ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Б О Б А К

ЯРОСЛАВ ПЕТРОВИЧ

УДК 575.24:577.391:577.158.5

Спонтанний та індукований рентгенівським

опроміненням мутагенез у ліній lozenge

Drosophila melanogaster та характеристика

фенолоксидази у одержаних мутантів

03.00.15 – Генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Львівському національному університеті

імені  Івана  Франка
Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Черник Ярослава Іванівна

Львівський національний університет

імені Івана Франка

доцент

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Коновалов Вячеслав Сергійович

Інститут розведення і генетики тварин УААН

старший науковий співробітник

кандидат біологічних наук, доцент

Безруков Володимир Федорович

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка

доцент

Провідна установа: Інститут агроекології та біотехнології УААН

Захист відбудеться " 13 " квітня 2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ_, вул. Васильківська 31/17 .

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, Київ-22, вул. Васильківська 31/17).

Автореферат розіслано " 10 " березня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми

Проблема генетичної нестабільності є однією з центральних у вивченні спонтанного та індукованого мутагенезу. Відкриття та дослідження мобільних генетичних елементів (МГЕ) у еукаріотичних організмів дозволило встановити, що важливим джерелом мінливості молекулярної структури геному є транспозиції МГЕ, а підвищена мутабільність окремих генів є фенотиповим проявом цих процесів [Ильин, 1982; Хесин, 1985; Ананьев, 1989]. В ряді робіт [Ананьев, 1989; Герасимова и др., 1990; Smith, Corces, 1991; Мурадян, 1992; Щербата та ін., 1999] було проведено детальний аналіз транспозиційних подій у D.в геномі якої виявлено декілька родин мобільних елементів, і яка є хорошою тест-системою для обліку мутацій і виявлення характеру мутаційних змін. Однак, природа нестабільних локусів у дрозофіли вивчена, в основному, на індукованих різними типами схрещувань [Engels, 1979; Ильин, 1982; Георгиев, Могила, 1988] і хімічними реагентами [Гершензон, Александров, 1982; Александров, Гершензон, 1985; Максимів та ін., 1995; Щербата, Максимів, 1997] системах нестабільності. Актуальним на даний час є вияснення впливу малих доз рентгенівського опромінення (РО) на мінливість геному та розробка методів прогнозування віддалених генетичних наслідків дії радіації. Різноманітні радіобіологічні дослідження проводяться і на дрозофілі. В ряді робіт показано, що радіоіндукована відповідь залежить від стадії розвитку, фізіологічної зрілості та статі імаго [Ватти, Джапаридзе, 1980; Giess, 1980; Моссэ и др., 1986]; проаналізовано вплив РО на тривалість життя і плодючість [Сущенко и др., 1985; Вайсерман и др., 1993]. Разом з тим дані про мінливість геному D. melanogaster з проходженням транспозиційних процесів при дії радіації в літературі є поодинокими та фрагментарними [Eeken, Sobels, 1986; Александрова и др., 1989; Забанов и др., 1995].

Важливе значення для розуміння закономірностей і механізмів мутаційного процесу, місця та ролі в ньому МГЕ має дослідження нестабільних систем природного походження. Моніторинг природних популяцій D. melanogaster дозволив виділити та описати нестабільні алелі для ряду генів - yellow, white, singed, forked, cut та деяких інших; найбільш повно охарактеризовані локуси singed та yellow [Голубовский, Беляева, 1985; Голубовский и др., 1987; Максимів та ін., 1995]. Цікавим та маловивченим в цьому плані є складний локус lozenge (lz; 1_27.7), який складається з чотирьох груп комплементації, має широкий спектр фенотипового прояву, характеризується високою частотою внутрігенних рекомбінаційних процесів. Крім того відомо, що ген lozenge є одним із регуляторів активності фенол-оксидази (ФО), ферменту, який відіграє важливу роль в меланізації, склеротизації та захисних реакціях у D. [Peeples et al., 1968; Warner et al., 1974; Rizki et al., 1985]. В оргнізмі дрозофіли ФО присутня у вигляді проферменту, представленого окремими білковими компонентами, який надалі піддається активації [Ohnishi, 1954; Ashida, Yamazaki, 1990]. Відомо, що фермент має множинний генетичний контроль. В другій групі зчеплення D. melanogaster локалізовані гени Dox-A2 і Dox-3, які кодують, відповідно, субодиниці A2 і A3 [Rizki et al., 1985; Pentz et al., 1986]; локалізація гену Dox-A1 не була встановлена. Вивчення фенолоксидазної активності на різних стадіях розвитку дрозофіли показало, що максимальна активність ферменту досягається в кінці третього личинкового періоду і у пізніх лялечок, коли відбувається формування пупарію, кутикули і меланізація [Geiger, Mitchell, 1966; Mitchell, 1966]. Однак, відомості про функціонування фенолоксидазного комплексу, його активацію, генетичний контроль та регуляцію на стадії імаго у D.в літературі відсутні, тому вияснення цих питань ввійшло в задачі даного дослідження.

Мета і основні завдання наукового дослідження

Метою роботи було проаналізувати спонтанну та індуковану РО мутабільність локусу lozenge у ліній Drosophila melanogaster та дослідити функціонування ФО у одержаних мутантів.

В зв’язку з цим були поставлені наступні завдання:

1.

1.

1.

Наукова новизна роботи

В результаті проведених експериментів встановлено, що стабільність ліній lozenge D. melanogaster тісно пов’язана з фенотиповим проявом алелю lozenge. Виявлений вплив на мутабільність алелю lz75V генетичних елементів статевої та 2-ї хромосом. Відмічена висока локусоспецифічність мутаційних подій - генеративні і соматичні мутації відбувалися, як правило, в нестабільних локусах. В Х-хромосомі ввиявлений новий регуляторний елемент, який впливає на фенотиповий прояв гену lz; він позначений нами як su(lz75V) і картований в положенні 1_22.7 одиниць карти. Показано, що опромінення сумарними дозами 3 Гр, 10 Гр і 30 Гр приводить до зростання числа мутаційних подій як в генеративних, так і в соматичних клітинах ліній D. melanogaster, які містять в Х-хромосомі нестабільні локуси. Висока частота появи індукованих мутантів спостерігається протягом декількох поколінь і супроводжується широким спектром мутаційних подій.

Досліджено ферментативну активність та електрофоретичний спектр фенолоксидази D. melanogaster в залежності від генотипу, статі та віку. Встановлена кореляція між фенотиповим проявом гену lz та активністю фенолоксидази. У ліній з різним алельним станом гену lozenge виявлена залежність між рівнем активності фенол-оксидази в репродуктивний період самок і їх фертильністю. На основі рекомбінаційного аналізу показано вплив генетичних елементів Х- та 2-ї хромосом на активність фенолоксидази у ліній з різними алелями lozenge. Вперше на основі поліморфізму за фракцією А1 встановлено димерну структуру А1-компоненту фенолоксидази, а ген Dox, що кодує його субодиниці, локалізовано в положенні 2_67.3 одиниць карти.

Науково-практична цінність роботи

Вивчення закономірностей спонтанного та індукованого рентгенівсь-ким опроміненням мутагенезу, а також вияснення природи змін в структурі геному у такого модельного об’єкту як дрозофіла допомагають правильно інтерпретувати мутаційні процеси у інших еукаріотичних організмів. На основі отриманої колекції lozenge-мутантів D. melanogaster створена модельна система, яка дає можливість аналізувати мутаційні події як в генеративних, так і в соматичних клітинах напротязі ряду поколінь і, таким чином, прогнозувати віддалені наслідки дії радіації на геном.

Дані про функціонування фенолоксидазного комплексу у D.на різних стадіях раннього та пізнього онтогенезу і в залежності від генотипу поглиблюють знання про генетичний контроль і регуляцію експресії цієї важливої ген-ензимної системи. Той факт, що існує кореляція між фертильністю самок дрозофіли та рівнем активності фенолоксидази, може бути використаний в процесі розробки біологічних методів боротьби з комахами-шкідниками.

Апробація роботи

Основні наукові результати дисертаційної роботи доповідались на звітних конференціях викладачів та співробітників Львівського державного університету ім. І.Франка (1994, 1996, 1998 рр.). Матеріали роботи були представлені на Всесоюзному симпозіумі: Об’єм та методи генотоксичної оцінки та побічних ефектів біологічно активних речовин (Ленінград, 22-26 травня 1989 р.), на 6 Всесоюзній Нараді з проблем біології та генетики дрозофіли (Одеса, 7-12 вересня 1989 р.), конференції Еколого-генетичний моніторинг стану навколишнього середови-ща (Караганда, 5-8 вересня 1990 р.), 4 Всесоюзній конференції Екологічна генетика рослин, тварин, людини (Кишинів, 20-21 листопада 1991 р.), 1 Всесоюзній конференції з генетики комах (Москва, листопад 1991 р.), з’їзді УТГтаС ім. Вавілова. (Полтава, 1992 р.), 2 Українському з’їзді радіобіологів (Київ, 1993 р.), 2 міжнародній конференції Радіобіологічні наслідки забруднення оточуючого середовища (Москва, 25-26 жовтня 1994 р.), міжнародній конференції Партнерство в охороні навколишнього середовища (Вроцлав, 1996 р.), Третьому з’їзді з радіаційних досліджень (Москва 14-17 жовтня 1997 р.).

Публікації

За метеріалами дисертації опубліковано 16 наукових праць, з них 4 статті у провідних фахових виданнях.

Структура і об’єм роботи

Дисертація викладена на 108 сторінках, включаючи 19 таблиць, 10 рисунків і фотографій і складається зі вступу, огляду літерарури, експериментальної частини з обговоренням одержаних результатів, висновків, а також списку літератури, який включає 224 джерела.

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових результатів

У процесі виконання дисертаційної роботи автором самостійно опрацьовано значний об’єм вітчизняної та закордонної літератури по темі виконуваних наукових експериментів. Самостійними є вибір методів дослідження, проведення експериментів, отримання експериментальних даних. Спільно з науковим керівником проведено аналіз одержаних результатів та їх інтерпретацію.

матеріали і методи досліджень

Матеріалом досліджень служили високоінбредні лінії Drosophila melanogaster дикого типу та з маркерами по Х-хромосомі. Опромінення проводили на апараті РУМ 11 потужністю дози 300 Р/хв; сумарні дози становили 3 Гр, 10 Гр та 30 Гр.

Для врахування спонтанних та індукованих РО мутацій в Х-хромосомі використовували самок зі зчепленими Х-хромосомами C(1)DX, y w f /Y. Аналізували потомків 1-5 поколінь. Частоту виникнення домінантних летальних мутацій (ДЛМ) визначали за співвідношенням кількості яєць з пізніми ембріональними леталями до загальної кількості проаналізованих яєць [Ватти, Джапаридзе, 1980]. Фертильність самок визначали на основі аналізу розвитку від індивідуальних схрещуваннь 1 самки з 5 самцями.

Активність фенолоксидази визначали за Мітчелом [Mitchell, 1966]. Реакційна суміш містила 0.3мМ розчин ДОФА в 0.1М фосфатному буфері (рН 6.3) та гомогенат. Проміри вели при 300С на протязі 6 хв при 475 нм на спектрофотометрі СФ_. Концентрацію білку в гомогенатах визначали за методом Лоурі [Lowry, 1951].

Дослідження спектру електрофоретичних фракцій фенолоксидази проводили згідно з модифікованою методикою Лемлі [Laemmli, 1970] в пластинах поліакриламідного гелю. Для активації проферменту гелі після завершення електрофорезу інкубували в інкубаційній суміші, яка складалася з 0.1М фосфатного буферу, рН 6.3, та одного із спиртів: метанолу, етанолу чи 2-пропанолу у співвідношенні 1:1. Гелі відмивали та інкубували в 0.1М фосфатному буфері, рН 6.3, який містив ДОФА.

Статистичну обробку отриманих даних проводили з використанням програми Statistica 5.0.

основні результати та їх обговорення

Мутабільність ліній lozenge Drosophila melanogaster

В роботі використано серію ліній lozenge (lz) D.які походять від генетично нестабільної лінії lz75V, виділеної з природної популяції Далекого Сходу. Роботами Голубовського та Волошиної показано, що висока мутабільність алеля lz75V обумовлена інсерцією в нього Р_елементу [Голубовский и Волошина, 1990]. Досліджувані лінії були розділені на 4 фенотипові класи, які перечислені в порядку підсилення фенотипового прояву: lz+, lzsl , lz75V та lzex. До кожного з класів відносився ряд алелів, які виникли незалежно. На основі аналізу частоти виникнення спонтанних мутантів виділено дві групи ліній: стабільні та нестабільні, відмінності між якими тісно пов’язані з алельним станом гену lz (табл. 1). Генетично стабільними виявилися лінії з фенотипом lz+ та лінії з максимальним вираженням гену lz - lzex. Серед потомків цієї групи ліній не було виявлено жодного мутаційного переходу по гену lz, а поодинокі мутаційні події відбувалися за його межами. До другої групи належали нестабільні лінії з алелями lzsl та lz75V, які відрізнялися між собою за рівнем і напрямом мутування. Кожен алель володів певним спектром мутацій; найчастіше фіксувалися мутаційні переходи до lz+. Описаний новий алель, позначений нами як lzss (lozenge super strong), який за фенотипом близький до lzex, однак відрізняється від нього темно-червоним кольором ока. Серед потомків досліджених ліній, крім повних мутантів, виявлені соматичні мозаїків по в генах rough (rou) та lz. Частота виникнення мутацій в соматичних клітинах була низькою і не залежала від алельного стану гену lozenge (табл. ). Тест на комплементацію показав, що всі досліджені алелі lz відносились до однієї групи комплементації, а всі мутаційні події відбувалися в сублокусі glossy складного локусу lozenge.

Пов’язуючи нестабільність досліджуваних ліній з активністю Р_елементу в локусі lozenge логічно було припустити, що мутації, які виникали de novo, були наслідком Р – М гібридного дисгенезу. На основі результатів схрещуваня з лінією 2 (сильна Р-лінія) показано, що лінія з алелем lz75V.1L поводить себе як М-лінія, демонструючи високий рівень стерильності при 25оС і статистично достовірне зростання цього показника при 29оС. В той же час у гібридних самок, які несли Х-хромосому з алелем lz75V.1L від нестабільних ліній lz75V.1L (88.5), y lz75V.1L (89.1) та snex lz75V.1L (91.1) в компаунді з Х-хромосомою М-лінії y ct v f, теж виявлено високий (90% і вище) відсоток стерильності вже при 25оС, що свідчить про відсутність характерних проявів Р-М гібридного дисгенезу.

З метою вивчення впливу аутосом на мутабільність гену lz у лінії lz75V.1L була проведена заміна другої хромосоми на хромосому лабораторної лінії black. Частота виникнення мутантів у отриманої лінії lz75V.1L b (89.3) різко зросла, що свідчило про вплив на частоту мутування досліджуваного алелю генетичних елементів другої хромосоми лінії black; спектр мутацій при цьому залишався незмінним. У стабільних ліній lz+ та lzex заміна 2-ї хромосоми не приводила до зміни рівня мутабільності. Щоб встановити, чи наявні регуляторні елементи в Х_хромосомі, проаналізовано ряд ліній lz, отриманих в результаті рекомбінаційних замін ділянок Х75V – хромосоми на ділянки Х-хромосоми лабораторних ліній yellow та y ct v f . Показано, що в дистальній частині Х75V – хромосоми присутні фактори, необхідні для підтримання нестабільного стану гену lozenge, тому що їх елімінація шляхом рекомбінації суттєво знижує мутабільність похідних від lz75V нестабільних алелів. На основі аналізу рекомбінантів, одержаних в результаті схрещування мух ліній lz75V (88.3) і y ct v f виявлено, що у 64,32% особин класу рекомбінантів ct – lz спостерігалося суттєве послаблення прояву алелю lz75V – фенотип був близький до lzВ. Фенотип lzВ не зустрічався cеред основних класів та інших типів рекомбінантів, тому можна було припустити, що він виник в результаті впливу на алель lz75V певного генетичного елементу, розташованого в Х-хромосомі на ділянці між генами ct i lz. Оскільки відбувалася супресія алелю lz75V, даний генетичний елемент був позначений нами як su(lz75V) і локалізований в положенні 1-22.7 одиниць карти (табл. 2).

Таблиця 2

Аналіз потомства в системі схрещування lz75V /yv f y ct v f

Фенотип потомків | Проаналізовано самців

Всього | З фенотипом lz75V | З фенотипом lzB

n | % | n | %

нерекомбінантні класи:

y ct v f

lz75V | 1254

1109 | -

1109 |

100 | -

-

рекомбінантні класи:

1) y lz75V, lz75V v f, lz75V f, y lz75V v f, y lz75V f, lz75V v. | 843 | 843 | 100 | -

2) y ct lz75V, y ct lz75V v f, y ct lz75V f, ct lz75V. | 213 | 76 | 35,68 | 137 | 64,32

З метою дослідження взаємозв’язку між мутуванням гену lz та інших нестабільних генів Х-хромосоми в дистальну частину Х-хромосоми лінії lz75V.1L шляхом рекомбінації були введені ділянки хромосом нестабільних ліній snex lz+ та y2 wa4. Синтезовані та похідні від них лінії містили в Х-хромосомі у різних комбінаціях два або чотири нестабільні алелі з інсерціями МГЕ (рис. 1). Нестабільними у даних ліній залишалися алелі lz75V.1L та lzsl.4L. Відмічено достовірне зростання рівня мутування алелю lz75V.1L в присутності алелів carmine та singedf. Серед інших генів Х-хромосоми найчастіше мутації в генеративних та соматичних клітинах виникали в локусі sn (sn+ snex, sn+snf). Таким чином, у всіх про-аналізованих ліній відмічена висока локусоспецифічність мутаційних подій; мутації відбувалися, як правило, в генетично нестабільних локусах, які містили інсерції МГЕ. Основну кількість мутантів складали мутаційні переходи по гену lozenge. Відмічене зростання частоти мутуваня гену lozenge при зміні генетичного оточення.

Вплив рентгенівського опромінення на мутабільність ліній D. з різним алельним станом гену lozenge

У групи ліній lozenge методом обліку домінантних летальних мутацій досліджено вплив РО сумарною дозою 30 Гр. Кожна з проаналізованих ліній в контролі володіла індивідуальним рівнем ДЛМ, який зазнавав статистично достовірного зростання в потомства F1 після опромінення. Кореляції між рівнем нестабільності ліній, алельним станом гену lozenge та рівнем ДЛМ не було виявлено. Отримані результати свідчили про те, що використана в експерименті доза РО є мутагенною для даної групи ліній D.Власне доза 30 Гр була використана при дослідженні частоти виникнення та спектру індукованих РО мутантів у ліній lozenge. Як і в контролі (при визначенні спонтанного рівня мутування), стабільними виявилися лінії з алелями lz+ та lzex, а поодинокі мутаційні події відбувалися за межами локусу lozenge (табл. 3). У нестабільних ліній з алелями lzsl та lz75V частота мутування в F1 після дії РО достовірно зростала у всіх випадках. Звернули на себе увагу розширення та зміна спектру алелів lz, які виникли de novo і складали основну масу мутантів, а також виникнення мутацій в інших генах - yellow, white, carmine, rou, які в контролі не фіксувалися. Разом з тим опромінення дозою 30 Гр не приводило до зміни частоти виникнення соматичних мозаїків у досліджуваної групи ліній, за виключенням лінії lz75V.1L, у якої цей показник достовірно перевищував дані при спонтанному мутуванні (табл. ).

В ході наступних експериментів був проаналізований вплив РО на частоту виникнення генеративних мутантів та соматичних мозаїків у ряду ліній, які в Х_ хромосомі несли інші нестабільні гени (рис. 2). Використані сумарні дози 3 Гр, 10 Гр та 30 Гр. Аналіз проводили на протязі 3-5 поколінь. Хоча кожна лінія мала певні індивідуальні особливості, були встановлені загальні закономірності радіоіндукованої відповіді. У всіх досліджених ліній частота виникнення мутантів зросла вже в F1 у порівнянні з контролем і зберігалася на високому рівні протягом декількох поколінь. Однак, опромінення сумарною дозою 30 Гр зумовлювало ширший спектр мутаційних подій і тривалішу в часі дестабілізацію генів, ніж дія 3 Гр і 10 Гр. Відмічена висока локусоспецифічність виявлених de novo мутацій: основна їх кількість виникала в локусі lozenge, та інших локусах Х-хромосоми - yellow, white, singed, які містили інсерції МГЕ. Таким чином, одержані результати свідчать про те, що нестабільні гени Drosophila можуть служити маркерами при дослідженні впливу РО.

Активність та електрофоретичний спектр фенолоксидази

На рис.3 представлені електрофоретичні спектри фенолоксидази личи-нок, лялечок та імаго OregonD. melanogaster при активації метанолом, етанолом та 2_пропанолом. Прояв фракцій фенолоксидази на електрофореграмах свідчив про те, що використані спирти по-різному впливають на активацію проферментів ФО на передімагінальних стадіях (у личинок третього віку і 24-х годинних лялечок): етанол і 2_пропанол активують A1 та A3 компоненти, а метанол активує всі три фракції - A1, A2, A3 (при цьому максимальною активністю володіє фракція A3). Для одноденних імаго при активації різними спиртами характерною була присутність на електрофореграмах тільки однієї фракції A1. Аналогічний прояв компонентів ФО-комплексу в процесі онтогенезу був виявлений і у всіх інших досліджених нами ліній D. melanogaster. На основі електрофоретичних досліджень, проведених через день на протязі 25 днів життя імаго, показана відсутність генотипових, статевих і вікових відмінностей; у всіх зразках виявлявся тільки A1_компонент фенолоксидаз-ного комплексу.

На основі аналізу електрофоретичного спектру ФО у ліній дикого типу та ряду лабораторних ліній нами виявлено поліморфізм за фракцією A1. F (Fast)-форма була присутня у ліній Анапа та yа S (Slow) - у всіх інших досліджених ліній. У гібридів F1 від схрещування y w b cn vg проявлялись три смуги активності фракції A1: по одній смузі, характерній для вихідних батьківських форм, і смуга з проміжною рухливістю (рис. 4). На основі цього був зроблений висновок, що компонент A1 фенолоксидазного комплексу є димером, субодиниці якого in vivo вільно комбінуються, формуючи гібридну молекулу.

Для встановлення групи зчеплення гену, який кодує субодиниці А1_компоненту ФО, ми використали методику отримання експериментальних ліній D. melanogaster з ізогенізованими хромосомами. Внутрішньохромосомна локаліза-ція гену Dox-A1 проведена на основі електрофоретичного аналізу рекомбінантних особин, отриманих в результаті аналізуючого схрещування між лініями Анапа і b cn vg (табл. 4). Структурний ген Doxлокалізовано нами в другій групі зчеплення в положенні 67.3 од. карти.

З метою визначення рівня експресії гену Dox-A1 нами спектрофото-метричним методом була досліджена активність фенолоксидази у ліній з різними алельними станами гену lozenge. Виявлені достовірні міжлінійні відмінності у рівні активності ферменту. Встановлена кореляція між алельним станом гену lz і активністю ферменту (табл. 5). Група ліній lz+ характеризувалася найвищою ферментативною активністю. У більшості ліній з фенотипом lzsl та lz75V рівень активності ферменту був знижений, а у lzex - мінімальний. Вікова динаміка активності ФО мала таку спрямованість: найвищою активністю володіли одноденні мухи, протягом перших п’яти днів життя активність ферменту знижувалась і надалі стабілізувалась. У самок цей процес відбувався поступово і специфічно у окремих ліній, причому чіткі міжлінійні відмінності зберігалися до 20 дня життя. У самців всіх досліджених ліній вже на 5 день спостерігався різкий спад активності ферменту, і в період з 5 по 20 день підтримувався той мінімальний рівень фенолоксидази, який, очевидно, необхідний для нормального функціонування захисної системи у дрозофіли. Високий рівень активності фенолоксидази у самок в репродуктивний період може бути пояснений потребою в цьому ферменті для утворення поліфенольних оболок яєць. Виявлена позитивна кореляція (r=0,955) між рівнем активності фенолоксидази у самок в репродуктивний період і їх фертильністю. Самки ліній, у яких активність ФО в репродуктивний період є високою, характеризуються високою фертильністю (більше 90%), тоді як самки ліній з низькою ферментативною активністю, мають низьку фертильність (менше 10 %).

Таблиця 4

Результати рекомбінаційного картування локусу Dox-A1

Генотип

рекомбінантного

класу | Число

проаналізованих особин | Число особин з різними формами А1 _компоненту фенолоксидази

F/S | S/S

b cn vg/ b + +

b cn vg/ + cn vg

b cn vg/ b cn +

b cn vg/ + + vg | 31

56

69

89 | 28

8

67

3 | 3

48

2

86

Примітка. Загальна кількість проаналізованих особин 245.

З метою дослідження впливу генетичних елементів Х- та 2 хромосом на активність ФО була проведена заміна 2 хромосоми та ділянок Х_хромосоми у ряду ліній з різними алельними станами гену lz. Визначена активність ФО у рекомбінантів, одержаних в результаті схрещування між лініями lz75V і y ct v f. Вихідні лінії достовірно відрізнялися за рівнем активності ферменту у одноденних імаго. Заміна у лінії lz75V ділянки Х-хромосоми від yellow (1-0.0) до cut (1-20.0) приводила до достовірного зростання активності фенолоксидази; заміна Х_хромосоми на ділянці від vermillion (1-33.0) до forked (1-56.7) ніяких змін не викликала. На підставі цих даних ми припустили, що регуляторний генетичний елемент, який впливає на рівень активності ферменту, розміщений у проксимальній ділянці Х_хромосоми і тісно зчеплений з геном yellow. Надалі була досліджена фенолоксидаза у лінії y2 wa4+3L75V.1L, яка характеризувалася високою активністю ферменту. Встановлено, що мутаційні переходи lz75V.1L  lz+ не приводили до змін у функціонуванні ФО. Разом з тим реверсія гену yellow до норми (y2 +) в присутності алелю lz75V.1L  знижувала активність ферменту до рівня ліній lz75V, а реверсія гену lozenge (lz 75V.1L lz+ при наявності алеля y+ вела до відновлення високого рівня активності ферменту. Одержані результати свідчили про регуляторний вплив на активність ФО в присутності алеля lz75V.1L власне гену yellow. При заміні 2-хромосоми від темнопігментованої лінії black cпостерігалось підвищення активності ФО у ліній з алелями lzsl та lz75V. У ліній lz+1L та lzex.1L перебудови геному за межами Х-хромосоми не викликали змін у функціонуванні ферменту.

Висновки

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Список опублікованих автором праць за темою дисертації

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Бобак Я.П. Спонтанний та індукований рентгенівським опроміненням мутагенез у ліній lozenge Drosophila melanogaster та характеристика фенолоксидази у одержаних мутантів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено виясненню закономірностей і механізмів спонтанного та індукованого рентгенівським опроміненням (РО) мутагенезу у ліній lozenge D.та дослідженню функціонування ген-ензимної системи фенолоксидази (ФО) у одержаних мутантів. Встановлено, що стабільність ліній lozenge тісно пов’язана з фенотиповим проявом алелів lz, на мута-більність яких впливають генетичні елементи Х- та 2-ї хромосом. Відмічена висока локусоспецифічність мутаційних подій. Показано, що індуковані РО мутації виникають з високою частотою як в генеративних, так і в соматичних клітинах протягом ряду поколінь, при цьому маркерами впливу низьких доз радіації у дрозофіли можуть служити нестабільні гени. Виявлено генотипові, вікові та статеві відмінності в експресії ген-ензимної системи фенолоксидази у імаго D. melanogaster. Встановлено димерну структуру А1-компоненту ФО та локалізовано ген Dox-A1. Одержані результати сприяють удосконаленню експериментальної роботи по аналізу віддалених наслідків дії радіації на геном еукаріотичних організмів та поглиблюють знання про генетичний контроль і регуляцію експресії фенолоксидазного комплексу.

Ключові слова: дрозофіла, мобільні генетичні елементи, нестабільні гени, рентгенівське опромінення, ферментативна активність, фенолоксидаза.

Бобак Я.П. Спонтанный и индуцированный рентгеновским облучением мутагенез у линий lozenge Drosophila melanogaster и характеристика фенолоксидазы у полученных мутантов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. Институт физиологии растеий и генетики НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена выяснению закономерностей и механизмов спонтанного и индуцированного рентгеновским облучением (РО) мутагенеза у линий lozenge D. melanogaster и исследованию функционирования ген-энзимной системы фенолоксидазы (ФО) у полученных мутантов. Анализом частоты возникновения спонтанных мутантов выделено две групы линий - стабильные и нестабильные, отличия между которыми тесно связаны с фенотипическим проявлением аллелей lozenge. Генетически стабильными оказались линии с фенотипом lz+ и линии с максимальным выражением гена lz - lzex; нестабильными были линии с аллелями lzsl и lz75V, которые различались между собой за уровнем и направлением мутирования. Тест на комплементацию показал, что все исследованые аллели lz относились к одной групе комплементации, а все мутационные события происходили в одном сублокусе - glossy сложного локуса lozenge. Мутирование lz-аллелей не сопровождалось проявлением Р-М гибридного дисгенеза. Показано, что определенные генетические элементы второй хромосомы линии black приводят к возростанию мутабильности аллеля lz75V, а в дистальном участке Х75V – хромосомы присутствуют факторы, необходимые для поддержания нестабильного состояния данного локуса, поскольку их элиминация путем рекомбинации существенно снижает мутабильность производных от lz75V нестабильных аллелей. Выявлено регуляторный генетический элемент, который влияет на экспрессию аллеля lz75V; он обозначен нами как su(lz75V) и картирован в Х-хромосоме в положении 22.7 единиц карты. Синтезированы линии, которые в Х-хромосоме в разных комбинациях содержали два или четыре нестабильные гены с инсерциями МГЕ. У всех проанализированных линий при исследовании как генеративных мутантов, так и соматических мозаиков проявлялся локусоспецифический мутагенез; мутации происходили, как правило, в нестабильных локусах - yellow, white, singed, lozenge. Преимущественно возникали мутационные переходы по гену lz, частота мутирования которого возрастала при изменении генетического окружения. Каждая линия lozenge в контроле владела индивидуальным уровнем возникновения доминантных летальных мутаций (ДЛМ), который достоверно возрастал в потомстве F1 после рентгеновскго облучения суммарой дозой 30 Гр. Корреляции между уровнем нестабильности линий, аллельным состоянием гена lozenge и уровнем ДЛМ не выявлено. Показано, что РО в дозах 3 Гр, 10 Гр и 30 Гр приводит к возрастанию числа мутационных событий в генеративных и в соматических клетках линий Drosophila melanogaster, которые несут в Х-хромосоме нестабильные локусы. Частота возникновения индуцированных мутантов уже в F1 была достоверно более высокой, чем данный показатель при спонтанном мутировании, и сохранялась на высоком уровне на протяжении нескольких поколений. Повышение суммарной дозы облучения до 30 Гр приводило к расширению спектра мутационных событий и более длительной во времени дестабилизации генов. Отмечена высокая локусоспецифичность выявленных de novo мутаций. Исследовано ферментативную активность и электрофоретический спектр фенолоксидазы в зависимости от генотипа, пола и возраста D. melanogaster. У разных линий полный спектр фракций - A1, A2, A3 проявлялся при активации метанолом у личинок третьего возраста и у 24-часовых куколок; для однодневных имаго характерной было присутствие на электрофореграммах только одной фракции A1. На основании полиморфизма по фракции A1 установлено димерную структуру А1-компонента ФО, а ген Dox-A1, который кодирует его субъединицы, локализован во 2-й группе сцепления в положении 67,3 единиц карты. Показано, что уровень и возрастная динамика активности ФО имеет генотипическую и половую зависимость. Установлена корреляция между фенотипическим проявлением гена lz и активностью фермента, между уровнем активности ФО и фертильностью самок в репродуктивный период. С целью исследования влияния генетических элементов Х- и 2-хромосом на активность фермента была проведена замена 2-хромосомы и участков Х_хромосомы у ряда линий с разными аллельными состояниями гена lz. Установлено, что экспрессия фермента в присутствии lz75V.1L-аллеля регулируется геном yellow, а в присутствии алелей lzsl та lz75V - генетическими элементами второй хромосомы. Полученные результаты способствуют усовершенствованию экспериментальной работы по анализу отдаленных последствий воздействия радиации на геном эукариотических организмов и углубляют знания о генетическом контроле и регуляции экспрессии фенолоксидазного комплекса.

Ключевые слова: дрозофила, мобильные генетические элементы, нестабильные гены, рентгеновское излучение, ферментативная активность, фенолоксидаза.

Bobak Ya.P. Spontaneous and induced by X-ray irradiation mutagenesis in Drosophila melanogaster lozenge strains and characteristic of phenoloxidase in obtained mutants.- Manuscript.

Thesis for a Ph.D. degree on speciality 03.00.15 - genetics.- The Institute of Plant Phisiology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to elucidation of regularities and mechanisms of spontaneous and induced by X-ray mutagenesis in Drosophila melanogaster lozenge strains and to investigations of phenoloxidase gene-enzyme system in obtained mutants. It has been established that stability of