УКРАЇНСЬКА АКАДЕМIЯ АГРАРНИХ НАУК

IНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ I ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

БАСОВСЬКИЙ Дмитро Миколайович

УДК 638.2:591.391/.398:578.083

Вплив мікрохірургічних маніпуляцій на цитогенетичні особливості запліднення та доімплантаційного розвитку in vitro у великої рогатої худоби

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

c. Чубинське, Київської областi

2000

Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана в лабораторії клітинної інженерії Iнституту розведення i генетики тварин Української академiї аграрних наук.

Науковий керiвник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кузнєцов Валерій Євгенович, Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське Київської обл., заступник директора з наукової роботи

Офiцiйнi опоненти:

aоктор біологичних наук, професор Коновалов В’ячеслав Сергійович, Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське Київської обл., головний науковий співробітник лабораторії генетичних основ селекції

кандидат біологичних наук Бердичевський Микола Степанович, Іннститут землеробства і біології тварин УААН, м. Львов, завідувач лабораторії генетики, розведення і селекції великої рогатої худоби

Провiдна установа:

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка Кабінету міністрів України, м.Київ, кафедра загальної та молекулярної генетики

Захист дисертацiї вiдбудеться " 1 " червня 2000 року. о 10 годинi на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д 27.355.01 Iнституту розведення i генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська область, Бориспiльський р-н, c. Чубинське, вул. Погребняка, 1. З дисертацiєю можна ознайомитися у бiблiотецi Iнституту розведення i генетики тварин УААН.

Автореферат розiсланий " 27 " квітня 2000 року.

Вчений секретар спецiалiзованої вченої

ради, кандидат сiльськогосподарських

наук Мiльченко Ю.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед методів, що використовуються у репродуктивній біотехнології ссавців, центральне місце займає запліднення in vitro (IVF in vitro fertilization). У відтворенні великої рогатої худоби при застосуванні даного методу, використовуючи прижиттєве вилучення ооцитів, можна одержувати значно більшу кількість ембріонів від корови-донора, ніж при використанні класичних методів індукції суперовуляції і ембріотрансплантації (multiple ovulation and embryo transfer MOET) (Kruip T.A.M., Boni R., 1994; Smorag Z. e.a., 1998; Кузнецов В.Е. и др., 1998). Однак не завжди IVF є ефективним. Так, у деякіх випадках неплідності обумовленої чоловічім фактором, IVF не дає бажаного результату (Iritani A., 1991; Tarin J..J., 1995). У тих випадках, коли за допомогою IVF неможливо досягти запліднення яйцеклітин, або з метою підвищення ефективності даної технології використовують мікрозапліднення.

Аналіз літературних джерел свідчить, що вплив мікрохірургичних методів на запліднення in vitro ооцитів (Goto K. е.а., 1991; Зубец М.В. и др., 1993; Kuznetsov V.E., Yelizarova I.B., 1994; Pavasuthipaisit K. e.a., 1994; Rho G. e.a., 1998) та доімплантаційний розвиток як цілих ембріонів, так і половинок (Schmidt M. е.а., 1990,1992; Мадіч А.В. та ін., 1997), четвертинок (Rho G. e.a., 1998) та ізольованих бластомерів (Loskutoff N.M. e.a., 1992,1993) зародків недостатньо досліджено у великої рогатої худоби. В літературі немає даних щодо доімплантаційного розвитку ембріонів великої рогатої худоби, одержаних за допомогою мікрозапліднення in vitro шляхом порушення цілісності прозорої оболонки, до стадії бластоцисти. Дуже мало повідомлень про вплив мікрохірургічного поділу зародків великої рогатої худоби, одержаних in vitro, на розвиток поза організмом половинок, четвертинок та ізольованих бластомерів ембріонів (Peura T., 1991; Loskutoff N.M. e.a., 1992,1993; Tominada K. e.a., 1996; Riedi J. e.a., 1996; Skrzyszowska M. е.а., 1997; Rho G. e.a., 1998), і ці питання залишаються майже не вивченими.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Інституту розведення і генетики тварин УААН по завданнях: “Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження високоцінних сільськогосподарських тварин” 1991-1995 рр. (№ держреєстрації UA01001476P); “Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів у селекції сільськогосподарських тварин” 1996-2000 рр. (№ держреєстрації 0196U016325), а також була підтримана грантом міністерства України у справах науки і технологій (№ держреєстрації 0198U002131, 1997-1998 pp.).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було виявлення цитогенетичних особливостей запліднення in vitro ооцитів корів з частково розсіченою прозорою оболонкою та яйцеклітин, позбавлених прозорої оболонки, доімплантаційного розвитку поза організмом ембріонів, одержаних таким шляхом, а також визначення закономірностей раннього ембріонального розвитку поза організмом ізольованих бластомерів, половинок і четвертинок зародків, одержаних in vitro та in vivo.

Згідно з метою досліджень були поставлені наступні завдання:

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Наукова новизна роботи. Продовжувалось вивчення впливу часткового розсічення прозорої оболонки на запліднення in vitro ооцитів корів і доімплантаційний розвиток ембріонів поза організмом. Розроблена методика часткового розсічення прозорої оболонки (PZD _zona dissection) ооцитів корів без використання мікроманіпулятора.

Вперше проведено детальний аналіз цитогенетичних особливостей поліспермного запліднення ооцитів корів та формування пронуклеусів у поліспермних зиготах.

Вперше доведено можливість розвитку ембріонів, одержаних після запліднення in vitro ооцитів корів з частково розсіченою прозорою оболонкою, до стадії бластоцисти та виявлено особливості цього розвитку.

Удосконалено методику культивування ізольованих бластомерів з використанням половинок прозорих оболонок та проведено порівняльний аналіз здатності до розвитку ізольованих бластомерів ембріонів великої рогатої худоби, що одержані in vitro, у різних системах культивування.

Вперше проведений порівняльний аналіз розвитку половинок і четвертинок морул-бластоцист, одержаних in vitro та in vivo.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена методика запліднення in vitro ооцитів корів з частково розсіченою прозорою оболонкою може бути використана на племпідприємствах України при використанні сперми генетично цінних бугаїв, які вибраковуються в зв’язку з низькою концентрацією або зниженою рухливістю сперматозоїдів. Визначення життєздатності половинок і четвертинок ембріонів великої рогатої худоби, одержаних in vitro та in vivo, методом їх культивування поза організмом на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводу корів може бути використано в практиці трансплантації половинок зародків, що значно збільшить кількість телят як від донорів ембріонів у схемах МОЕТ, так і при використанні IVF_зародків.

Особистий внесок здобувача. Участь автора в одержанні наукових результатів, викладених у дисертації, становить близько 87%. Автором особисто проведено аналіз першоджерел літератури; здійснені мікрохірургічні маніпуляції та дослідження по культивуванню in vitro половинок, четвертинок та інтактних ембріонів; експериментальні дослідження документовані мікрофотографіями; виконано статистичний аналіз отриманих даних. Дослідження по отриманню і пересадці половинок і четвертинок ембріонів, одержаних in vivo у схемах МОЕТ, проводились спільно із співробітниками лабораторії трансплантації ембріонів МП “Біосервіс” (м. Харків).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались та обговорювались на Всеукраїнській ювілейній науково-практичній конференції “Генетика продуктивності тварин” (Київ, 1994), на міжнародній науково-практичній конференції “Теория и практика племенного дела в животноводстве” (Харків, 1996), на ювілейній міжнародній конференції “Проблеми індивідуального розвитку сільськогосподарських тварин” (Київ, 1997), на міжнародній науково-практичній конференції “Конкурентноспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь” (Жодіно, 1998), на ІІ (Одеса, 1998) та ІІІ (Одеса, 1999) міжнародних конференціях “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях”, на міжнародній науково-виробничій конференції “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи консолідації новостворених порід і типів сільськогосподарських тварин” (Київ, 1999).

Публікації. Результати досліджень опубліковано в 3 статтях у наукових журналах, 4 збірниках наукових праць та в 3 матеріалах і тезах конференцій. Всього 11 друкованих праць, в тому числі у фахових виданнях опубліковано 8 друкованих робіт.

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 159 сторінках і містить 32 ілюстрації і 11 таблиць. Дисертація складається з вступу, 3 розділів, висновків та практичних пропозицій, списку літератури, який включає 278 джерел, в тому числі 229 іноземних.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ооцити корів і телиць одержували з яєчників забитих тварин та культивували in vitro на протязі 22-24 годин при 38,5oС. Дозрілі in vitro ооцити співкультивували з заморожено-відтанутими капацитованими поза організмом сперматозоїдами бугая у модифікованому середовищі Тироде Fert_Talp на протязі 18 годин. Сперматозоїди попередньо обробляли за модифікованою методикою (swimПаріша (Parrish J.J. e.a., 1986). Капацитацію сперматозоїдів викликали за допомогою гепарину (1,8 Од/мл) та інкубації в середовищі TALP, яке не містило іонів Са2+.

Дозрілі in vitro ооцити корів звільняли від клітин кумулюсу за допомогою обробки 0,02-0,04%-ним розчином гіалуронідази та піпетування, після чого скляною мікроголкою (без використання мікроманіпулятора) у 0,5 М розчину сахарози частково розсікали zona pellucida. В інших дослідах денудовані ооцити звільняли від zona pellucida перетравленням у 0,1%-ному розчині пронази. Ооцити з частково розсіченою (PZD-ооцити) та повністю перетравленою прозорою оболонкою (ZF-ооцити від англ. zona free oocytes) співкультивували з заморожено-відтанутими капацитованими in vitro сперматозоїдами бугая як описано вище для інтактних яйцеклітин.

Мікрохірургічний поділ морул і бластоцист на половинки і четвертинки здійснювали скляною мікроголкою без допомоги мікроманіпулятора. Ізольовані бластомери 4__клітинних зародків одержували шляхом лізису zona pellucida 0,1%-ним розчином пронази та наступним піпетуванням клітин у середовищі, що не містило іонів Са2+. Ембріони, половинки та четвертинки зародків, ізольовані бластомери 4__клітинних ембріонів великої рогатої худоби культивували у модифікованому середовищі 199 на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів (ЕКЯК) або у модифікованому середовищі 199 кондиційованому на моношарі ЕКЯК.

Яйцеклітини та ембріони фіксували за модифікованим нами методом Тарковського (Tarkowski A.K., 1966). Цитогенетичний аналіз сухоповітряних препаратів, пофарбованих 2%-ним розчином барвника Гімза, проводили під світловим мікроскопом МБД-15. Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критеріїв Ст'юдента та 2 (Рокицкий П.Ф., 1967). Матеріал документували мікрофотографіями.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Цитогенетичні особливості впливу порушення цілісності прозорої оболонки на частоту активації до партеногенезу, запліднення ооцитів корів in vitro та подальший доімплантаційний розвиток ембріонів поза організмом

Розробка і використання нових мікрохірургічних методів при заплідненні in vitro відкриває додаткові можливості для одержання зародків. Нами досліджувався вплив часткового розсічення та повного ензиматичного перетравлення прозорої оболонки ооцитів корів на частоту активації до партеногенезу та рівень моноспермного і поліспермного запліднення ооцитів корів in vitro і подальший розвиток зародків поза організмом.

Нами встановлено, що порушення цілісності прозорої оболонки ооцитів корів шляхом часткового розсічення або повного ензиматичного перетравлення не впливає на частоту активації до партеногенезу порівняно із спонтанним партеногенезом інтактних ооцитів (6,7%,7/104 і 6,9%, 7/102 проти 6,3%, 7/110 відповідно, P > ,05). Серед активованих ооцитів в усіх групах досліду найчисельнішою була група яйцеклітин з одним пронуклеусом (4,5% для інтактних, 2,9% для PZD- і 4,9% для ZF-ооцитів). Також в наших дослідах зустрічалися активовані яйцеклітини, що містили два пронуклеуси, які утворювалися, скоріше за все, внаслідок блокади екваційного ділення і формування другого полярного тільця після активації (0,9% для інтактних, 1,9% для PZD- і 1,0% для ZF-ооцитів). Крім того, у невеликої кількості активованих до партеногенезу ооцитів ми спостерігали дроблення до 2-4-клітинної стадії після 24_годинного культивування на моношарі ЕКЯК (0,9% для інтактних, 1,9% для PZD- і 1,0% для ZF-ооцитів)

Дослідження показали, що часткове розсічення прозорої оболонки ооцитів не сприяє збільшенню рівня запліднення та дроблення яйцеклеток (P>0,05) при використанні сперматозоїдів в концентрації 1,55106/мл (Табл. 1). При використанні меншої концентрації

Таблиця 1

Вплив концентрації сперматозоїдів на запліднення та дроблення in vitro інтактних та з частково розсіченою прозорою оболонкою ооцитів корів

Групи | Концентрація | Кількість | Кількість, n (%) | Частота | Частота

досліду | спермато-зоїдів, млн/мл, Mm | осіменених ооцитів | зигот з 2

пронук-леусами | зигот з 3-4 пронук-леусами | дроблення, n (%) | запліднення,

n (%) *

PZD-ооцити |

1,550,15a | 107 | 21d(19,6) | 5g (4,7) | 50h(46,7) | 76l (71,0)

Інтактні

ооцити |

112 | 11e (9,8) | 2g (1,8) | 55h (49,1) | 68l (60,7)

PZD-ооцити |

0,540,01b | 112 | 14de(12,5) | 1g (0,9) | 36i (32,1) | 51m(45,5)

Інтактні

ооцити |

109 | 8e (7,3) | 1g (0,9) | 28i (25,7) | 37mn(33,9)

PZD-ооцити |

0,180,015c | 100 | 10de(10,0) | 1g (1,0) | 18j (18,0) | 29n (29,0)

Інтактні

ооцити |

113 | 4fe (3,5) | 5k (4,4) | 9o (7,9)

* обчислювали як співвідношення кількості зигот з 2 і більше пронуклеусів та ембріонів до кількості осіменених ооцитів; a:b, b:c P ,001 (критерій Ст’юдента); d:f P ,05, d:e, j:k P ,01, l:m, l:n, l:o, n:o P ,001 (критерій 2); в цій та наступних таблицях різні суперскрипти в межах однієї колонки вказують на вірогідну різницю між показниками (Р не більше 0,05).

сперматозоїдів (5,4105/мл) статистично вірогідної різниці за рівнем дроблення між дослідною та контрольною групами також не було виявлено, хоча різниця за рівнем запліднення PZD_ооцитів та інтактних яйцеклітин наближалась до вірогідної. Однак при подальшому зниженні концентрації сперматозоїдів (до 1,8105/мл) частота запліднення і дроблення PZD-ооцитів була вірогідно вище, ніж у контролі. Таким чином, розсічення zona pellucida впливає на рівень запліднення і дроблення яйцеклітин корів у залежності від концентрації сперматозоїдів, при цьому зниження концентрації сперматозоїдів меншою мірою впливає на рівень запліднення і дроблення ооцитів з частково розсіченою zona pellucida порівняно з інтактними яйцеклітинами. За рівнем поліспермного запліднення між усіма групами досліду статистично вірогідної різниці не встановлено.

Таблиця 2

Вплив часткового розсічення прозорої оболонки ооцитів корів на їх запліднюваність in vitro та подальший доімплантаційний розвиток ембріонів поза організмом

Групи | Кількість | Кількість, n (%) | Частота | Частота | Морул | Блас-

досліду | осіменених ооцитів | зигот з 2

пронук-леусами | зигот з 3-

4 пронук-леусами | дроблен-ня, n (%) | заплід-нення,

n (%) | тоцист

Інтактні

ооцити | 114 | 9a (7,9) | 1b (0,9) | 72d (63,1) | 82e (71,9) | 20g

(17,5) | 6i (5,3)

PZD-ооцити | 107 | 11a (10,3) | 3b (2,8) | 75d (70,1) | 89e

(83,2) | 11g (10,3) | 1i (0,9)

В наступних експериментах ми вивчали вплив часткового розсічення та повного ензиматичного перетравлення прозорої оболонки ооцитів корів на подальший доімплантаційний розвиток ембріонів, одержаних з використанням таких ооцитів. Нами встановлено, що часткове розсічення прозорої оболонки ооцитів корів не впливає на частоту дроблення при концентрації сперматозоїдів 2106/мл, хоча і спостерігалась більш висока частота їх запліднення (різниця наближалась до вірогідної) (Табл.2). При подальшому культивуванні на моношарі ЕКЯК спостерігалась тенденція до більш високої життєздатності зародків у групі інтактних ооцитів. Так, через 90 годин культивування після запліднення більша кількість життєздатних зародків (8__клітинні ембріони) спостерігалась в групі інтактних ооцитів, однак вірогідної різниці за цим показником між групами інтактних та PZD_ооцитів не спостерігалось (40,3%, 29/72 проти 30,7%, 23/75 відповідно). Рівень розвитку до стадії морули після 139__годинного культивування був більшим в групі інтактних ооцитів, але вірогідної різниці за цим показником між групами інтактних та PZD_ооцитів також не спостерігалось (22,2%, 16/72 проти 14,7%, 11/75 відповідно). Після 139__годинного культивування бластоцисти виявлялися лише в контрольній групі (Рис.1). Утворення бластоцелю у ембріонів з групи PZD-ооцитів спостерігалося лише після 185 годин культивування, при цьому часткове розсічення прозорої оболонки ооцитів корів не перешкоджало вилупленню одержаних із них бластоцист. Загальний рівень розвитку до стадії морули хоча і був вищим у контрольній групі, але ця різниця не була вірогідною. За рівнем розвитку осіменених ооцитів до стадії бластоцисти статистично значимої різниці між дослідною та контрольною групами також не було

Рис. 1. Одержана in vitro бластоциста, яка вилуплюється з прозорої оболонки. Прижиттєва мікрофотографія (об. 9, ок. 10).

виявлено. Отже, отримані після запліднення PZD_ооцитів зародки великої рогатої худоби були здатні до розвитку in vitro до стадії бластоцисти.

Після осіменення ZF- та інтактних яйцеклітин було встановлено, що навіть при застосуванні концентрації сперматозоїдів, меншої на порядок (2105/мл проти 2106/мл відповідно), частота запліднення була вищою в групі ZF-ооцитів (86,4%, 95/110 проти 78,8%, 160/203, різниця наближалась до вірогідної). При цьому рівень поліспермного запліднення в дослідній групі був значно вищим ніж в контролі (3,6%, 4/110 проти 0,5%, 1/203, P ,05, критерій 2). За рівнем дроблення не було встановлено вірогідної різниці між ZF- та інтактними ооцитами при застосуванні оптимальної для кожного типу ооцитів концентрації сперматозоїдів (2105/мл та 2106/мл відповідно). При подальшому культивуванні ембріонів на моношарі ЕКЯК зародки, одержані з інтактних яйцеклітин, мали більш високу життєздатність ніж ембріони, отримані з ZF-ооцитів. Так, через 90 годин культивування після запліднення значно більша кількість 8__клітинних ембріонів спостерігалась у групі інтактних ооцитів, ніж у групі ZF_ооцитів (54,2%, 77/142 проти 25,9%, 21/81, P<0,001). Рівень розвитку до стадії морули після 139_годинного культивування в групі ZF_ооцитів був значно нижчим, ніж в групі інтактних яйцеклітин (2,5%, 2/81 проти 24,6%, 35/142, P<0,001). Подальшого розвитку ZF_ембріонів не спостерігалось. Таким чином, дозрілі ооцити корів, позбавлені прозорої оболонки, здатні до запліднення in vitro та подальшого розвитку поза організмом, принаймні, до стадії морули.

Цитогенетичний аналіз сухоповітряних препаратів PZD- і ZF-зародків показав наявність морфологічно нормальних ядер у кількості, відповідній стадії розвитку інтактних ембріонів.

Таблиця 3

Вплив порушення цілісності прозорої оболонки ооцитів корів на частоту запліднення та поліспермії

Групи | Кількість | Кількість зигот, n (%) | Частота

досліду | осіменених ооцитів | з 1 пронук- клеусом | з 2 пронук-леусами | з більш ніж 2 пронуклеусами | запліднення,

n (%)

Інтактні

ооцити | 97 | 2a (2,1) | 63b (64,9) | 3e (3,1) | 66g (68,0)

PZD-оцити | 96 | 1a (1,0) | 64b (66,7) | 7e (7,3) | 71g (74,0)

ZF-ооцити | 103 | 1a (1,0) | 22c (21,4) | 69d (67,0) | 91f (88,4)

b:c, e:d P ,001, g:f P ,01 (критерій 2).

Вивчення впливу порушення цілісності zona pellucida на рівень поліспермії (ооцити фіксували через 18 годин після осіменення) показало, що відсоток моно- та поліспермного запліднення і частота появи зигот з одним пронуклеусом, а також рівень запліднення значно не відрізнялись у контрольній групі та групі ооцитів з частково розсіченою прозорою оболонкою (Табл.3). Однак для ZF_ооцитів рівень поліспермії та загальна частота запліднення, на відміну від інших показників, були значно вищими ніж в контрольній групі чи в групі PZD-ооцитів. Отримані дані вказують на те, що блок поліспермії у великої рогатої худоби головним чином здійснюється на рівні прозорої оболонки, однак на рівні плазматичної мембрани у цих тварин також існує незначний блок поліспермії, що доводиться наявністю моноспермного запліднення при застосуванні більш низької концентрації сперматозоїдів (2105/мл).

Нами було проаналізовано співвідношення розбухлих головок сперматозоїдів, ранніх та пізніх пронуклеусів у поліспермних зиготах, одержаних після спільної 18_годинної інкубації сперматозоїдів у концентрації 2106/мл з інтактними, PZD_та ZF_ооцитами корів (Табл.4). Дослідження показали, що в поліспермних зиготах, одержаних після запліднення інтактних ооцитів, спостерігається максимальна частота формування пізніх чоловічих пронуклеусів, значно більша, ніж в інших групах досліду. Мінімальна частота формування пізніх чоловічих пронуклеусів спостерігалася в групі ZF_ооцитів. З іншого боку, середня кількість пізніх чоловічих пронуклеусів у одній поліспермній зиготі була максимальною в групі ооцитів, позбавлених прозорої оболонки. Ранні

Таблиця 4

Особливості формування чоловічих пронуклеусів у поліспермних зиготах, одержаних після запліднення інтактних, ZF- та PZD-ооцитів корів

Групи

досліду | Всього

дослід- | Кількість чоловічих пронуклеусів та деконденсованих головок сперматозоїдів

жено

полі- | n | у одній зиготі, | Головок сперматозоїдів | Ранніх пронуклеусів | Пізніх пронуклеусів

сперм-них зигот | Mm | n

(%) | у одній зиготі,

Mm | n

(%) | у одній зиготі,

Mm | n

(%) | у одній зиготі,

Mm

Інтактні

ооцити | 17 | 36 | 2,120,08a | 2c

(5,6) | 2,000,00f | 34i

(94,4) | 2,000,09lm

PZD-ооцити | 17 | 44 | 2,590,31a | 11de

(25,0) | 2,750,73gf | 33j

(75,0) | 1,940,14m

ZF-

ооцити | 69 | 426 | 6,300,45b | 170e

(39,9) | 4,470,18h | 175

(41,1) | 4,070,18 | 81k

(19,0) | 2,310,03l

d:c, i:j - P ,05, e:c, i:k, j:k - P ,001 (критерій 2).

g:h, l:m - P ,05; b:a, f:h - P ,001 (критерій Ст’юдента).

пронуклеуси спостерігалися тільки в групі ZF_ооцитів. Найбільший відсоток деконденсованих головок сперматозоїдів спостерігався в групі ZF_ооцитів. Середня кількість деконденсованих головок сперматозоїдів у одній поліспермній зиготі була значно більшою в групі ZF_ооцитів, ніж в інших групах досліду. Нами було встановлено, що дозрілі in vitro ооцити корів, звільнені перед заплідненням від прозорої оболонки, здатні деконденсувати в середньому 6,30,45 головок сперматозоїдів. Максимальна кількість пронуклеусів і деконденсованих головок сперматозоїдів, що спостерігалась нами у таких яйцеклітинах дорівнювала 13. З дослідів, проведених на мишах, відомо, що фактор формування чоловічого пронуклеуса утворюється в яйцеклітинах ссавців у обмеженій кількості і зберігається протягом обмеженого часу та швидко витрачається, якщо в ооцит потрапляють декілька сперматозоїдів (Witkowska A., 1981; Дыбан А.П., 1988). Подібне явище також спостерігалось нами в ооцитах корів при поліспермному заплідненні в поліпронуклеарних зиготах, одержаних після запліднення ZF_ооцитів. Фактора формування чоловічого пронуклеуса вистачало, в середньому, на утворення 2,310,03 пізніх пронуклеусів, а максимальна кількість пізніх пронуклеусів дорівнювала 5. В результаті недостатньої кількості в яйцеклітинах фактора формування чоловічого пронуклеуса у великої кількісті деконденсованих головок сперматозоїдів не утворювались повноцінні пізні пронуклеуси і вони зупинялися на стадії раннього пронуклеуса або формування пронуклеусів неспостерігалось.

Таким чином, кількість фактора деконденсації хроматину головки сперматозоїда в поліспермних зиготах великої рогатої худоби є достатньою для деконденсації, в середньому, 6,3 головок сперматозоїдів, що значно менше, ніж для інших видів ссавців. Формування повноцінних пізніх пронуклеусів із деконденсованих головок сперматозоїдів в поліспермних зиготах у більшості випадків порушено.

Одержання ембріональних клонів методом мікрохірургічного поділу зародків великої рогатої худоби

Вплив бісекції зародків, одержаних in vivo, на подальший розвиток напівембріонів був описаний рядом дослідників (Schmidt M. е.a., 1990, 1992; Loskutoff N.M. e.a., 1993; Мадіч А.В. та ін., 1997). У наших дослідженнях проводилось вивчення розвитку in vitro частин морул_бластоцист великої рогатої худоби, одержаних поза організмом (IVF_половинок та IVF_четвертинок), у порівнянні з половинками та четвертинками морул-бластоцист, одержаних in vivo, та проведено порівняльний аналіз розвитку in vitro половинок морул та половинок бластоцист, отриманих поза організмом. Як показали результати експериментів, половинки та четвертинки ембріонів, отриманих in vivo, починали компактизуватись раніше, ніж частини ембріонів, одержаних in vitro; третина напів_ембріонів, отриманих in vivo, округлялась вже через 30 секунд культивування (Рис.2), і вже через 30 хвилин частота компактизації цих частин зародків досягала свого максимуму (Рис.3а). Через 24 години культивування найменша частота округлення спостерігалася для IVF_четвертинок (66,7%, 20/30), причому цей показник у даній групі був вірогідно нижчим (P<0,05) порівняно з половинками зародків, одержаних in vivo (91,7%, 22/24). Різниця за цим показником між IVF_половинками (77,8%, 49/60) та IVF_четвертинками наближалась до вірогідної. Однак між іншими групами досліду вірогідної різниці за даним показником не було. Хоча процес компактизації у більшості випадків відбувався подібним чином у різних групах досліду, за здатністю до формування бластоцист між усіма дослідними групами спостерігалась відмінність. Так, у більшості половинок ембріонів, отриманих in vivo, формування бластоцелю спостерігалось вже через 2-3 години культивування, що свідчить про їх високу життєздатність. Однак

Рис. 2. Половинки пізньої морули великої рогатої худоби, одержаної in vivo. Прижиттєва мікрофотографія (об. 9, ок. 10).

лише половина четвертинок зародків, отриманих in vivo, менш ніж 25% половинок і лише 3,3% четвертинок IVF_ембріонів формували бластоцель через 10 годин культивування (Рис.3b). При подальшому культивуванні половинки зародків, отриманих in vivo, зберігали свою найкращу життєздатність і формували бластоцель вірогідно частіше порівняно з IVF_половинками і четвертинками будь-якого походження (87,5%, 21/24; 38,3%, 23/60; 50,0%, 5/10 і 16,7%, 5/30, P<0,05).

При порівнянні розвитку поза організмом половинок морул та бластоцист, одержаних in vitro, було встановлено, що половинки IVF-бластоцист починали округлятися раніше, вже через 30 хвилин культивування, а максимальний рівень їх компактизації спостерігався через 2 години культивування, тоді як максимальний рівень округлення половинок IVF_морул досягався тільки через 24 години культивування (Рис.3c). Однак після 24-годинного культивування кількість компактизованих напівембріонів, що походили від морул та бластоцист, одержаних in vitro, значно не відрізнялась між цими групами (74,5%, 35/44 та 87,5%, 14/16 відповідно) і порівняно з половинками бластоцист, одержаних in vivo (88,9%, 16/18). Поряд з цим, нами було показано, що половинки бластоцист та морул, одержаних in vitro, мають різні потенції до розвитку поза організмом. Так, за здатністю до формування бластоцелю через 24 години культивування половинки пізніх морул значно відрізнялись від половинок бластоцист (27,7%, 13/44 проти 62,5%, 10/16, P<0,05) (Рис.3d). Цікавим є те, що при порівнянні половинок ivf_бластоцист з половинками 7_денних бластоцист, одержаних in vivo (88,9%, 16/18), не спостерігалося вірогідної різниці за здатністю до формування бластоцелю через 24 години культивування. Цитогенетичні дослідження сухоповітряних препаратів показали наявність у половинок та четвертинок усіх дослідних груп відповідної кількості морфологічно нормальних непікнотичних ядер. Отже, рівень формування бластоцелю у половинок та четвертинок у значній мірі залежить від походження частин зародків (in vivo або in vitro), кількості в них клітин порівняно з інтактним

a | b

c |

d

Рис. 3. а) Здатність до компактизації половинок та четвертинок зародків, одержаних in vivo та in vitro. b) Здатність половинок та четвертинок зародків, одержаних in vivo та in vitro, до формування бластоцелю. c) Здатність до компактизації половинок морул та бластоцист, одержаних in vitro та in vіvo. d) Здатність половинок морул та бластоцист, одержаних in vitro та in vіvo, до формування бластоцелю.

ембріоном та стадії розвитку, на якій проводиться бісекція.

В інших дослідженнях нами проводилось вивчення потенції ізольованих бластомерів 4__клітинних ембріонів великої рогатої худоби до розвитку in vitro у різних системах культивування: у порожніх сурогатних zonae pellucidae (група І), на половинках zonaе pellucidaе (група ІІ) або без zona pellucida (група ІІІ); ізольовані бластомери усіх трьох груп культивували на моношарі ЕКЯК. Ізольовані бластомери без zona pellucida культивували також в середовищі, кондиційованому на моношарі ЕКЯК (група ІV). В наших експериментах не спостерігалося статистично вірогідної різниці між числом контрольних ембріонів, що розвивалися до 16__клітинної стадії, і кількістю ізольованих бластомерів І-ІІІ групи, що роздробилися до 2__клітинної стадії (31,3%, 62/198; 31,9%, 43/135; 33,3%, 38/114 і 35,0%, 36/103 відповідно). У даному випадку загальна кількість ділень контрольних та дослідних ембріонів була подібною 1_ділення. В окремих випадках у І дослідній групі спостерігали розвиток ізольованих бластомерів до стадії компактизованої морули, але компактизація починалася вже на 10-клітинній стадії. Подальшого розвитку зародків, одержаних з ізольованих бластомерів, не спостерігалось. У групі IV не відбувалось розвитку бластомерів внаслідок прилипання ізольованих бластомерів до дна культурального посуду. Цитогенетичний аналіз сухоповітряних препаратів зародків продемонстрував наявність морфологічно нормальних непікнотичних ядер у кількості, відповідної стадії розвитку ембріонів. Таким чином, ізольовані бластомери 4-8-клітинних зародків, отриманих поза організмом, здатні до наступного розвитку (дроблення) в умовах in vitro.

ВИСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1.

1.

1.

1.

Список основних праць, опублікованих за темою дисертації:

1.

1.

1.

1.

1.

Басовський Д.М. Вплив мікрохірургічних маніпуляцій на цитогенетичні особливості запліднення та доімплантаційного розвитку in vitro у великої рогатої худоби. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 генетика. Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське, Київськая обл., 2000.

Досліджено вплив порушення цілісності прозорої оболонки ооцитів корів шляхом часткового розсічення або повного ферментативного видалення на активацію до партеногенезу, моно- та поліспермне запліднення яйцеклітин і доімплантаційний розвиток зародків поза організмом. Вивчено морфологичні і цитогенетичні особливості формування пронуклеусів у поліспермних зиготах великої рогатої худоби. Розроблено методику часткового розсічення прозорої оболонки ооцитів корів, яка не потребує використання мікроманіпулятора. Проведено порівняльний аналіз розвитку поза організмом половинок і четвертинок морул і бластоцист, одержаних in vitro та in vivo. Досліджено здатність до розвитку in vitro ізольованих бластомерів 4-8-клітинних зародків, отриманих поза організмом.

Ключові слова: запліднення in vitro (IVF), часткове розсічення zona pellucida (PZD), ооцити без zona pellucida, цитогенетичний аналіз, напівембріони, четверть-ембріони, ізольовані бластомери, велика рогата худоба.

Басовский Д.Н. Влияние микрохирургических манипуляций на цитогенетические особенности оплодотворения и доимлантационного развития in vitro у крупного рогатого скота. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 генетика. Институт разведения и генетики животных УААН, с.Чубинское, Киевская обл., 2000.

Исследовано влияние нарушения целостности прозрачной оболочки ооцитов коров путем ее частичного рассечения или полного ферментативного удаления на активацию к партеногенезу, моно- и полиспермное оплодотворение яйцеклеток и доимплантационное развитие зародышей вне организма. Изучены морфологические и цитогенетические особенности формирования пронуклеусов в полиспермных зиготах крупного рогатого скота. Разработана методика частичного рассечения прозрачной оболочки ооцитов коров без использования микроманипуляторов. Проведен сравнительный анализ развития вне организма половинок и четвертинок морул и бластоцист, полученных in vitro и in vivo. Исследована способность к развитию in vitro изолированных бластомеров 4-8-клеточных зародышей, полученных вне организма.

Ключевые слова: оплодотворение in vitro (IVF), частичное рассечение zona pellucida (PZD), ооциты без zona pellucida, цитогенетический анализ, полуэмбрионы, четверть-эмбрионы, изолированные бластомеры.

Basovsky D.N. Influence of microsurgical manipulations on in vitro fertilization and preimplantation development in cattle (cytogenetic research). Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree of biological sciences on a speciality 03.00.15 genetics. Institute of animal breeding and genetics UAAS, v. Chubinsoye, Kiev Region, 2000.

Influence of partial zona dissection (PZD) or enzymatic zona removal (EZR) on activation to parthenogenetic development and mono- or polyspermic fertilization of cow oocytes and preimplantation development of bovine embryos had been studied. It had been determined, that PZD and EZR hadn’t increased the rate of cow oocyte parthenogenetic activation in comparison with zona-intact oocytes. Influence of PZD on the rate of cow oocyte fertilization and following cleavage depended on concentration of spermatozoa. There was no significant difference in the fertilization and cleavage rate in oocytes with partial zona dissection (PZD-oocytes) and zona-intact oocytes after their insemination with 1,55106 or 0,54106 spermatozoa/ml However, after decrease of sperm concentration (to 1,8105 spermatozoa /ml) fertilization and cleavage rate were significantly higher for PZD-oocytes in comparison with zona-intact oocytes. Morphological and cytogenetic analysis of preimplantation in vitro development had demonstrated the existence of some differences in developmental pattern of embryos obtained after in vitro fertilization of PZD- oocytes, zona-free oocytes and zona-intact oocytes. It had been also observed the developmental abnomalities of zona-free embryos cultured in vitro. Nevertheless, it had been shown that embryos derived from PZD- and zona-free cow oocytescould in vitro develop at least blastocyst or morula stage, respectively. EZR significantly increased the rate of polyspermic fertilization of bovine oocytes. PZD hadn’t significantly increased the rate of polyspermic penetration of cow oocytes. The main block of a polyspermic penetration of bovine oocytes exists the level of zona pellucida (ZP). Cow oocytes have also another (less essential) block of polysperm penetration on the level of oolemma. Normal monospermic fertilization of zona-free oocytes after their insemination with sperm suspension with low and higher concentration of spermatozoa/ml (2105 and 2106, respectively) had proved the existance of such another block of polyspermy. It had been established that quantity of the sperm nucleus decondensing factor (SNDF) in polyspermic cow zygotes is enough for decondensation of chromatin about 6,3 sperm nucleus. The formation of normal late pronucleus from decondensing sperm heads was often disordered in polyspermic zygotes owing to insufficient quantity of male pronuclear growth factor (MPGF).

It had been studied the in vitro developmental ability of halves and quarters of bovine morulae and blastocysts obtained in vitro and in vivo.

Obtained data indicated that development of halves and