НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ЗУБОВ ПАВЛО МИХАЙЛОВИЧ

УДК: 57.043:577.335:612.111:547.422

МОДИФІКАЦІЯ БІЛКІВ

МЕМБРАНО-ЦИТОСКЕЛЕТНОГО КОМПЛЕКСУ

та ЛІПІДНОЇ АСИМЕТРІЇ В ЕРИТРОЦИТАХ

ПРИ ОХОЛОДЖЕННІ та ЗАМОРОЖУВАННІ у

ПРИСУТНОСТІ КРіОПРОТЕКТОРА ПЕО-1500

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Бабійчук Любов Олександрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, зав. відділу кріоцитології та кількісної морфології, м. Харків

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор

Субота Ніна Павлівна, Харківський національний педагогічний університет імені. Г.С. Сковороди, зав. кафедри валеології, м Харків

Доктор біологічних наук, професор

Каліман Павло Авксентійович, Харківський національний університет

імені. В.Н. Каразіна, професор кафедри біохімії, м. Харків

Захист відбудеться „22” січня 2008 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за адресою: 61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розіслано „19” грудня 2007р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України,

д.м.н., професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розробка методів кріоконсервування еритроцитів донорської крові, а останнім часом і кордової, що дозволяють використовувати клітини відразу після розморожування, є актуальною проблемою в усьому світі. Створення безвідмивних технологій базується на використанні екзоцелюлярних кріопротекторів. Одним з них може виступати поліетиленоксид з молекулярною масою 1500 (ПЕО-1500) [Шраго М.И. и др., 1978]. Однак механізм дії непроникаючих кріопротекторів дотепер багато в чому залишається нез’ясованим. Зараз відомо, що важливу роль у реалізації механізмів кріозахисту клітин за допомогою непроникаючих кріопротекторів відіграє модифікація структурної організації плазматичної мембрани [Babijchuk L.A. et. al., 1997], яка першою реагує на зміну фізико-хімічних параметрів середовища, таких як тонічність, концентрація двовалентних катіонів, присутність кріопротектора. Внаслідок перебудов може бути змінена міцність білок-білкових взаємодій у цитоскелетній сітці, що охоплює як горизонтальні контакти між білками в рамках цитоскелету, так і вертикальні контакти цитоскелета з інтегральними білками мембрани. У свою чергу, білки мембрано-цитоскелетного комплексу (МЦК) впливають на ліпіди, змінюючи молекулярну впорядкованість й обмежуючи рухливість анулярних ліпідів, сприяючи асиметричному розподілу ліпідів у мембрані [Chandra R. et al., 1987, Manno S. et al., 2002, An X. et al., 2004]. Асиметричний розподіл ліпідів у мембрані є основою для нормального функціонування клітини. Перебудови в ліпідній організації мембрани, що відбуваються під впливом ПЕО-1500, а також зміни, опосередковані через модифікації білок-білкових та білок-ліпідних взаємодій у процесі кріоконсервування, можуть призводити до порушення асиметричного розподілу фосфоліпідів у мембрані. У результаті змінюються функціональні властивості цитоскелета, плазматичної мембрани та всієї клітини у цілому, що може призвести до погіршення результатів кріоконсервування [Dumaswala U.J. et al., 1997].

Останнім часом використання фракцій кордової крові (у тому числі й еритроцитів) знаходить широке застосування в клінічній практиці [Ballin A. et al., 1995, Hows J.M., 2001]. Однак еритроцити кордової крові мають ряд структурно-функціональних відмінностей від еритроцитів дорослої людини [Matovcik L.M. et al., 1985, Матвеев А.В. и др., 1997], які необхідно враховувати при розробці методів їх кріоконсервування.

Раніше було встановлено, що ПЕО-1500 проявляє різну ефективність при заморожуванні еритроцитів донорської крові в рідкому азоті залежно від температури й способу його введення в суспензію клітин [Бабийчук Л.А. и др., 1997, 2000]. Метод кріоконсервування еритроцитів донорської крові під захистом ПЕО-1500 був застосований і для кріоконсервування еритроцитів кордової крові. Оскільки раніше було встановлено, що зниження температури інкубації клітин з ПЕО-1500 і дозований спосіб його введення підвищує стійкість еритроцитів до заморожування, можна припустити, що структура МЦК і ліпідна асиметрія еритроцитів донорської й кордової крові в процесі низькотемпературного консервування може бути неоднаково модифікована як на етапі інкубації клітин з ПЕО-1500 при різних температурах, так і після розморожування.

У зв'язку із цим, вивчення впливу ПЕО-1500 та низьких температур на процеси, що відбуваються на рівні білків мембрани та цитоскелету, які в свою чергу впливають на ліпідний бішар, зокрема асиметричний розподіл ліпідів в мембрані, дозволить розширити уявлення як про механізми дії непроникаючих кріопротекторів, так і про механізми кріоушкоджень і кріозахисту біологічних об’єктів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи відділу кріоцитології та кількісної морфології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за темою №2.2.6.14 “Вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і цитоскелета еритроцитів донорської і кордової крові людини під впливом температурно-осмотичних ефектів і кріопротекторів різного механізму дії (№ держ. реєстрації 0104U006436), де автор виконував окремі розділи.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - виявлення модифікацій білок-білкових взаємодій у мембранному цитоскелеті й зв'язків цитоскелет-плазматична мембрана, а також змін ліпідної асиметрії в мембранах еритроцитів донорської та кордової крові під впливом кріопротектора ПЕО-1500 при охолодженні і заморожуванні-відігріванні.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Дослідити стан мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів при дії кріопротектора ПЕО-1500 під впливом неіонного детергенту сапоніну.

2. Визначити модифікації білок-білкових взаємодій у мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів донорської крові до та після кріоконсервування з ПЕО-1500 залежно від температури обробки клітин при інкубації у розчинах з різною іонною силою і варіюючим вмістом двовалентних катіонів.

3. Вивчити характер білок-білкових взаємодій в мембранному цитоскелеті та зміни зв'язків цитоскелет-плазматична мембрана в еритроцитах кордової крові під впливом кріопротектора ПЕО-1500, охолодження й заморожування-відігрівання, а також після перенесення клітин в ізотонічні умови.

4. Оцінити вклад гідрофобних взаємодій між білками цитоскелета, а також міцність взаємодії спектрин-актинової сітки з плазматичною мембраною еритроцитів донорської та кордової крові під впливом кріопротектора ПЕО-1500 і кріоконсервування при екстракції цитоскелетів у неіонному детергенті Тритон Х-100.

5. Провести порівняльне вивчення експресії глікофорину А, а також ліпідної асиметрії мембран еритроцитів донорської і кордової крові згідно розподілу фосфатидилсерина в мембрані під впливом кріопротектора ПЕО-1500 залежно від температури інкубації.

Об'єкт дослідження. Процеси модифікації білок-білкових взаємодій у мембрано-цитоскелетному комплексі та порушення ліпідної асиметрії в еритроцитах кордової і донорської крові під впливом факторів кріоконсервування.

Предмет дослідження. Білок-білкові взаємодії та ліпідна асиметрія мембран еритроцитів при дії кріопротектора ПЕО-1500 і низьких температур.

Методи дослідження. Спектрофотометричний, електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ), проточної цитофлуориметрії.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що під впливом непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 відбувається посилення взаємодій у МЦК еритроцитів донорської та кордової крові, що торкається вертикальних зв’язків цитоскелет-плазматична мембрана, а також білок-білкових взаємодій у самому цитоскелеті. Подальше кріоконсервування викликає додаткові модифікації білок-білкових взаємодій у МЦК, що супроводжується зміною відносного вмісту спектрина, білка смуги (б.с.) 3, анкірина, б.с.4.1, б.с.4.2 і б.с.4.9, що виявляються у розчинах з різною іонною силою та вмістом двовалентних катіонів. Дані модифікації залежать від температури інкубації клітин з кріопротектором: інкубація при 0-40С, у порівнянні з 370С, сприяє кращій збереженості цих білків після розморожування клітин, що свідчить про стабілізацію мембрани в даних умовах. У еритроцитів кордової крові залежність від температури обробки клітин виражена в більшій мірі. Встановлено, що зміни в МЦК еритроцитів кордової та донорської крові, кріоконсервованих під захистом ПЕО-1500, є зворотними при перенесенні клітин до фізіологічних умов. При оцінці внеску гідрофобних взаємодій між білками МЦК еритроцитів до та після кріоконсервування при екстракції тіней у неіонному детергенті Тритон Х-100 вперше виявлено зниження екстрагованості анкірина, актина, б.с.4.1, б.с.4.2, б.с.4.9 у клітин, оброблених кріопротектором ПЕО-1500 при 0-40С. Це може вказувати на стабільність структури макромолекул і посилення взаємодії білкових компонентів цитоскелета в присутності ПЕО-1500 в даних умовах експерименту. При цьому у еритроцитів кордової крові при екстракції тіней у Тритон Х-100 спостерігається збереженість б.с.3, який відсутній у еритроцитів донорської крові. Новим є виявлений у роботі факт стійкості глікофорина А до дії ПЕО-1500 й низьких температур. Виявлена кореляція між порушенням ліпідної асиметрії у еритроцитів відразу після розморожування й рівнем гемолізу після перенесення клітин у фізіологічні умови. При цьому зниження температури обробки клітин ПЕО-1500 до 0-40С як у еритроцитів донорської, так і у еритроцитів кордової крові призводило до значного зменшення кількості анексин мічених клітин відразу після розморожування, що корелювало з більш низьким рівнем гемолізу після перенесення клітин у фізіологічні умови.

Практичне значення одержаних результатів.

Отримані в роботі результати дозволяють розширити уявлення про механізми кріоушкодження та кріозахисту біологічних об'єктів при дії на клітини непроникаючого кріопротектора й низьких температур. Дані можуть бути використані для обґрунтування нових підходів, спрямованих на модифікацію структурно-функціонального стану клітин на початкових етапах перед кріоконсервуванням з метою підвищення стійкості клітин до наступного заморожування-відігрівання. Результати роботи можуть бути рекомендовані для розробки нових й удосконалення існуючих безвідмивних методів кріоконсервування клітинних суспензій, особливо еритроцитів кордової крові, а також – у навчальному процесі при підготовці фахівців з біології та медицини.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором разом з керівником сформульовані мета й визначені завдання дослідження. Здобувачем особисто отримані експериментальні дані у всіх розділах досліджень, проведена їх статистична обробка. Автором роботи самостійно проаналізовані отримані результати і зроблені висновки. В опублікованих разом зі співавторами роботах особистий вклад здобувача полягає:

- у роботах [1, 6, 7] у проведенні досліджень по вивченню збереженості еритроцитів донорської та кордової крові після кріоконсервування.

- у роботах [3-5, 10] у вивченні Са2+- залежних перебудов білок-білкових взаємодій мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом ПЕО-1500 і низьких температур, обробці та аналізі отриманих результатів.

- у роботах [2, 3, 6, 9, 11] у проведенні досліджень асиметричного розподілу фосфатидилсерину та аналізі отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на науково-практичній конференції молодих вчених „Досягнення молодих вчених – майбутнє медицини” (Харків, 2004), міжнародній науково-практичній конференції „Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання” (Київ, 2005), міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми й досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна й функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур” (Харків, 2005), конференції „Нове в гематології та трансфузіології” (Київ, 2005); ІІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів „Молодь і поступ біології” (Львів, 2006), конференції молодих вчених „Холод у біології і медицині” (Харків, 2006), ІV Міжнародному симпозіумі „Актуальні та невирішені питання гематології та трансфузіології” (Київ, 2006), IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 статей, з яких 5 - у наукових фахових журналах, 1 – в збірниках матеріалів наукових конференцій, 1 - патент на винахід та 4 – тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 190 сторінках друкованого тексту, з яких 141 сторінка основного змісту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків, переліку використаної літератури (240 першоджерел, розміщено на 26 сторінках). Робота ілюстрована 28 таблицями, 30 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження були виконані на еритроцитах донорської і кордової крові людини, заготовленої на консерванті „Глюгіцир”.

Обробка еритроцитів кріопротектором і заморожування-відігрівання. До еритроцитів при 0-40С та 370С дозовано додавали 30% кріопротектор ПЕО-1500, приготовлений на фізіологічному розчині (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-НCl, рН 7,4), у співвідношенні 1:1 за об’ємом. Заморожування здійснювали до температури -1960С шляхом занурення контейнера в рідкий азот. Відтаювання проводили на водяній бані при температурі 40-420С.

Моделювання трансфузії. Після розморожування еритроцитів клітини, оброблені кріопротектором ПЕО-1500, переносили до ізотонічного розчину (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-НCl (рН 7,4)) (1:10 за об’ємом) з підтримкою температури 370С протягом однієї години.

Рівень гемолізу еритроцитів визначали за вмістом вільного гемоглобіну в супернатанті спектрофотометричним методом на СФ-46 (ЛОМО, Росія), при довжині хвилі 543нм [Дервиз Г.В. и др., 1966]

Одержання білих тіней еритроцитів. Лізис еритроцитів здійснювали в 20-ти об’ємах розчинів з різною іонною силою (гіпотонічна - 5мM KCl; ізотонічна - 135мМ KCl; розчини з високою іонною силою - 250мM та 500мM KCl) і вмістом двовалентних катіонів: (1) 10-6M CaСl2, 10-3M MgCl2;

(2) 10-5M CaСl2, 10-3M MgCl2; (3)10-3M CaСl2, 10-3M MgCl2; (4) 2 мМ ЭДТА.

Всі розчини були приготовані на 10 мМ Трис- HCl (рН 7,6). На етапі лізису всі розчини містили сапонін (0,02%), PMSF (1мг/мл), ДТТ (10 мМ).

Лізис здійснювали протягом 30 хв. при 0-40С, після чого тіні еритроцитів тричі відмивали двадцятикратними об’ємами відповідних розчинів. Тіні осаджували центрифугуванням при 12000g у рефрижераторній центрифузі.

Для оцінки внеску гідрофобних взаємодій між білками цитоскелета еритроцитів, а також міцності взаємодій спектрин-актинової сітки з плазматичною мембраною проводили інкубацію тіней еритроцитів в 0,5% неіонному детергенті Тритон Х-100 протягом 1 години на крижаній бані.

Електрофорез білків мембран еритроцитів проводили у вертикальних пластинах SDS- поліакриламідного гелю із градієнтом пористості (5-20)Т4С за системою Лемлі [Feirbanks G. et al., 1971; Остерман Л.А., 1981]. Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери фірми Fluka. Оцінку відносного вмісту білків різних фракцій на доріжці SDS-ПАА гелю проводили за допомогою денситометра DM2120 („Solar”, Білорусь) та програми для персонального комп'ютера Scion Image.

Визначення експресії глікофорина А та фосфатидилсерина проводили за допомогою проточного цитофлуориметра FACS Calibur фірми Becton Dickinson (США) з використанням реагентів BD (Anti-glycophorin A PE та набір Annexin V-FITC detection KIT I). Для мінімізації помилки в пробі збирали 500000 подій. Результати оцінювали за допомогою програми для ПК - CELLQuest Pro. Отримані результати статистично обробляли за методом Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їх обговорення

Оскільки важливу роль у механізмах кріозахисту клітин за допомогою непроникаючих кріопротекторів відіграє модифікація структурно-функціональних властивостей плазматичної мембрани клітини [Babijchuk L.A. et al., 1997], можна припустити, що структура МЦК еритроцитів у процесі низькотемпературного консервування може бути неоднаково модифікована ще на етапі інкубації клітин з ПЕО-1500 при різних температурах. Оскільки дані модифікації являють собою тонкі перебудови міжмолекулярних контактів, то для їх виявлення необхідно підібрати умови, в яких вони могли б проявити себе й при цьому не порушити цілісність всієї цитоскелетної сітки. Для цього при одержанні тіней еритроцитів використовували різну тонічність розчинів, а також наявність або відсутність двовалентних катіонів у розчинах для лізису. Разом з цим, одержання тіней еритроцитів в ізотонічних та обраних нами розчинах з високою іонною силою не можливо без додавання додаткових реагентів, що викликають перфорацію мембрани. Для цього був використаний неіонний детергент сапонін, який може вносити вклад у зміну білкового спектра МЦК еритроцитів [Baumann E. et al., 2000]. У зв'язку із цим, на першому етапі роботи було досліджено вплив сапоніну на МЦК еритроцитів на моделі гіпотонічних тіней еритроцитів, отриманих з додаванням і без додавання сапоніну, а також після інкубації клітин з кріопротектором ПЕО-1500.

Виявлено (рис.1), що хоча під впливом детергенту зі спектру білків практично повністю зникають білок смуги 8, білки з Мм 63 та 55 кДа, знижується вміст б.с.7, основні білки МЦК еритроцитів, такі як спектрин, анкірин, б.с.3, б.с.4.1, б.с.4.2, актин залишаються без змін. Також сапонін не впливає на спрямованість змін спектру білків МЦК еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500.

Було виявлено, що як у присутності сапоніна, так і без його використання, після інкубації клітин з ПЕО-1500 спостерігається збільшення вмісту анкірина - основного якірного білка мембрани, у порівнянні з контрольними еритроцитами. Такі зміни у білковому спектрі МЦК під впливом ПЕО, пов’язані зі збільшенням фіксації анкірина у спектрі МЦК, можуть бути спрямовані на підвищення стабільності еритроцитів до дії факторів кріоконсервування.

Аналіз білкових спектрів МЦК еритроцитів під впливом ПЕО-1500 та температури інкубації дозволив виявити ще одну особливість, що пов’язана з гемоглобіном, який утворює міцні контакти з ділянками білків у мембрані. Було показано значне посилення зв’язування гемоглобіну з білками МЦК після інкубації еритроцитів з ПЕО-1500 при 370С у порівнянні як з контролем, так і з клітинами, інкубованими при 0-40С. Такі модифікації можуть призвести до обмеження еластичності цитоскелетної структури та здатності до деформації. Обробка еритроцитів кріопротектором при 0-40С викликає значно менше аномальних перебудов в МЦК еритроцитів, про що свідчить менший вміст гемоглобіну в спектрі білків тіней еритроцитів.

Таким чином, хоча сапонін і здійснює специфічний вплив на білковий спектр, він не впливає на спрямованість модифікацій білок-білкових взаємодій в МЦК еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500 при низькій іонній силі й варіюванні концентрацій двовалентних катіонів.

Аналіз модифікацій білок-білкових взаємодій у МЦК еритроцитів донорської крові під впливом кріопротектора ПЕО-1500 у розчинах з ізотонічною та високою іонною силами свідчить, що експонування клітин з ПЕО-1500 призводить до зміцнення взаємодій у МЦК (рис.2).

У першу чергу, це стосується вертикальних зв'язків цитоскелета й плазматичної мембрани, які опосередковані анкірином, б.с.4.1 та б.с.4.2, про що свідчить збільшення вмісту даних білків у спектрі тіней еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500 як при 370С, так і при 0-40С (рис.2).

Під впливом ПЕО-1500 була виявлена ще одна особливість - посилення взаємодій у структурі актинових протофіламентів при участі б.с.4.9 (рис.2). У зоні б.с.4.9 з використанням имуноблотінга було виявлено 2 білки – тропомодулін і дематин. Ці білки у різних позиціях локалізовані на актинових протофіламентах [Ursitti J.A. et al., 1994; Hemming N.J. et al., 1995; Azim A.C. et al., 1995] і сприяють стабілізації їх структури. Можна припустити, що зміни, які спостерігаються в спектрі МЦК еритроцитів, інкубованих з ПЕО, віддзеркалюють формування більш міцної структури вузлових комплексів цитоскелетної сітки. Посилення білок-білкових взаємодій може сприяти підвищенню механічної міцності клітин та їхньої стабілізації в умовах кріоконсервування. У той же час, збільшення іонної сили розчину, що моделює дегідратацію клітин у присутності ПЕО-1500, свідчить про зниження вмісту б.с.3, яке може негативно вплинути на стабільність мембрани.

Аналіз впливу температури інкубації еритроцитів з ПЕО-1500 на білок-білкові взаємодії показав, що у клітин, оброблених кріопротектором при 0-40С, спостерігається збільшення вмісту актина у порівнянні як з контролем, так і з клітинами, інкубованими при 370С, що свідчить про зміцнення зв'язків у білковому цитоскелеті в даних умовах і може сприяти підвищенню стійкості клітин до заморожування-відігрівання (рис.2).

Кріоконсервування еритроцитів під захистом ПЕО-1500 призводить до додаткових модифікацій білок-білкових взаємодій у МЦК, що супроводжується зміною відносного вмісту спектрина, б.с.3, анкірина, б.с.4.1, б.с.4.2, б.с.4.9, які виявляються у розчинах з різною іонною силою та вмістом двовалентних катіонів. Дані модифікації залежать від температури інкубації клітин з кріопротектором. Встановлено, що обробка еритроцитів при 0-40С, у порівнянні з обробкою при 370С, сприяє кращій фіксації б.с.3 після розморожування клітин, що свідчить про стабільність мембрани в даних умовах (рис.3).

Виявлені відмінності в характері модифікацій білок-білкових взаємодій в цитоскелеті при кріоконсервуванні еритроцитів донорської крові з ПЕО-1500, можуть бути обумовлені особливостями впливу ПЕО-1500 на структуру мембрани в залежності від температурних умов інкубації клітин до кріоконсервування: при зниженні температури кількість ПЕО, який зв’язується з мембраною, знижується, що корелює з підвищенням стійкості еритроцитів до факторів кріоконсервування. Можливо, що при 370С, коли кількість ПЕО, що зв’язується з клітинами, збільшується, проявляється його цитотоксична дія на структуру плазматичної мембрани. Ці зміни стають очевидними після кріоконсервування, коли порушення білок-білкових взаємодій обумовлюють зменшення життєздатності клітин у суспензії після розморожування.

Важливим аспектом проблеми кріоконсервування та подальшого застосування клітин є те, щоб модифікації, які відбувалися під впливом кріопротектора і сприяли стабілізації еритроцитів, були зворотними після перенесення клітин у фізіологічні умови. Таке моделювання трансфузії в умовах нашого експерименту показало, що збереженість еритроцитів залежить від температурних умов інкубації їх з кріопротектором перед кріоконсервуванням. Мінімальний гемоліз як після розморожування, так і після моделювання трансфузії був у еритроцитів, оброблених кріопротектором ПЕО-1500 при 0-40С і становив 2,3±0,32% та 15,0±4,5% відповідно, а інкубація при 370С – 4,0±0,8 та 28,0±5,9%. Стан МЦК еритроцитів, які зберегли цілісність структури після повернення у фізіологічні умови, може віддзеркалювати як зміни, пов'язані зі структурними перебудовами білків в деконсервованих еритроцитах, так і зміни субпопуляційного складу клітин, залучених в аналіз. Після перенесення клітин у фізіологічні умови у еритроцитів рівень б.с.3 відповідав контрольним значенням, відзначалося невелике підвищення, у порівнянні з контролем, вмісту б.с.4.9 та анкірина в розчинах з фізіологічним рівнем іонної сили. При всіх експериментальних умовах спостерігалось невелике збільшення вмісту актина, що свідчить про збереження міцних контактів у вузлових комплексах спектрин-актинової сітки. У цілому можна говорити, що зміни в МЦК еритроцитів, кріоконсервованих під захистом ПЕО-1500 після перенесення клітин до фізіологічних умов є зворотними.

Для оцінки вкладу гідрофобних взаємодій між білками цитоскелета еритроцитів донорської крові, а також міцності взаємодії спектрин-актинової сітки з плазматичною мембраною було використано неіонний детергент Тритон Х-100. Під його дією відбувається солюбілізація ліпідного бішару і білків, не пов’язаних з цитоскелетом, а також частини білків цитоскелета, які асоційовані за рахунок гідрофобних зв’язків. Було показано, що під впливом Тритон Х-100 відбувається повна втрата б.с.3 (рис. 4).

Крім цього, дані свідчать про неоднаковий характер модифікацій білок-білкових взаємодій під дією ПЕО-1500 при різних температурах. Отримані результати вказують на важливу роль іонної сили та двовалентних катіонів у виявленні змін білок-білкових взаємодій білків, які відбуваються під впливом ПЕО-1500. Виявлене нами Са2+-залежне зниження екстрагованості анкірина, актина, б.с.4.1, б.с.4.2, б.с.4.9 в тінях еритроцитів, оброблених кріопротектором при 0-40С, як до, так і після кріоконсервування, можуть вказувати на стабільність структури макромолекул і можливість посилення взаємодії білкових компонентів цитоскелета у присутності ПЕО-1500 в даних умовах (рис.5).

Застосування фракцій кордової крові в клінічній практиці можливо лише при довгостроковому зберіганні її компонентів в замороженому стані. Для кріоконсервування еритроцитів кордової крові ми застосували метод, розроблений раніше, для кріоконсервування еритроцитів донорської крові під захистом ПЕО-1500 з “холодовою” обробкою [Бабійчук Л.О., та ін., 2000]. Однак, у зв’язку з тим, що еритроцити кордової крові мають ряд структурно-функціональних відмінностей від еритроцитів дорослої людини, які можуть впливати на стійкість клітин до низькотемпературного впливу, була проведена порівняльна оцінка модифікацій білкового спектра МЦК еритроцитів кордової крові під впливом ПЕО-1500 і температури в умовах варіювання іонної сили і вмісту двовалентних катіонів відповідно до методичних підходів, застосованих для еритроцитів донорської крові. Показано, що спрямованість змін білок-білкових взаємодій відповідає таким донорських. Як у еритроцитів донорської крові, так і у еритроцитів кордової крові були виявлені залежні від температурних умов інкубації з кріопротектором, тонічності середовища і вмісту двовалентних катіонів зміцнення зв’язків в зоні білків, що забезпечують вертикальні контакти мембрани з цитоскелетом - анкірина, б.с.3, б.с.4.1, що може сприяти збільшенню механічної міцності клітин та їх стабілізації в умовах кріоконсервування.

Після кріоконсервування і подальшої інкубації у розчинах з різною іонною силою було виявлено, що, на відміну від еритроцитів донорської крові, у кордових спостерігалася збереженість анкірина в тінях, отриманих у розчинах з високою іонною силою (рис.6). Це може вказувати на стабільність та міцність вертикальних контактів між мембраною і цитоскелетом.

Після моделювання трансфузії у еритроцитів кордової крові, що залишилися цілими, вміст спектрина, б.с.3, б.с.4.1, б.с.4.9 відповідав контрольним значенням.

Вивчення внеску гідрофобних взаємодій при інкубації тіней еритроцитів кордової крові в неіонному детергенті Тритон Х-100 виявило кращу збереженість білків у клітин, оброблених кріопротектором при 0-40С. Це свідчить про стабільність структури макромолекул і незмінність зв’язків між білками-партнерами. Також слід зазначити, що при інкубації тіней еритроцитів кордової крові у Тритон Х-100, як до, так і після кріоконсервування, виявлена збереженість основного інтегрального білка мембрани – б.с.3, який відсутній у тінях еритроцитів донорської крові при аналогічних експериментальних умовах.

Відомо, що білки мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів впливають на ліпіди [Chandra R. et al., 1987, Xiu-Li An. et al., 2001]. Вони змінюють молекулярну впорядкованість й обмежують рухливість анулярних ліпідів, викликають зміну низькочастотних коливань всієї ліпідної фази, стимулюють поділ фаз і сприяють асиметричному розподілу ліпідів у мембрані.

Асиметричний розподіл фосфоліпідів є основою для нормального функціонування мембрани й клітини в цілому [Manno S. et al., 2002]. Перебудови в ліпідній організації мембрани, що відбуваються під впливом кріопротектора ПЕО-1500, а також зміни опосередковані через модифікації білок-білкових і білок-ліпідних взаємодій у процесі кріоконсервування, можуть призводити до порушення асиметричного розподілу фосфоліпідів у мембрані.

У зв'язку з цим для визначення змін ліпідної асиметрії мембрани під впливом кріопротекторів і інших факторів кріоконсервування був застосований метод проточної цитофлуориметрії з використанням маркера анексинV. АнексинV – білок з високою спорідненістю до фосфатидилсерина. Він зв’язується з клітинами, у яких фосфатидилсерин розташований на зовнішній поверхні мембрани. В нормі фосфатидилсерин локалізований тільки на внутрішній стороні. Тому по зв'язуванню анексинаV з фосфатидилсерином можна судити про ступінь порушення розподілу ліпідів у бішарі.

Разом з тим відомо, що в підтримці структурно-функціональної повноцінності еритроцитів важливе значення відіграє глікофорин А [Telen M.J. et al., 1990]. Він є маркером для ідентифікації популяції еритроцитів серед інших популяцій клітин крові. Виходячи з цього, перед вивченням змін ліпідної асиметрії було цікавим оцінити стабільність глікофорина А під впливом фізико-хімічних факторів кріоконсервування на еритроцити.

Вивчення стійкості глікофорина А показало, що ПЕО-1500 не призводить до зниження зв'язування глікофорина А з моноклональним антитілом Anti-glycophorin A PE на етапах кріоконсервування (рис.7).

Крім цього, глікофорин А характеризується високою стійкістю до факторів консервування, про що свідчить високий ступінь експресії його на клітині.

Вивчення впливу кріопротектора ПЕО-1500 та кріоконсервування на порушення асиметрії мембрани показало, що як групи контрольних еритроцитів, так і оброблених кріопротектором, характеризувалися дуже низьким відсотком анексинV+-клітин. Варто вказати на більше число анексинV+-клітин у групах еритроцитів, оброблених кріопротектором при 370С.

Після розморожування еритроцитів, оброблених кріопротектором ПЕО-1500 при 0-40С виявлялося збільшення відсотка анексинV+-клітин у донорській крові до 17,1±3,5%, а у еритроцитів, оброблених кріопротектором при 370С - 29,7±5,5% (рис.8).

Після розморожування еритроцитів кордової крові, оброблених кріопротектором ПЕО-1500 при 0-40С, відсоток анексинV+-клітин складав 11,5±2,9%, а у клітин, оброблених кріопротектором при 370С - 21,6±4,1%. Що стосується порівняння ступеня порушення ліпідної асиметрії, то у еритроцитів кордової крові, у порівнянні з еритроцитами донорської крові, відсоток анексин мічених клітин після розморожування був нижчим.

Визначення анексинV+-клітин після перенесення їх у фізіологічні умови показало, що відсоток еритроцитів з експонованим на зовнішній стороні мембрани фосфатидилсерином як у донорській, так і у кордовій крові практично не відрізняється від відповідних груп до кріоконсервування, що напевно пов'язане з гемолізом частини клітин. Розходження у відсотку анексинV+-клітин залежно від способу їх обробки кріопротектором зберігалися. Однак, перенесення деконсервованих донорських еритроцитів у фізіологічні умови викликало гемоліз 15,0±4,5% у клітин, оброблених кріопротектором при 0-40С, та 28,0±5,9% у клітин, оброблених при 370С. У суспензії кордових еритроцитів гемоліз при аналогічних умовах обробки був на рівні 12,3±3,9% та 25,9±3,8% відповідно. Отримані результати дозволили продемонструвати чітку кореляцію між відсотком анексинV мічених клітин відразу після розморожування й рівнем гемолізу еритроцитів після перенесення клітин до фізіологічних умов. Тобто, можна вказати на те, що гемолізу піддаються анексинV+-клітини. При цьому, як у еритроцитів донорської, так і у еритроцитів кордової крові, оброблених при 0-40С, порушення асиметрії було менше відразу після розморожування, що корелює з більш низьким рівнем гемолізу при перенесенні клітин до ізотонічних умов. Обробка клітин кріопротектором при 370С призводить до більш значного порушення ліпідної асиметрії і, як наслідок, збільшення рівня гемолізу після моделювання трансфузії.

Таким чином, аналіз результатів, отриманих при вивченні впливу непроникаючих кріопротекторів і низьких температур на стійкість еритроцитів, свідчить про існування досить складних механізмів, в основі яких лежить певна послідовність модифікацій як мембрано-цитоскелетного комплексу клітин, так і пов'язаних з ними змін ліпідної асиметрії. Разом з тим, характер і спрямованість цих змін істотно залежить від початкових умов залучення клітин у технологічний процес кріоконсервування.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення і нове рішення наукового завдання, спрямованого на вивчення модифікацій білків мембрано-цитоскелетного комплексу та зміни ліпідної асиметрії в еритроцитах донорської та кордової крові під впливом кріопротектора ПЕО-1500 залежно від температури інкубації клітин з метою підвищення їхньої стійкості до заморожування-відігрівання.

1. Показано, що спрямованість змін білкового спектра мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500, не залежить від застосування неіонного детергенту сапоніну для одержання тіней еритроцитів.

2. Інкубація еритроцитів донорської та кордової крові з ПЕО-1500 призводить до зміцнення вертикальних зв'язків цитоскелета з плазматичною мембраною, опосередкованих анкірином, б.с.4.2, б.с.4.1, а також до посилення взаємодій у структурі актинових протофіламентів за участі білків смуги 4.9, що сприяє стабілізації клітин до заморожування-відігрівання. При цьому обробка еритроцитів ПЕО-1500 при 0-40С, на відміну від 370С, призводить до збільшення вмісту актину, що в даних умовах свідчить про зміцнення зв'язків у білковому цитоскелеті.

3. Кріоконсервування еритроцитів донорської та кордової крові під захистом ПЕО-1500 призводить до змін відносного вмісту спектрина, анкірина, б.с.3, б.с.4.1, б.с.4.2 і б.с.4.9, що виявляються у розчинах з різною іонною силою та різним вмістом двовалентних катіонів. Дані модифікації залежать від температури інкубації клітин з кріопротектором: інкубація при 0-40С, у порівнянні з 370С, сприяє кращій збереженості цих білків після розморожування клітин. У еритроцитів кордової крові залежність від температури обробки клітин виражена в більшій мірі.

4. Зміни в мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів кордової та донорської крові, кріоконсервованих під захистом ПЕО-1500, є зворотними при переносі клітин до фізіологічних умов: у еритроцитів, що залишилися цілими, відзначається відповідність контрольним значенням рівнів спектрина, б.с.3, б.с.4.1, б.с.4.9.

5. Оцінка внеску гідрофобних взаємодій до та після кріоконсервування при екстракції тіней еритроцитів донорської та кордової крові в неіонному детергенті Тритон Х-100 виявила Са2+-залежне зниження екстрагованості анкірина, актина, б.с.4.1, б.с.4.2, б.с.4.9 у клітин, оброблених кріопротектором при 0-40С. Екстракція тіней еритроцитів кордової крові в Тритон Х-100 виявила збереженість у еритроцитів кордової крові б.с.3, який відсутній у еритроцитів донорської крові.

6. Виявлено високу стійкість глікофорина А до факторів низькотемпературного консервування: обробка еритроцитів ПЕО-1500 не призводить до зниження ступеня його зв'язування з моноклональним антитілом Anti-glicophorin A РЕ, як на етапі інкубації з кріопротектором, так і після заморожування-відігрівання.

7. Виявлено кореляцію між відсотком анексин мічених клітин відразу після розморожування та рівнем гемолізу еритроцитів після перенесення їх до фізіологічних умов. При цьому у еритроцитів як донорської, так і кордової крові, оброблених ПЕО-1500 при 0-40С, порушення асиметрії значно менше після розморожування, ніж у клітин, оброблених при 370С, що корелює з більш низьким рівнем гемолізу після моделювання трансфузії.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В., Зубов П.М., Тимченко О.Л. Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 // Проблемы криобиологии.- 2005.- Т.15, №3.- C.556-560.

2. Зубов П.М. Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В., Тимченко О.Л. Влияние криопротектора ПЭО-1500 и режимов обработки на асимметрию мембраны эритроцитов в процессе криоконсервирования // Проблемы криобиологии.- 2005.- Т.15, №3.- C.573-574.

3. Зубов П.М., Зубова О.Л., Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В. Модификация белков мембрано-цитоскелетного комплекса и липидной асимметрии мембран эритроцитов кордовой и донорской крови до и после криоконсервирования с ПЭО-1500 // Укр. журнал гематології та трансфузіології.- 2006.- №4.- C.41-47.

4. Зубов П.М., Землянских Н.Г., Бабийчук Л.А. Модификация белкового состава мембрано-цитоскелетного комплекса эритроцитов под влиянием ПЭО-1500 // Проблемы криобиологии.- 2006.- Т.16, №2.-C.164-175.

5. Зубов П.М., Землянских Н.Г., Бабийчук Л.А. Изменение содержания спектрина в изолированных цитоскелетах эритроцитов под влиянием ПЭГ-1500 и замораживания-отогрева // Гематологія і переливання крові.- 2006.- №33.- C.109-113.

6. Зубов П.М., Зубова О.Л. Криоконсервирование эритроцитов кордовой крови: влияние на структурно-функциональные показатели клеток / Матер. V міжнар. наук. симпоз. „Актуальні та невирішені питання гематології та трансфузіології”, Київ, 2006 // Новое в гематологии и трансфузиологии.- 2006.- №5.- C.38-42.

7. Патент України № 80062 А01N 1/02. Спосіб кріоконсервування цільної кордової крові. Бабійчук Л.О., Грищенко В.І., Гуріна Т.М., Рязанцев В.В., Зубова О.Л., Зубов П.М.- №200602122; Заявл. 27.02.06; Опубл. 10.08.07. Бюл. №12, 4 c.

8. Зубов П.М. Модифікація білків мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом кріопротектору ПЕО-1500 у розчинах з різною іонною силою // Матеріали науково-практичної конференції молодих, присвяченої 350-річчю міста Харкова.- Харків, 2004.- C.36-37.

9. Зубов П.М., Зубова О.Л. Структурно-функціональні показники еритроцитів кордової та донорської крові при кріоконсервування з ПЕО-1500 // Зб. тез Другої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ біології”.– Львів, 2006.- C.49-50.

10. Землянских Н.Г., Зубов П.М., Бабийчук Л.А. ПЭО-1500 модифицирует мембрано-цитоскелетный комплекс эритроцитов человека // Зб. Тез ІХ Українського біохімічного з’їзду.- Харків, 2006.- Т.1.- C.42-43.

11. Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В., Зубова О.Л., Зубов П.М. Сравнение структурных и функциональных показателей эритроцитов кордовой и донорской крови до и после криоконсервирования // Зб. Тез ІХ Українського біохімічного з’їзду.- Харків, 2006.-Т.1.- C.31.

Анотація

Зубов П.М. Модифікація білків мембрано-цитоскелетного комплексу та ліпідної асиметрії в еритроцитах при охолодженні та заморожуванні у присутності кріопротектора ПЕО-1500.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена вивченню білок-білкових взаємодій у мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів донорської та кордової крові, а також оцінці особливостей трансмембранного розподілу фосфатидилсерина в мембрані, що викликані впливом непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 та кріоконсервуванням. Встановлено, що обробка кріопротектором ПЕО-1500 призводить до посилення взаємодій в мембрано-цитоскелетному комплексі, зокрема вертикальних зв’язків цитоскелета та плазматичної мембрани, що опосередковані анкірином, б.с.4.1, б.с.4.2, а також укріплення зв’язків у структурі актинових протофіламентів за участі б.с.4.9. Кріоконсервування еритроцитів донорської та кордової крові викликає додаткові модифікації білок-білкових взаємодій, що призводить до зміни відносного вмісту білків. Ці модифікації залежать від температури інкубації з кріопротектором: обробка при 0-40С, у порівнянні з 370С, сприяє кращій збереженості білків. Встановлено, що зміни в мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів донорської та кордової крові є зворотними при перенесенні клітин до фізіологічних умов. Показано, що клітини, оброблені ПЕО-1500 при 0-40С, є більш стійкими до дії неіонного детергенту Тритон Х-100. Екстракція тіней еритроцитів кордової крові в Тритон Х-100 виявила збереженість у еритроцитів кордової крові б.с.3, який відсутній у еритроцитів донорської крові.

Виявлено високу стійкість глікофорина А до факторів низькотемпературного консервування: обробка еритроцитів ПЕО-1500 не призводить до зниження ступеня зв'язування глікофорина А з моноклональним антитілом Anti-glicophorin A РЕ, як на етапі інкубації з кріопротектором, так і після заморожування-відігрівання. Встановлена кореляція між відсотком анексин мічених клітин відразу після розморожування та рівнем гемолізу еритроцитів після перенесення їх до фізіологічних умов. При цьому як у еритроцитів донорської, так і кордової крові, оброблених ПЕО-1500 при 0-40С, порушення асиметрії менше, ніж у клітин, оброблених при 370С, що корелює з більш низьким рівнем гемолізу після моделювання трансфузії.

Ключові слова: еритроцити, мембрано-цитоскелетний комплекс, білок-білкові взаємодії, ліпідна асиметрія, кріопротектор ПЕО-1500, кріоконсервування.

Аннотация

Зубов П.М. Модификация белков мембрано-цитоскелетного комплекса и липидной асимметрии в эритроцитах при охлаждении и замораживании в присутствии криопротектора ПЭО-1500.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена изучению белок-белковых взаимодействий в мембрано-цитоскелетном комплексе эритроцитов донорской и кордовой крови, а также оценке особенностей трансмембранного распределения фосфатидилсерина в мембране, которые вызваны влиянием непроникающего криопротектора ПЭО-1500, охлаждением и замораживанием-отогревом.

Показано, что неионный детергент сапонин не влияет на направленность модификаций белок-белковых взаимодействий в мембрано-цитоскелетном комплексе эритроцитов, инкубированных и замороженных с криопротектором ПЭО-1500.

С помощью метода электрофореза в ПААГ установлено, что обработка ПЭО-1500 при различных температурных условиях приводит к усилению вертикальных взаимодействий в мембрано-цитоскелетном комплексе эритроцитов кордовой и донорской крови, которые опосредованы анкирином, б.п.4.1, б.п.4.2, а также к усилению взаимодействий в структуре актиновых протофиламентов при участии белков полосы 4.9. Обработка эритроцитов ПЭО-1500 при 0-40С, в отличие от 370С, приводит к увеличению содержания актина.

Криоконсервирование эритроцитов донорской и кордовой крови под защитой