МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського
МАТОЛІНЕЦЬ
Оксана Михайлівна
УДК 615.916-085.246.2/272.4]-092.9
ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ АНТИОКСИДАНТНОЇ ТА ІМУННОЇ СИСТЕМ У ТВАРИН З КАДМІЄВОЮ ІНТОКСИКАЦІЄЮ І КОРЕКЦІЯ ЇХ ЗА ДОПОМОГОЮ АНТИОКСИДАНТІВ І ЕНТЕРОСОРБЕНТІВ
14.03.04 - патологічна фізіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Тернопіль - 2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Тернопільській державній медичній академії
ім. І.Я.Горбачевського Міністерства охорони здоров'я України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Гонський Ярослав Іванович,
Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського, завідувач кафедри медичної хімії
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Бідюк Мартин Миколайович, Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького, завідувач кафедри патологічної фізіології;
кандидат медичних наук Заморський Ігор Іванович, Буковинська державна медична академія, доцент кафедри фармакології.
Провідна установа: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
відділ по вивченню гіпоксичних станів, м. Київ.
Захист відбудеться 27 жовтня 2000 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 58.601.01 у Тернопільській державній медичній академії ім. І.Я. Горбачевського (46000, м. Тернопіль, майдан Волі,1).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського (м. Тернопіль, вул.Руська, 12 ).
Автореферат розісланий 19 вересня 2000 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор Боднар Я.Я.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Із зростанням індустріалізації значно збільшився рівень надходження важких металів у довкілля, а звідси - в організм людини. Кадмій - метал, який достатньо поширений у природі, де він міститься в низьких концентраціях. Антропогенний вклад у надходження його в атмосферу значно перевищує його надходження природнім шляхом. Близько 65 т кадмію щорічно потрапляє у атмосферу Європи (Михалева Л.М., 1982). Потрапивши в організм, кадмій при гострому отруєнні в більшості випадків викликає ураження печінки, зумовлюючи в ній цілу низку обмінних порушень. Важливо при цьому врахувати віковий аспект, оскільки реакції молодого і старого організму на введення ксенобіотиків є неоднаковими. Відомо, що у період статевого дозрівання молодий організм тварин є більш чутливим до дії токсичних чинників (Савченков М.Ф., 1979). Водночас до групи ризику при кадмієвій інтоксикації відносять людей у віці понад 40 років (Ликутова И.В., 1989). Це зумовлено тим, що в організмі кадмій здатний кумулюватися, оскільки період його напіввиведення становить близько десятиліття (Михале-ва Л.М., 1982). Не останню роль в онтогенетичній відмінності реакцій захисних систем організму відіграє вікова зміна інтенсивності синтезу металотіонеїну -білка, який виконує важливу функцію у процесі детоксикації кадмію ( Wormaser V., Nir I.,1988).
Механізм токсичної дії кадмію на печінку залишається ще не встановленим. Припускають, що його пошкоджуюча дія зв'язана із перекисним окисленням ліпідів (ПОЛ) біомембран гепатоцитів (Pharikal К.,1988; Koizumi T., 1996; Rana S., Verma S., 1997). Активація ПОЛ в свою чергу може спричинити пригнічення захисних систем організму і, зокрема, антиоксидантної системи (АОС). Зміна активності ферментів АОС зумовлює ряд порушень, які виникають в організмі. Кадмій є тіоловою отрутою і проявляє мембранолітичну дію (Koizumi T., 1996). При хронічній інтоксикації кадмієм у крові людей з'являються антиламінові антитіла (Okumura N., Kameko M., 1984). Відомо також, що кадмій пригнічує фагоцитарну активність лейкоцитів (Chowdhury B., Chandra R., 1991; Kendrey G. R., 1969). Проте вплив кадмію на імунну систему вивчений ще недостатньо.
Органами - мішенями при інтоксикації кадмієм, крім печінки, є нирки, сім'яники, кісткова тканина (Kendrey G.R.,1969; Михалева Л.М.,1982). Хронічна дія кадмію викликає характерні зміни кісткової тканини, які одержали назву хвороби “ітаї-ітаї” (Михалева Л. М., 1982).
Печінка є бар'єром на шляху надходження токсичних речовин у організм, тому фармакотерапія токсичних уражень печінки є актульним питанням сьогодення.
Дані літератури не розкривають суті впливу кадмієвої інтоксикації на стан АОС та імунної системи залежно від віку, не з'ясовані шляхи корекції цих змін за допомогою ентеросорбентів, антиоксидантів та прополісу, який містить цілий набір речовин із біоантиоксидантною дією (Оконенко Л. Б. 1985). Тому погіршення екологічної ситуації та відсутність розробленої фармакотерапії кадмієвої інтоксикації з урахуванням вікового аспекту потребує подальшого вивчення, що зумовлює актуальність таких експериментальних досліджень.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною планової наукової міжкафедральної теми “Вікові особливості перебігу окислювального і нуклеотидного обміну за умов ураження печінки хімічними і біологічними токсинами та способи їх корекції” (кафедр медичної хімії та біології) Тернопільської державної медичної академії (№ держреєстрації 0195U023938), у виконанні якої автором самостійно проведено дослідження токсичного ураження організму кадмієм та їх корекції за допомогою антиоксидантів і ентеросорбентів, що викладено у матеріалах дисертації.
Мета і задачі дослідження. Встановити вікові особливості антиоксидантної та імунної систем у лабораторних тварин з кадмієвою інтоксикацією та ефективність корекції змін цих систем за допомогою антиоксидантів, ентеросорбентів та штучно одержаних ліпосом.
Відповідно до мети було поставлено такі основні задачі:
1. Вивчити стан ферментативної та неферментативної антиоксидантної системи при ураженні тварин хлоридом кадмію у динаміці експерименту з врахуванням вікових особливостей (молоді, дорослі, старі тварини).
2. Встановити вікові особливості змін імунної системи при інтоксикації тварин кадмієм.
3. Дослідити особливості метаболічних процесів у печінці тварин з кадмієвою інтоксикацією.
4. Вивчити ефективність корекції стану антиоксидантної системи при кадмієвій інтоксикації тварин різного віку за допомогою ліпосом, начинених манітолом і цитохромом С, прополісу та комбінації прополісу із ентеросорбентом “Фібрабетом”.
5. Вивчити ефективність корекції стану імунної системи при кадмієвій інтоксикації тварин різного віку за допомогою ліпосом, прополісу та комбінації прополісу із ентеросорбентом “Фібрабетом”.
Об'єкт дослідження – кадмієва інтоксикація у щурів різного віку.
Предмет дослідження – показники ферментативної і неферментативної ланок антиоксидантної системи та стан імунної системи у тварин різного віку з кадмієвою інтоксикацією та після її корекції.
Методи дослідження - Біохімічні: активність каталази (КТ), активність супероксиддисмутази (СОД), активність глутатіонредуктази (ГР) та глутатіон-пероксидази (ГП) для визначення стану ферментативної ланки антиоксидант-ної системи; рівень SH-груп, рівень трансферину, концентрація аскорбінової кислоти (АК), концентрація вітаміну А, вміст церулоплазміну (ЦП) для оцінки стану неферментативної ланки антиоксидантної системи. Імунологічні: вміст імуноглобулінів класів А, М і G та циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), активність комплементу та концентрація лізоциму. Інтенсивність катаболічних та анаболічних процесів у печінці in vitro оцінювали методом радіоактивної мітки.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано вікові особливості антиоксидантної та імунної систем при інтоксикації тварин хлоридом кадмію:
- встановлено, що ураження тварин хлоридом кадмію викликає пригнічення ферментативної та неферментативної ланки антиоксидантної системи у печінці тварин усіх вікових груп, причому більш виражені зміни спостерігаються у тварин 3-місячного віку;
- показано, що інтоксикація кадмієм викликає суттєві зміни гуморального імунітету та стану неспецифічної резистентності організму: знижується рівень усіх досліджуваних класів імуноглобулінів, активність комплементу та зростає рівень ЦІК у крові тварин усіх вікових груп, особливо вираженими є зміни у тварин 18-місячного віку;
- показана ефективність корекції кадмієвої інтоксикації за допомогою ліпосом, прополісу та комбінації прополісу із ентеросорбентом “Фібрабетом” в залежності від віку;
- досліджено особливості метаболічних процесів у печінці 6-місячних тварин і показано, що кадмієва інтоксикація викликає посилення катаболічних процесів;
- встановлено високу ефективність корекції кадмієвої інтоксикації за допомогою ліпосом із включеними в них манітолом і цитохромом С;
- виявлено, що введення прополісу викликає позитивні зміни антиоксидантної та імунної систем у тварин усіх вікових груп як у крові, так і у печінці;
- ефект від введення прополісу і “Фібрабету” з метою корекції змін антиоксидантної та імунної систем має виразний нормалізуючий вплив.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень розширюють знання про механізм дії кадмію на організм, зокрема, на антиоксидантну та імунну системи, відкривають можливості для вдосконалення шляхів детоксикації організму за допомогою ліпосом, прополісу та ентеросорбентів. Позитивний вплив використаних середників на АОС та імунну систему, дозволяє рекомендувати їх для застосування з метою профілактики і лікування токсичної дії важких металів. Показники вмісту ЦІК, Ig G, активності ГП та ГР, які найбільш чутливі до дії кадмію і відображають стан АОС та імунної системи при кадмієвій інтоксикації, можуть бути використані як діагностичний критерій для оцінки перебігу токсичного ураження важкими металами.
Результати дослідження впроваджені на кафедрах медичної хімії, фармакології та загальної гігієни і екології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського у навчальний процес, що підтверджено відповідними актами впровадження (від 23.06.2000 року та 25.06.2000 року).
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено експериментальні дослідження, статистичну обробку результатів, написання та оформлення дисертації. Акти впровадження, де описується сутність нововведення, зроблені самостійно. Формулювання завдань і інтерпретацію результатів здійснено разом із науковим керівником. Дослідження метаболічних процесів виконані за сприяння кафедри екології Тернопільського педагогічного університету ім. В. Гнатюка, за що автор висловлює щиру подяку к. б. н. Бродіну С.В.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднені на ІІІ та ІV Міжнародних медичних конгресах студентів та молодих вчених (Тернопіль, 1999-2000); щорічних обласних науково-практичних конференціях (Тернопіль, 1998-2000).
Публікації. Опубліковано 9 наукових праць, з яких 3 – у фахових наукових виданнях, та 6 – у матеріалах і збірниках конференцій та конгресів.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 167 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методик дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел (всього 341 найменування). Робота проілюстрована 29 таблицями та 2 рисунками і містить 3 додатки. Загальний обсяг ілюстрацій, таблиць, списку використаних джерел і додатків дорівнює 61 сторінка.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 498 білих щурах - самцях лінії Вістар, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. Для вивчення використовували щурів трьох вікових періодів: статевого дозрівання, коли спостерігається підвищення чутливості до шкідливих впливів (3-місячні тварини), статевої зрілості (6-місячні тварини) та старіння (тварин 18-місячного віку).
Кадмієвий токсикоз викликали шляхом внутрішньоочеревинного введення хлориду кадмію, який попередньо розводили на 0,9 % розчині хлориду натрію, з розрахунку 7 мг/кг маси тіла тварини, що становить 1/12 DL50 (Губский Ю.И., Долго-Сабуров В.Б., Храпак В.В., 1993). Інтактним тваринам внутрішньоочеревинно вводили відповідну кількість 0,9% розчину хлориду натрію.
Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1– інтактні щури; 2–уражені хлоридом кадмію щури, 3 – щури, яким вводили для корекції кадмієвої інтоксикації прополіс; 4 – щури, яким вводили для корекції кадмієвої інтоксикації комплекс антиоксидантів, інкапсульованих у ліпосоми; 5 – щури, яким застосовували для корекції кадмієвої інтоксикації поєднання прополісу і ентеросорбенту “Фібрабет”. Тварин декапітували під ефірним наркозом на 1-у, 4-у, 7-у та 14-у доби з моменту інтоксикації.
Прополіс, виготовлений самостійно згідно методики П.А. Кравчук (1982), вводили з розрахунку 0,25 г/кг маси тіла у вигляді 10 % спиртового розчину перорально за допомогою зонда через 24 год після введення хлориду кадмію протягом усього досліду щоденно (Падалко В.І., Суходуб А.Л., Козлова О.В., Лемешко В.В.,1996). Суспензію холінфосфатидних ліпосом вводили нутрішньо-очеревинно щоденно у дозі 0,1 г/кг протягом усього досліду (Корда М.М., 1997). Ентеросорбент “Фібрабет” - біологічний харчовий додаток давали тваринам із розрахунку 1 г/кг маси тіла за допомогою зонда щоденно протягом усього експерименту через 24 год після введення прополісу (кафедра медичної хімії Тернопільської державної медичної академії).
Експерименти на тваринах проводили із збереженням сезонності і часу доби.
Об'єктами дослідження були плазма крові, сироватка крові та гомогенат печінки.
Показники ферментативної АОС визначали наступними методами: активність КТ визначали фотоколориметричним методом за інтенсивністю забарвленого комплексу, який утворюється при взаємодії перекису водню з молібдатом амонію (Королюк М.А. и соавт., 1988); активність СОД – за ступенем інгібування відновленого нітротетразолію синього (Чевари С., Ча-
ба И., Секей И., 1985); активність ГР визначали за кількістю НАДФН2, що витрачається у ферментативній реакції відновлення окисленого глутатіону; ГП – за кількістю відновленого глутатіону, що використовується у реакції (Кругликова Т.О., Штутман Ц.М., 1976). Показники неферментативної АОС визначали за такими методами: рівень SH-груп – за методом Дж. Елмана (1959), рівень трансферину – спектрофотометричним методом (Бабенко Г. О., 1968); концентрацію АК – за методом В.В. Соколовського, Л.В. Лєбєдєвої (1974); концентрацію вітаміну А – флюориметричним методом (Черняуске-
не Р.Ч., Варикявичене З.З., Грибаускас П.С., 1984); вміст ЦП – за кількістю утворених забарвлених продуктів окислення п-фенілендіаміну в присутності церулоплазміну (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). Визначення вмісту імуноглобулінів класів А, М і G в сироватці крові проводили за методикою, що базується на фракціонуванні білків сироватки крові органічними розчинниками і буферними розчинами з утворенням білково-буферних комплексів (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978). Кількість ЦІК визначали преципітацією їх розчином поліетиленгліколю - 6000 (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978). Активність комплементу визначали колориметричним методом за допомогою сенсибілізованих гемолізином еритроцитів, які гемолізувались у присутності комплементу (Козлюк А.С., Анисимова Л.А., Шройт И.Г., 1987); концентрацію лізоциму – за специфічним ферментним лізисом еталонного штаму мікрокока Micrococcus lysodeicticus досліджуваною сироваткою (Козлюк А.С., Анисимов Л.А., Шройт И.Г., 1987). Інтенсивність катаболічних та анаболічних процесів у печінці in vitro оцінювали за допомогою радіоактивної мітки (Янович В.Г., Вовк С.И., Бродин С.В., 1991).
Результати досліджень піддавали статистичному аналізу (Гублер Е.В., 1978). Достовірність отриманих результатів визначали, використовуючи критерій Ст'юдента. Зміни вважали достовірними при Р < 0,05. Для розрахунків використовували комп'ютерну програму Exel (Microsoft, США).
Основні результати досліджень. Результати наших досліджень свідчать про значні зміни стану АОС та імунної системи у крові та печінці тварин усіх вікових груп під впливом дії хлориду кадмію. Так, у тварин спостерігалося зниження більшості показників АОС печінки практично у всі терміни дослідження (табл. 1). При цьому достовірно підвищувалась активність КТ у крові тварин в усі дні експерименту. Очевидно, що підвищення активності цього ферменту є захисною реакцією і спрямоване на руйнування пероксиду водню, генерацію якого індукував кадмій. Утримування на відносно високому рівні активності КТ крові на 7-ий і 14-ий дні експерименту, ймовірно, є наслідком виходу із пероксисом частини ферменту у кров внаслідок мембранолітичної дії кадмію. Найбільш істотні зміни стану АОС спостерігалися у печінці тварин 3-місячного віку, особливо на 1-у добу експерименту. Такі результати свідчать, очевидно, про нижчі адаптаційні можливості молодого організму та недостатню відрегульованість балансу між АОС та ПОЛ. Більш стабільними до змін КТ виявилися тварини 18-місячного віку, в яких активність цього ферменту у печінці протягом всього експерименту змінювалася найменше щодо даних у інтактних тварин.
Вміст ЦП під впливом кадмію в більшості термінів дослідження був на зниженому рівні в порівнянні з даними інтактних 3- та 18-місячних щурів, і тільки у 6-місячних тварин рівень його знижувався незначно. Прицьому, найбільш низький рівень ЦП був у тварин 3-місячного віку на 14-у добу, що є, ймовірно, проявом зниженого синтезу цього мідьвмісного білка. На 1-у і 4-у доби експерименту знижувався і вміст трансферину відносно показників інтактних тварин. Після цього вміст трансферину зростав, досягаючи максимальних значень на 7-у добу, і утримувався на високому рівні до кінця експерименту у всіх групах тварин. Це засвідчує його найвищу антиоксидантну спрямованість на 7-ий та 14-ий дні експерименту, позаяк включення іонів двовалентного заліза у трансферин переводить їх у тривалентний стан, що не має здатності ініціювати ПОЛ. Збільшення вмісту трансферину, яке спрямоване на пригнічення ПОЛ, особливо вираженим було у тварин 3- і 6-місячного віку.
Активність СОД у крові тварин найбільше знижувалася саме на 1-у добу після введення хлориду кадмію. Аналогічних змін зазнавала активність СОД у печінці тварин, особливо на 14-у добу. Зниження активності СОД у гомогенаті печінки можна пояснити як пригніченням регуляторного впливу сульфгідрильних груп, так і пошкодженням активного центру СОД, внаслідок незворотнього зв'язування іонів міді та окисленням тіолових груп іонами кадмію. До 14-ї доби активність СОД у крові тварин усіх вікових груп наближалася до норми. Важливо, що нормалізація СОД в крові супроводжувалася зниженням її активності в печінці, що наводить на думку про можливе переміщення частини цього ферменту з печінки у кров.
Концентрація АК у всіх вікових групах уражених тварин на протязі експерименту була нижчою, ніж у інтактних тварин, що є, очевидно, наслідком витрачання її на інгібування ПОЛ та відновлення окислених вітамінів Е та А. Найнижчий рівень вітаміну С на всьому протязі експерименту спостерігався у тварин 3-місячного віку, особливо на 7-у добу. Суттєвих змін зазнавала і концентрація вітаміну А як у печінці, так і у крові, особливо у 3-місячних щурів на 7-у добу порівняно з даними у інтактних тварин.
На 1-у і 4-ту доби експерименту спостерігали достовірне зниження рівня SH- груп у печінці та у крові усіх тварин. Те, що аналогічні зміни спостерігаються в крові, очевидно свідчить, що кадмій швидко потрапляє в кров, а звідси у печінку. Виходячи з того, що кадмій є тіоловою отрутою з вираженою мембранолітичною дією (Rana S., Verma S., 1997), можна вважати, що зменшення вмісту SH- груп у крові є наслідком зв'язування кадмію із цими групами білків. За цих умов відбувається окислення SH- груп та утворення металотіонеїнів, дія яких спрямована на зменшення токсичного впливу кадмію. Ці дані узгоджуються із результатами інших авторів (Jamall J.S., 1985; Шевченко А.В., 1986; Caisova D., Eybl V., 1988; Sarkar S., 1995).
Суттєвого зниження у крові зазнає ГР на 14-ту добу експерименту, що, очевидно, зв'язано із виснаженням ресурсів для синтезу цього ферменту. У порівнянні з тваринами інших вікових груп, найнижчою була активність ГР 3-місячних тварин. Активність ще одного ферменту глутатіонової системи - ГП також знижується у крові тварин, особливо на 4-у добу експерименту, причому у 3-місячних щурів активність ГП знижувалася максимально.
Таблиця 1. Вікові особливості динаміки показників АОС печінки тварин з кадмієвою інтоксикацією (М± m; n = 6)
Група тварин
Вік Показник Інтактні Уражені щури, доба експерименту
щури 1 4 7 14
3- КТ, кат/кг 2,60±0,01 2,12±0,05* 2,47±0,03* 2,18±0,04* 2,50±0,03*
місяч-ні СОД, Ч106 ум.од./кг 0,60±0,02 0,37±0,08* 0,41±0,01* 0,47±0,01* 0,33±0,02*
вітамін А, мкМ/кг 220,0± 12,0 150,0± 15,0* 180,0± 14,0* 120,0± 16,0* 160,0± 13,0*
АК, мМ/кг 7,09±0,51 1,28±0,55* 5,62±0,47* 1,14±0,68* 2,49±0,31*
6- КТ, кат/кг 2,58±0,05 2,17±0,04* 2,34±0,01* 2,61±0,07 2,41±0,06*
місяч-ні СОД, Ч106 ум.од./кг 0,56±0,02 0,41±0,02* 0,54±0,02 0,39±0,01* 0,32±0,02*
вітамін А, мкМ/кг 200,0± 14,0 160,0± 14,0* 170,0± 12,0 140,0± 13,0* 150,0± 18,0*
АК, мМ/кг 6,64±0,46 2,88±0,39* 5,75±0,44 2,39±0,41* 2,43±0,45*
18- КТ, кат/кг 2,45±0,04 2,10±0,02* 2,32±0,03* 2,21±0,02* 2,40±0,02
місяч-ні СОД, Ч106 ум.од./кг 0,50±0,02 0,39±0,03* 0,41±0,02* 0,37±0,01* 0,38±0,01*
вітамін А, мкМ/кг 160,0± 14,0 110,0± 11,0* 140,0± 20,0 100,0± 10,0* 130,0± 19,0
АК, мМ/кг 5,42±0,34 2,61±0,43* 4,85±0,10 1,27±0,71* 2,32±0,43*
Примітка. * – Р< 0,05 відносно показників у інтактних тварин.
Аналогічну ситуацію спостерігали на 4-у добу у печінці щурів. Таке зниження активності ГП на 4-у добу корелювало із змінами вмісту SH-груп, рівень яких також знижувався максимально на цю добу експерименту. В інші дні експерименту активність ГП знаходилася на зниженому рівні у крові та печінці усіх тварин.
Отже, пригнічення АОС за умов введення хлориду кадмію відіграє важливу роль у патогенезі розвитку токсичного ураження кадмієм, яке позначається на функціонуванні різних органів та систем, особливо у молодих тварин.
Наші дослідження стану імунної системи при кадмієвій інтоксикації засвідчують імунотропність дії кадмію у тварин усіх вікових груп (табл. 2). Виражене підвищення рівня ЦІК ( у 1,5 і більше разів) у тварин усіх вікових груп на 7-у добу після введення кадмію, очевидно, викликано деструкцією клітинних мембран, адже хлорид кадмію та інші його сполуки мають цитолітичну дію (Rana S., Verma S., 1997). Зростаня кількості ЦІК може бути також зумовлено порушенням фагоцитарної активності макрофагів.
Імунотоксичний вплив кадмію проявляється у зниженні уже на 1-у добу кількості імуноглобулінів усіх досліджуваних класів з поступовим збільшенням лише рівня Ig G на 7-у добу. Очевидно, таке зниження рівня імуноглобулінів є не тільки результатом проявів токсичного ураження печінки, а й є наслідком прямої токсичної імуносупресивної дії хлориду кадмію, що, можливо, обумовлено зменшенням під впливом кадмію кількості лімфоцитів у тимусі і селезінці.
Таблиця 2. Вікові особливості динаміки показників імунної системи тварин з
кадмієвою інтоксикацією ( М ± m; n = 6 )
Група тварин
Вік Показник Інтактні Уражені щури, доба експерименту
щури 1 4 7 14
Ig A, г/л 0,66±0,02 0,54±0,02* 0,58±0,03* 0,53±0,02* 0,62 ±0,11
3-мі- Ig M, г/л 1,2±0,13 0,60±0,10* 0,64±0,07* 0,57±0,16* 0,59±0,09*
сячні Ig G, г/л 3,6±0,12 3,25±0,10* 3,34±0,06 6,44±0,17* 7,36±0,06*
ЦІК,ум.од. 37,0±1,07 41,0±0,90* 37,2±1,80 80,0±1,00* 81,0±1,50*
Ig A, г/л 0,53±0,03 0,40±0,01* 0,55±0,04 0,41±0,02* 0,46±0,03
6-мі- Ig M, г/л 1,35±0,12 0,44±0,15* 0,61±0,12* 0,64±0,12* 0,83±0,07*
сячні Ig G, г/л 3,77±0,10 3,51± 0,08* 3,83±0,05 5,52±0,20* 5,61±0,06*
ЦІК,ум.од. 41,0±0,86 46,0± 1,92* 43,8±1,60 79,5±2,06* 65,0±1,50*
18- Ig A, г/л 0,64±0,05 0,52±0,01* 0,43±0,05* 0,41±0,06* 0,53±0,01*
мі- Ig M, г/л 1,5±0,19 0,51±0,01* 0,47±0,06* 0,71±0,06* 0,72±0,04*
сяч- Ig G, г/л 3,86±0,10 3,63±0,05* 3,46±0,08* 4,58±0,19* 4,78±0,01*
ні ЦІК,ум.од. 64,0±1,86 69,0±2,60 47,4±1,60* 71,0±2,10* 71,2±2,70*
Примітка. * – Р<0,05 відносно даних у інтактних тварин.
Слід зазначити, що особливо низькі рівні вищезазначених імуноглобулінів спостерігаються у тварин старшого віку, що, швидше всього, обумовлено більшою чутливістю їх імунної системи до токсичних чинників. Зростання кількість Ig G у крові, імовірно, є наслідком утворення антитіл проти пошкоджених клітин, зокрема печінки, та пригніченням фагоцитарної активності, про що свідчать дані інших авторів якими показано, що кадмій викликає пригнічення фагоцитарної активності лейкоцитів (Михалева Л.М., 1982). Порівняно менший рівень зростання вмісту ЦІК спостерігався у тварин старшої вікової групи, що, можливо, зв'язано із порушенням при старінні імунних реакцій у відповідь на поступлення в організм токсичної сполуки. Результати наших досліджень узгоджуються з даними інших авторів (Яхонто-
ва О.И., Дуданова О.П., 1992).
У 3-місячних тварин спостерігали достовірне збільшення вмісту лізоциму і зменшення активності комплементу, що ми розцінюємо як реакцію організму щурів на дію токсичної речовини. Це узгоджується з концепцією “токсичного стресу” С. Н. Голікова та співавт. (1986). У тварин 6- і 18-місячного віку на 7-у добу досліду відмічали зменшення вмісту лізоциму. Це ймовірно пояснюється зниженням синтезу його у клітинах органів і тканин. Зменшення активності комплементу, яке спостерігали уже на 1-у добу експерименту у 6-місячних тварин, може бути наслідком порушення функціональної здатності печінки синтезувати його компоненти.
Таким чином, на основі одержаних нами результатів і аналізу літературних даних, можна стверджувати, що хлорид кадмію має імуносупресивну дію, яка найбільше виражена у тварин 18-місячного віку. Це, очевидно, пов'язано із гормональними змінами, що відбиваються на активності імунної системи та супроводжуються порушенням антигенної мозаїки організму у старшому віці. Можливо, імунна система з віком стає більш чутливою до змін у печінці, які виникають під дією ксенобіотика. Аналогічні дані одержано і в роботах інших авторів (Mochizuki Y., 1988; Chowdhury B., Chandra R., 1991).
З метою корекції порушень АОС та імунної системи нами було використано речовини з антиоксидантною та сорбтивною дією. Для цього ми виготовили ліпосоми - штучні сферичні везикули, які побудовані із фосфоліпідів і здатні виконувати роль носіїв, що забезпечують цілеспрямоване надходження лікарських речовин всередину клітин-мішеней (Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Каплун А.П., 1999). Можливість корекції порушень захисних систем організму за допомогою ліпосом вивчалася багатьма науковцями (Середенко М.М. та співавт., 1986; Музе Г.Н., 1989; Добрыни-
на О.В., 1991; Корда М.М., 1997). В наших дослідженнях з метою збільшення ефективності ліпосом, в них заключали манітол і цитохром С, які є пастками супероксидного та гідроксильного радикалів ( ).
Як видно із результатів досліджень (табл. 3), під впливом ліпосом, начинених антиоксидантами, спостерігається нормалізація показників АОС усіх тварин, яка досягає найкращих результатів на 7-у добу експерименту. Ця нормалізація, швидше всього, пов'язана із взаємодією ліпосом із клітинами печінки та наступною модифікацією мембран і підвищенням функціональної активності гепатоцитів. Введення ліпосом регулювало активність КТ у крові, яка на 7-у добу нормалізувалася у тварин усіх вікових груп. Такий ефект ліпосом може бути частково обумовлений прямим інгібуванням ПОЛ за рахунок фосфатидилхолін, що входить до складу ліпосом, та антиоксидантів. У печінці активність КТ під впливом ліпосом зазнавала підвищення у всі терміни дослідження, особливо на 7-у добу експерименту.
Таблиця 3. Рівень -SH груп (мМ/кг), активність ГП (мМ ГSH/хвґкг ) та ГР
(мМ НАДФ/хвґкг) у печінці тварин з кадмієвою інтоксикацією та після
корекції ліпосомами (М± m; n = 6)
Група тварин
Вік Показ- ник Інтакт-ні Уражені щури, доба експерименту Ліковані щури, доба експерименту
щури 1 4 7 1 4 7
3- -SH групи 2,54± 0,02 1,69± 0,02* 1,47± 0,01* 2,17± 0,05* 1,88± 0,03** 2,13± 0,05** 2,48± 0,03**
місячні ГП 29,0± 0,45 17,6± 0,68* 14,0± 0,65* 17,1± 0,73* 20,4± 0,45** 25,3± 0,37** 27,1± 0,49**
ГР 10,2± 0,15 5,3± 0,30* 6,0± 0,55* 6,5± 0,45* 6,8± 0,45** 8,7± 0,35** 9,4± 0,20**
6- -SH групи 2,41± 0,05 1,88± 0,04* 1,62± 0,02* 2,12± 0,04* 1,98± 0,02** 2,23± 0,04** 2,39± 0,04**
місячні ГП 26,5± 0,60 19,4± 0,85* 13,3± 0,90* 15,8± 0,14* 22,4± 0,40** 24,5± 0,60** 26,2± 0,33**
ГР 12,2± 0,30 5,9± 0,80* 6,6± 0,30* 7,4± 0,50* 7,3± 0,55 9,1± 0,25** 11,6± 0,30**
18- -SH групи 2,28± 0,07 1,77± 0,01* 1,34± 0,01* 2,06± 0,03* 1,93± 0,04** 2,04± 0,06** 2,25± 0,03**
місячні ГП 23,9± 0,58 18,7± 0,41* 16,1± 0,67* 17,5± 0,84* 20,5± 0,62** 21,1± 0,57** 23,2± 0,61**
ГР 12,0± 0,44 5,6± 0,65* 5,9± 0,30* 6,8± 0,10* 8,7± 0,35** 9,3± 0,28** 11,7± 0,39**
Примітка. * – Р< 0,05 відносно показників інтактних тварин, ** – Р< 0,05 – відносно показників уражених тварин.
Водночас застосування ліпосом наближало рівень ЦП до рівня інтактних тварин. Рівень трансферину, який зазнавав суттєвих змін під впливом кадмію, також нормалізувався внаслідок дії ліпосом.
Активність СОД на 7-у добу суттєво підвищувалася як у крові, так і у печінці тварин. Концентрація АК на 7-у добу експерименту достовірно зростала у 6,1 рази у 3-місячних тварин і ставала близькою до норми, що свідчить про відновлення її вмісту та зменшення витрачання цього вітаміну на процеси інгібування ПОЛ. Введення ліпосом також нормалізувало концентрацію вітаміну А у крові і печінці усіх тварин. Таким чином, введення ліпосом сприяло достовірній номалізації показників, особливо в кінці експерименту, що свідчить про виразний антиоксидантний вплив ліпосом на організм тварин.
Застосування ліпосом корегувало зміни імунної системи тварин 3-, 6-, 18- місяців. На 7-у добу рівень імуноглобулінів A і М достовірно зріс, тоді як рівень імуноглобулінів G зменшився і наблизився до норми у тварин усіх вікових груп. Введення ліпосом вплинуло і на вміст ЦІК у крові тварин, наближаючи його до контрольних показників. Концентрація лізоциму у тварин 3-, 6- та 18-місяців нормалізувалася під впливом ліпосом на 7-у добу. Активність комплементу також зазнавала позитивних достовірних змін у тварин всіх вікових груп. Вірогідно найкращий ефект від терапії ліпосомами спостерігався у тварин 18-місячного віку.
Отже, результати досліджень з використанням ліпосом, навантажених антиоксидантами, показали доцільність їх застосування як потужного антиоксидантного середника, що нормалізує стан ферментативної і неферментативної ланок антиоксидантної системи та показники імунного статусу організму. Це дозволяє вважати можливим використання ліпосом в клініці гострих токсичних станів. Про те, що ліпосоми попереджують порушення АОС, свідчать й інші роботи (Ельский В.Н. и соавт., 1993).
Другим чинником, який було використано нами в експерименті - це прополіс, який володіє антиоксидантними властивостями (Бойнянский В., Кослянова В., 1981; Оконенко Л.Б., 1988; Тихонов А.И., 1996). Значну частинy в його складі займають біофлавоноїди та поліфенольні сполуки з антиоксидантною дією (Оконенко Л.Б., 1985). Крім цього, біофлавоноїди мають імуномодулюючі властивості. Так, встановлено, що вони зменшують клітинно-опосередковану імунну реактивність проти специфічних антигенів печінки хворих та попереджують утворення в лімфоцитах вільних радикалів (Кивалкина В.П., Бударкова Е.Л., 1972). У використаному нами прополісі ми виявили такі речовини: каротин, вітамін А та С, біофлавоноїди, фенольні сполуки. Введення прополісу викликало позитивні зміни стану АОС у тварин, уражених кадмієм. Так, під впливом прополісу у тварин 3-місячного віку спостерігалася чітка тенденція до підвищення активності КТ у печінці протягом експерименту в порівнянні із ураженими тваринами. Активність СОД під впливом прополісу поступово зростала. Позитивні достовірні зміни спостерігалися на 1-у і 4-у доби у крові та на 4-у та 7-у доби у печінці. До 7-ої доби активність СОД під впливом прополісу у печінці 3-місячних тварин становила від норми 88,3 %. Очевидно, що позитивна дія прополісу обумовлена його протекторною дією на біологічні мембрани. Крім цього, може мати також значення активація під впливом прополісу синтезу ферментів АОС. Достовірних змін зазнавав і рівень ЦП. Поступово відновлювалася його концентрація у крові і на 7-у добу досягала максимальних значень. Зазнавав під впливом прополісу позитивних змін і рівень трансферину. Так, на 7-у добу показники його достовірно знижувалися у 1,3 рази відносно даних уражених тварин. Введення прополісу корегувало зміни концентрації вітамінів А та С як у крові, так і у печінці. До 7-ої доби концентрація вітамінів достовірно зростала. Незначне підвищення активності ферментів глутатіонової системи, очевидно, із-за нездатності прополісу компенсувати пригнічення компонентів цієї системи. При цьому кращих результатів було досягнуто у тварин старшої вікової групи. Корекція прополісом імунологічних зрушень після введення кадмію призвела лише до часткової їх нормалізації. Достовірних позитивних змін вдалося досягнути у тварин 3- і 18-місяців. Вміст ЦІК у тварин за дії прополісу зазнавав зниження. Нормалізувалася до 7-ої доби концентрація лізоциму (у тварин 3-, 6-місяців) та показники активності комплементу. Нормалізуючий вплив прополісу, очевидно, зв'язаний із здатністю активізувати імунокомпетентну лімфоїдну тканину. Крім прямої дії на імунітет, прополіс діє опосередковано, впливаючи на функціональний стан печінки, роль якої у створенні імунологічної реактивності достатньо велика (Тихонов А.И., Сало Д.П., 1977; Сейланов А.С., Нурханов Б.М., 1990).
Одним із сучасних методів лікування токсичних уражень печінки є ентеросорбція, метод якої грунтується на пригніченні ендогенної інтоксикації внаслідок фіксації на поверхні сорбенту токсинів із шлунково-кишкового тракту (Андрейчин М.А., Гнатюк М.С., 1992) Під впливом ентеросорбції підвищуються адаптаційні можливості мікросомальної детоксикуючої системи у старих щурів до рівня дорослих (Скакун Н.П., Шманько В.В., Охримо-
вич Л.М., 1995). Сорбційні властивості притаманні також харчовим волокнам (Андрейчин М.А., Гнатюк М.С., 1992).
Нами було використано препарат “Фібрабет”, який створений на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горба-чевського проф. Я.І. Гонським та рекомендований МОЗ України як харчовий біологічно-активний додаток (Свідоцтво № 7.09.2951 від 25 листопада 1997 року). Крім сорбуючих речовин, в своєму складі він містить також вітаміни - А, В1, В2, В5, С, Е, Р та мікроелементи - калій, натрій, залізо, фосфор, марганець, мідь, цинк, що попереджують можливі негативні ефекти від введення сорбуючої речовини, збагачуючи організм потрібними мікроелементами та вітамінами. Поєднана дія прополісу із “Фібрабетом” виявилася більш ефективним засобом корекції кадмієвої інтоксикації, ніж сам прополіс, і проявилася нормалізацією частини показників АОС та імунітету в усіх тварин. Комбінація сорбційно-детоксикаційних властивостей “Фібрабету” та прополісу покращувала показники гуморальної ланки імунної системи та стану неспецифічної резистентності організму в більшій мірі, ніж сам прополіс. Так, концентрація лізоциму у тварин під впливом прополісу і “Фібрабету” дещо нормалізувалася відносно уражених тварин (р<0,05). Введення прополісу і “Фібрабету” покращувало показники активності комплементу на 7-у добу, що, можливо, зв'язано із зниженням функціонального навантаження на печінку і нормалізацією активності мікросомальних ферментів. Зменшення деструкції гепатоцитів знижує утворення аутоантитіл та запуск утворення ЦІК. Зниження вмісту ЦІК у крові тварин після впливу прополісу і “Фібрабету” підтверджує цю думку.
Позаяк кадмій найбільше вражає печінку, що показав огляд літератури і результати наших досліджень, була вивчена інтенсивність метаболічних процесів у ній. З цією метою визначали радіоактивність білків, загальних ліпідів, вуглеводів за допомогою радіоактивної мітки, роль якої виконував гліцин [гл-14С]. Протягом інкубації вловлювали СО2, який виділявся гомогенатом, і визначали його радіоактивність. Встановлено, що інтенсивність катаболічних процесів у печінці під впливом кадмію суттєво зростає вже на 1-у добу після введення кадмію і до 4-ої доби залишається в 1,7 рази достовірно вище показника у інтактних тварин. Це підтверджує думку про деструктивні зміни у печінці, які викликає кадмій як мембранолітик. Інтенсивність включення радіоактивної мітки гліцину у білковий, ліпідний та вуглеводний обіміни також знижується під дією хлориду кадмію, що є проявом порушення синтетичних процесів в організмі, і, очевидно, є наслідком блокування сульфгідрильних груп ферментів іонами кадмію, що було показано і в інших роботах (Shukla G.S., Srivastava R.S., Chandra S.V., 1987).
Отже, результати досліджень показали, що кадмій викликає виражені зміни стану захисних систем організму у тварин усіх вікових груп. Найбільш виражені зміни АОС виявилися у 3-місячних тварин. Результати показали імунотоксичний вплив кадмію, при цьому зміни з боку імунної системи більш істотними були у тварин 18-місячного віку. Корекція ліпосомами викликала нормалізацію більшості показників у тварин усіх вікових груп. Поєднане введення прополісу і “Фібрабету” проявляло позитивний вплив у більшій мірі, ніж сам прополіс.
Таким чином, результати наших досліджень підтвердили дані ряду дослідників, що кадмій проявляє токсичну дію на організм, і показали, що в основі цієї дії знаходиться його здатність пригнічувати антиоксидантну та імунну захисні системи організму, що може бути наслідком підсилення ПОЛ через руйнівну дію кадмію на мембрани взагалі і ендоплазматичної сітки, зокрема. Запропоновані нами засоби для корекції порушень метаболізму при кадмієвому токсикозі засвідчують доцільність використання їх для нормалізації біохімічних порушень, викликаних солями важких металів та іншими токсичними речовинами.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у встановленні вікових особливостей антиоксидантної та імунної систем у тварин з кадмієвою інтоксикацією та пошуку ефективного, природного способу корекції кадмієвої інтоксикації за допомогою антиоксидантів і сорбентів. Ця наукова задача вирішена шляхом експериментального вивчення антиоксидантної та імунної систем у тварин у віковому аспекті та використання ліпосом із інкорпорованими антиоксидантами, поєднання прополісу та ентеросорбенту “Фібрабету” з метою корекції інтоксикації.
Призначення наукової задачі – удосконалення та підвищення ефективності профілактики та лікування токсичних уражень важкими металами.
У результаті вирішення наукової проблеми встановлено такі наукові і прикладні висновки:
1. Ураження тварин хлоридом кадмію викликає пригнічення ферментативної (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза) та неферментативної (аскорбінова кислота, вітамін А, -SH групи) ланок антиоксидантної системи у печінці тварин усіх вікових груп, причому найбільш виражені зміни спостерігаються у 3-місячних тварин на 1-у добу експерименту.
2. У крові всіх тварин під впливом хлориду кадмію настають фазові зміни вмісту трансферину та SН-груп, а також пригнічення активності супероксиддисмутази та зниження рівня церулоплазміну майже у всі терміни дослідження. Зростання активності каталази у крові тварин усіх вікових груп при одночасному зниженні активності у печінці свідчить про перерозподіл її із печінки у кров.
3. Інтоксикація кадмієм викликає суттєві зміни гуморального імунітету та стану неспецифічної резистентності організму: у крові тварин усіх вікових груп знижується рівень усіх досліджуваних класів імуноглобулінів, активність комплементу та зростає рівень циркулюючих імунних комплексів. Найменший рівень циркулюючих імунних комплексів, імуноглобулінів і лізоциму спостерігається у 18-місячних тварин. Вміст імуноглобулінів G, починаючи із 7-ої доби, зростає у тварин усіх вікових груп.
4. В результаті дії хлориду кадмію у печінці дорослих тварин суттєво порушується вуглеводний, ліпідний, білковий обміни та інтенсифікуються катаболічні процеси, особливо на 1-у добу.
5. Корекція кадмієвої інтоксикації ліпосомами, начиненими манітолом і цитохромом С, сприяє нормалізації показників антиоксидантної та імунної систем у тварин усіх вікових груп до 7-ої доби, особливо у тварин 18-місячного віку.
6. Введення прополісу викликає позитивні зміни стану антиоксидантної та імунної систем у тварин усіх вікових груп як у крові, так і у печінці, що підтверджує його антиоксидантні та імунорегулюючі властивості.
7. Поєднане введення прополісу і “Фібрабету” з метою корекції змін антиоксидантної та імунної систем має нормалізуючий вплив на тварин усіх вікових груп із кадмієвим токсикозом.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1.
