофітного добору у рицини за стійкістю до фузаріозного в'янення рекомендується використовувати як засіб цілеспрямованої зміни генетичної структури популяцій спорофітів для збільшення кількості рослин як стійких до фузаріозу, так і з бажаними морфологічними та фізіологічними ознаками.

4. Встановлення нового третього гена А, крім двох відомих генів Suf 1 і suf2, і демонстрація складної їхньої взаємодії, у результаті якої у популяціях F2 спостерігається як перевага стійких форм, так і перевага сприйнятливих, дає можливість одержувати необхідні генні комбінації й стійкі до фузаріозу сорти.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Никонова В.Н., Лях В.А. Оценка устойчивости клещевины к фузариозу на гаметофитном уровне // Міжвідомчий тематичний наук. збірник Інституту овочівництва і баштанництва УААН “Овочівництво й баштанництво”. – Харків, 2002. – Вип. 47. – С. 431-433 (доля участі здобувача – 50%, особистий внесок – виконання експериментальних досліджень, статистична обробка даних, участь у написанні статті).

2. Ніконова В.М. Інгібуюча дія гриба Fusarium oxysporum на рослини рицини // Вісник аграрної науки. – 2005. – №7. – С. 74-75.

3. Лях В.А., Никонова В.Н. Оценка клещевины к фузариозному увяданию в условиях искусственного климата // Наук.-техн. бюл. ІОК УААН. – Запоріжжя, 2002. – Вип. 7. – С. 26-30 (доля участі здобувача – 50%, особистий внесок – виконання експериментальних досліджень, статистична обробка даних, участь у написанні статті).

4. Никонова В. Н., Лях В.А. Влияние отбора в F1 пыльцы, устойчивой к токсину Fusarium oxysporum, на некоторые количественные признаки в популяции F2 клещевины // Наук.-техн. бюл. ІОК УААН. – Запоріжжя, 2004. – Вип. 9. – С. 67-73 (доля участі здобувача – 60%, особистий внесок – виконання експериментальних досліджень, статистична обробка даних, участь у написанні статті).

5. Никонова В.Н., Лях В.А. Влияние отбора в F1 пыльцы, устойчивой к токсину Fusarium oxysporum, на генетическую структуру расщепляющейся популяции спорофитов у клещевины // Вісник ЗНУ. – Запоріжжя, 2006. – Вип. 1. – С. 132-136 (доля участі здобувача – 60%, особистий внесок – виконання експериментальних досліджень, статистична обробка даних, участь у написанні статті).

6. Войтович Е.Н., Никонова В.Н., Лях В.А. Генетика устойчивости клещевины к фузариозному увяданию // Зб. наук. пр. Українського товариства генетиків і селекціонерів “Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології”. – К.: Логос, 2007. – Т.2. – С. 57-60 (доля участі здобувача – 50%, особистий внесок – виконання експериментальних досліджень, статистична обробка даних, участь у написанні статті).

7. Никонова В.Н., Лях В.А. Гаметофитный отбор