Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича

МІХЄЄВ АНДРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 616.461.234-008.6-053-06:547-481.2-092.9

БІОХІМІЧНІ АСПЕКТИ ВІКОВОЇ РЕАКТИВНОСТІ НИРОК ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ ОКСАЛАТНІЙ ІНТОКСИКАЦІЇ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Чернівці - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Науково-дослідному інституті медико-екологічних проблем Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук Горбань Євген Миколайович, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії радіобіології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Мещишен Іван Федорович, Буковинська державна медична академія, завідувач кафедри медичної хімії

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН Левицький Анатолій Павлович, Інститут стоматології АМН України, м. Одеса, заступник директора з наукової роботи

Провідна установа:

Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, кафедра біоорганічної, біологічної та фармакологічної хімії, Міністерство освіти та науки України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 15.11.2000 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д76.051.05 при Чернівецькому національному університеті імені Ю.Федьковича за адресою:

58012, м. Чернівці, вул. Коцюбинського, 2.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Чернівецького національного університету імені Ю.Федьковича за адресою:

58012, м. Чернівці, вул. Л.Українки, 23

Автореферат розісланий 13.10.2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гіпероксалурія є однією з причин виникнення сечокам'яної хвороби, на яку хворіють 10 % людей (Нейко Е.М. и соавт., 1991; Ярошевская О.И. и соавт., 1990; Verkoelen C.F. et al., 1996; Wasserstein A.G., 1998). В основі уролітіазу лежать біохімічні порушення оксалатного метаболізму. При гіпероксалурії І типу має місце недостатність печінкового ферменту аланінгліоксилатамінотрансферази [КФ 2.6.1.44], що призводить до гіперпродукції оксалату і пошкодження нирок внаслідок мінералізації останнього і порушення уродинаміки (Dallaporta B. et al., 1996). ІІ тип гіпероксалурії є наслідком дефекту метаболізму серину, який є одним з попередників оксалату в організмі (Игнатова Н.С. и соавт., 1994). Помірна гіпероксалурія спостерігається у 8-50 % пацієнтів з уролітіазом (Sutton R. et al., 1994).

До інших типів належать гіпероксалурії обумовлені надходження оксалатів з їжею (Даниленко В.С. и соавт., 1986; Смоляр В.И., 1991; Schilinger F. et al., 1990; Weiss G.H. et al., 1992), внаслідок отруєнь чи внаслідок прийому великої кількості попередників щавлевої кислоти (Wharton R. et al., 1990). До останніх належать аскорбінова кислота (Auer B.L. et al., 1998), пірідоксилат (Dandon M. et al., 1987) та етиленгліколь (Lux E.A., 1990).

Роль порушення обміну щавлевої кислоти у генезі нефропатій визначається її здатністю утворювати нерозчинні солі з кальцієм (Heaney S.B. et al., 1988). Навіть транзиторна і незначна гіпероксалурія значно посилює утворення кристалів, а виділення з сечею їх великої кількості здатне суттєво пошкоджувати нирки (Игнатова Н.С. и соавт., 1994).

Оксалатно-кальцієвий уролітіаз розповсюджений у всіх вікових групах населення. Це захворювання починаючись, в основному, у ранньому віці і призводить до важких ускладнень у дорослих людей (Milliner D.S. et al., 1998). Пошкодження нирок при цьому ускладнюється розвитком хронічної ниркової недостатності, а у важких випадках - гострої ниркової недостатності або гломерулонефриту. Останній супроводжується кристалурією, збільшенням екскреції фосфоліпідів, метаболічним ацидозом, інтерстиційними пошкодженнями і порушенням функції канальцевого відділу нефрона (Юрьева Э.А. и соавт., 1983).

Експериментально доведена токсична дія щавлевої кислоти та її сполук на живі організми. Вважається, що рсновні патогенетичні механізми загальної токсичності обумовлені змінами процесів ліпопероксидації, активності ферментів анаеробного окиснення вуглеводів, а нефротоксичності - утворення кристалів оксалату кальцію у канальцях, що призводить до їх руйнування внаслідок посилення пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) у ниркових тканинах (Хлус К.Н., 1998; Schladt L. et al., 1998).

При певних успіхах щодо вивчення механізмів загальної токсичності оксалатів, біохімічні аспекти їх впливу на функціональний стан нирок остаточно не з'ясовані. Зокрема, не визначені причини парадоксальної локалізаціі нефротоксичних ефектів оксалатів по довжині нефрону - основним місцем натрій-залежного транспорту оксалатів є проксимальні звивисті канальці, а утворення депозитів та формування каменів відбувається у кінцевих відділах структурно-функціональної одиниці нирок (Yamakawa M. et al., 1991). Залишається нез'ясованим питання щодо ролі змін канальцевих механізмів ацидифікації сечі в утворенні кристалів оксалату кальцію, хоча відомо, що додавання залужуючих препаратів щурам з індукованим оксалатно-кальцієвим нефролітіазом знижує ризик утворення каменів у нирках та сечовивідних шляхах (Gregory J.G. et al., 1985). Відсутні відомості стосовно впливу оксалатів на аеробне енергетичне забезпечення натрій-залежних процесів ацидо- та амоніогенезу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною НДР НДІ медико-екологічних проблем МОЗ України "Встановити вікові особливості водно-сольового обміну та морфо-функціонального стану нирок за умов дії хімічних антропогенних факторів з метою їх впровадження в практику гігієнічного регламентування" (номер держреєстрації 0196U021063).

Мета дослідження. Розробити біохімічно обгрунтовані способи профілактики і корекції оксалатних нефропатій на підставі вивчення вікових особливостей реактивності нирок при оксалатній інтоксикації, сформованій тривалим введенням калію оксалату.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

1. Вивчити вплив тривалого введення калію оксалату на функціо-нальний стан нирок у ювенільних, статевозрілих та старих щурів.

2. Вивчити стан пероксидного окиснення ліпідів, фібринолітичної активності кіркової речовини нирок за субхронічної оксалатної інтоксикації у тварин різного віку.

3. Встановити біохімічні особливості тривалого впливу калію оксалату на енергетичне забезпечення ниркових процесів у тварин різного віку після тривалого введення калію оксалату.

4. Дослідити біохімічні особливості перебігу періоду залишкових реакцій нирок (після відміни оксалатного навантаження) у тварин різного віку.

5. Розробити патонетично обгрунтовані способи нефропротекції при інтоксикації тварин калію оксалатом.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що нефротоксичність калію оксалату має чітку вікову залежність, яка зумовлена особливостями біохімічного забезпечення функції нирок у тварин різного віку. Встановлено, що основним місцем пошкодження ниркових структур калію оксалатом є дистальні відділи нефрона.

Вперше показано, що тривале навантаження організму калію оксалатом дозозалежно пригнічує активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) в нирках статевонезрілих та старих щурів.

У дорослих щурів субхронічна оксалатна інтоксикація характеризується підвищенням активності СДГ за дії мінімальної дози калію оксалату з наступним дозозалежним зменшенням активності цього ферменту в кортикальній тканині нирок.

Вперше з'ясовано, що збільшена секреція іонів калію в дистальних канальцях за оксалатної інтоксикації супроводжується підвищенням інтенсивності ацидо- та амоніогенезу, що значно знижує рН кінцевої сечі.

Вперше доведено, що головним проявом оксалатної нефропатії є порушення канальцево-канальцевого балансу внаслідок біохімічних порушень енергозабезпечення системи дистального транспорту іонів натрію.

Вперше встановлено, що оксалат-індуковані біохімічні порушення діяльності нирок залишкового характеру мають, у залежності від віку, різний ступінь функціональних проявів і потребують спрямованої корекції.

Вперше розроблений спосіб нефропротекції при оксалатній інтоксикації за допомогою виноградної олії, яка запобігає біохімічним зсувам і попереджає мінералізацію оксалатів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційного дослідження є основою для розробки та клінічної апробації способів лікування сечо-кам'яної хвороби оксалатної етіології, для оптимізації біохімічної діагностики оксалатної нефропатії у різних вікових категоріях та для розробки методів профілактики оксалатного уролітіазу з використанням виноградної олії.

Результати дисертації впроваджено у науково-педагогічний процес на кафедрах патологічної фізіології та біохімії Одеського державного медичного університету, кафедрах нормальної фізіології та медичної хімії Буковинської державної медичної академії, в науковий процес в Інституті геронтології АМН України.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел. Здобувач оволодів методами біохімічних та функціональних досліджень, самостійно провів експериментальну частину роботи та обробку фактичного матеріалу з використанням статистичних методів, написав усі розділи дисертації, сформулював висновки та рекомендації, які узгоджені з керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дослідження доповідались на симпозіумі з міжнародною участю "Хірургічні проблеми і екологія" (Чернівці, 1995), на конференції молодих вчених "Фізіологія та патологія перекисного окислення, гемостазу та імуно-генезу" (Полтава, 1995), на конференції "Біомінералогія і медична екологія" (Луцьк, 1995), на другій науково-практичній конференції "Актуальні проблеми експериментальної медицини" (Київ, 1998), на XV з'їзді Українського фізіологічного товариства ім. І.П.Павлова (Донецьк, 1998), на міжнародному симпозіумі "Актуальні питання медичної допомоги населенню" (Чернівці, 2000), на 5-му міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Катовіце, Польща, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 робіт у наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, та отримано 2 патенти на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 145 сторінках машинопису і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, списку використаних літературних джерел та містить 48 таблиць і 39 рисунків. Список літератури включає 270 джерел, з них - 164 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У огляді літератури розкриваються питання вікової сприйнятливості організму до дії ксенобіотиків, охарактеризовано вікові змін функції нирок та токсична дію щавлевої кислоти і її солей, зокрема, на функціональний стан нирок.

Матеріали та методи дослідження. Експерименти проведені на 324 рендомбредних аутбредних самцях білих лабораторних щурів трьох вікових груп: молоді тварини (маса тіла 0,06-0,08 кг, вік 2-3 місяці), статевозрілі щурі (маса тіла 0,15-0,18 кг, вік 5-7 місяців) та старі тварини (маса тіла 0,35-0,45 кг, вік 18-20 місяців).

Гіпероксалурію моделювали тривалим (28 діб) введенням калію оксалату у 3 дозах: 0,5 (1 група), 5,0 (2 група) та 50,0 (3 група) мг/кг маси тіла тварини внутрішньошлунково, один раз на добу.

Функціональний стан нирок оцінювали за умов водного навантаження шляхом внутрішньошлункового введення водогінної води в об'ємі 5% від маси тіла з урахуванням двохгодинного діурезу (Берхин Е.Б. и соавт., 1972). Водне навантаження проводили через кожних 7 діб. На 28 добу проводили декапітацію тварин під легкою ефірною анестезією. Для стабілізації крові використовували безнатрієву форму гепарину. Після тривалого введення калію оксалату (впродовж 4-х тижнів) окремі групи тварин залишали на 2-х тижневий період для вивчення динаміки відновлення функціонального стану нирок.

У сечі та плазмі крові визначали вміст іонів натрію та калію фотометрично (Берхин Е.Б. и соавт., 1972). Концентрацію білка у сечі визначали сульфосаліциловим методом (Михеева А.И. и соавт., 1969), креатиніну - фотометрично за реакцією з пікриновою кислотою (Мерзон А.К. и соавт., 1970). Вміст у сечі титрованих кислот та аміаку досліджували титрометрично (Рябов С.И. и соавт., 1979). Вміст оксалатів у сечі визначали титруванням перманганатом калію у кислому середовищі (Сивориновский Г.А., 1969).

Функціональний стан нирок оцінювали після визначення основних процесів - канальцевої секреції, канальцевої реабсорбції та клубочкової фільтрації (Наточин Ю.В., 1982; Шюк О., 1981; Рябов С.И.,1997).

Оцінку інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів у нирках проводили за вмістом ТБК (2-тіобарбітурова кислота) активних продуктів (малоновий альдегід) (Стальная И.Д. и соавт., 1977) та дієнових кон'югатів (Гаврилов В.Б. и соавт., 1983). Визначали активність ферментів антиоксидантного захисту - каталази [КФ 1.11.1.6] (Королюк М.А. и соавт., 1988), супероксиддисмутази [КФ 1.15.1.1] (Чевари С. и соавт., 1985) і глутатіонпероксидази [КФ 1.11.1.9] (Мещишен І.Ф., 1991).

Стан фібринолітичної активності кортикальної тканини нирок оцінювали за лізисом азофібрину (БіоМарк, Україна) (Кухарчук О.Л., 1996).

Активність сукцинатдегідрогенази [КФ 1.3.99.1] визначали за Торчинським Ю.М. (1959).

Для корекції порушень функціонального стану нирок тваринам у період залишкових змін після відміни оксалатного навантаження внутрішньо-шлунково впродовж 2-х тижнів вводили виноградну олію у кількості 2,0 мл/кг маси тіла тварини.

Статистичну обробку отриманих даних проводили на РС ІВМ 586 за програмами статаналізу "Statgraphics" (США) та "Excel - 5.0" (Microsoft Оffice, США). У таблицях ступінь вірогідності різниць показників вказано тільки для p<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

1. Дослідження впливу калію оксалату на функцію нирок у молодих щурів

Затравка щурів калію оксалатом впродовж 28-ми діб із розрахунку 0,5 мг/кг призводила до гіпероксалурії - концентрація оксалатів у сечі зростала удвічі - з 0,12±0,02 мг/л у контролі до 0,24±0,02 мг/л у досліді (p<0,001; n=30), а їх екскреція перевищувала контрольний рівень на 129 % (p<0,01). Гіпероксалурія супроводжувалася підвищенням концентрації іонів калію у сечі з 5,38±0,58 ммоль/л до 7,81±0,84 ммоль/л відповідно (p<0,05; n=30), що було наслідком активації дистальної секреції цього катіону за пригнічення його реабсорбції, яка знижувалась з 89,86±1,65 до 78,79±4,29 % (p<0,05; n=30). Кліренс безкалієвої води, величина якого характеризує дистальну секрецію іонів калію, зростав з 4,14±0,20 до 4,88±0,25 мл/2 год (p<0,05; n=30).

Нирковий транспорт іонів натрію при оксалатному навантаженні із розрахунку 0,5 мг/кг калію оксалату характеризувався інтенсифікацією їх дистального транспорту - 0,78±0,05 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату у контролі та 0,95±0,07 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату у досліді (p<0,05; n=30). Підвищення навантаження калію оксалатом до 5,0 та 50,0 мг/кг супроводжувалось підсиленням процесів амоніогенезу - екскреція аміаку зростала до 17,61±0,89 (p<0,05) та 19,26±1,04 (p<0,01) при контролі 13,74±1,44 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату (n=30).

Оксалатне навантаження не впливало на інтенсивність процесів ліпопероксидації в кірковій речовині нирок, а зміни тканинного фібринолізу характеризувались підвищенням неензиматичного лізису фібрину.

Гіпероксалурія супроводжувалась пригніченням активності сукцинатдегідрогенази у кортикальній тканині нирок (рис. 1).

Рис. 1. Активність сукцинатдегідрогенази в кірковій речовині нирок ювенільних

щурів після тривалого введення калію оксалату (мкг/год ґ мг білка).

Примітка. Достовірність у порівнянні з контролем відзначено: ** - p<0,01, *** - p<0,001.

Після відміни оксалатного навантаження на 14-й день досліду оксалурія зберігалась у тварин, яких піддавали максимальному навантаженню калію оксалатом (0,52±0,07 мг/2 год у контролі та 1,25±0,19 мг/2 год у досліді, p<0,01; n=30). У тварин, які отримували середнє навантаження, зміни функції нирок полягали у зниженні клубочкової фільтрації (відповідно 614,01±50,88 мкл/хв і 469,44±30,57 мкл/хв, p<0,05; n=30), що призводило до обмеження фільтраційного заряду іонів натрію та зниження проксимальної (відповідно 9,32±0,83 та 6,91±0,40 ммоль/2 год, p<0,05; n=30) і дистальної (відповідно 554,41±28,88 та 440,22±38,59 мкмоль/2 год, p<0,05; n=30) реабсорбції цього катіону.

Впродовж 2 тижнів відміни оксалатного наватаження спостерігалося збільшення екскреції іонів водню за інтенсифікації амоніогенезу (табл. 1).

Таблиця 1

Стан кислотовидільної функції нирок молодих щурів через 2 тижні

після відміни оксалатного навантаження (x ± Sx)

Показники, що вивчались Контроль (n = 15) 1 група (n = 14) 2 група (n = 13) 3 група (n = 14)

Екскреція титрованих кислот, мкмоль/ 100 мкл клубочкового фільтрату 4,04 ± 0,70 6,14 ± 1,38 4,82 ± 0,89 5,46 ± 0,54

Екскреція аміаку, мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату 13,74 ± 1,44 19,27 ± 0,87 p <0,01 19,98 ± 1,54 p <0,05 15,08 ± 0,92

Екскреція іонів водню, нмоль/ 100 мкл клубочкового фільтрату 0,52 ± 0,15 0,77 ± 0,26 1,21 ± 0,12 p <0,05 0,99 ± 0,07 p <0,05

Примітка: p - ступінь вірогідності відмінностей при порівнянні з контролем

n - кількість спостережень

Активність сукцинатдегідрогенази в кортикальній тканині нирок знижувалась з 25,72±1,09 мкг/год ґ мг білка (контроль) до 15,47±1,42 (1 група, p<0,001), 17,59±1,17 (2 група, p<0,001) та 17,71±0,30 мкг/год ґ мг білка (3 група, p<0,001).

2. Дослідження впливу калію оксалату на функцію нирок у дорослих щурів

Тривале навантаження калію оксалатом статевозрілих тварин викликало значну дозозалежну гіпероксалурію (рис. 2), яка супроводжувалась протеїнурією у всіх тварин (0,29±0,02 мг/2 год у контролі та 0,34±0,01, 0,36±0,02 і 0,38±0,02 мг/2 год у 1-й, 2-й та 3-й групах відповідно; p<0,05 для 1-ої та 2-ої груп, p<0,01 для третьої). Зауважимо, що у статевозрілих щурів оксалатна інтоксикація змін швидкості клубочкової фільтрації не викликала.

Гіпероксалурія супроводжувалась підвищенням дистальної секреції іонів калію за зниження їх реабсорбції (табл. 2), що у кінцевому результаті призводило до виведення іонів калію з сечею.

Рис. 2. Оксалати сечі у дорослих щурів: а) концентрація в сечі; б) екскреція з сечею.

Примітка. Достовірність в порівнянні з контролем відмічено: *** - p <0.001

Таблиця 2

Нирковий транспорт калію в дорослих щурів з оксалатною нефропатією (x ± Sx)

Показники, що вивчались Контроль (n = 15) 0,5 мг/кг (n = 14) 1 група 5,0 мг/кг (n = 15) 2 група 50,0 мг/кг (n = 15) 3 група

Екскреція іонів калію з сечею, мкмоль/2 год 11,75±0,97 21,54±1,99 p <0,001 20,42±3,54 p <0,05 26,92±2,44 p <0,001

Відносна реабсорбція іонів калію, % 95,54±0,32 91,52±1,18 p <0,01 92,33±0,73 p <0,01 92,23±0,46 p <0,001

Дистальна секреція іонів калію, мкмоль/2 год 15,65±0,96 19,97±0,94 p <0,01 16,02±0,79 20,40±0,68 p <0,01

Кліренс безкалієвої води, мл/2 год 4,03±0,19 4,75±0,18 p <0,05 4,49±0,19 4,91±0,12 p <0,01

Примітка: p - ступінь вірогідності різниць показників при порівнянні з контролем

n - кількість спостережень

Оксалатна нефропатія характеризувалась пригніченням проксимальної реабсорбції іонів натрію у тварин всіх дослідних груп (табл. 3).

Таблиця 3

Канальцевий транспорт іонів натрію в дорослих щурів

після оксалатного навантаження (x ± Sx)

Показники, що вивчались Контроль (n = 15) (n = ) 0,5 мг/кг (n = 14) 1 група 5,0 мг/кг (n = 15) 2 група 50,0 мг/кг (n = 15) 3 група

Концентрація іонів натрію у плазмі, ммоль/л 141,88 ± 1,47 138,21 ± 1,52 130,63±0,91 p <0,001 128,44±0,81 p <0,001

Екскреція іонів натрію/100 мкл КФ 0,26 ± 0,02 0,88 ± 0,16 p <0,01 0,54 ± 0,06 p <0,001 0,19 ± 0,04

Проксимальна реабсорбція іонів натрію/100 мкл КФ 13,36 ± 0,14 12,75 ± 0,15 p <0,05 12,27 ± 0,11 p <0,001 12,06 ± 0,11 p <0,001

Дистальний транспорт іонів натрію/ 100 мкл КФ 0,83 ± 0,06 1,06 ± 0,09 p <0,05 0,79 ± 0,06 0,78 ± 0,06

Примітка: p - ступінь вірогідності відмінностей при порівнянні з контролем

n - кількість спостережень

Водночас підвищення дистального транспорту іонів натрію спостерігалось лише після введення мінімальної дози калію оксалату У тварин 2-ої і 3-ої груп це призводило до гіпонатріємії.

Кислотовидільна функція нирок за умов гіпероксалурії характеризувалась активацією екскреції іонів водню (0,29±0,09 нмоль/ 100 мкл клубочкового фільтрату у контролі та 0,65±0,10 нмоль/100 мкл клубочкового фільтрату у досліді; p<0,05; n=30), підсиленням процесів ацидогенезу (7,67±1,79 та 12,50±1,40 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату, відповідно, p<0,05; n=30) за зменшення екскреції аміаку і амонійного коефіцієнту (4,89±0,87 та 2,77±0,24 од., відповідно, p<0,05; n=30).

Активність сукцинатдегідрогензи в кірковій речовині нирок зростала у тварин всіх груп (рис. 3).

Рис. 3. Активність сукцинатдегідрогенази в кірковій речовині нирок

у дорослих щурів після тривалого введення калію оксалату (мкг/год ґ мг білка).

Примітка. Достовірність у порівнянні з контролем відзначено** - p <0,01, *** - p <0,001.

Зауважимо, що збільшення дози калію оксалату призводило до зниження активності СДГ порівняно з попередніми групами тварин.

На 14-ту добу після відміни оксалатного навантаження оксалурія зберігалася у тварин, яким калію оксалат вводили із розрахунку 5,0 та 50,0 мг/кг: 0,42±0,03 мг/2 год у контролі, 0,89±0,17 мг/2 год (p<0,001) та 1,08±0,24 мг/2 год у 2-й та 3-й групах, відповідно.

Рівень проксимальної реабсорбції іонів натрію був достовірно нижчим за контроль - 13,36±0,14 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату у контролі, 12,23±0,05 - у 1-й, 12,19±0,10 - у 2-й та 12,30±0,11 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату - у 3-й групі тварин, відповідно (p<0,001 для всіх груп), що призводило до зниження концентрації іонів натрію у плазмі крові. Активність СДГ в кірковій тканині нирок при цьому відповідала контрольним показникам.

Активація кислотовиділення відбувалась за рахунок збільшення виділення іонів водню лише у тварин, яким вводили максимальну дозу калію оксалату 1,52±0,32 та 4,38±0,61 нмоль/2 год, відповідно, p<0,001, n=30) без змін інших параметрів.

3. Дослідження впливу калію оксалату на функцію нирок у старіючих щурів

Тривале введення калію оксалату старим щурам супроводжувалося гіпероксалурією, але при максимальній дозі оксалатного наванта-ження відбувалося порушення виведення оксалатів з організму (рис. 4).

Рис. 4. Оксалати сечі у старих тварин: а) концентрація (мг/л); б) екскреція (мг/2 год).

Примітка. 1 - контроль, 2 - 0,5 мг/кг, 3 - 5,0 мг/кг, 4 - 50,0 мг/кг.

Достовірність в порівнянні з контролем відзначено: ** - p <0.01, *** - p <0.001

Оксалатна нефропатія характеризувалась зменшенням швидкості клубочкової фільтрації з 344,11±22,91 мкл/хв у контролі до 251,85±40,89 (перша група) та 227,42±21,17 (друга група, p<0,01; n=30), що призводило до гіперазотемії - концентрація креатиніну у плазмі крові складала відповідно 61,25±4,27, 82,50±7,15 та 72,75±3,84 мкмоль/л (p<0,05 для обох груп тварин).

Вплив тривалого введення калію оксалату на нирковий транспорт іонів натрію проявлявся у зниженні екскреції іонів натрію після введення дози 50,0 мг/кг з 2,13±0,21 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату у контролі до 0,82±0,11 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату у досліді (p<0,001; n=30), що було наслідком підвищення транспорту іонів натрію в дистальних канальцях, тоді як проксимальна реабсорбція іонів натрію вірогідних змін не зазнавала.

Ниркове кислотовиділення при оксалатній інтоксикації відбувалось за рахунок активації натрій-водневого антипорту, в той час як екскреції аміаку зменшувалась з 138,89±9,18 (контроль) до 90,28±12,46 мкмоль/2 год (третя група, p<0,01; n=30).

Через 2 тижні після відміни оксалатного навантаження у старих щурів були відсутні зміни на рівні гломерулярного апарату нирок та не спостерігалося гіпероксалурії.

Нирковий транспорт іонів натрію після відміни навантаження калію оксалатом характеризувався підсиленням їх проксимальної реабсорбції з 11,78±0,12 у контролі до 12,23±0,06 у 1-й, 11,94±0,17 у 2-й та 11,81±0,14 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату у 3-й групі тварин (p<0,01 для всіх груп).

Інтенсифікація проксимального транспорту іонів натрію супро-воджувалась підвищенням ацидифікації сечі за рахунок натрій-вод-невого протитранспорту, оскільки екскреція титрованих кислот не змі-нювалась, а екскреція аміаку була меншою за контрольні дані (табл. 4).

Таблиця 4

Стан кислотовидільної функції нирок у старіючих щурів через 2 тижні

після відміни оксалатного навантаження (x ± Sx)

Показники, що вивчались Контроль (n = 15) 1 група (n = 14) 2 група (n = 14) 3 група (n = 14)

Екскреція титрованих кислот/ 100 мкл клубочкового фільтрату 11,43 ± 1,70 8,71 ± 1,22 8,83 ± 2,03 9,08 ± 2,14

Екскреція аміаку/100 мкл клубочкового фільтрату 42,28 ± 4,71 25,55±0,69 p <0,01 23,41± 2,41 p <0,01 26,72±2,42 p <0,05

Екскреція іонів водню/100 мкл клубочкового фільтрату 0,11 ± 0,01 0,19 ± 0,03 p <0,05 0,29 ± 0,07 p <0,05 0,25 ± 0,04 p <0,05

Примітка: p - ступінь вірогідності відмінностей при порівнянні з контролем

n - кількість спостережень

Зміни функціонального стану нирок у тварин, яким вводили калію оксалат у дозі 0,5 мг/кг у цей період екскперименту супроводжувались пригніченням ензиматичного лізису фібрину у кірковій речовині нирок у тварин (рис. 6).

Рис. 5. Фібринолітична активность кортикальної тканини нирок старих щурів

через 2 тижні після відміни оксалатного навантаження (E440/год ґ г тканини).

Примітка. Достовірність в порівнянні з контролем відмічено: * - p<0,05, ** - p<0,01.

4. Аналіз впливу виноградної олії на функцію нирок при оксалатній нефропатії у ювенільних щурів

У молодих щурів, яким впродовж 14 діб після відміни оксалатного навантаження вводили виноградну олію спостерігалось підвищення швидкості клубочкової фільтрації та зменшення вмісту креатиніну у плазмі крові, а зменшення діурезу було зумовлено збільшенням реабсорбції води. Екскреція білка знижувалась і відповідала контрольним даним (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив виноградної олії на функцію нирок у молодих щурів через 2 тижні

після відміни оксалатного навантаження (x ± Sx)

Показники, що вивчалися Контроль (n = 15) Калію оксалат (n = 15) Відміна оксалату + олія (n = 15)

Діурез, мл/2 години 4,15 ± 0,20 4,44 ± 0,18 3,62 ± 0,29 p1<0,05

Концентрація креатиніну в плазмі, мкмоль/л 57,13±3,98 76,88±4,14 p<0,01 56,38±3,08 p1<0,01

Швидкість клубочкової фільтрації, мкл/хв 614,01±50,88 493,32±47,88 587,86±66,84

Екскреція білка/100 мкл клубочкового фільтрату 0,10 ± 0,01 0,14 ± 0,02 p <0,05 0,10 ± 0,01 p1<0,05

Примітка: p - ступінь вірогідності різниць показників у порівнянні з контролем

p1 - ступінь вірогідності різниць показників у порівнянні із введенням оксалату

n - кількість спостережень

Введення виноградної олії сприяло нормалізації проксимальної реабсорбції іонів натрію (11,58±0,24 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату в тварин, яким не вводили олію, 12,58±0,01 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату після введення олії, p<0,01 та 12,59±0,16 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату в контролі). Дистальний транспорт іонів натрію при цьому складав відповідно 1,04±0,11, 0,69±0,07 та 0,78±0,05 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату, тобто виноградна олія достовірно (p<0,05) зменшувала реабсорбцію іонів натрію у дистальних канальцях.

Таблиця 6

Вплив виноградної олії на пероксидне окислення ліпідів та фібринолітичної активність в кірковій речовині нирок ювенільних щурів через 2 тижні після відміни оксалатного навантаження (x ± Sx)

Показники, що вивчались Контроль (n = 14) Калію оксалат (n = 15) Олія (n = 14)

Дієнові коньюгати, нмоль/мг білка 0,39 ± 0,10 0,54 ± 0,05 0,19 ± 0,05 p1<0,001

Малоновий альдегід, нмоль/мг білка 0,24 ± 0,06 0,27 ± 0,04 0,17±0,02 p1<0,05

Каталаза, мкмоль/хв ґ мг білка 28,14±4,96 14,09±0,89 p<0,01 20,14±2,37 p1<0,05

Глутатіонпероксидаза, мкмоль G-SH/хв ґ мг білка 0,42 ± 0,07 0,16 ± 0,02 p<0,01 0,25 ± 0,03 p <0,05

Ферментативний фібриноліз Е440/год ґ г тканини 3,70 ± 0,95 9,85 ± 1,49 p<0,01 4,69 ± 1,04 p1<0,05

Примітка: p - ступінь вірогідності відмінностей в порівнянні з контролем

p1 - ступінь вірогідності відмінностей в порівнянні із введенням оксалату

n - кількість спостережень

Вплив виноградної олії на процеси пероксидного окислення ліпідів в кортикальній тканині нирок характеризувався зменшенням вмісту дієнових кон'югатів та ТБК-активних продуктів (малонового альдегіду) порівняно з нелікованими тваринами (табл. 6). Це відбувалось за збільшення активності каталази та глутатіонпероксидази і підвищенням інтенсивності ензиматичного лізису розщеплення фібрину.

ВИСНОВКИ

1. Екзогенна калій оксалат-індукована гіпероксалурія у молодих щурів супроводжується активацією енергозалежних механізмів канальцевої секреції іонів калію після введення із розрахунку 0,5 мг/кг із збільшенням інтенсивності амоніогенезу та підвищенням реабсорбції іонів натрію у дистальних відділах нефрону після введення 5,0 та 50,0 мг/кг.

2. Після відміни оксалатного навантаження у молодих щурів відбувається активація ацидогенезу, пригнічення активності сукцинатдегідрогенази і збільшення вмісту малонового альдегіду у кортикальній тканині нирок за зниження канальцевого транспорту іонів натрію та зменшення швидкості клубочкової фільтрації.

3. Субхронічна оксалатна інтоксикація у дорослих щурів при введенні калію оксалату із розрахунку 0,5, 5,0 та 50,0 мг/кг характеризується протеїнурією, гіпероксалурією, збільшенням інтенсивності ацидогенезу та гіпонатріємією після введення 50,0 мг/кг, яка виникає внаслідок зниження проксимальної реабсорбції іонів натрію.

4. Після відміни калію оксалату у дорослих щурів зберігаються порушення проксимального транспорту іонів натрію, а гіпероксалурія супроводжується підвищенням інтенсивності ниркового кислотовиділення.

5. Субхронічна оксалатна інтоксикація у старіючих щурів зменшує швидкість клубочкової фільтрації і збільшує вміст креатиніну у плазмі крові після введення калію оксалату із розрахунку 0,5 та 5,0 мг/кг за відсутності порушень проксимального транспорту іонів натрію.

6. Після оксалатної інтоксикації у старіючих щурів гіпероксалурія супроводжується збільшенням екскреції активних іонів водню та підвищенням проксимальної реабсорбції іонів натрію за зниження їх дистального транспорту і зменшення інтенсивності ензиматичного лізису фібрину у кірковій речовині нирок.

7. Екзогенна оксалатна інтоксикація після введення всіх досліджуваних доз калію оксалату створює умови для уролітіазу: гіпероксалурія закономірно поєднується з активацією процесів ацидифікації сечі, що не залежить від віку тварин. У молодих і старіючих щурів оксалатне навантаження призводить до реалізації механізмів тубуло-гломерулярного зворотнього зв'язку, що викликає ішемічне пошкодження канальцевих структур нефрону з порушенням екскреторної функції нирок.

8. Виноградна олія при оксалатній інтоксикації (введення калію оксалату із розрахунку 50,0 мг/кг) нормалізує співвідношення між проксимальним та дистальним транспортом іонів натрію, знижує вміст креатиніну у плазмі крові та ступінь протеїнурії, що відбувається за зменшення вмісту ТБК-активних продуктів (малонового альдегіду) і підвищення ферментативного фібринолізу у кірковій речовині нирок.

Список опублікованих праць за темою дисертації

. Міхєєв А.О., Кухарчук О.Л., Власик Л.І. Вплив тривалого введення калію оксалату на функцію нирок у статевозрілих білих щурів // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2000. - №2(10). - С. 50 - 54.

. Власик Л.І., Міхєєв А.О. Вплив калію оксалату на функцію нирок у старих щурів за умов водного навантаження // Одеський медичний журнал. - 1999. - №4 (54). - С. 22 - 24.

. Міхєєв А.О., Власик Л.І. Вплив олії з кісточок винограду на перебіг відновчого періоду у статевонезрілих щурів з оксалатною нефропатією // Фармакологічний вісник. - 1999. - №2. - С. 36 - 38.

. Власик Л.І., Міхєєв А.О. Особливості змін функціонального стану нирок молодих щурів при дії оксалату калію // Вісник гігієни та епідеміології. - 1998. - Т.2, №1 (3). - С. 36 - 39.

. Міхєєв А.О. Характеристика впливу оксалату калію на функціональний стан нирок у білих щурів // Фізіологічний журнал. - 1998. - Т. 44, №3. - С. 340.

. Власик Л.І., Міхєєв А.О., Проданчук М.Г., Коновчук В.М. Репаративний засіб. - Патент на винахід України від 03.02.1998., № 22276А.

. Власик Л.І., Кухарчук О.Л., Магаляс В.М., Міхєєв А.О., Проданчук М.Г., Роговий Ю.Є. Спосіб моделювання нефропатії. - Патент на винахід України від 11.06.1997, № 20825А.

. Власик Л.І., Кухарчук О.Л., Міхєєв А.О. До питання про механізми утворення сечових конкрементів під впливом оксалату калію // Матеріали конференції "Біомінералогія і медична екологія". - Луцьк, 1995. - С. 44 - 45.

. Міхєєв А.О. Вивчення впливу калію оксалату на функціональний стан нирок білих лабораторних щурів // Матеріали симпозіуму з міжнародною участю "Хірургічні проблеми і екологія". - Чернівці, 1995. - С. 88.

. Михеев А.А. Влияние калия оксалата на перекисное окисление липидов и тканевой фибринолиз в корковом веществе почек белых крыс // Матеріали конференції молодих учених "Фізіологія і патологія перексиного окислення, гемостазу та імуногенезу". - Полтава, 1995. - С. 33 - 34.

. Міхєєв А.О. Вплив виноградної олії на стан канальцево-канальцевого балансу у щурів з експериментальною гіпероксалурією // Матеріали міжнародного симпозіуму "Актуальні питання медичної допомоги населенню". - Чернівці, 2000. - С. 180.

. Mikheev A.O. The age peculiarities of renal function in rats under the water load condition // 5th World Wide International Medical Students & Young Doctors Congres, Katowice, Poland, 12-14 April 2000. - P. 68.

АНОТАЦІЯ

Міхєєв А.О. Біохімічні аспекти вікової реактивності нирок при експериментальній оксалатній інтоксикації. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Чернівецький національний університет ім. Ю.Федьковича, Чернівці, 2000 р.

Дослідження присвячено вивченню вікових особливостей реактивності нирок при експериментальному оксалатному навантаженні. У результаті дослідження встановлено, що нефротоксичність калію оксалату має чітку вікову залежність, що зумовлюється особливостями біохімічного забезпечення функції нирок у тварин різного віку. Виявлено, що основним місцем пошкодження ниркових структур при оксалатному навантаженні є дистальні відділи нефрона. Це супроводжується дозозалежним пригніченням активності сукцинатдегідрогенази кіркової речовини нирок у молодих та старих тварин та активацією цього фермента у дорослих щурів. Збільшення секреції іонів калію у дистальних відділах нефрона при дії калію оксалату супроводжується збільшенням інтенсивності процесів ацидифікації сечі, що значно знижує рН та створює умови для виникнення уролітіазу. Одним з проявів оксалатної нефропатії є порушення канальцево-канальцевого балансу іонів натрію у результаті біохімічних порушень енергозабезпечення системи дистального транспорту іонів натрію незалежно від віку. Залишкові зміни індуковані калію оксалатом мають у залежності від віку різний ступінь функціональних проявів та потребують спрямованої корекції. Використання виноградної олії з метою корекції порушень функціонального стану нирок при оксалатній інтоксикації виявило її протективні властивості, що проявляється у попередженні біохімічних зсувів при гіпероксалурії і попередженні мінералізації оксалатів.

Ключові слова: калію оксалат, гіпероксалурія, функція нирок, вікові особливості, сукцинатдегідрогеназа, пероксидне окиснення ліпідів, фібриноліз.

АННОТАЦИЯ

Михеев А.А. Биохимические аспекты возрастной реактивности почек при экспериментальной оксалатной интоксикации. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологически наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Черновицкий национальный университет им. Ю.Федьковича, Черновцы, 2000 г.

Исследование посвящено изучению возрастных особенностей реактивности почек при експериментальной оксалатной нагрузке.

Для достижения цели исследования были поставлены такие задачи:

1. Изучить влияние длительного введения калия оксалата на функциональное состояние почек у молодых, взрослых и стареющих крыс.

2. Изучить состояние перекисного окисления липидов, фибринолитическую активность коркового вещества почек при субхронической оксалатной интоксикации у животных разного возраста.

3. Установить биохимические особенности длительного влияния калия оксалата на энергетическое обеспечение почечных процессов у животных разного возраста после длительного введения калия оксалата.

4. Исследовать биохимические особенности протекания периода остаточных реакций почек у животных разного возраста после отмены оксалатной нагрузки.

5. Разработать биохимически обоснованные способы нефропротекции при интоксикации животных калия оксалатом.

В результате изучения установлено, что нефротоксичность калия оксалата имеет четкую возрастную зависимость, что обусловлено особенностями биохимического обеспечения функции почек у животных разного возраста. Выявлено, что основным местом повреждения почечных структур являются дистальные канальцы нефрона. Это сопровождается дозозависимым угнетением активности сукцинатдегидрогеназы коркового вещества почек у молодых и старых крыс и активацией этого фермента у взрослых. Увеличение секреции ионов калия в дистальных отделах нефрона при действии калия оксалата сопровождается увеличением интенсивности процессов ацидификации мочи, что существенно снижает рН и создает условия для возникновения уролитиаза.

Одним из проявлений оксалатной нефропатии является нарушение канальцево-канальцевого баланса ионов натрия в результате биохимических нарушений энергообеспечения систем дистального транспорта ионов натрию независимо от возраста животных.

Остаточные изменения индуцированные калия оксалатом имеют в зависимости от возраста разную степень функциональных проявлений и нуждаются в целенаправленной коррекции. Использование виноградного масла с целью корекции нарушений функционального состо-яния почек при оксалатной интоксикации выявило его протекторные свойства, которые проявляются в предупреждении биохимических сдвигов при гипероксалурии и предупреждении минерализации оксалатов.

Ключевые слова: калия оксалат, гипероксалурия, функция почек, возрастные особенности, сукцинатдегидрогеназа, перекисное окисление липидов, фибринолиз.

SUMMARY

Mikheev A.A. Biochemical aspects of age renal activity in experimental oxalate intoxication. - Manuscript.

Dissertation for Сandidate's of Biological Sciences Degree. Speciality 03.00.04 - biochemistry. The Fedcovich National University, Chernivtsy, 2000.

This studying is dedicated to age peculiarities of renal reactivity in experimental oxalate loading. As a result of experiment it was found that potassium oxalate nephrotoxicity has a distinct age dependence, that is stipulated by the peculiarities of biochemical ensuring of renal function in animals of different age. It was revealed that the principle places of the renal structures damaging in oxalate loading are the distal sections of nephron. It's accompanied by dosedependet oppression of succinatdehydrogenase activity of renal cortical substance in young and old animals and by this enzyme activation in adult rats. The increase of potassium ions in distal nephron section under the influence of potassium oxalate effect is accompanied by increase of the intensivity of urine acidification processes, that significantly decrease pH and creates the condition for urolithiasis origin. One of the manifestation of the oxalate nephropathy is the breaches of tubular-canalicular balance of potassium ions, as a result of energy provisions system biochemical breaches of the distal potassium ions transport, regardless of age. The residual changes induced by potassium oxalate have the different degree of functional manifestations, depending upon the age, and need the direct correction. The use of the grapes oil with the purpose of correction of functional renal state breaches in oxalate intoxication, revealed its protective properties. That is manifested by prevention of biochemical shifts in hyperoxaluria and by prevention of oxalate mineralization.

Key words: potassium oxalate, hyperoxaluria, renal function, age peculiarities, succinatedehydrogenase, lipid peroxidation, fibrinolysis.