ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ПЕТРУХ ІРИНА МИХАЙЛІВНА

УДК 636.5:578.262.7:577.1

ФІЗІОЛОГІЧНИЙ ПРІОН І БІЛКИ ПРІОН-РЕПЛІКУЮЧИХ ОРГАНІВ ТВАРИН ЗАЛЕЖНО ВІД ВІКУ ТА ФАКТОРІВ ГОДІВЛІ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Львів – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник – доктор ветеринарних наук, професор, академік

УААН Влізло Василь Васильович, Інститут

біології тварин УААН, директор.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук Куртяк Богдан Михайлович, управління ветеринарної медицини в Львівській області, начальник;

кандидат ветеринарних наук Голубець Руслан Анатолійович, Державне підприємство Всеукраїнський державний науково-виробничий центр стандартизації, метрології, сертифікації та захисту прав споживачів (Укрметртестстандарт), начальник лабораторії молекулярно-генетичних досліджень

Захист дисертації відбудеться ”_19 ” червня__2008 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 Інституту біології тварин УААН, за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий ”__17 ” _ травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Трансмісивні спонгіоформні енцефалопатії (ТСЕ) або пріонні інфекції – це група нейродегенеративних захворювань тварин і людини, які характеризуються ураженням центральної нервової системи та 100 % летальністю. Збудником ТСЕ є конформаційно змінений білок, який S.В. Prusiner (1982) назвав пріоном. Пріони існують у здоровому організмі у вигляді клітинних (фізіологічних) білків (PrPc). ТСЕ виникають у наслідок інфікування патологічним (інфекційним) пріоном (PrPsc).

Проблема пріонних інфекцій набула актуальності у зв’язку з значним поширенням у кінці 80-х і на початку 90-х років ХХ століття губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби (ГЕ ВРХ) у Великій Британії (Wells G.A. et al., 1987). Сьогодні ГЕ ВРХ виявлена у більшості країн Європи. Існує загроза поширення захворювання серед людей, оскільки відомо (Will R. G. et al., 1996; 2001; Шлопов В.Г., 2000; Влізло В.В., Вербицький П.І., 2007), що збудник ГЕ ВРХ може інфікувати людей, викликаючи новий варіант Крейтцфельдта-Якоба хвороби (нвКЯХ).

Поширення інфекції залежить від шляху інфікування та рівня продукції фізіологічної форми пріон-протеїну в тканинах організму, оскільки саме PrPc трансформується у PrPsc (Biacabe A. et al., 1997; Gliese A. et al., 1998; Richt J. et al., 2007). Відомо (Prusiner S. В. et al., 1993), що найбільший рівень експресії PrPc спостерігається в нервовій та лімфоретикулярній системах.

Сьогоднішні найбільш інформативні методи лабораторної діагностики (ІФА, вестерн-блот аналіз, імуногістохімія) дають змогу виявити PrPsc за 6 місяців до появи клінічного прояву хвороби (Hoеrnlimann B. et al., 2001). Ці тести грунтуються на селективній деградації PrPс протеїназою К та ідентифікації PrPsс за допомогою специфічних моноклональних антитіл. В останні роки вдосконалено методи визначення патологічної форми пріон-протеїну, в бік зменшення кількості досліджуваного матеріалу, підвищення специфічності та чутливості реакцій імунодетекції. Проте відсутні прижиттєві методи діагностики пріонних інфекцій, не з’ясовано багато важливих питань патогенезу ТСЕ. Маловідомими є кількісний і якісний склад білків зони пріон-протеїну та співвідношення окремих ізоформ фізіологічного пріона у різних органах і тканинах тварин. Не з’ясовано роль фізіологічних пріонів і вплив ендогенних та екзогенних чинників на регуляцію синтезу. Водночас визначення PrPc у різних тканинах може бути основою для пошуку ранніх методів діагностики, зокрема прижиттєвих.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Науково-дослідна робота виконана відповідно до тематичного плану Науково-виробничого центру з вивчення пріонних інфекцій Інституту біології тварин і є частиною науково-технічних програм УААН: “Фізіолого-біохімічні основи збереження здоров’я та високої продуктивності тварин” за темою “Вивчення біологічних механізмів розвитку пріонних хвороб” (02.08 ДР 0103U000672); “Ветеринарне благополуччя” за темою “Моніторинг епізоотичної ситуації, дослідження етіологічних і патогенетичних механізмів розвитку пріонних інфекцій” (37.02/046 ДР 0106U003072); тем МАП України “Відпрацювання методів діагностики та заходів боротьби з губчастоподібною енцефалопатією великої рогатої худоби з метою недопущення хвороби на територію України” (81/1 ДР 0101U003439) і “Розробити та впровадити в Україні методи нагляду та діагностики, заходи профілактики та боротьби з пріонними інфекціями тварин” (ДР 0105U006969). Автор провела дослідження фізіологічного пріона в пріон-реплікуючих органах та лейкоконцентраті великої рогатої худоби, удосконалила метод імуноелектрофорезу для детекції пріон-протеїну та діагностики ТСЕ.

Мета і завдання досліджень. Мета дисертаційної роботи – виявити фізіологічний пріон та встановити особливості білків у пріон-реплікуючих органах тварин залежно від віку, породи та годівлі.

Для досягнення поставленої мети потрібно було розв’язати такі завдання:–

вивчити вікову динаміку розчинних білків мозку, селезінки, підщелепових лімфатичних вузлів та крові великої рогатої худоби; –

дослідити породні відмінності у вмісті білків зони пріон-протеїну в довгастому мозку великої рогатої худоби; –

вивчити вплив згодовування продуктів тваринного походження на вміст білків у мозку та пріон-реплікуючих органах дослідних мишей; –

виявити фізіологічний пріон та його ізоформи у довгастому мозку, пріон-реплікуючих органах та лейкоцитах крові великої рогатої худоби; –

удосконалити методи виявлення пріон-протеїну в тканинах тварин.

Об’єкт дослідження – співвідношення ізоформ фізіологічного пріона, динаміка білків мозку і пріон-реплікуючих органів великої рогатої худоби та мишей, особливості білків зони пріон-протеїну в довгастому мозку великої рогатої худоби різних порід.

Предмет дослідження – фізіологічний пріон-протеїн, кров, мозок, селезінка, підщелепові лімфатичні вузли, слизова оболонка тонкого відділу кишечнику великої рогатої худоби та мишей.

Методи дослідження – спектрофотометричні (загальний білок), електрофоретичні (білкові фракції), імуноелектрофоретичні, вестерн-блот (виявлення пріона), зоотехнічні (порода, вік, стать), статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі вперше досліджено вміст та співвідношення окремих ізоформ фізіологічного пріона у пріон-реплікуючих органах (довгастому мозку, селезінці, підщелепових лімфатичних вузлах, слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику) та лейкоконцентраті великої рогатої худоби. Найвищий рівень фізіологічного пріона виявлено в довгастому мозку, менший – у селезінці та підщелепових лімфатичних вузлах, найменший – у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику. Отримано нові дані щодо ізоформ PrPс у пріон-реплікуючих органах корів української чорно-рябої молочної породи. Встановлено три ізоформи пріон-протеїну: ди-, моно- та деглікозильовану. У довгастому мозку, селезінці, підщелепових лімфатичних вузлах та лейкоконцентраті переважає диглікозильована ізоформа, а деглікозильована – в кишечнику. Удосконалено метод імуноелектрофорезу для детекції пріон-протеїну та діагностики ТСЕ. У тварин вміст білків зони пріона (27–35 кДа) та білковий склад пріон-реплікуючих органів змінюється залежно від віку, годівлі та породи. Кількість білків з молекулярною масою 27–35 кДа у корів німецької чорно-рябої породи вдвічі більша, ніж у корів української чорно-рябої молочної породи.

Практичне значення одержаних результатів. Для експрес-діагностики ТСЕ та детекції фізіологічного пріона слід застосовувати метод горизонтального імуноелектрофорезу в 5% ДСН-ПААГ з наступним виявленням пріона шляхом зафарбування білків. Як арбітражний метод діагностики ТСЕ, зокрема губчастоподібної енцефалопатій великої рогатої худоби, запропоновано при проведені імуноелектрофорезу вносити моноклональні антитіла у лунки 5 % ДСН-ПААГ і одержаний результат фіксувати на рентгенівській плівці.

Дисертантом у співавторстві видано методичні рекомендації „Діагностика губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”, які затверджені НМК Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України. Розроблено ДСТУ Велика рогата худоба „Методи діагностики губчастоподібної енцефалопатії”, ДСТУ Інфекції пріонні „Методи відбору та підготовки проб мозку для лабораторної діагностики”, СОУ 85.20-37-569:2007 „Експрес-метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”, СОУ 85.20-37-568:2007 „Гістологічний метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”, СОУ 85.20-37-570:2007 „Імуногістохімічний метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”, СОУ 85.20-37-669:2007 „Пріонні інфекції. Метод визначення патологічного пріона – вестерн-блот”, СОУ 85.20-37-670:2007 „Пріонні інфекції. Імуноферментний метод визначення патологічного пріона”.

Особистий внесок здобувача. Здобувач підібрала та опрацювала першоджерела літератури за темою дисертаційної роботи, виконала експерементальні й аналітичні дослідження, розробила методику виявлення пріона проведенням горизонтального імуноелектрофорезу та адаптувала цей метод для діагностики ТСЕ. Здійснила статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опублікувала результати досліджень. Планування наукової програми, аналіз та обговорення результатів досліджень проведено за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідалися на міжнародних науково-практичних конференціях: “Актуальні проблеми розвитку тваринництва, ветеринарної медицини, харчових технологій, економіки та освіти”, присвяченій 120-річчю Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького (м. Львів, 2004), “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (м. Львів, 2004), “Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин” (м. Львів, 2006), науково-практичних конференціях молодих науковців і спеціалістів Інституту біології тварин УААН “Актуальні проблеми тваринництва та ветеринарної медицини” (м. Львів, 2005) і “Сучасний стан тваринництва та перспективи його розвитку” (м. Львів, 2006).

Публікації результатів досліджень. За результатами досліджень опубліковано 12 наукових праць, із них 10 статей у фахових наукових виданнях, які рекомендовані ВАК України, а також у співавторстві видано методичні рекомендації та довідник.

Структура та об’єм дисертації. Дисертація викладена на 122 сторінках комп’ютерного тексту, містить 10 таблиць (6 сторінок) і 21 рисунок (8 сторінок), складається зі вступу, чотирьох розділів (огляд літератури; вибір напрямів досліджень, матеріал і методи виконання роботи; результати власних досліджень; обговорення результатів досліджень), висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури, який містить 194 джерела, у тому числі 119 латиною.

Вибір напрямів досліджень, матеріал і методи виконання роботи. Роботу виконували упродовж 2003–2007 рр. у Інституті біології тварин УААН. Матеріалом для досліджень була велика рогата худоба різного віку, а також лабораторні тварини (білі миші), у яких для досліджень відбирали кров, а після забою – довгастий мозок, селезінку, нижньощелепові лімфатичні вузли і тонкий відділ кишечнику. Зразки тканин великої рогатої худоби одержували на Львівському м’ясопереробному підприємстві, приватних підприємствах „Галевресурс” та „Інтеркомерс” Львівської області, у підсобному господарстві АП „Шахта ім. Засядька” Донецької області та СТоВ „Зоря” Волинської області.

Під час виконання дисертаційної роботи було проведено три досліди. У першому досліді вивчали вікову динаміку і породні особливості білків пріон-реплікуючих органів та крові великої рогатої худоби. Для цього відбирали зразки органів плодів, молодняку (10-місячного віку) та корів (5-, 6- і 7-річних). Крім цього, було досліджено особливості вмісту білків зони пріон-протеїну довгастого мозку у двох порід великої рогатої худоби – німецької чорно-рябої та української чорно-рябої молочної.

У другому досліді вивчали вплив згодовування продуктів тваринного походження на кількісний і якісний склад білків пріон-реплікуючих органів у лабораторних тварин. Для досліду були відібрані білі миші, аналоги за походженням та віком, з яких формували одну контрольну і три дослідні групи. Мишам усіх груп згодовували гранульвану кормосуміш, збалансовану за всіма елементами поживності. Водночас мишам першої дослідної групи додатково згодовували мозок великої рогатої худоби (50 мг гол./добу), другій – м’ясо-кісткове борошно (50 мг гол./добу), третій – мозок великої рогатої худоби (25 мг гол./добу) та м’ясо-кісткове борошно (25 мг гол./добу).

У третьому досліді за допомогою тесту „Prionics-Check Western” виявляли пріон-протеїн та визначали співвідношення окремих його ізоформ у мозку, слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику, селезінці, підщелепових лімфатичних вузлах та лейкоцитах крові великої рогатої худоби.

Концентрацію загального білка у тканинах і органах визначали за методом Лоурі (1951). Розчинні білки тканин і сироватки крові досліджували шляхом електрофорезу в 7,5% поліакриламідному гелі (ПААГ; Холод В.М., 1983), склад білків за молекулярними масами – в 12,5% поліакриламідному гелі у присутності додецил сульфату натрію та 2-меркаптоетанолу (ДСН-ПААГ) (Laemmli U.K., 1970) приладом для вертикального гель-електрофорезу (Bio-Rad). Ідентифікацію білків проводили за допомогою стандартного набору маркерів з молекулярними масами (кДа): 94,6 (Cellulase), 66,2 (BSA), 45,0 (Ovalbumin), 31,0 (Carbonic anhydrase), 21,5 (Trypsin inhibitor), 14,4 (Lysozime). Після завершення електрофорезу зони білків фарбували Кумасі R-250 (Гааль Е., 1982). Відсотковий вміст білкових фракцій визначали аналізатором фореграм АФ–1.

Під час апробації методів діагностики ГЕ ВРХ адаптовано горизонтальний імуноелектрофорез для виявлення пріон-протеїну та діагностики ТСЕ.

Отримані цифрові дані опрацьовували статистично на комп’ютері за допомогою програми Microsoft Office Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Білки сироватки крові та пріон-реплікуючих органів великої рогатої худоби залежно від віку і породи. При дослідженні спектра розчинних білків довгастого мозку великої рогатої худоби виявлено максимальний вміст постальбумінових фракцій у плодів (27,4±1,24 %), нижчий – у молодняку 10-місячного віку (21,7±0,53 %, р<0,05), ще нижчий – у 5- та 6-річних корів (20,0±1,77 %, р<0,01 та 18,9±0,25 %, р<0,01 відповідно), мінімальний – у 7-річних корів (15,4±1,56 %, р<0,001). Кількість альбумінів у довгастому мозку з віком тварин майже не змінювалася і знаходилася в межах 49,0 – 51,3 %. Рівень - і -глобулінів зростав. Так, у плодів кількість - і -глобулінів була найнижчою (10,8±0,55 % і 3,6±0,46 % відповідно), зростала у молодняку 10-місячного віку (15,9±1,10 %, р<0,01 і 4,2±0,42 %) і досягала максимуму в 6-, 7-річному віці (22,7±1,54 %, р<0,001, 4,9±0,24 %, р<0,01). Кількість г-глобулінів у плодів становила 6,3±0,89 %, у 10-місячного молодняку – 6,7±1,67 % і була найвищою у 7-річних корів (9,3±0,31 %, р<0,01). Отже, зміни білкового спектра у довгастому мозку великої рогатої худоби залежать від віку тварин. В онтогенезі знижується здатність білків тканин до адсорбції, зменшується їх перетравлювання пепсином і трипсином, підвищується енергія активації протеолізу, що призводить до вікових змін вмісту деяких білків (Никитин В.Н. и др., 1980). Це виявляється у зменшенні з віком тварин постальбумінових фракцій (низькомолекулярних білків) та підвищенні рівня глобулінів (високомолекулярних білків).

При електрофоретичному розділенні білків довгастого мозку у 12,5% ДСН–ПААГ виявлено білки, молекулярна маса яких відповідає пріон-протеїну (27–35 кДа). Їх кількість змінювалася з віком тварин. У плодів число білків із молекулярною масою 27–35 кДа становило 14,1±1,82 %, з віком пропорційно зменшувалося і досягало мінімальних значень у 7-річних корів (6,9±0,91 %, р<0,05). Білки з молекулярною масою до 27 кДа аналогічно як і білки, що знаходилися у зоні пріон-протеїну, переважали у плодів (50,8±0,81 %) та молодняку 10-місячного віку (50,3±1,13 %), зменшувались у 5-річних корів (37,8±0,88 %, р<0,001) і досягали мінімального рівня у 6-, 7-річних (33,6±1,08 %, р<0,01). Вміст білків з молекулярною масою понад 35 кДа, навпаки, з віком тварин збільшувався. У плодів він становив 35,0±0,08 %, у молодняку 10-місячного віку збільшувався на 2,4 %, а у корів віком 5–7 років був найбільший (53,5±0,37 % – 57,3±1,45 %; р<0,01).

Виявлені онтогенетичні зміни вмісту білків у тканині довгастого мозку великої рогатої худоби характеризують фізіологічний стан, період розвитку тварин та інтенсивність обмінних процесів. У плодів і молодняку відбувається ріст, формування та структурна організація тканин організму, зокрема тканин довгастого мозку, а також інтенсивний синтез білків з молекулярною масою до 35 кДа. У тварин старшого віку ріст і розвиток організму припиняється, стабілізується функціональний стан довгастого мозку і зростає кількість білків із високою молекулярною масою (понад 35 кДа).

Аналогічні онтогенетичні зміни спектра білків виявлені в селезінці, підщелепових лімфатичних вузлах і слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику.

Нашими дослідженнями з’ясовано, що спектр білків довгастого мозку корів, завезених із Німеччини (групи ризику, країна неблагополучна щодо ГЕ ВРХ), інший ніж у великої рогатої худоби, вирощеної в Україні. Порівняння вмісту білків зони 27–35 кДа тканини довгастого мозку корів 5-річного віку української чорно-рябої молочної породи та німецької чорно-рябої породи показало, що вміст цих білків більший у імпортованих тварин (рис. 1). Так, кількість білків у пріонвмісній зоні спектра довгастого мозку німецької чорно-рябої породи становила 15,4±1,02 % і була вищою на 6,8 % (р<0,001), ніж у корів української чорно-рябої молочної породи (8,6±1,33 %). Значна відмінність між вмістом білків зони пріон-протеїну у корів німецької чорно-рябої та української чорно-рябої молочної порід, ймовірно, зумовлена кормовими чинниками, продуктивними та породними відмінностями (німецька чорно-ряба

Рис. 1. Вміст білків у тканині довгастого мозку корів німецької чорно-рябої та української чорно-рябої молочної порід

з продуктивністю понад 6 тис. кг молока за лактацію, українська чорно-ряба молочна – близько 3 тис. кг). Тварин української та німецької порід утримували в типових приміщеннях, проте умови годівлі відрізнялись. Корови німецької чорно-рябої породи споживали більше концентрованих кормів, а корови української чорно-рябої молочної породи – грубих (сіно, силос). Цілком ймовірно, що високий вміст пріонподібних білків (27–35 кДа) у клітинах довгастого мозку корів німецької чорно-рябої породи може сприяти розвитку губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби.

Вміст білків у пріон-реплікуючих органах мишей при згодовуванні їм продуктів тваринного походження. Згодовування мишам мозку великої рогатої худоби упродовж 360 діб спричиняло підвищення вмісту загального білка у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику на 4,6 %, селезінці – на 6,9 % та мозку – на 10,3 % (р<0,001). При додаванні до раціону мишей м’ясо-кісткового борошна загальний білок підвищувався у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику на 2,8 %, селезінці – на 4,1 % і мозку – на 1,9 %, а при поєднанні у раціоні мишей м’ясо-кісткового борошна і мозку корів – на 3,1 (р<0,001), 0,8 і 21,2 % (р<0,001) відповідно. Отже, максимальне збільшення вмісту загального білка встановлено у мозку мишей при додаванні до їх раціону м’ясо-кісткового борошна та мозку великої рогатої худоби.

Разом з цим, при згодовуванні продуктів тваринного походження мишам виявлено зміни у співвідношенні деяких білків досліджуваних тканин. Так, додавання до раціону мишей мозку великої рогатої худоби упродовж 360 діб призводило до зменшення кількості білків з молекулярною масою до 27 кДа (на 5,3 %) та збільшення на 4,3 % (р<0,01) білків у зоні пріон-протеїну (ММ 27–35 кДа) у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику. Подібні зміни реєстрували при визначенні білків у селезінці та мозку мишей. У цих органах вміст білків у зоні пріон-протеїну підвищувався на 3,8 і 3,5 % (р<0,05) відповідно.

При згодовуванні м’ясо-кісткового борошна мишам другої дослідної групи, а також поєднанні мозку корів з м’ясо-кістковим борошном у раціоні мишей третьої групи відзначено збільшення білків у зоні пріон-протеїну (27–35 кДа) і зменшення білків з молекулярною масою до 27 і понад 35 кДа у всіх досліджуваних органах. Отже, надмірний вміст у раціоні мишей продуктів тваринного походження спричинює зростання вмісту білків, які за молекулярною масою відповідають пріон-протеїну.

Дослідження пріон-протеїну. Від шляху інфікування та рівня трансформації фізіологічної форми пріон-протеїну в тканинах і клітинах організму залежить розвиток трансмісивних спонгіоформних енцефалопатій. При виникненні пріонної інфекції фізіологічний пріон-протеїн слугує попередником для утворення патологічного пріона, який накопичується в клітинах у великій кількості, що приводить до їх руйнування. Проведені нами дослідження показали, що PrPc міститься в різних органах і тканинах. Зокрема, за допомогою методу вестерн-блот з’ясовано, що найвищий рівень його синтезу спостерігається в довгастому мозку, менший – у селезінці та підщелепових лімфатичних вузлах, найменший – у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику. У всіх органах виявлено три ізоформи фізіологічного пріона – де-, моно- та диглікозильовану. Проведений аналіз показав, що в довгастому мозку великої рогатої худоби ( рис. 2 ) домінуючою є диглікозильована ( 62,0 % )

Рис. 2. Відносна кількість ізоформ фізіологічного пріона в довгастому мозку великої рогатої худоби

ізоформа, середньою – моноглікозильована (20,0 %) і найменшою – деглікозильована (18,0 %). Таке співвідношення характерне для довгастого мозку і відображає структурно-функціональний стан системи посттрансляційної модифікації фізіологічного пріона. При пріонних інфекціях, зокрема при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби у довгастому мозку зростає вміст моно- та деглікозильваних ізоформ (Aguzzi A., Christian H., 2003; Collinge J., 2005), відповідно зменшується вміст диглікозильованої ізоформи пріона.

При трансмісивних спонгіоформних енцефалопатіях інфікування тварин відбувається переважно оральним шляхом. У слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику лімфоретикулярні клітини служать резервуаром, звідки пріон поширюється в організмі. Далі збудник потрапляє до селезінки та інших органів лімфоретикулярної системи й рухається по периферичній нервовій системі до центральної нервової системи, де активно реплікується, викликаюючи патологічні зміни тканин мозку (Blattber T. et al., 1997; Wells G.A. et al., 1998).

Як показали проведені дослідження, вміст окремих ізоформ у загальній кількості пріона слизової оболонки тонких кишок має певні особливості. Так, у цій тканині переважає деглікозильована (67,0 %), у меншій кількості представлена моноглікозильована (20,0 %) і найменше – диглікозильована ізоформи пріона (13,0 %). Одержані результати дають змогу стверджувати, що лімфоїдні клітини тонких кишок можуть бути залучені до процесів реплікації патологічного пріона.

Проведені дослідження пріон-протеїну в селезінці та підщелепових лімфатичних вузлах великої рогатої худоби показали, що серед трьох його ізоформ у цих органах переважає диглікозильована (66 і 49 % відповідно), менше представлена моноглікозильована (22 і 34 %) і найменше – деглікозильована (11 і 17 %, рис. 3).

Рис. 3. Відносна кількість ізоформ фізіологічного пріону у селезінці та підщелепових лімфатичних вузлах великої рогатої худоби

Як відомо (Dodelet V.C. et al., 1998; Houston D.A. et al., 2000), пріони можуть переноситися лейкоцитами крові. Проведені нами дослідження ізоформ фізіологічного пріона в лейкоконцентраті великої рогатої худоби показали, що 46,6 % загальної кількості становить диглікозильована ізоформа, 32,4 % – деглікозильована і 21,4 % – моноглікозильована (рис.4).

Рис. 4. Денсинтограма фізіологічного пріона лейкоконцентрату крові корів: 1 – ди-,

2 –моно-, 3 – деглікозильована ізоформи PrPс

Отже, виявлення в лейкоконцентраті крові корів PrPc та визначення співвідношень його ізоформ свідчить про можливу участь лімфоцитів крові в процесах реплікації збудника і може бути основою для розробки методів ранньої та прижиттєвої діагностики пріонних інфекцій.

Аналіз відносного вмісту окремих ізоформ пріон-протеїну в його загальній кількості показав, що у клінічно здорових корів української чорно-рябої молочної породи диглікозильована ізоформа переважає в мозку, селезінці та підщелепових лімфатичних вузлах. Менше представлена моноглікозильована ізоформа, кількість якої змінюється залежно від органа. Деглікозильована ізоформа PrPc у цих органах найменша. Водночас у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику відносний вміст деглікозильованої ізоформи найбільший, менший – моноглікозильованої і найменший – диглікозильованої. У лейкоцитах крові співвідношення ізоформ фізіологічного пріона має свої особливості: найвищий відсоток тут займає диглікозильована ізоформа, середнє значення має деглікозильована і найменше – моноглікозильована ізоформа (рис.5).

Рис. 5. Відносна кількість ізоформ фізіологічного пріона в різних тканинах і органах великої рогатої худоби

Співвідношення ізоформ відображає структурно-функціональний стан органів, що зумовлено посттрансляційними модифікаціями фізіологічного пріона. Визначення співвідношення між ізоформами пріона та детекцію його змін у перспективі можна застосовувати як один із показників для визначення штамів пріонних інфекцій і використовувати в діагностиці трансмісивних спонгіоформних енцефалопатій.

Розробка методів виявлення пріон-протеїну. Сьогодні серед методів діагностики ТСЕ основним залишається імуноблот-аналіз, який грунтується на детекції патологічного пріона за допомогою моноклональних антитіл після електрофоретичного розділення та перенесення одержаних фракцій білків з гелю на PVDF мембрану.

Для детекції фізіологічного пріон-протеїну використано метод імуноелектрофорезу в 5% ДСН–ПААГ із застосуванням аплікації моноклональних антитіл і антимишиного імуноглобуліну на поверхню гелю, що дає змогу виявляти пріон-протеїн без проведення блоту. Дія електричного поля забезпечує міграцію антитіл до антигена з утворенням преципітатів. Щоб видалити білки, які не брали участі у преципітації, гель промивали 12,5% розчином NaCI. Утворені конгломерати пріон-протеїну та моноклональних антитіл завдяки великим розмірам з гелю не вимиваються сольовим розчином і виявляються при зафарбовуванні Кумасі R-250. На пластині 5% ДСН–ПААГ після проведення імуноелектрофорезу виявляли білки, які під час приготування зразків не піддавалися дії протеїнази К. Зразки, оброблені протеїназою К, містили лише сліди білків у зоні маркерного барвника. Такий спосіб виявлення пріон-протеїну можна застосовувати для експрес-діагностики пріонних інфекцій (рис. 6).

1 2 3 4 5 6

Рис. 6. Виявлення пріон-протеїну за допомогою імуноелектрофорезу в тканині мозку

великої рогатої худоби: 1, 2, 3 – зразки без дії протеїнази К; 4, 5, 6 – зразки за дії

протеїнази К.

У референс-лабораторіях рекомендується використовувати метод вестерн-блот фірми Prionics-Check Western (Швейцарія), за допомогою якого виявляють інфекційний пріон. Цей метод є високоінформативним, а тому застосовується як арбітражний при діагностиці ТСЕ. Нами апробована методика, за якою приготовлені згідно методу вестерн-блот проби вносяться в лунки 5% ДСН–ПААГ разом з моноклональним антитілом і антимишиним імуноглобуліном. У результаті електрофорезу пріон-протеїн зв’язується з моноклональними антитілами, утворені конгломерати виявляються специфічним фарбуванням та переносяться на рентгенівську плівку (рис. 7). Зафіксований на рентгенівській плівці результат може довго зберігатися. Тривалість досліджень не перевищує 4 год. Метод простий у виконанні, дешевий і менш тривалий за часом проведення (на 2–3 год.), порівняно з Prionics-Check Western.

Рис. 7. Імуноелектрофорез тканини довгастого мозку великої рогатої худоби:

1, 3 – зразки за дії протеїнази К; 2, 4 – зразки без дії протеїнази К

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вперше досліджено фізіологічний пріон у пріон-реплікуючих органах (мозку, селезінці, підщелепових лімфатичних вузлах, слизовій оболонці тонких кишок) і лейкоконцентраті крові корів української чорно-рябої молочної породи, отримано нові дані з ідентифікації ізоформ PrPс, адаптовано метод імуноелектрофозу для детекції пріон-протеїну. Показано, що у тварин вміст білків зони пріона (27–35 кДа) змінюється залежно від віку, породи та кормових чинників.

1. У пріон-реплікуючих органах великої рогатої худоби (мозок, селезінка, нижньощелепові лімфатичні вузли) вміст розчинних білків змінюється з віком тварин, зокрема зменшується рівень постальбумінів (р<0,05–0,001) і зростає – глобулінів (р<0,05–0,001).

2. У білках пріон-реплікуючих органів корів з віком виявлено зниження білків з молекулярною масою до 27 та 27–35 кДа у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику (р<0,05), селезінці (р<0,001), підщелепових лімфатичних вузлах (р<0,01) та мозку (р<0,05) і зростання вмісту білків з молекулярною масою понад 35 кДа (р<0,05–0,001).

3. У довгастому мозку корів німецької чорно-рябої породи кількість білків з молекулярною масою 27–35 кДа (пріонвмісна зона) становила 15,4+1,02 % і була вища на 6,8 % (р<0,001), ніж у корів української чорно-рябої молочної породи (8,6+1,33 %), що зумовлено генетичними відмінностями, особливостями годівлі та рівнем продуктивності і може бути сприятливим чинником у розвитку трансмісивних спонгіоформних енцефалопатій.

4. Надмірне надходження продуктів тваринного походження в організм мишей упродовж 360 днів спричинює нагромадження загального білка в мозку (р<0,01–0,001), а також призводить до збільшення концетрації білків у зоні пріон-протеїну в слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику (р<0,05), селезінці та мозку (р<0,05).

5. Дослідження фізіологічного пріона (PrPc) у великої рогатої худоби методом вестерн-блот показали, що найвищий його рівень спостерігається в довгастому мозку, нижчий – у селезінці та підщелепових лімфатичних вузлах, найнижчий – у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику.

6. У пріон-реплікуючих органах (довгастому мозку, селезінці, підщелепових лімфатичних вузлах, слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику) та лейкоконцентраті крові великої рогатої худоби фізіологічний пріон представлений у трьох ізоформах: ди-, моно- і деглікозильованій.

7. Відносний вміст окремих ізоформ фізіологічного пріона в його загальній кількості у досліджуваних пріон-реплікуючих органах різний: диглікозильована форма PrPc переважає в довгастому мозку (62,0 %) та в селезінці (66,0 %), нижчий її вміст встановлено в підщелепових лімфатичних вузлах (49,0 %) і найнижчий – у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику (14,0 %); моноглікозильована форма PrPс у довгастому мозку становить 20 %, селезінці – 22, підщелепових лімфатичних вузлах – 34, слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику – 20,0 %; деглікозильована форма PrPс переважає у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику (67,0 %), а у довгастому мозку (18 %), селезінці (11 %) та підщелепових лімфатичних вузлах (17 %) її рівень значно нижчий.

8. У лейкоконцентраті крові великої рогатої худоби фізіологічний пріон містить 46,6 % диглікозильованої ізоформи, 32,4 % – деглікозильованої та 21,4 % – моноглікозильованої.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. З метою здешевлення та скорочення часу проведення досліджень для діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби пропонуємо використовувати методику виявлення пріон-протеїну із застосуванням горизонтального імуноелектрофорезу в 5% ДСН–ПААГ. При проведенні імуноелектрофорезу слід вносити моноклональні антитіла в лунки гелю; одержаний результат фіксувати на рентгенівській плівці.

2. З метою запобігання виникнення трансмісивних спонгіоформних енцефалопатій в Україні слід заборонити використовувати жуйним білки тваринного походження.

3. Для діагностики та моніторингу губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби необхідно дотримуватися методичних рекомендацій „Діагностика губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби” (Київ, 2007).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині: Довідник / Л.В. Андреєва, П.І Вербицький, О.І Віщур, ... І.М. Петрух та ін. – Львів, 2004. – 399 с. (Дисертант брала участь у впорядкуванні довідника та підготовці до друку 1 розділу).

2. Білки сироватки крові та довгастого мозку великої рогатої худоби / В.В.Влізло, П.І. Вербицький, І.М. Петрух, Д.Д. Остапів, В.В. Каплінський, Ю.В. Мартин, О.В. Ложкіна // Наук.-техн. бюл. Ін–ту біології тварин УААН. – Львів, 2002. – Вип. 4, №1. – С. 31–36. (Дисертант провела дослідження білкового складу тканини довгастого мозку та сироватки крові корів різного віку, проаналізувала результати та виклала у статті).

3. Петрух І.М., Вербицький П.І. Вікова та породна відмінність пріонвмісних білків у довгастому мозку великої рогатої худоби // ????.-????. ???. ??–?? ???????? ?????? ????. – Львів, 2004. – Вип.5, №1, 2. – С. 129–132. (????????? визначила вміст загального білка і вікову динаміку білків тканини довгастого мозку у корів різних порід, статистично обробила одержані р????????и, написала статтю).

4. Петрух І.М., Остапів Д.Д., Ісламов Р.М. Розчинні білки селезінки і підщелепового лімфатичного вузла великої рогатої худоби в онтогенезі // Наук.-техн. бюл. Ін–ту біології тварин УААН. – Львів, 2004. – Вип.5, №3. – С. 282–285. (Диссертант провела дослідження зміни білкового складу селезінки і підщелепового лімфатичного у корів різного віку, виконала аналіз і узагальнила результати).

5. Виявлення пріонів у мозку / П.І. Вербицький, В.В. Влізло, Д.Д. Остапів, І.М. Петрух // Наук. Вісн. Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. – Львів, 2004. – Т.6 (№3), Ч.1. – С. 26–31. (Дисертант відібрала матеріал, провела імуноблот-аналіз і узагальнила одержані результати, написала статтю).

6. Виявлення пріонів у лейкоцитах крові великої рогатої худоби / П.І. Вербицький, І.М. Петрух, В.В. Влізло, Д.Д. Остапів // Біологія тварин. – 2004. – Т.6, №1, 2. – С. 238–242. (Дисертант провела імуноблот-аналіз, статистичну обробку результатів досліджень і написала статтю).

7. Зміни вмісту низькомолекулярних білків і продуктів перекисного окиснення ліпідів у довгастому мозку великої рогатої худоби протягом онтогенезу / І.М. Петрух, А.З. Пилипець, П.І. Вербицький, В.В. Влізло // Наук.-техн. бюл. Ін–ту біології тварин та ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. – Львів, 2005. – Вип. 6, № 1. – С. 130–133. (Дисертант визначала вміст загального білка, якісний і кількісний склад білкових фракцій, проводила статистичну обробку отриманих результатів та їх аналіз).

8. Можливості ранньої діагностики трансмісивних спонгіформних енцефалопатій / П.І. Вербицький, В.В. Влізло, І.М. Петрух, Д.Д. Остапів // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Харків, 2005. – Т. 85. – С. 217–220. (Дисертант проводила експериментальні дослідження, статистичну обробку отриманих результатів та їх аналіз).

9. Петрух І.М. Склад білків тканин селезінки великої рогатої худоби в онтогенезі // Наук.-техн. бюл. Ін–ту у біології тварин та ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. – Львів, 2005. – Вип. 6, № 2. – С. 179–183.

10. Петрух І.М., Остапів Д.Д. Стан білків тканин окремих органів мишей при згодовуванні їм мозку великої рогатої худоби // Наук.-техн. бюл. Ін–ту біології тварин та ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. – Львів, 2006. – Вип. 7, № 1, 2. – С. 96–100. (Дисертант визначала вміст загального білка, якісний і кількісний склад білкових фракцій, узагальнила отримані результати та написала статтю).

11. Локалізація фізіологічного пріона в мозку великої рогатої худоби / В. Влізло, П. Вербицький, В. Стадник, Х. Майор, І. Петрух // Ветеринарна медицина України. – 2007. – №10. – С. 8–10. (Дисерттант відібала матеріал, провела дослідження та узагальнила отримані результати).

12. ??????????? ???????????????? ????????????? ??????? ??????? ??????: ????????? ???????????? / ?.?. ??????, ?.?. ??????????, ?.?. ???????, ?.?.???????, ?.?. ???????, ?.?. ??????, ?.?. ??????, ?.?. ?????, ?.?. ???????. – ????, 2007. – 61 ?. (????????? ????? ?????? ? ????????????? ???????????? ?? ??????????? ?? ????? 3.4.1, 3.4.1.1 ? 3.4.1.2 ?????????? 3 ???????).

АНОТАЦІЇ

Петрух І.М. Фізіологічний пріон і білки пріон-реплікуючих органів тварин залежно від віку та факторів годівлі. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біології тварин УААН, Львів, 2008.

У дисертаційній роботі вперше досліджено фізіологічний пріон у пріон-реплікуючих органах (довгастому мозку, селезінці, підщелепових лімфатичних вузлах, слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику) та лейкоконцентраті крові великої рогатої худоби, отримано нові дані про ізоформи PrPс у пріон-реплікуючих органах корів української чорно-рябої молочної породи. Найвищий рівень PrPc спостерігається в довгастому мозку, нижчий – у селезінці та підщелепових лімфатичних вузлах, найнижчий – у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику. У пріон-реплікуючих органах відносний вміст окремих ізоформ фізіологічного пріона становить, %: диглікозильована форма PrPc у довгастому мозку – 62, селезінці – 66, підщелепових лімфатичних вузлах – 49, слизовій оболонці тонких кишок – 14, лейкоконцентраті крові – 46,6; моноглікозильована форма PrPC у довгастому мозку – 20, селезінці – 22, підщелепових лімфатичних вузлах – 34, слизовій оболонці тонких кишок – 20, лейкоконцентраті крові– 21,4; деглікозильована ізоформа – у слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику – 67, довгастому мозку – 18, селезінці – 11, підщелепових лімфатичних вузлах – 17, лейкоконцентраті крові – 32,4. Отримано нові дані про зміни білкового складу пріон-реплікуючих органів великої рогатої худоби залежно від віку, породи та умов годівлі. Зокрема, виявлено, що у корів німецької чорно-рябої породи, порівняно з коровами української чорно-рябої молочної породи, кількість пріонвмісних білків з молекулярною масою 27–35 кДа вдвічі більша. Удосконалено метод імуноелектрофорезу для детекції пріон-протеїну та діагностики трансмісивних спонгіоформних енцефалопатій.

Ключові слова: велика рогата худоба, миші, мозок, лімфоретикулярна тканина, лейкоцити, білки, фізіологічний пріон-протеїн, ізоформи пріона.

Петрух И.М. Физиологический прион и белки прион-реплицирующих органов животных в зависимости от возраста и факторов кормления. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биологии животных УААН, Львов, 2008.

В диссертацинной работе приведены данные о возрастных изменениях и породных особенностях белков прион-реплицирующих органов у крупного рогатого скота, а также влияния скармливания мышам кормов животного происхождения на белковый состав прион-реплицирующих органов.

Определено, что в прион-реплицирующих органах крупного рогатого скота с возрастом уменьшается количество постальбуминов в мозге на 15 % (р<0,05), селезенке – на 14,1 % (р<0,001), подчелюстных лимфатических узлах – на 12,4 % (р<0,01) и увеличивается количество гамма-глобулинов – в мозге на 3,0 % (р<0,01), селезенке – на 8,4 % (р<0,001) и лимфатических вузлах – на 5,9 % (р<0,001). В структурных белках прион-реплицирующих органов коров с возрастом уменьшается доля белков с молекулярной массой до 27 и 27–35 кДа в слизистой тонкого кишечника (р<0,05), селезенке (р<0,001), лимфатических узлах (р<0,01) и мозге (р<0,05) и увеличивается количество белков с молекулярной массой больше 35 кДа (р<0,05–0,001). В результате исследований породных особенностей белков зоны прион-протеина в мозге коров установлено, что количество белков с молекулярной массой 27–35 кДа у коров немецкой чорно-пестрой породы в два раза больше, чем у коров украинской чорно-пестрой молочной породы.

Выявлено физиологический прион в прион-реплицирующих органах и определено соотношение его изоформ. Показано, що клеточный прион образуется не только в продолговатом мозге, но и в других тканях и органах. Самый высокий уровень PrPc отмечается в продолговатом мозгу, более низкий – в селезенке и лимфатических узлах, самый низкий – в слизистой оболочке тонкого кишечника. Соотношение отдельных изоформ физиологического приона в его общем количестве в исследуемых прион-реплицирующих органах разное: дигликозелированная форма PrPc переобладает в мозге (62,0 %) и селезенке (66,0%), меньшее количество определено в лимфатических узлах (49,0 %) и самое низкое – в кишечнике (14,0 %); моногликозелированная форма PrPс в мозге составляет 20,0 %, селезенке – 22 %, лимфатических узлах – 34 %, слизистой тонкого кишечника – 20,0 %; дегликозелированная форма