Харківський державний університет

ВІРНИК Костянтин Михайлович

УДК 577.32

ЕНЕРГЕТИЧНІ І ДИНАМІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ

СИСТЕМИ ДНК-ВОДА

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України.

Науковий керівник:

Доктор фізико-математичних наук, професор Малєєв Володимир Якович,

Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, завідувач

відділу біофізики (м. Харків).

Офіційні опоненти:

-

Севастопольський державний технічний університет, професор

(м. Севастополь);

-

Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур

ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу

молекулярної біофізики (м. Харків).

Провідна установа:

Інститут фізики НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться "29" квітня 1999 року о 16-30 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському державному

університеті, 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці

Харківського державного університету: 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий "22" березня 1999 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У наш час розуміння біологічного значення нуклеїнових кислот (НК) у функціонуванні організмів стимулює інтенсивні експериментальні та теоретичні дослідження з метою виявлення впливу різних факторів (іон-гідратного оточення, випромінювання тощо) на структуру, стабільність, конформаційну рухливість і фізико-хімічні властивості НК. Але незважаючи на велику кількість отриманих даних, для побудови більш повної картини функціонування НК у біологічних системах необхідні подальші дослідження фундаментальних термодинамічних властивостей НК. Зміна конформаційного стану НК, а значить і її біологічних функцій, як і зміна стану будь-якої системи, повинна знаходити адекватне відображення в зміні енергетичних та динамічних характеристик НК. Той факт, що гідратація відіграє суттєву роль у процесах конформаційної рухливості НК, викликає необхідність вивчення впливу водного оточення на енергетику і динаміку НК, зокрема ДНК.

Стан і стабільність системи істотно залежить від впливу навколишнього середовища. Несприятлива радіаційна обстановка, яка склалась в багатьох точках світу, особливо у зоні Чорнобильскої АЕС, а також в усій Україні, примушує вчених працювати над проблемою впливу радіації на організм. При цьому великий інтерес викликають дослідження радіаційних уражень генетичного апарату. Важлива роль в процесах радіаційних пошкоджень ДНК належить вільним радикалам, які формуються при радіолізі водного оточення. Встановлено, що на ці процеси впливає стан гідратної оболонки ДНК, яка, в свою чергу, обумовлює конформацію ДНК. Однак, роль гідратної оболонки в процесах радіаційного пошкодження ДНК при різних рівнях гідратації остаточно ще не виявлена.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, результати яких представлені в дисертації, є частиною науково-дослідної роботи, яка виконується у відділі біофізики Інституту радіофізики та електроніки НАН України в межах держбюджетних тем “Дослідження фізичних особливостей гідратованих біополімерів з урахуванням впливу іонізуючої радіації” (шифр “Гран”, № 01.96U006110, виконується за постановою Бюро ВФА НАН України від 19 грудня 1995р., протокол №9), “Експериментальні та теоретичні дослідження гідратно-залежних процесів стабілізації структури природних та модельних нуклеїнових кислот” (№2.4/759, виконується за проектом Державного фонду фундаментальних досліджень).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є з’ясування впливу гідратації на енергетику і динамічні властивості системи ДНК-вода, а також на стабільність цієї системи, що знаходиться в умовах дії - радіації. Для досягнення цієї мети вирішувались такі задачі:

1.

1.

1.

Наукова новизна одержаних результатів. Одержано експериментальні значення енергії дегідратації полімерних матриць природних ДНК і модельних двоспіральних полірибонуклеотидів в залежності від рівня гідратації та нуклеотидного складу. Знайдене лінійне співвідношення між енергією дегідратації НК та її AT/GC-складом. Проведено диференціацію молекул води гідратної оболонки ДНК за їх енергетичними характеристиками. Встановлено той факт , що властивості гідратного оточення відбивають структуру НК на різних рівнях її організації. Розраховане значення фрактальної розмірності ДНК у різних конформаційних станах. Встановлено, що фрактальна розмірність поверхні ДНК може служити характеристикою різних конформаційних станів ДНК. Побудовано модель поверхневої дифузії води, зв’язаної з молекулою ДНК. На основі цієї моделі отримано оціночні значення коефіцієнту дифузії зв’язаної води. Знайдено, що найбільші зміни в ДНК внаслідок опромінення мають місце при низьких і високих рівнях гідратації. Встановлено, що в процесі опромінення водне оточення молекули ДНК в залежності від вмісту води в зразку може відігравати подвійну роль, виступаючи на першому етапі гідратації як стабілізатор структури ДНК, а при подальшому збільшені вмісту води в системі – як підсилювач деструктивної дії радіації.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі експериментальні та теоретичні результати розширюють існуючі уявлення про вплив гідратації та опромінення на фізичні властивості системи ДНК-вода. Залежності енергетичних та динамічних параметрів від вмісту води можуть використовуватися як характеристики структурного стану гідратної оболонки (та ДНК у цілому) для моделювання процесів конформаційної динаміки ДНК, які відбивають біологічну функціональність даного біополімеру. Знання залежностей енергії дегідратації від вмісту води для двох ДНК з відомим AT/GC-складом і для ДНК невідомого складу дозволяє знайти нуклеотидний склад останньої без проведення дорогих експериментів. У той же час, знаючи нуклеотидний склад ДНК, яка нас цікавить, та залежності енергії дегідратації від вмісту води для двох інших відомих ДНК, можна розрахувати “енергетичний спектр” дегідратації даної ДНК. Фрактальна розмірність поверхні ДНК, яка залежить від конформаційного стану макромолекули, може бути застосована як характеристика вторинної структури ДНК. Крім того, значення фрактальної розмірності ДНК були використані в даній роботі при моделюванні поверхневої дифузії молекул зв’язаної води, бо при аналізі динамічних процесів такого типу врахування фрактальних властивостей біополімерів є необхідним. Оціночні значення коефіцієнтів поверхневої дифузії води при різних рівнях гідратації ДНК є необхідними для побудови моделей з розподіленими параметрами для подальших досліджень процесів сорбції води і конформаційних переходів у ДНК. Такі моделі дозволяють отримати термодинамічні параметри системи НК-вода з урахуванням кооперативності зв’язування води та існування гістерезисних явищ. Дані, що характеризують роль гідратної оболонки в процесах радіаційного ураження ДНК, можуть використовуватися в дослідженнях механізмів взаємодії ДНК з різними біологічно активними молекулами, зокрема з фармацевтичними препаратами радіопротекторної дії, а також для вибору режимів зберігання генетичних матеріалів в умовах підвищеної радіації.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих спільно зі співавторами наукових працях особистий внесок дисертанта полягає:

у роботах [1, 5, 10, 11] – в участі в підготовці і проведенні експериментів, в обробці, аналізі й обгрунтуванні одержаних результатів;

у роботах [2, 4, 6-9] – в участі в розробці моделей, проведенні розрахунків і аналізі отриманих даних, обгрунтуванні висновків;

у роботі [3]– в участі в проведенні експериментальних робіт, в обробці й інтерпретації одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень, які ввійшли в дисертаційну роботу, були представлені на:

·

· 17th Discussion Conference on Surface and Interfacial Phenomena in Macromolecular Systems, Prague, Czech, 1997;

· NATO School on Hydration Processes in Biology: Theoretical and Experimental Approaches, Les Houches, France, 1998;

· II З’їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 1998;

· International Conference "Physics of Biological Systems", Kyiv, 1998;

· семінарі Харківського відділення Українського біофізичного товариства, Харків, 1998.

Публікації. Результати роботи опубліковані в 11 наукових працях, у тому числі в 6 статтях у наукових журналах і в 5 тезах доповідей на конференціях.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, п’яти розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 151 сторінку, з них 25стор. займають 29 ілюстрацій, 5стор. – 7 таблиць, 20стор. – список використаних літературних джерел (198 найменувань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми дисертації, сформульована мета і задачі дослідження, показана його новизна, наукова та практична цінність, наведено дані про основні публікації за темою дисертації, апробацію роботи, загальну структуру дисертації.

Розділ 1 присвячений огляду основних напрямків експериментальних і теоретичних досліджень впливу різних факторів на структуру, стабільність і властивості НК. У першій частині розглянуто вплив стану іон-гідратного оточення на формування вторинної структури НК за даними різних методів, які включають рентгеноструктурний аналіз, оптичну мікроскопію, спектральні методи, методи машинного моделювання та інші. Детальний розгляд цих даних показує, що іон-гідратне оточення істотно впливає на структуру НК і повинно розглядатись як невід’ємний структурний елемент НК. Далі в огляді обговорюється проблема, яка стосується досліджень енергетики і динамічних властивостей системи ДНК-вода. Проаналізовано існуючі експериментальні та теоретичні підходи до вивчення впливу гідратації на енергетичні і динамічні характеристики цієї системи. На основі літературних даних зроблено висновок, що вода в ДНК виділяється своєю високою рухливістю, і навіть локальна кількісна зміна її вмісту, викликана процесами поверхневої дифузії, може індукувати оборотні конформаційні переходи. Такі структурні перебудови призводять до зміни фізичних властивостей ДНК. У заключній частині огляду приділено увагу розгляду проблеми впливу випромінювань різних типів на зволожені зразки НК, яка дуже важлива в екологічних умовах, що склалися на Україні після аварії на Чорнобильскій АЕС. На основі аналізу всього набору існуючих літературних даних сформульовані основні задачі дослідження.

У розділі 2 наведено дані про зразки, які досліджувались в роботі (волокна poly(A)poly(U), poly(G)poly(C), ДНК з Clostridium perfringens (С-ДНК: АТ/GC=2,23), ДНК з тимуса теляти (Т-ДНК: АТ/GC=1,38) та ДНК з Micrococcus luteus (М-ДНК: АТ/GC=0,39), коротко викладено методики приготування зразків та проведення експериментів.

У розділі 3 представлені результати експериментальних досліджень енергетики дегідратації системи НК-вода при різному вмісті води, які були одержані методами диференційної скануючої мікрокалориметрії в ізотермічному режимі (Т=303К) та термогравіметрії. На рис.1а представлені залежності енергії дегідратації E від вмісту води в зразку n (кількість молекул води, які припадають на один нуклеотид, тобто МН2О/МН) або так звані “енергетичні спектри” води (енергетичні ізотерми дегідратації), яка зв’язана на матрицях poly(A)poly(U), poly(G)poly(C) і природних ДНК з різним нуклеотидним складом. Залежності E(n) для різних біологічних матриць мають схожу якісну поведінку (за виключенням poly(G)poly(C)) – зі збільшенням вмісту води в системах спостерігається монотонне зменшення енергії дегідратації. При цьому є кількісні відмінності – зі збільшенням вмісту GC-пар у зразку енергія дегідратації E(n) зростає.

Це може свідчити про підвищення термостабільності системи НК-вода, якщо прийняти до уваги те, що гідратна оболонка відіграє важливу роль у стабілізації структури НК. На рис.1б представлено залежність надлишкової енергії гідратації E (величини, яку зручніше використовувати при розгляданні процесу сорбції або десорбції) від вмісту води n та відносного вмісту GC-пар (Х) у зразку. E(n) дорівнює E(n)–E0, де Е(n) – експериментально одержана енергія дегідратації, E0=40,5кДж/MH2O – середня енергія взаємодії вода-вода в об’ємній фазі. Зі зростанням вмісту води в зразках НК значення надлишкової енергії гідратації зменшуються. Спільний аналіз калориметричних даних і результатів, що були одержані за допомогою методу ІЧ-спектроскопії, дозволяє виділити в залежності E(n,Х) декілька областей вмісту води (рис.1б). У першій області (чорні кружки) молекули води найбільш міцно зв’язані з ДНК (область моногідратного шару). У другій області (біли кружки) молекули води проявляють менший ступінь зв’язування (область формування А-конформації). В останній області (чорно-біли кружки) вода також має невеликий ступінь зв’язування і складає ту частину гідратної оболонки НК, яка відповідає за формування В-конформації. У ході аналізу одержаних даних також було знайдено лінійну залежність енергії дегідратації ДНК Е (ДНК) від нуклеотидного складу, яку можна представити у вигляді:

Е (ДНК) = (1–Х)Е (АТ) + ХЕ (GC) , (1)

де Х – відносний вміст GC-пар в структурі ДНК; Е (АТ), Е (GC) – енергії дегідратації НК, які складаються тільки з АТ-, або з GC-пар відповідно. З метою перевірки цієї залежності з використанням даних для С- та М-ДНК у широкому інтервалі вмісту води було розраховано параметр Х Т-ДНК для Т-ДНК, значення якого можна порівняти з уже відомим значенням відносного вмісту GC-пар в Т-ДНК (Х=0,42). Параметр Х Т-ДНК знаходили з рівняння:

, (2)

де Е Т-ДНК, Е С-ДНК, Е М-ДНК – енергії дегідратації Т-, С- і М-ДНК відповідно, Х С-ДНК, Х М-ДНК – відносний вміст GC-пар в С- і М-ДНК. Знайдене за “енергетичними спектрами” середнє значення вмісту GC-пар у структурі природної Т-ДНК () збігається з довідковими даними. Крім того, знаючи нуклеотидний склад даної ДНК, Х, енергетичні ізотерми дегідратації двох інших ДНК (Е1 і Е2), а також їх нуклеотидний склад (Х1 і Х2), можна розрахувати “енергетичний спектр” дегідратації ДНК (Е), яка нас цікавить:

. (3)

Результати такого розрахунку добре узгоджуються з експериментальними даними. При цьому, порівняння одержаних розрахункових даних для полінуклеотидів poly(dA)poly(dT) та poly(dG)poly(dC) з експериментальними даними для полірибонуклеотидів poly(A)poly(U) та poly(G)poly(C) показали, що природа мономірних ланок (рибонуклеотид або дезоксирибонуклеотид), які входять до структури НК, практично не впливає на енергію дегідратації НК.

Зі зростанням n ухил прямих Е(Х) (E(n)) змінюється. Можна виділити дві області різної поведінки залежності E/X (n) – область убування, де при збільшенні вмісту води в системі НК-вода приблизно до n=6 ухил прямих Е(Х) зменшується практично лінійно та область, де значення E/X майже не змінюються (n>6). У процесі зволоження зразка ДНК до n=6 сорбуються молекули води, які створюють моногідратний шар з міцними зв’язками, при цьому починається формування упорядкованої, спіральної структури ДНК. У даній області значень n відносний енергетичний вклад з боку молекул води, що зв’язані з GC-парами, у загальну надлишкову енергію гідратації (енергію дегідратації) зменшується. При подальшому зростанні вмісту води у зразку співвідношення між енергетичними вкладами з боку молекул води, які зв’язані з GC- і АТ-парами, залишається практично незмінним. Таким чином, енергетичні параметри зв’язаної води є найбільш чутливими до зміни нуклеотидного складу в області формування моногідратного шару.

Результати термогравіметричних досліджень, які були проведені на зразках NaДНК (у вигляді водної дисперсії) в ізотермічному режимі (Т=370С), доповнюють дані з мікрокалориметрії.

Аналіз одержаних результатів дозволяє виділити чотири стани води в зразку ДНК, що досліджувалась: сильно зв’язана вода (вміст води n<6), перші приблизно три молекули якої мають найбільший ступінь зв’язування з матрицею ДНК; вода, яка має середній ступінь зв’язування (n=6-12); слабо зв’язана вода (n становить від 12 до 22-30) та вільна вода (n>30).

Далі в роботі проводиться диференціація молекул води в гідратному оточенні ДНК за їхніми енергіями зв’язування. Виділяється декілька типів центрів гідратації, які відрізняються за характером й енергією зв’язування. Розглядаються процеси сорбції (гідратації) трьох типів: a) сорбція ленгмюрівськими центрами зв’язування, які, мабуть, розташовані на азотистих основах (гідратація з насиченням); б) сорбція генрієвськими центрами зв’язування, які знаходяться на катіон-фосфатних групах (гідратація без насичення); в) мультишарова сорбція (гідратація попереду зайнятих центрів зв’язування). Також враховується, що молекули води, сорбовані за різними типами, вносять енергетичний вклад у стабілізацію кожного з конформаційних станів, в яких може існувати ДНК (в області вмісту води, яка розглядається, це – неупорядкований стан, A- і B-форма ДНК). Для загальної вільної енергії зв’язування G(n) маємо:

(4)

де A(n), B(n), U(n) – частки А-, В-конформацій і неупорядкованого стану у вторинній структурі ДНК відповідно; XL(n), XH (n), XML(n) – частки молекул води, зв’язані з ленгмюрівськими, генрієвськими центрами і в мультишаровій частині гідратної оболонки ДНК відповідно; – шукані величини енергетичного вкладу в стабілізацію m-ої конформації з боку молекул води, які беруть участь в гідратації k-го типу (k=L, H, ML; m=A, B, U).

У табл.1 представлено значення , які були одержані в результаті розрахунків. Аналіз значень у межах кожного типу сорбції показує, що вода, зв’язана на ленгмюрівських центрах переважно сприяє стабілізації А-форми, у той час як вода, зв’язана на генрієвських центрах – стабілізації В-форми. Це узгоджується з уявленнями про те, що гідратація азотистих основ і фосфатних груп відіграє ведучу роль у стабілізації A- і B-форм ДНК відповідно. Молекули води, зв’язані в мультишарі, найбільш важливі для стабілізації як А-, так і В-форми, порівняно з неупорядкованим станом. Це результат того, що основне формування мультишарової частини гідратного оточення йде при великому вмісті води в ДНК.

Значення загальної вільної енергії зв’язування зі зростанням вмісту води в системі зменшуються. Це вказує на той факт, що доля молекул води, відносно міцно зв’язаної з центрами первинної гідратації (ленгмюрівські і генрієвські центри) на матриці ДНК, зменшується через збільшення слабої (вторинної) сорбції води, тобто мультишарової сорбції.

У розділі 4 представлені результати досліджень динамічних властивостей води, зв’язаної на матрицях різних НК. Тісна взаємозалежність енергетичних та динамічних характеристик дозволила нам розрахувати значення різних динамічних параметрів, що характеризують мобільність води в гідратному оточенні НК.

Залежність часу діелектричної релаксації диполів води d від вмісту води n в зразку була отримана з рівняння, що зв’язує цей параметр з надлишковою енергією гідратації E(n):

d(n)=, (5)

де d0 – значення для об’ємної води при кімнатній температурі, яке становить 0,9*10–11с; Т – температура в градусах Кельвіна; R – газова стала.

Залежності d(n) для НК різного нуклеотидного складу, які були розраховані з рівняння (5), представлені на рис.1а. Вони мають якісно схожий вигляд (за виключенням poly(G)poly(C)). З рис.1а видно, що на початкових стадіях гідратації (n<6) значення d швидко убувають (приблизно на порядок), а при подальшому збільшенні n поступово наближаються до значення d для об’ємної води (d0). Отриманий результат узгоджується з даними, які вказують на нерозрізнення фізичних властивостей периферійної частини гідратного оточення НК та властивостей об’ємної води. З рис.1а також видно, що зі збільшенням вмісту GC-пар в зразку НК значення часу діелектричної релаксації диполів води d(n) зменшуються.

Ще одним динамічним параметром, розрахованим з отриманих залежностей E(n), є “вільний об’єм” Vf, який займають молекули води в гідратній оболонці НК. У випадку системи НК-вода такий параметр, як ” вільний об’єм” обумовлює характер молекулярних сил зв’язування молекул води з адсорбційними центрами донорного та акцепторного типів, а також появи на біополімерних матрицях регулярно упорядкованих структур молекул води.

У запропонованій моделі “вільний об’єм” Vf визначається як різниця між загальним об’ємом гідратної оболонки V та забороненим об’ємом B, який залежить від температури Т, загального об’єму V і числа молекул N. Тут Vf представляє собою об’єм, в якому можуть здійснюватися трансляції незв’язаних молекул води, а заборонений об’єм B відповідає об’єму, в якому трансляційні рухи є ускладненими внаслідок водневого зв’язування молекул води. Повна теплота випарювання води з поверхні біополімеру (енергія дегідратації) E в розрахунку на один моль може бути представлена у такому вигляді:

E = RT ln[(Vп –Bп )/(Vг –Bг)]+P(Vп –Vг) , (6)

де Р – тиск насиченої пари; Vп, Vг – молярні загальні об’єми насиченої пари і гідратної води відповідно; Bп, Bг – заборонені об’єми для води в стані пари і в гідратній оболонці відповідно.

Стан реального газу (пари) звичайно описується загальним віріальним рівнянням стану:

PVп /RT = 1+B/Vп+C/Vп2+ . (7)

Для частинного врахування міжмолекулярних взаємодій при розрахунку “вільного об’єму” (Vf =Vг–Bг) ми використовували перші два члени віріального ряду (7). З урахуванням того, що в області низьких тисків водяних пар виконуються умови VпBп и VпVг, тобто справедливе співвідношення газових законів, маємо:

. (8)

Порівнюючи залежності Vf(n), які були отримані з рівняння (8) для зразків НК різного нуклеотидного складу (рис.2), можна зробити висновок про те, що вода в гідратній оболонці poly(G)poly(C) знаходиться в більш “стиснутому” стані порівняно з гідратними оболонками poly(A)poly(U) та природних ДНК. Із рис.2 видно, що в області середніх значень n для усіх зразків спостерігається відносне зменшення швидкості зростання “вільного об’єму”.

Ці особливості в залежностях Vf(n) можуть бути пов’язані з переходом НК з неупорядкованого стану в спіральну конформацію. В цьому процесі, очевидно, йде впровадження молекул води до внутрішніх областей структури нуклеїнової кислоти і структуризація гідратної оболонки, а не просте адитивне збільшення її об’єму.

Однією з основних фізичних характеристик взаємодії гідратного оточення з молекулою ДНК є коефіцієнт поверхневої дифузії води. Було запропоновано модель трансляційної дифузії сорбованої води по матриці ДНК. Як основу для даної гратчастої моделі було взято підхід, запропонований Френкелем в теорії реальних кристалів та рідин.

Для описання процесу дифузії розглянемо полімерну матрицю у вигляді гратчастої структури з періодом грат, який дорівнює а (рис.3). У такій структурі енергетична неоднорідність поверхні виникає внаслідок періодичності в розташуванні елементів біополімерної матриці (рис.3). Будемо вважати, що кожна зв’язана молекула води розташована у вузлі грат (місце зв’язування). Процес дифузії розглядається як процес звільнення одного місця зв’язування з подальшим зайняттям молекулою води найближчого місця зв’язування.

Припустімо, що w=n/N імовірність того, що місце зв’язування є зайнятим молекулою води, де N – загальне число місць зв’язування в зразку ДНК, n – число зайнятих місць зв’язування. В інтервалі часу t місце зв’язування є зайнятим протягом часу toc=wt, а число подій зв’язування води M дорівнює wt/, де – час життя молекули води в зв’язаному стані або тривалість існування місця зв’язування зайнятим. Тоді,

tr= t/M = /w – середній час між звільненням одного місця зв’язування і зайняттям молекулою води іншого місця зв’язування або середній час, впродовж якого триває переміщення молекули води між двома центрами зв’язування, яке дорівнює a, тобто час трансляції.

Припускається також, що процес дифузії триває згідно з законом Фіка. Беручи до уваги той факт, що величина середнього квадрата зміщення молекули з початкового положення впродовж часу tr є фіксованою (а саме a2), і, припускаючи, що переходи в протилежних напрямках є статистично незалежними, маємо <x2>=a2=2D 1tr , тобто:

(9)

Аналогічно випадку одномірної дифузії можна розглянути процеси двомірної і просторової дифузії, для яких коефіцієнти дифузії виражаються як D2=a2/4tr и D3=a2/6tr відповідно. Видно, що коефіцієнти дифузії для задач різної розмірності відрізняються тільки числовим коефіцієнтом. Цей коефіцієнт становить 1/2d, де d – розмірність дифузійної задачі. У загальному випадку маємо:

. (10)

При розгляді процесу дифузії зв’язаних молекул води по поверхні ДНК виникає питання про вибір розмірності задачі. Вибір двомірної дифузійної задачі представляється некоректним, оскільки відомо, що молекула ДНК має дуже складну структуру поверхні. Для описання таких складних об’єктів вводиться поняття масштабної або фрактальної (хаусдорфової) розмірності об’єкта D і об’єкт, який має фрактальні властивості, тобто є інваріантним відносно масштабування, називається фракталом. Фрактальна розмірність звичайно відрізняється від топологічної і її значення лежать в межах інтервалу 2 D 3, але деякі сорбенти мають фрактальну розмірність більшу, ніж 3.

Для оцінки фрактальної розмірності поверхні молекули ДНК використовувався метод, який полягає в уявному прокатуванні пробної частинки (кульки) уздовж поверхні молекули ДНК і розрахунку площі доступної поверхні для пробних кульок різних радіусів. Було вибрано три значення радіусів пробних кульок: r1=1,5А; r2=3,0А; r3=4,5А. Для двох різних радіусів пробної кульки маємо:

D = – ln(N(d))/ lnd , (11)

де N –число пробних кульок, які покривають поверхню ДНК (поверхню середньої пари нуклеотидів), d=2r (r – радіус пробної кульки). Було розраховано середні значення фрактальної розмірності для А- і В-ДНК, які становлять 3 і 2,5 відповідно. Фрактальна розмірність поверхні ДНК має різні значення для А-и В-форми. Через те, що значення площі доступної поверхні визначаються типом конформації ДНК, фрактальна розмірність поверхні ДНК може розглядатися як характеристика вторинної структури ДНК і відбивати її динамічну поведінку, тобто зміну конформаційного стану.

Таким чином, замінюючи топологічну розмірність d в рівнянні (10) середньою фрактальною , маємо рівняння для отримання коефіцієнта поверхневої дифузії молекул води:

. (12)

Оцінка коефіцієнта дифузії зв’язаної води уздовж поверхні NaДНК при різних умовах вмісту води проводилась у трьох інтервалах відносної вологості (ВВ) або вмісту води згідно з критерієм найбільш імовірного існування окремої форми ДНК з конкретними структурними характеристиками в цих інтервалах. В області ВВ 0-100% (n становить від 0 до 22МН2О/МН) існують три різні структури ДНК: В-подібна форма або Р-форма (ВВ72%, n7), A-форма (ВВ=78-90%, n=8-15), В-форма (ВВ>92%, n>16). В інтервалах n=7-8 і n=15-16 відбуваються конформаційні переходи із В-подібної форми в А-форму та з А- в В-форму ДНК відповідно. Ці інтервали були вилучені з розгляду, тому що структура ДНК в цих інтервалах є мінливою.

Величини були розраховані із рівняння (5), в якому коефіцієнтом є 0 – час між послідовними трансляційними рухами молекул води в об’ємній фазі при кімнатній температурі (2,5*10–10 с). Значення часу життя молекул води в зв’язаному стані становлять 1,3*10–8 – 3,3·10–10 с в інтервалі вмісту води, який досліджувався.

Залежність значень коефіцієнта поверхневої дифузії D від ВВ, розрахована з рівняння (12) з відповідними значеннями параметрів, представлена на рис.4а. Величина коефіцієнта дифузії D монотонно зростає в кожній секції графіка. Таку поведінку цієї залежності можна пояснити фактом зменшення частки молекул води, “сильно” зв’язаних з ДНК, внаслідок посилення мультишарової сорбції, яка характеризується малими енергіями зв’язування.

Одним з випадків дифузії зв’язаної води є подовжня дифузія, тобто дифузія, яка спрямована уздовж осі спіралі ДНК. Припускається, що такий тип дифузії представляє собою випадок одномірної дифузії. Таким чином, у даній моделі біополімерну матрицю слід розглядати як одномірні грати (у рівнянні (12) становить 1, а параметр грат a в даному випадку відповідає середньому зміщенню молекули води в напрямку осі спіралі). Для оцінки значень коефіцієнта подовжньої дифузії D1 необхідно використати рівняння (9).

Залежність D1 вмісту води в системі, n, (або від ВВ) якісно схожа на залежність для загального випадку дифузії (рис.4б), однак, значення коефіцієнта подовжньої дифузії перевищують значення коефіцієнта дифузії уздовж фрактальної поверхні. Це відбувається внаслідок того, що сумарна дифузія містить дифузійні процеси по поверхні в усіх напрямках (у тому числі й повільну поперечну дифузію), отже, сумарний процес йде повільніше ніж процес подовжньої дифузії.

Наші значення D1 узгоджуються з експериментальними даними у відповідних інтервалах, що видно з рис.4б. Очевидно, що при збільшенні вмісту води в системі ДНК-вода значення коефіцієнта дифузії повинні поступово збільшуватися, наближаючись до значення коефіцієнта дифузії для розчинів ДНК. Це підтверджується виглядом третьої гілки залежності D (або D 1) від ВВ, де буде спостерігатися наприкінці вихід залежності D (або D 1) до насичення (рис.4а,б).

У розділі 5 наведено результати дослідження опромінених зразків тимусної NaДНК в залежності від дози опромінення (експозиційні дози дорівнюють 270кР, 540кР, 1080кР і 2484кР) та ступеня їх зволоження (0, 32, 56, 65, 81 і 90% ВВ). Аналіз стану ДНК проводився методами гель-електрофорезу і денситометрії, які дозволяють одержати інформацію про розподіл фрагментів деградованої ДНК за молекулярними масами (довжинами фрагментів).

У випадку опромінення зразків з мінімальною дозою (270кР) спостерігається протяжна зона міграції фрагментів ДНК для усіх значень ВВ (0, 32, 56, 65, 81 і 90%). Також спостерігаються чітко визначені смуги, розташовані в області смуги контрольної ДНК. Розподіл молекулярних мас в усіх опромінених ДНК практично однаковий. При збільшенні експозиційної дози опромінення зразків ДНК спостерігається збільшення кількості низько- та високомолекулярних фрагментів ДНК (і зменшення вмісту фрагментів первісної довжини). При цьому для зразків з ВВ 56% та 65% протяжність зони міграції найменша порівняно з іншими. Це свідчить про відносно більшу радіаційну стійкість даних зразків.

У зразку ДНК, опроміненої з експозиційною дозою 270кР при 0% ВВ, присутні фракції ДНК в інтервалі довжин 2322-23131 пар основ. При збільшенні дози опромінення на електрофореграмах зразків ДНК збільшується протяжність зони міграції цих ДНК, спостерігається тенденція до зміщення позиції смуги максимальних молекулярних мас у бік їх зменшення та побільшення. При цьому інтенсивність смуги, яка відповідає максимальному вмісту фрагментів в контрольній ДНК, зменшується і практично зникає. Максимальний вміст фрагментів ДНК з найбільшими і найменшими молекулярними масами спостерігається в зразку, який був опромінений з експозиційною дозою 2484кР. Аналізуючи результати наших експериментів та даних, що були отримані іншими дослідниками, можна зробити такий висновок: у процесі опромінення вологих зразків ДНК вода в системі, що досліджується, певно, відіграє подвійну роль. Спочатку при невеликому вмісті води у зразку (до 66-76% ВВ) молекули зв'язаної води по відношенню до ДНК виступають як стабілізуючі агенти. При подальшому зволоженні зразка, коли збільшується кількість молекул води, що слабо зв'язані з ДНК, водне оточення сприяє деструкції ДНК, збільшуючи її чутливість до дії радіації.

Висновки

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Анотація

Вірник К.М. Енергетичні і динамічні характеристики системи ДНК-вода. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський державний університет, м. Харків, 1999.

Проведено експериментальні і теоретичні дослідження енергетичних і динамічних характеристик систем нуклеїнова кислота-вода з різним нуклеотидним складом. Знайдено лінійну взаємозалежність між енергією дегідратації нуклеїнової кислоти та її AT/GC складом. Запропоновано гратчасту модель дифузії зв’язаної води вздовж поверхні молекули ДНК з урахуванням її фрактальних особливостей. На основі цієї моделі було отримано оціночні значення коефіцієнтів дифузії води в гідратному оточенні ДНК. Розраховано значення фрактальної розмірності ДНК у різних конформаційних станах. При дослідженні властивостей системи ДНК-вода в умовах дії -радіації знайдено, що в процесі опромінення водне оточення молекули ДНК у залежності від рівня вмісту води може виступати як стабілізатором структури ДНК, так і підсилювачем деструктивної дії радіації.

Ключові слова: нуклеїнові кислоти, ДНК, гідратація, енергетика, динамічні властивості, дифузія, фрактальна розмірність, -радіація.

Аннотация

Вирник К. М. Энергетические и динамические характеристики системы ДНК-вода.– Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский государственный университет, г.Харьков, 1999.

Проведены экспериментальные и теоретические исследования энергетических и динамических характеристик систем нуклеиновая кислота-вода с различным нуклеотидным составом. Обнаружена линейная взаимосвязь между энергией дегидратации нуклеиновой кислоты и ее AT/GC составом. Предложена решеточная модель диффузии связанной воды вдоль поверхности молекулы ДНК с учетом ее фрактальных особенностей. На основе данной модели были получены оценочные значения коэффициентов диффузии воды в гидратном окружении ДНК. Рассчитаны значения фрактальной размерности ДНК в различных конформационных состояниях. При исследовании свойств системы ДНК-вода в условиях действия -радиации обнаружено, что в процессе облучения водное окружение молекулы ДНК в зависимости от уровня содержания воды может выступать как в качестве стабилизатора структуры ДНК, так и усилителя деструктивного действия радиации.

Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, ДНК, гидратация, энергетика, динамические свойства, диффузия, фрактальная размерность, -радиация.

SUMMARY

Virnik K.M. Energetic and dynamic characteristics of DNA-water system. – Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 – biophysics. – Kharkov State University, Kharkov, 1999.

Nucleic acid functioning occurs due to their conformational mobility that can be influenced by numerous factors. One of the most important factors determining the secondary structure and properties of a nucleic acid, DNA particularly, is hydration surroundings. Changing water content in a DNA sample can cause reversible transitions of the disorder-order, order-order types. The transitions are closely coordinated with a rearrangement of