МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ ІМЕНІ П.Л. ШУПИКА

ОМЕЛЬЧЕНКО ЗІНАЇДА ІЛАРІОНІВНА

УДК:615.332:582.542.1:633.87

ФІТОХІМІЧНЕ ВИВЧЕННЯ SETARIA ITALICA ТА СТВОРЕННЯ НА ЇЇ ОСНОВІ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі хімії природних сполук Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

Кисличенко Вікторія Сергіївна

Національний фармацевтичний університет,

завідуюча кафедрою хімії природних сполук

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, старший науковий

співробітник

КОНОВАЛОВА ОЛЕНА ЮРІЇВНА

Медичний інститут Української асоціації народної медицини, завідуюча кафедрою

фармацевтичної хімії та фармакогнозії

кандидат фармацевтичних наук, доцент

ТОДОРОВА ВІОЛЕТА ІВАНІВНА

Національна медична академія післядипломної

освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України,

доцент кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії

Захист відбудеться „_20___”__ червня_ 2008 р. о __11.00_____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий „_16___” травня___ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.Б. Пилипчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук рослин з достатньою сировинною базою, комплексне використання сировини з метою створення нових лікарських засобів пояснює інтерес до вивчення сільськогосподарських культур. До таких культур належить чумиза (італійське просо) – Setaria italica (L.), родини злакові – Poaceae, плоди якої широко використовуються в харчовій промисловості, спиртовиробництві. Відходом виробництва є трава чумизи, яка використовується як поживний корм та містить значну кількість біологічно активних речовин (БАР).

На практиці потенціал БАР і природний ресурс трави та плодів чумизи використовуються недостатньо. Інтерес до цього виду сировини обумовлений рядом чинників, серед яких основним є той факт, що до складу плодів і трави входить комплекс сполук, якісний склад і кількісний вміст яких, дозволяє розглядати її як джерело для виробництва лікарських препаратів, косметичних засобів, спеціальних харчових продуктів – дієтичних добавок.

Наявність достатньої сировинної бази, значний вміст різних груп БАР з різноманітною фармакологічною активністю, перспективність розробки на їх основі нових лікарських засобів роблять тему дисертації актуальною. Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом проблемної комісії «Фармація» МОЗ та АМН України і є фрагментом комплексної науково – дослідної роботи Національного фармацевтичного університету «Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження (номер державної реєстрації 0103U000476).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було фітохімічне вивчення чумизи сорту Дніпровська, що культивується в Україні, дослідження різних груп біологічно активних речовин трави і плодів чумизи та визначення можливості створення лікарських засобів на їх основі, стандартизація сировини та отриманого фітозасобу.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- провести інформаційний пошук та критичний аналіз сучасного стану досліджень за темою дисертаційної роботи;

- провести попередні фітохімічні дослідження якісного складу трави та плодів чумизи;

- визначити кількісний вміст основних груп БАР у траві та плодах чумизи;

- одержати біологічно активні субстанції, визначити їх хімічний склад та фармакологічну дію;

- виділити в індивідуальному стані БАР і встановити їх структуру;

- встановити основні анатомо-діагностичні ознаки трави та плодів чумизи;

- вибрати спосіб одержання екстракту з трави чумизи;

- провести стандартизацію лікарської рослинної сировини – трави та плодів чумизи; рідкого екстракту з трави чумизи та розробити відповідні проекти аналітичної нормативної документації (АНД);

- підтвердити можливість створення нових лікарських засобів з сировини, що досліджувалась, шляхом вивчення фармакологічної активності отриманої субстанції.

Об`єкти дослідження: трава чумизи, плоди чумизи, біологічно активні речовини, виділені з них: вільні і зв`язані цукри, полісахариди, мікро- та макроелементи, амінокислоти, вітаміни, сапоніни, органічні кислоти, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, дубильні речовини, кумарини, ліпофільні речовини.

Предмет дослідження: виявлення, виділення, ідентифікація БАР трави та плодів чумизи, одержання і стандартизація на їх основі нових лікарських субстанцій, вивчення фармакологічної активності.

Методи дослідження: Якісний склад і кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами з використанням тонкошарової хроматографії (ТШХ), паперової хроматографії (ПХ), газорідинної хроматографії (ГРХ), газової хроматографії/мас-спектрометрії (ГХ/МС). Ліпофільні комплекси досліджували за допомогою тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектра. Для розділення БАР використовували колонкову хроматографію на поліаміді та силікагелі, а також препаративну хроматографію на папері і в тонкому шарі сорбента. Хімічну будову виділених сполук встановлювали за допомогою УФ-, ІЧ-, ПМР-спектрів, мас-спектрометрії, температури плавлення та їх хімічних перетворень. Елементний склад вивчали методом атомно-емісійної спектрометрії, амінокислотний – за допомогою амінокислотного аналізатора LKB 4151 «Альфа Плюс». Анатомічну будову трави та плодів вивчали на препаратах з поверхні та поперечних зрізах. Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичне фітохімічне вивчення БАР трави та плодів чумизи сорту Дніпровська, що культивується на території України.

Встановлено в них наявність та кількісний вміст вуглеводів, органічних кислот, амінокислот, сапонінів, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, кумаринів, хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот, вітамінів, стеринів, мікро- і макроелементів.

Вперше в траві та плодах чумизи ідентифіковано 56 речовин, з них виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 18 фенольних сполук: 5 гідроксикоричних кислот (кавової, ферулової, хлорогенової, неохлорогенової, п-кумарової), 5 похідних кумарину (умбеліферону, скополетину, ізоскополетину, дафніну, 4-пропеноксикумарину), 8 флавоноїдів (апігеніну, лютеоліну, цинарозиду, кверцетину, вітексину, орієнтину, гомоорієнтину, сапонаретину); 2 ангідроцукрів; 24 жирних кислот; 12 стеринів. Встановлено наявність та кількісний вміст 16 амінокислот, 27 мікро- та макроелементів.

Визначено оптимальні умови і розроблено спосіб одержання рідкого екстракту з трави чумизи (новизна розробленого оригінального фітозасобу підтверджена поданою заявкою до Укрпатенту на корисну модель № u 2007 13310 від 29.11.2007 (Рішення про видачу патенту на корисну модель від 19.12.2007).

Вперше вивчено анатомічну будову сировини – трави та плодів чумизи і визначено діагностичні ознаки.

Вперше для рідкого екстракту з трави чумизи визначена гостра токсичність, встановлена протизапальна та діуретична активність.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено спосіб одержання рідкого екстракту з трави чумизи з протизапальною та діуретичною активністю. Розроблено проекти АНД на «Траву чумизи», «Плоди чумизи», «Рідкий екстракт з трави чумизи».

Результати досліджень впроваджені в навчальний процес кафедри ботаніки Національного фармацевтичного університету; кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національного фармацевтичного університету; кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського; кафедри фармакогнозії Запорізького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо автором здійснено:

- інформаційний пошук за темою дисертаційної роботи, аналіз сучасних досягнень за обраним напрямком, що стало підґрунтям для вибору об`єктів дослідження;

- встановлено наявність і визначено кількісний вміст полісахаридів та їх фракційний склад, а також амінокислот, органічних кислот, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, кумаринів, жирних кислот, стеринів, вітамінів, хлорофілів, каротиноїдів, мікро- та макроелементів;

- ідентифіковано 56 речовин, з них виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 18 фенольних сполук; 2 ангідроцукрів; 24 жирних кислот; 12 стеринів. Встановлено наявність та кількісний вміст 16 амінокислот, 27 мікро- та макроелементів;

- розроблено спосіб та одержано рідкий екстракт з трави чумизи;

- вивчено анатомічну будову трави та плодів чумизи;

-

- розроблено проекти АНД на сировину: «Трава чумизи», «Плоди чумизи» та «Рідкий екстракт з трави чумизи».

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговорені на науково-практичних конференціях різного рівня: «Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок» (Тернопіль, 2004); «Актуальные проблемы образования, науки и производства в фармации» (Ташкент, 2005); II Міжнародному симпозіумі «Методи хімічного аналізу» (Ужгород, 2005); «Лікувальна косметика: дійсність та майбутнє» (Харків, 2005); VI Національному з`їзді фармацевтів України (Харків, 2005); X Международном съезде Фитофарм 2006 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов растительного происхождения (г. Санкт-Петербург, 2006); II Міжнародній науково-практичній конференції «Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок» (Харків, 2006); Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі «Ліки та життя» (Київ, 2007); VII Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Клінічна фармація в Україні»(Харків, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 12 наукових робіт, у тому числі 4 статті (3 у наукових фахових виданнях), 8 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, 4 розділів, загальних висновків, списку літературних джерел та 7 додатків. Загальний обсяг дисертації складає 167 сторінок машинописного тексту. Робота ілюстрована 65 рисунками і 32 таблицями. Обсяг основного тексту дисертації складає 126 сторінок. Список використаних літературних джерел містить 155 найменування, з них 103 кирилицею та 52 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Ботанічна характеристика родини злакові. Характеристика роду мишій (Setaria Beauv.), розповсюдження, хімічний склад, біологічна активність деяких представників роду, застосування чумизи в медицині та народному господарстві (огляд літератури)

В огляді літератури наведено ботанічну характеристику родини злакові та роду мишій, який об`єднує більше 120 видів, з яких на території країн колишнього СРСР налічується тільки 9 видів, в Україні з них зростає 4 види. Мишій італійський широко культивується в світі, зокрема в Україні вирощують сорт чумизи Дніпровська згідно ТУ У 01.1-30378663-001-2002. Сорт характеризується багатим вмістом біологічно активних речовин і може використовуватися не тільки як зернокруп`яна культура, що є сировиною для продуктів дитячого, дієтичного та лікувально-профілактичного харчування, але й як фуражна та лікарська сировина. З плодів чумизи отримують олію, яка може застосовуватися в косметології і медицині.

Хімічний склад трави та плодів чумизи вивчено недостатньо. Тому актуальним є фітохімічне і фармакологічне дослідження рослинної сировини чумизи з метою розробки аналітичної нормативної документації для стандартизації сировини, що дасть змогу створення лікувально-профілактичних засобів на її основі, враховуючи біологічну дію і забезпеченність сировинною базою.

Дослідження хімічного складу та ідентифікація біологічно активних речовин трави та плодів чумизи

За допомогою якісних реакцій, хроматографічних методів аналізу, тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в траві та плодах чумизи виявлені полісахариди, вільні та зв`язані цукри, ангідроцукри, амінокислоти, органічні кислоти, прості феноли, дубильні речовини, гідроксикоричні кислоти, кумарини, флавоноїди, сапоніни, хлорофіли, каротиноїди, жирні кислоти та стерини.

Проведено фракціювання полісахаридів, в результаті чого виділені водорозчинні полісахариди (ВРПС), пектинові речовини (ПР), геміцелюлози (ГЦ). Вперше в полісахаридному комплексі плодів чумизи методом газової хроматографії/мас-спектрометрії були виявлені 1,6-ангідро-в-D-глюкопіраноза (С6Н10О5; Mм=162) і 1,6-ангідро-б-D-галактофураноза (С6Н10О5; Mм=162). Результати дослідження підтверджено мас-спектрами ідентифікованих ангідроцукрів.

З метою комплексного дослідження трави та плодів чумизи нами були отримані ліпофільні фракції. Вихід ліпофільних речовин з трави чумизи становив 2,97 %, з плодів – 9,60 %. Для вивчення якісного складу ліпофільної фракції плодів було застосовано тривимірну скануючу спектрофлуориметрію в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектра. Аналіз одержаних спектрів дозволив зробити висновок щодо наявності в ліпофільній фракції фосфоліпідів, які мають ароматичні групи фенольного типу, конденсованих ароматичних сполук, фенольних сполук (зокрема агліконів деяких флавоноїдів), суміші хлорофілів А і В.

Жирнокислотний склад ліпофільних фракцій з трави та плодів чумизи аналізували методом газорідинної хроматографії (ГРХ) на хроматографі «Chrom-5». В ліпофільній фракції з трави чумизи ідентифіковано 4 жирних кислоти: ліноленову, міристинову, лінолеву, стеаринову, серед яких домінує ліноленова; з плодів – 9 кислот: валеріанову, лінолеву, олеїнову, пальмітинову, ліноленову, стеаринову, арахінову, гондоїнову, ерукову, серед яких на лінолеву кислоту припадає 42,5%. Також у великій кількості міститься валеріанова кислота, яка може бути «маркером» при стандартизації сировини.

Оскільки плоди дають більший вихід ліпофільної фракції, ніж трава, і накопичують за складом більшу кількість жирних кислот, тому було доцільно проаналізувати ліпофільну фракцію плодів методом газової хроматографії/мас-спектрометрії (ГХ/МС). Результати дослідження наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Якісний склад жирних кислот плодів чумизи

Жирна кислота | Загальна формула | Мм

Пентанова (валеріанова), 4-оксо- | С5Н8О3 | 116

Пентадеканова кислота, метиловий ефір | С16Н32О2 | 256

Пентадеканова кислота, 14- метил-, метиловий ефір | С17Н34О2 | 270

Гексадеканова кислота, метиловий ефір | С17Н34О2 | 270

Гексадеканова кислота, етиловий ефір | С18Н36О2 | 284

Гептадеканова кислота, метиловий ефір,

(маргаринова) | С18Н36О2 | 284

6-Октадеценова кислота, (Z) (петрозелінова) | С18Н34О2 | 282

9,12-Октадекадієнова кислота, (Z,Z) (лінолева) | С18Н32О2 | 280

Октадеканова кислота, метиловий ефір, (стеаринова) | С19Н38О2 | 298

9-Октадеценова кислота, метиловий ефір, (Е) (стеаролова) | С19Н36О2 | 296

9-Октадеценова кислота, метиловий ефір, (Z) (стеаролова) | С19Н36О2 | 296

9,12-Октадекадієнова кислота, (метиловий ефір), (Е,Е) (лінолева) | С19Н34О2 | 294

9,12-Октадекадієнова кислота, метиловий ефір (лінолева) | С19Н34О2 | 294

9,12,15-Октадекатриєнова кислота, метиловий ефір, (Z,Z,Z) (ліноленова) | С19Н32О2 | 292

Нонадеканова кислота, метиловий ефір | С20Н40О2 | 312

Лінолева кислота, етиловий ефір | С20Н36О2 | 308

Ейкозанова кислота, метиловий ефір (арахінова) | С21Н42О2 | 326

11-Ейкозенова кислота, метиловий ефір | С21Н40О2 | 324

Генейкозанова кислота, метиловий ефір | С22Н44О2 | 340

Докозанова кислота, метиловий ефір (бегенова) | С23Н46О2 | 354

Трикозанова кислота, метиловий ефір | С24Н48О2 | 368

Тетракозанова кислота, метиловий ефір, (лігноцеринова) | С25Н50О2 | 382

Гексакозанова кислота, метиловий ефір | С27Н54О2 | 410

Октакозанова кислота, метиловий ефір | С29Н58О2 | 438

Результати дослідження ліпофільної фракції плодів чумизи підтверджено мас-спектрами жирних кислот, ідентифікованих в плодах чумизи.

Досліджено стериновий склад ліпофільної фракції плодів чумизи методом ГРХ на хроматографі «Chrom-5». В результаті проведених досліджень було виявлено холестерин та суму фітостеринів, до складу яких входять кампестерин та в-ситостерин. Однак, на наш погляд, суму фітостеринів потрібно було детальніше ідентифікувати. У вирішенні проблеми з`ясування будови стеринів значні можливості дає метод мас-спектрометрії, який дозволяє точно визначати молекулярну масу стерину і легко розрізняти сполуки зі скелетом, що містить 29, 30 чи 31 вуглецеву одиницю. Методом ГХ/МС в плодах чумизи ідентифіковано набагато більше стеринів. Результати експерименту наведено в табл. 2.

Таблиця 2

Якісний склад стеринів плодів чумизи

Стерин | Загальна формула | Мм | Т. пл., оС, [б],

град

Ергостанол | С28Н50О | 402 | F=144-145о [б]D= 15,9 о

г- Ситостерол | С29Н50О | 414 | F=146-148 о [б]D= - 42

Стігмастерол | С29Н48О | 412 | F=168-170 о [б]D= - 51о

Холест-5-єн-3-oл,24-пропіліден,(3в)- | С30Н50О | 426

Ланостерол | С30Н50О | 426

Стігмаста-5,24(28)-дієн-3-oл,(3 в, 24 Z)- | С29Н48О | 412

5-Холестен-3-oл, 24-метил- | С28 Н48О | 400

Стігмастанол | С29Н52О | 416 | F=138-141о [б]D= 24 о

Стігмастан-3,5-дієн | С29Н48 | 396

Кампестерол | С28 Н48О | 400 | F=157-158 о [б]D= -33 о

Стігмаст-4-єн-3-oн | С29Н48О | 412

9,19-Циклоланост-24-єн-3-oл, aцетат, (3 в)- | С32Н52О | 468

Результати дослідження ліпофільної фракції плодів чумизи підтверджено мас-спектрами стеринів, які ідентифіковані в плодах чумизи.

Для виділення БАР і розділення їх на індивідуальні компоненти використовували методи колонкової хроматографії, рехроматографії на поліаміді і силікагелі, препаративної хроматографії на папері і в тонкому шарі сорбента. В результаті дослідження вперше в траві та плодах чумизи ідентифіковано 56 речовин, з них виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 18 фенольних сполук: 5 гідроксикоричних кислот (кавової, ферулової, хлорогенової, неохлорогенової, п-кумарової), 5 похідних кумарину (умбеліферону, скополетину, ізоскополетину, дафніну, 4-пропеноксикумарину), 8 флавоноїдів (апігеніну, лютеоліну, цинарозиду, кверцетину, вітексину, орієнтину, гомоорієнтину, сапонаретину); 2 ангідроцукрів; 24 жирних кислот; 12 стеринів. Встановлено наявність та кількісний вміст 16 амінокислот, 27 мікро- та макроелементів.

На основі фізико-хімічних властивостей речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії, ГХ/МС, порівняння з вірогідними зразками встановлено їх структури. Основні фізико-хімічні властивості виділених фенольних сполук наведені в табл. 3.

Таблиця 3

Основні фізико-хімічні властивості фенольних сполук, виділених з трави та плодів чумизи

Речовина, її структурна характеристика | Джерело отримання сполуки | Т пл., єС | [б],

град | УФ-спектр, л нм | Rf у системах розчинників

Система | Rf

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

Кумарини

2.1. Умбеліферон

(7-гідроксикумарин) | Трава | 228-230 | - | 218

256

328 | 3

4 | 0,64

0,36

2.2. Скополетин

(6-метокси-7-гідроксикумарин) | -“- | 204-205 | - | 234

256

298

343 | 3

4 | 0,5

0,58

2.3. Ізоскополетин

(6-гідрокси-7-метоксикумарин) | -“- | Аморфне | - | 230

255

295

345 | 4 | 0,83

2.4. Дафнін

(7-O-в-D-глюкозил-8-гідроксикумарин) | -“- | 215 | - | 223

259

311 | 4 | 0,51

2.5. 4-пропеноксикумарин | -“- | 104-105 | - | 220

265

276

303

338 | 4 | 0,33

Похідні коричної кислоти

2.6. n-Кумарова кислота

(4-гідроксикорична кислота) | Трава | 212-214 | - | 310

228 | 1

3 | 0,89

0,48

2.7. Кавова кислота

(3,4-дигідроксикорична кислота) | -“- | 194-195 | - | 325

299

235 | 1

3 | 0,81

0,32

Продовж. табл. 3

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

2.8. Ферулова кислота

(3-метокси-4-гідроксикорична кислота) | -“- | 168-170 | 320

290

234 | 1

3 | 0,88

0,55

2.9. Хлорогенова кислота

(5-О-кофеїл-D-хінна кислота) | -“- | 203-205 |

-32 (метанол) | 329

300

245 | 1

3 | 0,62

0,66

2.10. Неохлорогенова кислота

(3-О-кофеїл-D-хінна кислота) | -“- | Аморф. | +2,6 (етан

ол) | 330

300

244 | 1

3 | 0,66

0,7

Флавони

2.11. Апігенін

(5,7,4’ – тригідроксифлавон) | Трава | 345-346 | - | 275

321

401 | 1

3 | 0,9

0,1

2.12. Лютеолін

(5,7,3,4 - тетрагідроксифлавон) | -“- | 327-328 | - | 255

318

350

410 | 1

3 | 0,82

0,11

2.13. Цинарозид

(лютеолін-7-О-в-D-глюкопіранозид) | -“- | 257-259 | -41 | 352

257 | 1

3 | 0,42

0,21

Флавоноли

2.14. Кверцетин

(3,5,7,3,4-пентагідроксифлавон) | Трава | 310-312 | - | 375

268

256 | 1

3 | 0,69

0,7

С-глікозиди флавонів

2.15. Вітексин

(апігенін-8-С-в-D-глюкопіранозид) | Трава | 263-265 | - 14,2 (етан

ол) | 280

300

389 | 1

3 | 0,58

0,36

2.16. Орієнтин

(лютеолін-8-С-в-D-глюкопіранозид) | -“- | 255-257 | +22

(етан

ол) | 348

255

271 | 1

3 | 0,29

0,19

2.17. Гомоорієнтин

(лютеолін-6-С-в-D-глюкопіранозид) | -“- | 220-223 | + 21

(етан

ол) | 284

307

322

350 | 1

3 | 0,38

0,44

2.18. Сапонаретин

(апігенін-6-С-в-D-глюкопіранозид) | -“- | 259-261 | + 48

(етан

ол) | 280

300

405 | 1

3 | 0,72

0,61

Примітка. Системи розчинників: 1- н-бутанол-кислота оцтова-вода БОВ (4:1:2); 3- 15 % кислота оцтова; 4- хлороформ (формамід 25 %).

Кумарини. Речовини 2.1-2.5 на підставі якісних реакцій, ТШХ, ПХ – наявність блакитно-синьої флуоресценції в УФ-світлі при обробці хроматограм парами аміаку та жовтогарячого забарвлення при денному світлі після обробки хроматограм діазореактивом – віднесені до похідних кумарину.

Речовини 2.1 – 2.4 давали позитивні реакції з розчином заліза (III) хлориду, що вказувало на наявність фенольних гідроксилів.

В УФ-спектрі етанольного розчину речовини 2.1 виявлялися максимуми при 218, 256, 328 нм. При додаванні натрію етилату спостерігалося батохромне зміщення смуги – 231, 370 нм, що вказувало на присутність у досліджуваній речовині фенольної групи. В ІЧ-спектрі речовини 2.1 смуги поглинання виявлялися при 3260 см-1. Це дозволяло припустити наявність гідроксильної групи при С-7. Відсутність депресії температури плавлення суміші речовини 2.1 з умбеліфероном свідчило про ідентичність досліджуваної речовини умбеліферону (7-гідроксикумарину).

В УФ-спектрі речовини 2.2 виявлялися максимуми при 234, 256, 298, 343 нм. Наявність фенольного гідроксилу підтверджується батохромним зсувом довгохвильової смуги в УФ-спектрі на 60 нм при додаванні натрію етилату. При ацетилюванні речовини 2.2 утворювався моноацетат, при метилюванні отримано метильне похідне з температурою плавлення 142-143 °С, яке не давало депресії температури плавлення з 6,7-диметоксикумарином. Порівняння фізико-хімічних властивостей речовини 2.2 і скополетину, величин Rf в різних системах розчинників, а також ідентичність їх УФ- та ІЧ-спектрів і відсутність депресії температури плавлення змішаної проби зі скополетином дозволило охарактеризувати речовину 2.2 як скополетин (6-метокси-7-гідроксикумарин).

Речовина 2.3 виявлялася на хроматограмах у вигляді ледь блакитної плями, а після обробки парами аміаку, забарвлювалася в жовтий колір. В УФ-спектрі виявлялися максимуми при 230, 255, 295, 345 нм. Одержана речовина за фізико-хімічними властивостями, УФ- та ІЧ-спектрами, забарвленням в УФ-світлі до і після обробки парами аміаку, відсутністю депресії температури плавлення змішаної проби з ізоскополетином виявилася ідентичною ізоскополетину (6-гідрокси-7-метоксикумарину).

В УФ-спектрі речовини 2.4 виявлялися максимуми при 223, 259, 311 нм. Ця речовина відновлювала реактив Фелінга. Температура плавлення речовини 2.4 – 215 °С. При ферментативному гідролізі вона розщеплювалася на D-глюкозу і гідроксикумарин з температурою плавлення 255-256 °С, в УФ-спектрі якого виявлялися максимуми при 260, 327 нм. Наявність вільної гідроксильної групи підтверджувалося батохромним зсувом довгохвильової смуги в УФ-спектрі на 49 нм при додаванні натрію етилату. Для визначення місця приєднання вуглеводного залишку до кумаринового ядра було проведено метилювання сполуки 2.4 діазометаном з подальшим гідролізом отриманої речовини. Характер та положення замісників фенольного радикалу дафнетину встановлювали на підставі результатів метоксилювання та ацетилювання сполук. Змішана проба продукту гідролізу з дафнетином не давала депресії температури плавлення. Речовину 2.4 було ідентифіковано як дафнін (7-O-в-D-глюкозил-8-гідроксикумарин), а продукт гідролізу – дафнетин (7,8-дигідроксикумарин).

Речовина 2.5 – кристалічна речовина, з температурою плавлення 104-105 °С, яка не давала позитивної реакції з розчином заліза (III) хлориду. В УФ-спектрі виявлялися максимуми при 220, 265, 276, 303, 338 нм, в ІЧ-спектрі (КBr, см-1) – при 1726, 1630, 1572, 1495, 1365, 1270, 1190, 995, 848.

Мас-спектр речовини 2.5 отримано на хромато-мас-спектрометрі Hewlett Packard HP-6890 з мас-селективним детектором HP-5972. Мас-спектр має пік молекулярного іона m/z 202 і пік з m/z 41, який відповідає пропіленовому фрагменту оксикумаринового ядра. Речовина 2.5 мала загальну формулу С12Н10О3, [Mм=202].

Речовина 2.5 не вступала в реакції ацетилювання і метилювання, що свідчило про відсутність вільних гідроксигруп. Речовину 2.5 було ідентифіковано як 4-пропеноксикумарин.

Похідні гідроксикоричних кислот. Речовини 2.6 - 2.10 давали позитивні якісні реакції на фенольний гідроксил з заліза (III) хлоридом, діазотованою сульфаніловою кислотою. Кислотні властивості цих сполук виявлені на підставі утворення синіх плям на ПХ з бромтимоловим синім. При обробці хроматограм реактивом барбітурової кислоти плями речовин 2.9, 2.10 давали блакитне забарвлення, що свідчило про наявність у їх складі хінної кислоти. За результатами хімічних перетворень, даними УФ-спектрів, у порівнянні з вірогідними зразками речовини 2.6 - 2.10 були ідентифіковані відповідно як п-кумарова, кавова, ферулова, хлорогенова та неохлорогенова кислоти (див. табл. 3).

Флавоноїди. З флавоноїдних речовин нами було виділено 8 сполук, які представлені агліконами та монозидами. Положення гідроксильних груп в речовині 2.11 доводили за допомогою прямої і диференціальної УФ-спектроскопії з використанням іонізуючих і комплексоутворюючих реагентів. Батохромний зсув максимуму довгохвильової смуги на 22 нм в присутності натрію ацетату свідчив про наявність ОН-групи при С-7. При додаванні цирконілу хлориду спостерігався батохромний зсув І смуги на 42 нм, що свідчило про вільну гідроксигрупу при С-5. Калію гідроксид викликав батохромний зсув на 65 нм, що характерно для гідроксигрупи у С-41. З кислотою борною і натрію ацетатом батохромний зсув був відсутній, що свідчило про відсутність або заміщення гідроксильної групи у С-31.

Змішана проба сполуки 2.11 з вірогідним зразком апігеніну не давала депресії температури плавлення. На підставі проведених досліджень речовину 2.11 було ідентифіковано як 5,7,41 – тригідроксифлавон (апігенін).

Речовина 2.12 – жовті голчасті кристали, добре розчинні в ацетоні, спирті; нерозчинні в хлороформі, бензолі. В УФ-спектрі речовини 2.12 було два характерних максимуми поглинання при 353 нм (І) та 255 нм (ІІ), а також «плече» при 265 нм, що характерно для флавонів з вільним ортодигідроксиугрупуванням у бічному фенільному радикалі. Будову речовини 2.12 підтверджували константами ацетильних та метоксильних похідних. При ацетилюванні було отримано ацетильне похідне з температурою плавлення 226-228 єС. Змішана проба речовини 2.12 з достовірним зразком лютеоліну не давала депресіїї температури плавлення (330 єС). Результати проведених досліджень дозволили охарактеризувати речовину 2.12 як 5,7,31,41 – тетрагідроксифлавон (лютеолін).

Для підтвердження глікозидної природи речовини 2.13 було проведено кількісний кислотний і ферментативний гідроліз. Методом ПХ у системі розчинників ацетон-бутанол-вода (7:2:1) в продуктах кислотного гідролізу речовини 2.13 було виявлено D-глюкозу. Аглікон на підставі фізико-хімічних властивостей ідентифіковано з речовиною 2.12. Фізико-хімічні властивості речовини 2.13 наведені в табл. 3. Величину окисного циклу вуглеводного залишку та конфігурацію глікозидного зв`язку визначали порівнянням молекулярних обертань речовини 2.13 і фенілглікозидів. В результаті було встановлено, що аглікон зв`язаний в-зв`язком з вуглеводним залишком піранозної форми, що також підтверджувалося даними ІЧ-спектрів, в яких виявлялися три максимуми в області 1100-1010 см-1 (піранозна форма) і при 890 см-1 (в-конфігурація глікозидного зв`язку). Таким чином, за результатами проведених досліджень речовину 2.13 було охарактеризовано як лютеолін-7-О-в-D-глюкопіранозид (цинарозид).

Речовина 2.14 – яскраво-жовті голчасті кристали. Позитивна ціанідинова проба за Бріантом, жовте забарвлення в УФ-світлі дозволило віднести речовину 2.14 до похідних флавонолів. Фізико-хімічні властивості речовини 2.14 наведені в табл. 3.

В УФ-спектрі сполука 2.14 мала два максимуми поглинання при 375 нм та 256 нм, що характерно для флавонолів з вільними гідроксильними групами (в орто-положенні) у бічному фенільному радикалі. Це підтверджувалося утворенням комплексу з борною кислотою при іонізації ацетатом натрію, в результаті чого спостерігався батохромний зсув першого максимуму поглинання на 18 нм, що пов`язано з утворенням стійкого комплексу по С-31 і С-41 гідроксигрупам.

Положення гідроксильних груп встановлювали за даними прямої та диференційної УФ-спектроскопії. При лужній деструкції речовини 2.14 в продуктах розпаду методом ПХ з достовірними зразками в системі розчинників БОВ (4:1:2) були ідентифіковані флороглюцин і 3,4-дигідроксибензойна кислота. Змішана проба речовини 2.14 з вірогідним зразком кверцетину не давала депресії температури плавлення. Таким чином, на підставі проведених досліджень речовину 2.14 було охарактеризовано як 3,5,7,31,41 – пентагідроксифлавон (кверцетин).

Сполуки 2.15-2.18 відносяться до С-глікозидів. Вільні гідроксильні групи та положення вуглеводних замісників в глікозидах встановлювали спектральними методами. В УФ-спектрах досліджуваних речовин в присутності ацетату натрію спостерігались батохромні зсуви максимумів у довгохвильовій та короткохвильовій областях, що свідчило про присутність вільної гідроксильної групи в С-7 положенні. В УФ-спектрах речовин 2.16, 2.17 при додаванні натрію ацетату та борної кислоти спостерігався зсув довгохвильових максумумів на 24 та 22 нм відповідно, а в спектрах речовин 2.15 і 2.18 зсуву не спостерігалося, що дозволило припустити наявність ортодигідроксиугрупування в С-31 та С-41 положеннях у речовин 2.16 і 2.17 та відсутність його у речовин 2.15 та 2.18. З калію гідроксидом в спектрах досліджуваних сполук спостерігались значні батохромні зсуви максимумів І смуги на 52-65 нм та ІІ смуги на 8-10 нм, що свідчило про наявність гідроксильної групи в С-41 положенні глікозидів. Цирконілу хлорид викликав в спектрах сполук батохромний зсув довгохвильової смуги на 45-77 нм, який зникав при додаванні лимонної кислоти, що характерно для вільної гідроксильної групи в С-5 положенні. В продуктах кислотного гідролізу С-глікозидів по Кіліані були отримані аглікони та ідентифіковані як лютеолін (для сполук 2.16 і 2.17) та апігенін (для сполук 2.15 і 2.18). В гідролізаті речовин 2.15-2.18 ПХ з вірогідними зразками моноцукрів було ідентифіковано D-глюкозу. Проби змішування досліджуваних С-глікозидів з вірогідними зразками не давали депресії температури плавлення. Таким чином, проведені дослідження дали змогу охарактеризувати виділені С-глікозиди: речовину 2.15 – як апігенін-8-С-в-D-глюкопіранозид (вітексин); 2.16 – як лютеолін-8-С-в-D-глюкопіранозид (орієнтин); 2.17 – як лютеолін-6-С-в-D-глюкопіранозид (гомоорієнтин); 2.18 – як апігенін-6-С-в-D-глюкопіранозид (сапонаретин) (див. табл. 3).

Речовини ліпофільної фракції. На підставі даних ГХ/МС ідентифіковано 24 жирні кислоти (див. табл. 1) та 12 стеринів (див. табл. 2).

Ангідроцукри. На підставі даних ГХ/МС були виявлені 1,6-ангідро-в-D-глюкопіраноза (С6Н10О5; Mм=162) і 1,6-ангідро-б-D-галактофураноза (С6Н10О5; Mм=162).

Визначення кількісного вмісту різних груп біологічно активних речовин в траві та плодах чумизи

З метою стандартизації сировини та визначення можливості її комплексної переробки проведено визначення кількісного вмісту основних груп БАР. Гравіметричним методом встановлено кількісний вміст полісахаридів, який становить в траві чумизи 9,19 %, в плодах – 20,18 %. Із шроту, який залишився після отримання ліпофільних фракцій, послідовно виділяли фракції полісахаридів: водорозчинних полісахаридів, пектинових речовин, геміцелюлоз. Результати визначення вмісту полісахаридів за фракціями наведені в табл. 4.

Таблиця 4

Кількісний вміст полісахаридів за фракціями в траві та плодах чумизи

Об`єкт дослідження | Кількісний вміст, %

ВРПС | ПР | ГЦ

Трава чумизи | 7,18 | 1,8 | 17,9

Плоди чумизи | 24,6 | 4,94 | 2,35

Чумиза широко використовується як харчова та кормова культура, тому важливо було визначити вміст амінокислот та білка. Використовуючи амінокислотний аналізатор, в траві та плодах чумизи було визначено кількісний вміст 16 амінокислот. В рослинній сировині чумизи домінує глутамінова кислота. Вміст білка встановлювали за методом Лоурі.

Зі сполук фенольного комплексу було визначено кількісний вміст флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, кумаринів (спектрофотометричним методом у перерахунку на лютеолін, хлорогенову кислоту та умбеліферон відповідно), суми поліфенолів, що окиснюються (за методом Левенталя). Титриметричними методами було встановлено кількісний вміст органічних кислот та кислоти аскорбінової.

Методом атомно-емісійної спектроскопії визначено вміст у траві чумизи 16, у плодах – 27 мікро- та макроелементів. Ряд залежності такий: калій, силіцій, кальцій, магній, натрій, фосфор, ферум, алюміній, цинк, манган.

В ліпофільних фракціях трави та плодів чумизи методом ГРХ було визначено кількісний вміст жирних кислот і стеринів. Кількісний вміст жирних кислот та стеринів було визначено в ліпофільній фракції плодів чумизи методом ГХ/МС.

З метою стандартизації ліпофільних фракцій трави та плодів чумизи були визначені основні числові показники: кислотне число, число омилення, ефірне число, йодне число та вміст хлорофілів і каротиноїдів.

Одержання рідкого екстракту з трави чумизи, стандартизація сировини : трави, плодів та екстракту чумизи і вивчення його фармакологічної активності

З метою створення нових лікарських субстанцій з достатньою сировинною базою нами було розроблено спосіб одержання рідкого екстракту з трави чумизи (новизна розробленого оригінального фітозасобу підтверджена поданою заявкою до Укрпатенту на корисну модель № u 2007 13310 від 29.11.2007).

Оптимальними умовами виділення БАР з трави чумизи є екстракція сировини, подрібненої до розміру часток 3-5 мм, 10 % етанолом при кімнатній температурі протягом 8-10 годин. Оптимальне співвідношення між сировиною та екстрагентом становило 1:6-1:7. Рідкий екстракт – це рідина темно-коричневого кольору, слабо-гіркуватого смаку, з приємним специфічним запахом чумизи.

Вивчення гострої токсичності, протизапальної та діуретичної активності рідкого екстракту з трави чумизи проводили на базі Центральної науково-дослідної лабораторії НФаУ при консультативній допомозі професора Деримедвідь Л.В.

Результати вивчення гострої токсичності рідкого екстракту з трави чумизи дозволило віднести його до практично нешкідливих речовин.

Діуретичну дію екстракту з трави чумизи вивчали за його впливом на спонтанний діурез у дослідних тварин. Результати показали, що екстракт з трави чумизи у дозах 0,05 та 0,1 мл/100 г маси збільшував сечовиділення за 2 години на 26,1 – 77,6 %, а за 4 години – на 52,4 – 107,6 %. Препарат порівняння – нефрофiт в експерименті збільшував діурез на 70,1 % за 2 години і на 83,7 % за 4 години відповідно.

Дослідження впливу рідкого екстракту з трави чумизи на спонтанний діурез показало, що він при однократному введенні підвищував кількість добового споживання води на 15,3 %, підсилював клубочкову фільтрацію на 17,2 %, збільшував екскрецію натрію – на 43,8 %, екскрецію калію – на 5,2 %. Нефрофiт при однократному введенні підвищував кількість добового споживання води на 8,9 %, збільшував клубочкову фільтрацію на 5,9 %. Під дією нефрофiту збільшувалася екскреція іонів натрію на 25,9 %, калію на 18,2 %.

Протизапальні властивості рідкого екстракту вивчали на моделі ексудативного набряку, який викликали введенням 1 % розчину карагеніну щурам субплантарно. Як препарат порівняння використовували нефрофіт. У результаті проведеного досліду встановлено, що обидва досліджувані фітопрепарати виявляли протизапальну активність. При цьому в реалізації їх антифлогістичного ефекту брали участь різні фактори. Так, при застосуванні ектракту з трави чумизи, максимум активності припадав на 2 та 3 годину досліду, що свідчило про вплив на систему гістаміну та серотоніну. Впливаючи на дані медіатори, екстракт з трави чумизи зменшував їх лабілізуючий вплив на мембрани та, як наслідок, зменшував утворення протизапальних простагландинів. Нефрофiт, хоч і виявляв схожу з рідким екстрактом трави чумизи сечогiнну та протизапальну активнiсть, поступався за антифлогістичним ефектом в середньому у 1,4-1,5 рази.

Для розробки АНД на сировину нами були визначені основні анатомічні діагностичні ознаки трави та плодів чумизи. Дослідження проводили на кафедрі ботаніки НфаУ при консультативній допомозі професора Сербіна А.Г. та доцента Гонтової Т.М. Встановлено анатомічні діагностичні ознаки трави чумизи: для листка і стебла – прозенхімна форма клітин епідерми, тетрацитний тип продихового апарату; лист має ізолатеральний тип анатомічної будови, епідерма опушена з обох боків простими короткими волосками, яких більше над жилками з верхньої сторони листка; край листкової пластинки і місце переходу до піхви густо опушене довгими гострокінцевими 1-клітинними волосками; стебло – соломина. Плід вкритий пупирчастою насінневою шкіркою; зовнішня епідерма утворена кількома шарами тонкостінних клітин, що зумовлюють зморшкуватість; внутрішня епідерма представлена сильно звивистостінними тонкостінними прозенхімними клітинами. Ендосперм складається з тонкостінних клітин, які наповнені краплинами масла та простими концентричними крохмальними зернами в вигляді шестикутника, з центром утворення у вигляді крапки. Отримані результати використані при розробці відповідних розділів АНД на лікарську рослинну сировину «Трава чумизи», «Плоди чумизи».

Розроблено також проект АНД на «Рідкий екстракт з трави чумизи» та встановлено параметри його стандартизації.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено фітохімічне вивчення чумизи сорту Дніпровська, що культивується в Україні, досліджено якісний склад та кількісний вміст біологічно активних речовин у траві та плодах рослини, основні з яких виділені в індивідуальному стані та ідентифіковані. Отримано рідкий екстракт з трави чумизи, стандартизований за вмістом біологічно активних сполук, що виявляє діуретичну та протизапальну активність і кваліфікується як потенційний лікарський засіб.

2. За допомогою якісних реакцій, хроматографічних, спектральних методів аналізу, тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в траві та плодах чумизи виявлено полісахариди, вільні та зв`язані цукри, амінокислоти, органічні кислоти, прості феноли, дубильні речовини, гідроксикоричні кислоти, кумарини, флавоноїди, сапоніни, хлорофіли, каротиноїди, жирні кислоти та стерини.

3. Отримано ліпофільні фракції з трави та плодів чумизи, вихід з трави чумизи складає 2,97 %, з плодів – 9,6 %.

4. Методом ТШХ визначено наявність хлорофілів та каротиноїдів в ліпофільних фракціях трави та плодів чумизи.

5. За допомогою фізико-хімічних властивостей вихідних речовин і продуктів їх перетворень, даних ГРХ, ГХ/МС, УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії в траві та плодах чумизи ідентифіковано 56 речовин, з них виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 18 фенольних сполук: 5 гідроксикоричних кислот (кавової, ферулової, хлорогенової, неохлорогенової, п-кумарової), 5 похідних кумарину (умбеліферону, скополетину, ізоскополетину, дафніну, 4-пропеноксикумарину), 8 флавоноїдів (апігеніну, лютеоліну, цинарозиду, кверцетину, вітексину, орієнтину, гомоорієнтину, сапонаретину); 2 ангідроцукрів (1,6-ангідро-б-D-галактофуранози, 1,6-ангідро-в-D-глюкопіранози); 24 жирних кислот; 12 стеринів. Встановлено наявність та кількісний вміст 16 амінокислот, 27 мікро- та макроелементів в сировині, що досліджувалась.

6. За допомогою спектрометричних, спектроскопічних, титриметричних та гравіметричного методів аналізу визначено кількісний вміст основних груп БАР в траві та плодах чумизи. Кількісний вміст полісахаридів у траві чумизи становить 9,19 %, в плодах – 20,18 %; кількісний вміст полісахаридів за фракціями у траві чумизи становить: ВРПС – 7,18 %, ПР – 1,8 %, ГЦ – 17,9 %; в плодах чумизи – ВРПС – 24,6 %, ПР – 4,94 %, ГЦ – 2,35 %; кількісний вміст в плодах чумизи 1,6-ангідро-в-D-глюкопіранози складає 1,242 мг/кг, 1,6-ангідро-б-D-галактофуранози – 3,740 мг/кг; визначено кількісний вміст 16 амінокислот в траві та плодах чумизи; кількісний вміст флавоноїдів у траві чумизи становить 1,19 %, в плодах – 0,21 %; кількісний вміст поліфенолів, що окиснюються у траві чумизи становить 6,11 %, в плодах – 2,26 %; кількісний вміст гідроксикоричних кислот у траві чумизи складає 1,65 %, в плодах – 0,65 %; визначено кількісний вміст 16 мінеральних елементів у траві та коренях чумизи та 27 – в плодах; визначено кількісний вміст 9 жирних кислот в ліпофільній фракції плодів чумизи та 4 – в ліпофільній фракції трави методом газорідинної хроматографії; визначено кількісний вміст 24 жирних кислот в ліпофільній фракції плодів чумизи методом газової хроматографії/мас-спектрометрії; визначено основні хімічні числові показники ліпофільних фракцій трави та плодів чумизи: кислотне число, число омилення, ефірне число, йодне число; кількісний вміст каротиноїдів у ліпофільних фракціях трави чумизи складає 3,95 мг/%, плодів – 69,25 мг/%; кількісний вміст хлорофілів у ліпофільних фракціях трави чумизи складає 5,39 %, плодів – 0,01 %; масова доля вітаміну Е складає 4,7 мг/%, вітаміну А – 7,9 МО в 1 г ліпофільної фракції плодів чумизи; визначено кількісний вміст 12 стеринів в ліпофільній фракції плодів чумизи методом газової хроматографії/мас-спектрометрії; кількісний вміст органічних