Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної

медицини УААН

К О Ц Ю М Б А С

Ігор Ярославович

УДК: 619:615.9:658.562(043.3/5)

СИСТЕМА ТОКСИКОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ

ЗАСОБІВ ЗАХИСТУ ТВАРИН ТА КОРМОВИХ ДОБАВОК

(розробка, апробація та впровадження)

16.00.04 – ветеринарна фармакологія і токсикологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Державному науково-дослідному контрольному інституті ветеринарних препаратів та кормових добавок (ДНДКІ ветпрепаратів) Міністерства аграрної політики України

Науковий консультант – доктор біологічних наук, професор Малик Остап Григорович, завідувач відділу фармакології і токсикології ДНДКІ ветпрепаратів

Офіційні опоненти :

-

-

-

Провідна установа:

Білоцерківський державний аграрний університет кафедри: терапії та клінічної діагностики, паразитології та фармакології Міністерства аграрної політики України, м. Біла Церква

Захист відбудеться “____” ________________ 2001 р. о____________

годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м.Харків, вул. Пушкінська, 83

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м.Харків, вул. Пушкінська, 83

Автореферат розісланий “______” ________________ 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор ветеринарних

наук, професор Конаржевський К.Є.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Упродовж останніх 10 років ринок України почав поповнюватися великою кількістю ветеринарних препаратів та кормових добавок у першу чергу імпортного, а згодом і вітчизняного виробництва. Все це зумовило розвиток ветеринарної фармакології, яка на сучасному етапі повинна базуватися на комплексних дослідженнях, зокрема на фармакокінетиці, фармакодинаміці та токсикології, що дає підставу для створення високоефективних і нешкідливих засобів захисту тварин (Малінін О.О. і сп., 1998; Лукьянчук В.Д., 1998; Калинюк Т.Г. і сп., 1999).

Невід’ємною частиною фармакології є токсикологія лікарських речовин, яку обов’язково вивчають спочатку на лабораторних, а потім на сільськогосподарських тваринах. За цих умов звертають особливу увагу на гостру та хронічну токсичність, видову чутливість, побічну негативну дію та наслідки після тривалого застосування – наявність ембріотоксичності, терато-, мута- і алергенної дії тощо (Каган Ю.С., 1978; Трахтенберг И.М. з співавт., 1991; Хмельницький Г.О. з співавт., 1994).

Однак, розробки методів та методик у токсикології лікарських препаратів сягнули піввікової давнини і, звичайно, потребують значних модифікацій, удосконалень та адаптацій щодо вимог сьогодення. Крім того, важливим чинником є розробка нових альтернативних експрес-методів, які б відповідно до вимог світової співдружності не передбачали використання теплокровних тварин (Walum E. et al., 1992; Рожнов Г.И. и др., 1995; Lambre Claude R.et al., 1996; Еропкин Е.М. и др., 1997; Дітчук О.Р., 1997). Опрацювання системи токсикологічного контролю та пошуки шляхів її удосконалення й адаптація способів і методів дослідження фармакодинаміки, фармакокінетики, токсичності та нешкідливості ветеринарних препаратів, організація фармако-токсикологічного моніторингу, розробка експрес-методів у нашій країні практично не проводилися. В огляді літератури сконцентровано увагу на недостатньо вивчених аспектах токсикологічних досліджень, зокрема на біохімічних процесах розвитку отруєнь, значенні фізіолого-біохімічних показників, оцінці дії лікарських засобів, вивченні фармакокінетики та фармакодинаміки ветеринарних препаратів тощо. В кожному розділі розглянуті проблеми токсикологічного контролю препаратів та визначені шляхи їх розв’язання.

В останні роки у зв’язку зі значним обмеженням, а в окремих випадках повною забороною використання для токсикологічних досліджень лабораторних тварин у світі спостерігається швидке впровадження в токсикологію методів, альтернативних використанню в експериментах теплокровних тварин. Науково-практичне вирішення цієї складної проблеми вимагає проведення всебічних досліджень у питаннях альтернативної токсикології з використанням у цих експериментах клітинних культур, органотипічних культур спеціалізованих клітин (найчастіше це сперма бугаїв), бактерій, одноклітинних організмів, примітивних ракоподібних та інших гідробіонтів (Червонская Г.П. и др., 1988; Лукьянов А.С. и др., 1996; Balls M. et al., 1997; Еропкин М.Ю., 1999).

Ще однією не менш важливою проблемою є випробування готових лікарських засобів на нешкідливість. На перевагу добре висвітленій в літературі проблемі побічної дії створених нових препаратів проблема контролю нешкідливості готових лікарських форм досі не знайшла свого практичного застосування (Крылов Д.Ф., Кивман Г.Я. и др., 1983; Викторов О.П.Даниленко В.С. , 1988; Cooper J.F., 1996; Долгова Г.В., Неугорова Н.П.2000).

Отже, з вище наведених даних видно, що проблема токсикологічного контролю ветеринарних препаратів, особливо готових лікарських форм, розробка нових альтернативних методів токсикологічних досліджень з використанням тест-організмів є надзвичайно актуальною і потребує нагального вирішення та впровадження у практику ветеринарної медицини України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. При написанні дисертації використані дані, які були одержані при виконанні двох п'ятирічних програм у лабораторії фармакології і токсикології Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів та кормових добавок (ДНДКІ ветпрепаратів) за період 1991-2000 роки:

№ держреєстрації UA 01002785 P. 1991-1995 рр. “Розробити і освоїти наукову систему токсикологічного контролю вітчизняних та імпортних препаратів”;

№ держреєстрації 0198U007874. 1996-2000 рр. “Удосконалити і впровадити науково-технічну систему токсикологічного контролю, згідно міжнародних вимог”.

Мета і задачі досліджень. Метою роботи було удосконалити, модифікувати, адаптувати, розробити та впровадити класичні і альтернативні методи фармако-токсикологічного контролю засобів захисту тварин та кормових добавок із використанням лабораторних і сільськогосподарських тварин, риб гуппі, інфузорій, культури клітин, дрозофіл та розробити науково-обґрунтовану систему токсикологічного контролю згідно з міжнародними вимогами.

У завдання роботи входило:

- вивчити та встановити токсикологічні параметри ветеринарних препаратів імпортного та вітчизняного виробництва, які належали до різних груп. Установити їх LD50 у гострих і хронічних дослідах за різних способів уведення та визначення їх класу токсичності;

- провести повний токсикологічний контроль окремих препаратів та встановити такі параметри: гостру і хронічну токсичність, кумуляцію, побічну дію, віддалені наслідки; модифікувати методи і методики, адаптувати до наших умов та визначити найбільш доступні, дешеві, зручні у виконанні з відповідною вірогідністю результатів і рекомендувати їх до застосування щодо встановлення токсичності засобів захисту тварин і кормових добавок;

- апробувати методи встановлення нешкідливості засобів захисту тварин та розробити відповідний нормативний документ, який би регламентував основні положення визначення нешкідливості готових лікарських засобів і кормових добавок, що дозволить забезпечити їх належну якість;

- вивчити морфологію та функції інфузорії Paramecium caudatum у гострих і хронічних токсикологічних дослідженнях різних за токсичністю та функціональним призначенням ветеринарних препаратів;

- розробити методику визначення класу токсичності засобів захисту тварин за допомогою інфузорії Paramecium caudatum;

- визначити токсичність окремих кормових добавок і розробити експрес-метод встановлення їх токсичності за допомогою інфузорій;

- установити кореляцію між визначенням токсичності ветеринарних препаратів в експериментах на теплокровних тваринах і цитотоксичною оцінкою їх за допомогою культури клітин.

Об'єкт дослідження : токсикологічний контроль засобів захисту тварин, встановлення параметрів шкідливої дії, визначення наслідків віддаленої дії на тварин, вплив на фізіологічні функції, окремі органи і тканини.

Предмет дослідження : гостра, хронічна токсичність, побічна дія (шкірно-резорбтивна, алергічна, пірогенна, гістаміноподібна тощо), віддалені наслідки (ембріотоксичність, тератогенність, мутагенність з прогнозом канцерогенності), кумуляція засобів захисту тварин та кормових добавок.

Методи дослідження. У роботі були застосовані наступні методи дослідження: токсикологічні, фізіологічні, гематологічні, біохімічні, патоморфологічні, гістологічні та гістохімічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше запропонована науково обґрунтована система токсикологічного контролю засобів захисту тварин та кормових добавок, яка включає вивчення гострої та хронічної токсичності, кумуляції, побічної дії, віддалених наслідків. Визначено порядок проведення токсикологічних досліджень, послідовність постановки дослідів із вибором конкретної методики. Проведено модифікацію та адаптацію до умов сьогодення ряду методик та методів установлення токсикологічних параметрів, зокрема мутагенності, нешкідливості, фармакокінетики та фармакодинаміки в хронічних дослідах.

За період проведення досліджень (1991-2000 рр.) вивчено та встановлено токсикологічні параметри 163 препаратів імпортного та вітчизняного виробництва, апробовано різні способи визначення токсичності, проведено аналіз отриманих даних, залежно від фармакологічних груп та ступеня токсичності. Встановлено LD50 в гострих та хронічних дослідах за різних класифікацій.

Вперше проведені дослідження щодо визначення дії лікарських засобів, які різняться за ступенем токсичності, формою і функціональним призначенням на виживання, розмноження, поведінку, морфологічний стан, функціонування травної системи, осморегуляторної функції Paramecium caudatum у гострих і хронічних дослідах.

Розроблено, запатентовано і впроваджено експрес-метод визначення токсичності нових засобів захисту тварин та кормових добавок за допомогою інфузорій, де вивчено морфологію та функції інфузорії Paramecium caudatum у гострих і хронічних токсикологічних дослідженнях, виявлено її високу чутливість до дії ветеринарних препаратів; установлено прямий зв’язок між токсичністю препаратів на лабораторних тваринах та інфузоріях; розроблено метод визначення класу токсичності за допомогою інфузорій.

Доведено можливість використання культури клітин як модельної системи для токсикологічних досліджень ветеринарних препаратів. Виявлена наявність прямої кореляції між токсичністю в експериментах для теплокровних тварин і цитотоксичною дією їх на культуру клітин. Науково обґрунтовано загальні принципи, порядок і вимоги до визначення нешкідливості та розроблено нормативний документ (галузевий стандарт), який регламентує основні положення визначення нешкідливості ветеринарних препаратів. Окрім того, проведено порівняння методів токсикологічного контролю на лабораторних тваринах, рибах гуппі, інфузоріях різних видів кормів та кормових добавок, визначено позитивні та негативні сторони кожного методу. Застосовано інфузорію Paramecium caudatum для експрес-визначення токсичності кормів та кормових добавок.

Практичне значення одержаних результатів. Узагальнено і систематизовано методи і методики проведення токсикологічного контролю з використанням теплокровних тварин у методичні рекомендації “Токсикологічний контроль засобів захисту тварин”, К., 1997, 33 с. Це дало можливість визначити порядок токсикологічних досліджень, послідовність проведення досліду, визначитись у виборі методу, виходячи з конкретних умов.

Розроблено методичні рекомендації “Токсикологічний контроль кормів та кормових добавок”, К., 1998, 110 с., які визначають порядок проведення досліджень на токсичність, забруднених кормів, сировини та кормових добавок мікотоксинами, важкими металами та іншими токсикантами з метою забезпечення їх високої якості.

Розроблено метод установлення класу токсичності засобів захисту тварин та експрес-метод визначення токсичності кормових добавок за допомогою інфузорій (методичні рекомендації “Токсикологічний контроль засобів захисту тварин, кормів та кормових добавок із використанням інфузорії Paramecium caudatum”, К., 1999, 29 с.). Використання даних методів досліджень рекомендуємо для:

- орієнтовної прискореної оцінки токсичності засобів захисту тварин і кормових добавок;

- визначення класу токсичності препарату;

- установлення нешкідливості засобів захисту тварин чи кормових добавок під час вибіркового контролю;

- визначення токсичності препарату, при наявності його в мінімальних кількостях;

- отримання оперативних даних оцінки токсичності окремих активно діючих речовин, розчинника, інших складових компонентів препарату під час його розробки;

- екологічного тестування залишків ветеринарних препаратів, які становлять загрозу для довкілля.

Розроблено та затверджено методичні рекомендації “Визначення мутагенності засобів захисту тварин”, К., 2000, 23 с. Дані рекомендації складені на основі власних досліджень з використанням відомих методів щодо встановлення можливих мутагенних властивостей засобів захисту тварин та їх окремих складників з використанням мікроорганізмів, дрозофіл, соматичних і статевих клітин лабораторних і сільськогосподарських тварин. У доступній формі подані способи вирахування вірогідності одержаних результатів та методичні підходи для узагальнення та підсумкового висновку щодо мутагенності та прогнозу канцерогенності засобів захисту тварин.

Розроблено та затверджено Галузевий стандарт України “Ветеринарні препарати. Методи визначення нешкідливості” ГСТУ 46.009-2000 р., який регламентує основні положення визначення нешкідливості (безпечності) лікарських засобів і кормових добавок. Застосування цього стандарту дало можливість виключити порушення регламенту технологічних процесів, транспортування чи зберігання засобів захисту тварин і кормових добавок.

Одержано патент на винахід “Застосування інфузорії Paramecium caudatum Ehrenberg для експрес-визначення токсичності лікарських засобів” N30232 А.

Подано заявку на винахід “Експрес-метод визначення класу токсичності ветеринарних препаратів за допомогою інфузорій Paramecium caudatum Ehrenberg”.

Розроблені рекомендації впроваджено в Україні. Вони розраховані на науковців та спеціалістів, які займаються розробкою і державним контролем засобів захисту тварин, а також для спеціалістів державних лабораторій ветеринарної медицини, науково-контрольних і науково-дослідних установ, вищих і середніх навчальних закладів та лабораторій, які займаються охороною довкілля.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто обґрунтував наукову концепцію, керував двома науковими програмами, які покладені в основу дисертаційної роботи, а також сформулював тематику та плани наукових досліджень, узагальнив робочі програми, календарні плани досліджень, методи та схеми проведення дослідів і приймав безпосередню участь у проведенні дослідів та визначенні окремих показників.

Розробив та обґрунтував систему токсикологічних досліджень, запропонував нові методичні підходи, альтернативні токсикологічні дослідження з використанням тест-організмів, приймав безпосередню участь у проведенні досліджень, статистично обрахував та узагальнив одержані результати, сформував висновки та практичні рекомендації. Одержані результати публікував у фахових виданнях, приймав участь у республіканських і міжнародних конференціях, симпозіумах, з'їздах тощо.

Токсикологічні, гематологічні, біохімічні, гістохімічні дослідження проводив разом зі співробітниками лабораторії фармакології і токсикології ДНДКІ ветпрепаратів та сектору клінічних токсикологічних досліджень, де був завідувачем, а також зі співробітниками кафедри патанатомії та гістології Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Ґжицького, які є співавторами окремих спільних публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення дисертації висвітлені в доповідях і схвалені на звітах ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок, науково-технічних Радах Державного департаменту ветеринарної медицини України з 1991 по 2000 роки; на 4-му і 5-му засіданнях Державної фармакологічної комісії ветмедицини України (липень, листопад 2000 р.), на засіданні Львівського регіонального наукового товариства фармакологів та токсикологів (м. Львів, 2000 р.); на Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (вересень 1994 р., м. Львів); на 50-ій науково-виробничій конференції Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Ґжицького (м. Львів, жовтень 1995 р.); на І-му Міжнародному симпозіумі Україна-Австрія “Сільське господарство: Наука і практика” (м. Львів, 22-26 вересня, 1996 р.); на першій Всеукраїнській конференції “Теоретичні та практичні аспекти соціоекології” (м. Львів, 7-11 жовтня 1996 р.); на міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми” (м. Харків, 24-26 вересня 1997 р.); на міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва” (м. Львів, 9-11 жовтня 1997 р.); на ІІ міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми неінфекційної патології тварин” (м. Біла Церква, 4-5 червня 1998 р.); на міжнародній науково-виробничій конференції “Морфологія – практичній ветеринарії і медицині” (м. Біла Церква, 22-24 жовтня 1998 р.); на першій Всеукраїнській науково-методичній конференції ветеринарних фармакологів і токсикологів “Актуальні питання ветеринарної фармакології і токсикології” (м. Київ; 21-22 жовтня 1998 р.); на V Національному з'їзді фармацевтів України (симпозіум “Актуальні проблеми ветеринарної фармації”, м. Харків, 6-8 вересня 1999 р.); на міжнародній науковій конференції “Сучасні проблеми зооінженерії та шляхи їх вирішення” (м. Львів, 7-8 жовтня 1999 р.); на ХХХVI, XXXVII міжнародних наукових конференціях з бджільництва (м. Пулави, Польща, 10-11 березня 1999 р., 8-9 березня, 2000 р.); на міжнародній науковій конференції з фізіології і біохімії тварин (м. Львів, 27-29 січня 2000р.); на міжнародній науковій конференції “С.З. Ґжицький і сучасна аграрна наука” (м. Львів, 4-6 травня 2000 р.); на ІІІ Міжнародному симпозіумі Україна-Австрія “Сільське господарство: Наука і практика” (м. Чернівці, 14-16 вересня 2000 р.); на ІІІ міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми неінфекційної патології тварин” (м. Біла Церква, 3-4 листопада 2000 р.); на міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 85-річчю з дня народження академіка Гладенка І.М., “Ветеринарна наука на порозі ХХІ століття” (м. Харків, 14-15 листопада 2000 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 55 робіт. З них статей у наукових виданнях - 34 (14 одноосібних), праць на міжнародних, всесоюзних, загальнодержавних та галузевих з'їздах, симпозіумах та конференціях – 12, методичних рекомендацій – 7, одержано патентів – 1, подано заявку на винахід – 1, галузевий державний стандарт - 1.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Методи досліджень”, “Результати досліджень”, “Аналіз і узагальнення результатів досліджень”, “Висновки”, “Практичні рекомендації”, “Список використаної літератури” (671 найменування, з них 316 іноземних), “Додатки”. Дисертацію викладено на 380 сторінках машинописного тексту, вона містить 77 таблиць, 5 рисунків та 4 додатки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана у 1991-2001 рр. в лабораторії фармакології і токсикології ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок.

Вивчення, розробку та впровадження класичних і альтернативних методів фармако-токсикологічного контролю ветеринарних препаратів та кормових добавок проводили з використанням лабораторних і сільськогосподарських тварин, інфузорій, культур клітин, риб гуппі, дрозофіл і сальмонел.

Утримання і годівля лабораторних тварин (з репродуктора “Глеваха”, Київської області) відповідали ветеринарно-санітарним вимогам розміщення та утримання віваріїв.

Основні параметри гострої та хронічної токсичності визначали методами Y. Kдrber (1931), J. Litchfild та F. Wilcoxon (1949), Г.Н. Першина (1950), В.Б. Прозоровського (1962), Б.М. Штабского (1980).

Одержані дані обробляли статистично методом найменших квадратів за пробіт-аналізом J. Litchfild та F. Wilcoxon (1949), В.Б. Прозоровським (1962), методом трьох точок за Б.М. Штабским (1980), вираховуючи ЛД0, ЛД16, ЛД50, ЛД84, ЛД100. Для порівняння видової чутливості лабораторних тварин до препарату, що досліджували, та з метою економії кількості тварин користувалися методом однієї точки за Ван дер Варденом (1940).

Хронічну токсичність препаратів вивчали на білих мишах і щурах. Лабораторним тваринам препарати вводили щоденно внутрішньошлунково в дозах: 1 групі – 1/5 ЛД50, 2 – 1/10 ЛД50, 3 – 1/20 ЛД50 і тваринам 4 (контрольної) групи вводили фізіологічний розчин, розчин крохмалю або розчинник, який застосовується в даному випадку.

Тварин протягом усього досліду зважували щотижня або за потреби, а після введення всієї дози препаратів, що досліджувались, проводили визначення антитоксичної функції печінки методом гексеналової проби.

Визначення впливу препаратів на витривалість дослідних тварин проводили у пробах з плаванням (Філова М.Л., 1964).

Упродовж усіх дослідів тварини знаходилися під наглядом. За цих умов враховували стан волосяного покриву і слизових оболонок, поведінку, вагові показники, місцеву подразнюючу дію, гематологічні показники (кількість еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, концентрацію гемоглобіну, величину гематокриту, швидкість зсідання крові, виводили лейкоцитарну формулу) (Колб В.Г., Камишников В.С., 1982), біохімічні показники (загальний білок, білкові фракції, активність аспартатамінотрансферази (К.Ф.2.6.1.1.), аланінамінотрансферази (К.Ф. 2.6.1.2.), лактатдегідрогенази (К.Ф. 1.1.1.2.7.), лужної фосфатази (3.1.3.1.)) (Покровський О.О., 1969), функціональний стан серцево-судинної та дихальної систем.

Про ступінь кумуляції орієнтовно робили висновок з індексу кумуляції в досліді з одноразовим уведенням речовин (Штабский Б.М., 1971).

Додаткову інформацію про кумулятивні властивості отримували, використовуючи метод, запропонований Б.М. Штабским (1973). Для цього проводили розгорнутий гострий дослід, а величину ЛД50 розраховували двома способами: за результатами загибелі тварин упродовж однієї доби (Д1) та протягом усього досліду (Д2). Виходячи з цих показників, вираховували індекс кумуляції (Ік):

Ік = 1 – (Д1 / Д2)

Визначення кумуляції проводили також методом, в якому тварини протягом 24 діб отримували препарат у постійно зростаючих дозах (Lim1961). Коефіцієнт кумуляції визначали за формулою Ю.С. Кагана, В.В. Станкевича (1964).

Алергічну дію препаратів установлювали використовуючи внутрішньошкірний метод їх уведення. Розрахунок отриманих даних проводили через добу за шестибальною шкалою (Алексеева О.Г., Дуева И.А., 1978).

Дослідження ембріотоксичної й тератогенної дії препаратів проводили на здорових білих статевозрілих щурах. Внутрішні органи вивчали за методикою Вільсона в модифікації відділу ембріології НДІЕМ АМН СРСР (1986). Для виявлення тонших функціональних змін в органах застосовували фарбування зрізів за П.Петерсом, а також метод вісцерального дослідження органів плодів за Стейплсом. Установлення змін у скелеті проводили шляхом фарбування плодів (хрящів та кісток) за П.Петерсом або за методом А. Даутсона (Штабский Б.М., 1980).

Оцінку мутагенної дії препаратів здійснювали за допомогою мікроядерного тесту (Schmid W., 1973), цитогенетичного аналізу клітин кісткового мозку ссавців (метафазний чи анафазний аналіз) або тестом Еймса на сальмонелах (1975), мутагенної активності – методом обліку аномальних головок сперміїв мишей.

Дослідження на інфузорії Paramecium caudatum виконували методом Е.Г. Голубкової (1978) та І.Т. Олексіва, О.П. Андрущишин (1995) у нашій модифікації. З метою вивчення осморегуляторної функції користувалися методикою Г.І. Роскіна, Л.Б. Левінсона (1957). Під час проведення гострих і хронічних дослідів оцінювали дію фармакологічних препаратів за наступними показниками: час настання смерті 50% (ЛТ50) і 100% (ЛТ100) інфузорій, швидкість їх розмноження, характер руху, форма тіла, інтенсивність фагоцитозу, розміри травних вакуоль, їх кількість і діяльність скоротливих вакуоль.

Цитотоксичний вплив препаратів на моношар клітин вивчали на культурах клітин: перещеплюваній лінії Vero (нирки африканської зеленої мавпи) та первинній – ФЕК (фібробластів ембріонів курчат). Пересівання перещеплюваної лінії та приготування первинної культури клітин здійснювали за методом Л.П. Дьяконова (1980).

Визначення токсичності кормів і кормових добавок проводили на рибах гуппі (метод, затверджений ГУВ МСГ СРСР, 1980), мишах (метод, затверджений ГУВ МСГ СРСР, 1979), кроликах (тест Драйза, 1944) та інфузоріях (Коцюмбас І.Я. з співавт., 1999).

Матеріали для гістологічних досліджень (проби органів і тканин розміром 0,5х0,5 см) відбирали після евтаназії тварин і фіксували в 10% нейтральному формаліні, для гістохімічних – в розчині Карнуа або 800 охолодженому спирті, заливали в парафін згідно із загальноприйнятими методиками.

Для фарбування зрізів застосовували загальні, спеціальні, а також, за потребою, гістохімічні методи з використанням гематоксилін-еозину, судану ІІІ, методики Гоморі, Браше.

Одержані результати статистично опрацьовували за Стьюдентом, зміни показників вважали вірогідними при р ? 0,05, р ? 0,01 та р ? 0,001.

Окрім експериментальних досліджень на лабораторних, сільськогосподарських тваринах і тест-об’єктах проведено аналіз і узагальнення нормативної документації понад 350 препаратів вітчизняного та зарубіжного виробництва, а також фармакопейних статей, державних і галузевих стандартів, методик і рекомендацій щодо токсикологічного та біологічного контролю.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Розробка системи токсикологічного контролю засобів захисту

тварин

Загальна токсичність лікарських засобів залежить від негативної дії препаратів на організм тварин. Зокрема, високотоксичні препарати завдають значної шкоди цілому організму, потрапляючи в незначних кількостях. Малотоксичні препарати не впливають шкідливо доки їх концентрація не досягне певної межі. Таким чином, токсичність не може бути визначена без врахування кількості введеного препарату (діючої речовини, дози), шляхів, якими дана кількість речовини потрапила в організм, розподіл її в часі (разове чи повторне введення), типу і характеру пошкодження та часу прояву токсикологічного ефекту.

Планування всіх експериментів з оцінки токсичності речовин повинно здійснюватися на науковій основі. Оцінка кожної нової речовини не є ідентичним завданням, а тому, відповідно, будуть відрізнятися і методичні підходи вивчення різноманітних речовин. Схема експериментів повинна уточнюватися у процесі їх проведення з обов'язковим порівнянням з попередньо одержаними результатами. Важливо також, щоб дані лабораторних досліджень узгоджувались з відомими механізмами розвитку токсичних пошкоджень. Крім цього, нами підтверджено, що ряд ендогенних і екзогенних чинників можуть змінювати токсичність препарату.

На основі проведених численних різносторонніх ґрунтовних досліджень встановлено, що токсикологічні обстеження повинні обов'язково базуватись на визначенні ЛД50 на мишах, щурах, морських свинках, а в окремих випадках і на кролях. Крім того, підгострі досліди повинні тривати не менше 1-2 місяців задля одержання даних про функціональні порушення органів і систем та здатності фармакологічних речовин до кумуляції в організмі.

Ці дослідження повинні доповнюватись хронічними експериментами, які тривають 6-8 місяців на лабораторних, і, що дуже важливо, завершуються на сільськогосподарських тваринах і птиці. Виявлення побічної дії та віддалених наслідків також є необхідними компонентами токсикологічних досліджень.

Вивчення гострої токсичності на тваринах має важливе значення для прогнозування можливих токсичних наслідків дії таких доз препарату, які майже досягають смертельних. Результати таких досліджень дозволили прогнозувати характер гострих відповідних реакцій організму з метою розробки заходів щодо підтримки життєвих сил організму.

Найбільш важливим етапом у проведенні токсикологічних досліджень є вивчення можливого хронічного впливу хімічних речовин. Тести на хронічну токсичність допомагають у визначенні можливого впливу на живий організм за умов довготривалої дії низьких концентрацій препаратів. Особливої уваги заслуговують речовини, які проявляють побічну дію чи мають тенденцію до віддалених наслідків (ембріотоксичність, тератогенність і мутагенність).

Використання нових методів може бути більш доречним та інформативним, ніж використання рутинних, традиційних підходів, хоча нові методи не обов'язково повинні змінювати традиційні чи застосовуватися чисто механічно, поки не буде доведено їх важливість, надійність, економічність тощо.

Незалежно від того, використовуються старі методи чи нові, важливо щоб конкретні умови експерименту були доступні іншим дослідникам, що дало б можливість порівнювати результати досліджень, одержані в різних лабораторіях.

Надзвичайно важливим у проведенні токсикологічних досліджень є відбір лабораторних тварин, які використовуються в експериментах, і догляд за ними. Вияснення процесів метаболізму під дією лікарських засобів в організмі експериментальних лабораторних і сільськогосподарських тваринах підвищує впевненість в обґрунтованості оцінки можливої шкідливості їх дії. Нами адаптовані, удосконалені та розроблені різні методи оцінки токсичності препаратів. Вони включають гострі, підгострі та хронічні дослідження. Основна різниця між ними полягає лише в застосовуваних дозах і тривалості дії препарату. Однак існують й інші відмінності, які можуть бути обумовлені метою експерименту і хімічною будовою речовини та складом лікарського засобу.

Проведення хронічних токсикологічних досліджень на сільськогосподарських тваринах і птиці дозволило використовувати широкий набір біохімічних тестів для оцінки функціонування різних органів і систем.

Дослідження функціонування органів і систем найкраще проводити до початку затравки та на 1, 3, 10 дні після введення препарату, а згодом з 30-добовими інтервалами в період уведення і після його завершення.

У процесі експерименту для оцінки хронічної токсичності біохімічні дослідження проводили з метою визначення функціональної цілісності різних систем. У першу чергу проводили дослідження простішою методикою (якісною) чи використовували експрес-методи і лише за отримання позитивних результатів застосовували складні методи токсикологічних досліджень.

У хронічних експериментах на лабораторних тваринах гематологічні та біохімічні дослідження проводили до затравки і пізніше з 30-денним інтервалом та після завершення затравки. З таким же інтервалом забирали кістковий мозок у вимушено забитих тварин. Для цього в хронічних дослідах використовували тварин з розрахунку на проведення цих досліджень.

Основне завдання визначення ЛД50 полягало в тому, щоб одержати повну уяву про величину гострої стадії токсичності від дози препарату та інформацію про вид токсичного ефекту. Така інформація вміщувала дані про термін загибелі тварин (моментальна, віддалена), чи було відновлення після введеної дози, близької до летальної, швидким і повним.

Проте величина ЛД50 – не дає вичерпної інформації про токсичність лікарського засобу. Хоча є передбачення про те, що речовини, які не викликали шкідливих ефектів за введення в організм у дозах 3-5 г /кг маси тіла, в основному не є токсичними і, навпаки, є приклади того, що сполуки з ЛД50 вище 5 г/кг володіють токсичною дією в низьких дозах протягом тривалого терміну (Червонская Г.П. и др., 1988; Добровольский М.А., 1992).

Якщо головним завданням тесту на гостру токсичність є визначення величини ЛД50, то основною задачею оцінки досліджень підгострої та хронічної токсичності було встановлення характеру й глибини токсичної дії, а також визначення рівня дози за, так званої, “шкідливої дії, яка не проявлялась”.

Надзвичайно важливими у токсикологічних дослідженнях ветеринарних препаратів було виявлення патологоанатомічних змін. Звичайно, на них базуються кінцеві висновки про рівень токсичності. Усі патологоморфологічні дані, одержані на дослідних тваринах, ретельно описуються, диференціюються і систематизуються та оцінюються за допомогою відповідних статистичних методів.

Дуже важливе значення мало встановлення індексу кумуляції препарату – відношення ЛД50 при одноразовому введенні до ЛД50 за багаторазового застосування. Після встановлення кумулятивних властивостей препарату починали вивчати процеси нагромадження, розподілу, шляхів і швидкості виділення з організму самої речовини і її метаболітів. Щурам (50-60 тваринам) одночасно вводили у шлунок максимально толерантну дозу лікарської речовини і після цього тварин забивали через 24 і 48 год., 5, 10, 15 і 20 днів. У кожний період часу проводили евтаназію по 5-6 тварин за легкого ефірного наркозу і встановлювали концентрацію препарату в крові, сечі, жовчі, калі, внутрішніх органах, головному мозку, м’язах, жировій тканині та залозах внутрішньої секреції.

Метою хронічних досліджень було виявлення шкідливої дії препарату у випадку його тривалого введення в організм дослідних тварин. Водночас враховували і виявляли найбільш чутливі органи, системи і встановлювали термін відновлення функцій на тлі дії препарату, що досліджувався.

Тривалість уведення лікарського препарату лабораторним тваринам у вивченні хронічної дії залежав від тривалості його застосування для лікування або профілактики захворювань тварин (табл.1).

Таблиця 1

Залежність уведення препарату лабораторним тваринам від тривалості його застосування для сільськогосподарських тварин

Тривалість застосування препарату для сільськогосподарських тварин | Тривалість уведення препарату лабораторним тваринам

Одноразове введення

1-6 днів

7-14 днів

15-30 днів

1-6 міс.

Понад 6 міс. | 3 дні

10 днів

1 міс.

2-4 міс.

6-12 міс.

12-18 міс.

У хронічних дослідах також виявляли віддалені наслідки дії препарату, а саме ембріотоксичність, тератогенність, мутагенність тощо.

Тестування тератогенної та ембріотоксичної активності препаратів здійснювали послідовно на щурах, мишах і кролях. Якщо на щурах установлені тератогенні властивості, то додаткові дослідження на вагітних мишах і кролях не проводили. Зауважимо, що у тих випадках, якщо препарат повинен застосовуватися вагітним тваринам і на щурах не було виявлено тератогенної чи ембріотоксичної дії, додатково потрібно провести дослідження саме на вагітних мишах. За відсутності позитивних наслідків віддалену дію препарату досліджували на кролях. Важливо акцентувати увагу на тому, що виявлена тератогенна активність є серйозним аргументом проти використання даного препарату.

У випадках, коли токсична доза не викликала розвитку виродків або загибелі ембріонів, подальше тестування препаратів не проводили. За виявлення шкідливої дії препарату на ембріогенез продовжували дослідження його в терміни найбільшої чутливості ембріонів до ліків, в середній дозі між токсичною і терапевтичною. Якщо препарат мав виражений ембріотоксичний і тератогенний ефекти, то визначали дозу, яка в терміни найбільшої чутливості викликала загибель 50% ембріонів (ЛД50 для ембріонів). Згодом установлювали дозу, яка викликала виродковість у 50% ембріонів (ТД50). У кінці дослідження визначали дозу, яка викликала мінімальну статистично вірогідну шкідливу дію на розвиток ембріонів.

Єдиного методу, за допомогою котрого можна було б зареєструвати всі види мутацій, не існує, тому використовували комплекс методів. Для повної оцінки застосовували тести із залученням ссавців, котрі дозволяли не тільки виявити різні категорії мутацій, але й розробляти норми і регламенти використання препаратів із виявленою мутагенною активністю. Для оцінки хромосомних порушень у соматичній тканині застосовували методи цитогенетичного аналізу клітин крові і кісткового мозку ссавців (метафазний або анафазний аналіз). Для виявлення мутацій у зародковій тканині використовували метод обліку домінантних летальних мутацій. Як додатковий тест для обліку мутацій у статевих клітинах використовували метод обліку аномальних головок сперміїв мишей.

Якщо дані літератури свідчать про мутагенну активність хімічної сполуки, то її досліджують на другому етапі. За відсутності даних або у тих випадках, коли вони були суперечливі, проводили експериментальні дослідження першого етапу. Речовини, в яких виявили мутагенний ефект після дослідження першого етапу, відносили до потенційних мутагенів і вивчали на другому етапі.

Підсумок про мутагенну активність засобів захисту тварин базується на даних літератури відносно кожного складника окремо та разом, за результатами виявлення мутагенів на генному, геномному і хромосомному рівнях (Шумейко В.М. з спіавт.,1998).

Досі відсутні надійні альтернативи для хронічних тестів на встановлення канцерогенності лікарських засобів. Це означає, що проходить біля двох років і більше, перш ніж появляються результати оцінки канцерогенних властивостей речовин, що досліджувались. Однак значні успіхи в розробці тестів на мутагенність дали надію на появу короткотермінових тестів, передусім для відбору із великої кількості речовин, які піддавались оцінці тих, які заслуговували на першочергову увагу. Останнім часом встановлено, що біля 80% канцерогенних речовин є мутагенними. Вважаємо, що саме сучасні тести на мутагенність створили загальне уявлення про систему для скринінгу речовин, які підлягають подальшій оцінці на канцерогенність.

Послідовність проведення гострих і хронічних експериментів, вивчення фармакокінетики, фармакодинаміки та інших параметрів токсикологічних досліджень, а також допоміжних показників слід здійснювати за такою схемою (рис.1).

Дана схема увійшла в основу наших досліджень і допомогла створити загальний перелік детально описаних експериментальних методик і умов проведення токсикологічного контролю ветеринарних препаратів та кормових добавок. Крім цього, проведення токсикологічного контролю з дотриманням даної закономірності та використання системи токсикологічних досліджень дало можливість оцінювати токсичність препаратів у однакових умовах, висвітлювати одержані дані в публікаціях і, таким чином, у широкому масштабі порівнювати та вдосконалювати методичні підходи, методи вивчення параметрів токсикологічного контролю.

Отже, проведення токсикологічних досліджень лікарських речовин, їх окремих компонентів, різних форм ветеринарних препаратів є початковою і важливою ланкою, яка визначає не лише успішний розвиток подальших експериментальних, клінічних досліджень і практичних розробок, а й має вирішальний вплив на можливість створення високоефективних, малотоксичних і екологічно чистих препаратів.

Рис.1. Схема проведення токсикологічного контролю засобів захисту тварин

Біологічний контроль нешкідливості готових лікарських засобів

Однією із важливих проблем токсикології є контроль готових лікарських форм. Існуючі фармакопейні методи і показники біологічного контролю нешкідливості препаратів у більшості випадків не повністю відповідають своїм завданням. Результати випробувань і розробок, які були здійснені у СРСР та інших країнах, свідчать, що сьогодні настав час для істотних, а в ряді випадків принципових змін цих методів. Об'єкти і галузі цього виду контролю розширюються. Вище наведене, в першу чергу, відноситься до таких основних показників безпеки лікарських засобів, як нешкідливість за показниками: токсичність, стерильність, мікробне забруднення, пірогенність, які висвітлені практично в усіх фармакопеях світу та охоплюють найбільше число препаратів.

Біологічний контроль безпеки лікарських засобів у фармакологічному аспекті найбільш важко стандартизується, оскільки дослідження проводяться лише з використанням кролів. При дослідженні на пірогенність, наприклад, результати, отримані в різних регіонах, часто можуть не співпадати. В кінцевому наслідку заміна біологічного об'єкту інструментальними методами є дуже важливим моментом. Крім цього, можливість стандартизації в даному випадку значно зростає. Питання про заміну біологічних тест-об'єктів інструментальним методом, напевно, було б вирішене, якби пірогенність лікарських препаратів завжди визначалась ендотоксином грамнегативних бактерій (на них припадає 98% випадків) (Международная фармакопея,1973; Западнюк И.П. и др.,1983). Однак, не зважаючи на це, даний метод має цілий ряд суттєвих переваг над визначенням пірогенності на кролях і з успіхом застосовується в більшості країн світу (Wallhauser K.H., 1980; Крылов Ю.Ф. и др.,1983).

Ще однією важливою проблемою фармакопейного випробування готових лікарських засобів є дослідження на нешкідливість. На відміну від добре висвітленій у літературі проблемі побічної дії нових препаратів, контроль нешкідливості лікарських засобів серійного випуску вивчений недостатньо. За умов оцінки якості лікарських препаратів важлива роль надається в основному результатам мікробіологічного контролю, в тому числі дослідженням на стерильність.

Огляд фармакопейних методів визначення мікробного забруднення нестерильних лікарських засобів дав можливість зробити висновок про те, що в даний час ще немає єдиної схеми мікробіологічного аналізу. У фармакопеях, де приведений цей вид контролю, описані різні методи підрахунку та ідентифікації бактерій і грибів, традиційні для тієї або іншої країни. Однак в останні роки чітко простежується тенденція до уніфікації мікробіологічних методів і схем дослідження. Наприклад, значні розходження між методами визначення стерильності ін'єкційних препаратів, наведені у фармакопеї США XIX видання (1975 р.) і в Європейській фармакопеї (видання 1971 р.), цілком усунуті в наступних виданнях цих фармакопей, які були випущенні у 1980 р. Уніфіковано відбір зразків від серії, склад поживних середовищ і термін інкубації. Практично країни Європи і США користуються тепер ідентичними методами контролю стерильності лікарських засобів.

Виходячи з вищевикладеного та проаналізувавши наукову літературу і відповідну документацію, нами розроблено нормативний документ галузевий стандарт "Препарати ветеринарні. Методи визначення нешкідливості", який регламентує основні положення щодо визначення нешкідливості засобів захисту тварин та вміщує наступні показники проведення досліджень: визначення нешкідливості, стерильності, мікробного забруднення нестерильних препаратів, алергічної, місцевої подразнюючої, пірогенної дій (табл.2). При розробці нормативної документації і проведенню перевірки на нешкідливість у першу чергу звертали увагу на:

- потребу в перевірці на нешкідливість;

- план і перелік досліджень, узгоджений науково-методичною комісією;

- тварини (вид, порода, стать, вік, маса тіла) або інші біологічні тест-системи, на яких перевіряється препарат;

- спосіб уведення;

- дозу препарату;

- час і термін спостереження;

- критерії оцінки.

Аналізуючи показники нешкідливості ветеринарних препаратів з позицій інформативності, враховували, що незалежно від їх максимального вдосконалення вони дозволили лише з частковою впевненістю вважати препарат непридатним до використання через його токсичність, нестерильність, пірогенність тощо.

З огляду на сказане вище, особливого значення набувають методи, надійність яких практично виключає потребу в повторному дослідженні. Цим ми хочемо акцентувати увагу не тільки на потребу максимального вдосконалення біологічних методів, але