ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ

ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ

ПРОКОПЧУК Зоя Миколаївна

УДК 615.454.2:582.282.23:57.085

порівняльне дослідження антимікробних та

біологічних властивостей супозиторіїв

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Вінницькому державному медичному університеті ім. М.І. Пирогова МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Гордій Кіндратович Палій, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології Вінницького державного медичного університету ім. М.І.Пирогова МОЗ України

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Національна фармацевтична академія МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

- доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології.

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім. Л.В. Громашевського АМН України

Захист дисертації відбудеться 24 січня 2002 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м. Харків, МСП, вул. Пушкінська, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, 61057, м. Харків, МСП вул. Пушкінська, 14.

Автореферат розісланий 11 грудня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук І.Ю.Кучма

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед гнійно-запальних захворювань особливе занепокоєння викликають захворювання геніталій у жінок репродуктивного віку, спровоковані оперативними втручаннями та іншими факторами, що часто призводять до невиношування вагітності, мертвонародження. В загальній етіологічній структурі цих захворювань одне з чільних місць зайняли умовно-патогенні мікроорганізми, великий відсоток яких наділений природною стійкістю до лікарських засобів.(C.С.Трушкина, 1999; Л.В.Троян, 2000). Це призвело до необхідності пошуку і введення в обіг нових високоефективних антисептичних препаратів. Особливу увагу дослідників привертають протимікробні препарати, які є поверхнево-активними сполуками (декаметоксин, мірамістин, етоній, декамін та ін.). Вони характеризуються широким спектром антимікробної дії, низькою токсичністю. В Україні постійно проводять дослідження зі створення нових антисептичних препаратів, проте лише деякі з них впроваджено в медичну практику, налагоджено їх промислове виробництво (А.П.Красильников, 1995; Г.К.Палій, 1997; В.П.Ковальчук, 2000; Т.О.Когет, 2000).

В останні роки дослідники все більше приділяють уваги пошукам та розробці антимікробних препаратів, що дозволяють протягом тривалого часу підтримувати ефективні концентрації діючих речовин у вогнищі запалення. До таких лікарських препаратів відносять супозиторії, які містять в собі речовини з різноманітними фармакологічними властивостями. На ринку ліків, серед вагінальних лікарських форм супозиторії займають біля 41,67%, з яких 80% імпортують з інших країн (А.Листопад, 2000). Більшість існуючих основ для виготовлення супозиторіїв, що зараз здобули широкого визнання, є жирами, жироподібними речовинами, їх сплавами з емульгаторами. Однак, вони мають ряд суттєвих недоліків (Н.Г.Козлова, 1995). Вони не є індиферентними для організму людини, дають малопластичну супозиторну масу, потребують додавання емульгаторів і мають високу собівартість. Все це обмежує широке застосування та впровадження у клінічну практику нових вітчизняних супозиторіїв. Серед основ виділяють групу гідрофільних, що заслуговують на особливу увагу. Вони легко розчиняються при температурі тіла, не потребують додавання емульгаторів, є доступними і дешевими. Створення антисептичних супозиторних лікарських форм на гідрофільній основі відкриває сприятливу перспективу для насичення фармацевтичного вітчизняного ринку антимікробними препаратами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної тематики кафедри мікробіології, вірусології та імунології Вінницького державного медичного університету ім. М.І.Пирогова “Клініко-лабораторне дослідження властивостей та промислове впровадження нових лікарських засобів на основі декаметоксину, рекомбінантного інтерферону” (№ держреєстрації 0198U002709).

Мета і задачі дослідження. Мікробіологічна оцінка та експериментальне обгрунтування можливостей створення ефективних антисептичних супозиторіїв.

Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

Предмет дослідження – інфекційні та гнійно-запальні захворювання.

Об’єкт дослідження – антимікробні супозиторії, мікроби.

Методи дослідження. Робота грунтується на мікробіологічних дослідженнях п’яти антимікробних препаратів, вивчення спектру їх активності щодо збудників гнійно-запальних захворювань. За допомого мікробіологічних, спектрофотометричних, хроматографічних, діалізних методів, методики визначення в’язкості та поверхневого натягу визначено напрями подальшого вивчення антимікробних препаратів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено вивчення антимікробних супозиторіїв та значно розширено спектр антимікробної дії антисептичного засобу декаметоксину. Доведено залежність протимікробної дії супозиторіїв від різних фізико-хімічних і біологічних умов. Вивчено в експерименті in vitro швидкість та особливості формування резистентності у мікробів до антимікробних препаратів.

Вперше розроблено методики якісного та кількісного визначення компонентів у складі лікарського препарату та проведено порівняльне дослідження швидкості дифузійного вивільнення декаметоксину із супозиторіїв.

Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних мікробіологічних досліджень являють собою первинний етап вивчення антимікробних препаратів. Результати експериментального дослідження супозиторіїв з декаметоксином ввійшли до нормативно-технічної документації на цей препарат (ТФС, промисловий технологічний регламент, інструкція по клінічному застосуванню).

Розроблено проект тимчасової фармакопейної статті на препарат десептол та технологічний регламент на виготовлення супозиторіїв з декаметоксином, який передано на завод-виробник “Монфарм”. Виготовлено дослідну партію препарату в умовах виробництва. Отримано позитивне рішення Фармакологічного комітету МОЗ України (протокол № 10 від 25.12.1997 року) для проведення І фази клінічних досліджень препарату.

Результати дослідження рекомендовані і використовуються в програмах навчання лікарів на кафедрах мікробіології, вірусології, імунології вищих навчальних закладів (Буковинська державна медична академія, Дніпропетровська державна медична академія, Кримський державний медичний університет, Одеський державний медичний університет, Тернопільська державна медична академія).

Особистий внесок здобувача. Особисто автором проаналізована вітчизняна та іноземна література за темою дисертаційного дослідження, проведено патентно-інформаційний пошук. Особисто проведено вивчення антимікробної активності супозиторіїв та встановлено в експерименті швидкість формування у мікроорганізмів резистентності до ряду препаратів. Автором було вивчено фізико-хімічні властивості супозиторіїв десептол, а також встановлено швидкість вивільнення діючої речовини з лікарського препарату десептол. Самостійно виконані дослідження стабільності супозиторіїв у процесі тривалого зберігання. Особисто виконано токсикологічні експерименти на тваринах та вивчено вплив препарату на макроорганізм. Проведено статистичну обробку одержаних результатів, їх аналіз та сформульовано основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертації обговорювались на: симпозіумі “Синтез, експериментальне вивчення та клінічне застосування четвертинних амонієвих сполук” (Чернівці, 1995); V Республіканській навчально-методичній та науковій конференції завідуючих кафедрами загальної хірургії медвузів України (Тернопіль, 1996); науково-медичній конференції молодих вчених (Київ, 1998); IV, VI, VII університетських науково-практичних конференціях молодих вчених та фахівців (Вінниця, 1998; 2000; 2001); міжнародній науковій конференції “Стратегия и тактика борьбы с инфекционными заболеваниями” (Харьков, 1998, 2001); V національному з’їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті” (Харків, 1999); науковій конференції “Актуальні проблеми мікробіології, вірусології, імунології” (Харків, 1999); ІІ Установчому з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000); Міжнародній науковій конференції “Стратегія і тактика застосування антисептиків в медицині” (Вінниця, 2000); ІІ Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті в наукових журналах та 7 в збірках матеріалів з’їздів, симпозіумів, конференцій. Отримано один патент на винахід.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 207 сторінках, включає вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, три розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки та практичні рекомендації. Робота ілюстрована 37 таблицями і 25 рисунками, список використаних джерел містить 228 найменуваннь, який займає 26 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Для розв’язання поставлених задач нами проведено вивчення протимікробних та біологічних властивостей супозиторіїв з декаметоксином та бензалконію хлоридом.

Антимікробні супозиторії “Десептол” у своєму складі як діючу речовину містять антисептик декаметоксин. Декаметоксин – [1,10–Декаметилен-біс (N,N-диметилментоксикарбонілметил) амонію дихлорид], належить до групи бісчетвертинних амонієвих сполук. За фізичними властивостями декаметоксин – білий дрібнокристалічний порошок з слабким запахом, легко розчинний у воді та 95% етанолі, практично не розчинний в ефірі (ФС 42У-46-152-97). Він має широкий спектр антимікробної дії, активний щодо стафілококів, стрептококів, дифтерійної палички, грибів. Декаметоксин підвищує чутливість бактерій до антибіотиків. На мікробні клітини препарат діє бактерицидно та фунгіцидно. Для виготовлення супозиторіїв нами було використано гідрофільну желатино-гліцеринову основу, яка складається із природних компонентів: желатину медичного або харчового, гліцерину та води.

Желатин (Gelatina) – продукт часткового гідролізу колагену, який міститься в хрящах та кістках тварин. Має вигляд прозорих гнучких листочків або шматочків без запаху, злегка жовтуватого кольору. В холодній воді істотно набухає, розм’якшується. Розчинний в гарячій воді, в оцтовій кислоті та в гарячій суміші гліцерину та води; нерозчинний у спирті та ефірі. (ДФ X, ст. 309).

Гліцерин (Glycerinum) (СH2(OH)-CH(OH)-CH2OH). Емпірична формула C3H8O3. Це прозора, безбарвна, сиропоподібна гігроскопічна рідина, без запаху, солодка на смак. Гліцерин змішується з водою і 95% спиртом у всіх співвідношеннях; майже нерозчинний в ефірі, хлороформі, жирних та летючих маслах (ФС 42-2202-84).

Для вивчення порівняльної антимікробної активності нами було використано супозиторії “Фарматекс” (виробник Innotech International, Франція), активною речовиною у складі яких є бензалконію хлорид.

Бензалконію хлорид (Benzalconium chloridum) належить до синтетичних катіоноактивних солей четвертинних амонієвих сполук. Бензалконію хлорид - кристалічний порошок білого кольору, добре розчинний у воді. Його розчини без кольору, стійкі до дії температури, рН середовища. Препарат зберігає свою дію в присутності великої групи хімічних речовин. Наділений активністю щодо багатьох грамнегативних та грампозитивних бактерій та грибів. Його застосовують як консервант для лікарських форм, де необхідна відсутність подразнюючої дії та швидкий бактерицидний ефект (очні краплі, краплі для носа). Крім того, бензалконію хлорид має здатність пошкоджувати мембрани сперматозоїдів, тому використовується з контрацептивною метою (EP, At. 0371). Для порівняння швидкості формування резистентності у мікроорганізмів було вибрано препарат декамін. Декамін (Decaminum) – 1,10-Декаметилен-біс-(4-амінохінальдіній-хлорид), антисептичний препарат із групи катіонних бісчетвертинних амонієвих сполук. Декамін – білий з кремуватим або з жовтим відтінком порошок, малорозчинний у воді та етанолі. Інактивується милами. Наділений вираженою детергентною дією на клітинні мембрани, чим пояснюється його фунгіцидна та бактерицидна дія (на грампозитивні та деякі види грамнегативних бактерій). Декамін застосовують для лікування пароніхій, епідермофітії, кандидозу, грибково-бактеріальних уражень шкіри, а також при різних захворюваннях порожнини рота, а саме при ангіні, тонзиліті, стоматиті, фарингіті, глоситі та ін.

Супозиторії з декаметоксином для досліджень готували методом виливання за наступним прописом:

Декаметоксину 0,005 г

(ФС 42У-46-152-97) (0,125%)

Основи для супозиторіїв достатня кількість

желатино-гліцеринової: для одержання

(ГФ X , ст. 648) супозиторія масою 4 г

желатину медичного 12,5%

(ГФ X, ст.309

або харчового (ОСТ 11293089)

гліцерину 62,5%

(ФС 42-2202-84)

води очищеної 25%

(ФС 42-2619-89)

До медичного або харчового желатину додавали відповідну кількість води очищеної і залишали на 30-40 хв. для набухання. Після чого на водяній бані при температурі 60-700С розчиняли желатин при помішуванні. До желатину додавали необхідну кількість фармакопейного гліцерину і знову перемішували до одержання однорідної маси. Збільшували температуру у водяній бані до 100С і витримували масу протягом години. Після чого її охолоджували до 38-40С і вносили при перемішуванні розраховану кількість концентрату декаметоксину (частіше використовували 10% концентрат). Зменшення маси при нагріванні компенсували додаванням води. Ретельно перемішували, проціджували через марлю або капронове сито і в асептичних умовах розливали супозиторну масу у форми для виливання супозиторіїв. Заповнені форми вміщували в холодильник на 20-30 хв. до повного формування супозиторіїв. В асептичних умовах свічки запаювали в автоматі для запайки і нарізання контурної упаковки. За зовнішнім виглядом це напівпрозорі, однорідні, пружні супозиторії світло-жовтого або жовтого кольору, які розчинялися у воді при нагріванні до 40С на водяній бані.

Дослідження антимікробного спектру і чутливості клінічних ізолятів до декаметоксину, десептолу та фарматексу проводили трьохкратно методом двохкратних послідовних серійних розведень досліджуваних препаратів в рідкому поживному середовищі за загальноприйнятою методикою на 40 музейних і 104 клінічних штамах мікроорганізмів, що відносяться до 19 таксономічних груп. Швидкість формування резистентності у тест-штамів мікроорганізімів до антимікробних препаратів вивчали шляхом пасажування їх у присутності антисептиків. Всього проведено 40 пасажів мікробів. Після кожних п’яти пасажів вивчали морфологію, тінкторіальні, культуральні, біохімічні ознаки. Вивчення біологічної активності антимікробних препаратів в несприятливих фізико-хімічних (рН) і біологічних (мікробне навантаження) умовах проводили за існуючою методикою двократних послідовних серійних розведень препаратів в рідкому поживному середовищі. Фізико-хімічні властивості і вміст компонентів супозиторіїв вивчали згідно ДФ ХІ відразу після їх виготовлення та у процесі тривалого зберігання. Оцінку доступності досліджуваних препаратів, в залежності від концентрації активних речовин та рН середовища, проводили за допомогою діалізного методу. Для виявлення токсичності супозиторної лікарської форми на основі декаметоксину в експерименті використовували самок щурів та кролів. В роботі досліджували гостру та хронічну токсичність, а також загальнотоксичну дію препарату в динаміці за такими показниками, як реакція поведінки, маса тіла, виживання, гемограма, функція печінки та нирок.(Е.В.Гублер, 1973; В.В.Меньшикова, 1987; И.М.Трахтенберг, 1991). Алергізуючу дію десептолу вивчали за здатністю викликати у тварин контактний дерматит неалергічного характеру, а також специфічну сенсибілізацію шкіри. Сперміцидну активність десептолу вивчали на 31 еякуляті великої рогатої худоби та людини. Оцінку стану сперматозоїдів давали застосовуючи мікроскопічні, імунологічні, біохімічні, фізіологічні методи дослідження (В.К.Милованов, 1962; С.И.Сердюк, 1977; З.Ф.Васильева, В.К.Шаболина, 1984; A.Friberg, 1974; A.M.Shill, 1976). Контрацептивну дію супозиторіїв десептол вивчали в дослідах на щурах та кролях. Для досліду були відібрані самки, які раніше вагітніли і мали здорове потомство. Всього було виконано близько 2000 дослідів. Статистичну обробку результатів досліджень супозиторіїв проводили за методом варіаційної статистики, пристосованого для комп’ютерів типу IBM PC/АТ.

Результати власних досліджень

1. Оцінка властивостей антимікробних препаратів. Вивчення антимікробної активності супозиторіїв десептол проводили в порівняннні з декаметоксином та супозиторіями фарматекс з бензалконію хлоридом. Отримані результати наведені в табл. 1.

Декаметоксин та десептол проявляли згубну дію на грампозитивні та грамнегативні бактерії, а також дріжджоподібні гриби роду Candida. Найбільшу чутливість до досліджуваних препаратів було виявлено у стафілококів, для яких МБцК препаратів становила 0,06-3,9 мкг/мл. Достатньо високою була активність декаметоксину та десептолу щодо вегетативних форм деяких спороутворюючих мікроорганізмів, наприклад B. subtilis (МБцК – 15,6 мкг/мл) та B.cereus (МБцК – 15,6 мкг/мл).

Для C. albicans концентрація препаратів, що призводила до їх загибелі дорівнювала також 15,6 мкг/мл. В процесі вивчення активності декаметоксину та десептолу встановлено їх ефективність щодо музейних штамів ентеробактерій та псевдомонад. Серед представників родини Enterobacteriaceae найбільш чутливими до досліджуваних препаратів були ешерихії (МБцК – 7,8-31,2 мкг/мл), клебсієли (МБцК – 31,2 мкг/мл), сальмонели (МБцК – 15,6-31,2 мкг/мл). Враховуючи збільшення кількості гнійно-запальних інфекцій, що викликає грамнегативна флора та гриби роду Candida, нами було досліджено антимікробну активність десептолу та декаметоксину щодо клінічних ізолятів ентеробактерій, псевдомонад та кандид. Результати дослідження чутливості клінічних штамів мікроорганізмів показали високу антимікробну активність щодо них як у декаметоксину, так і у десептолу.

Таблиця 1

Антимікробна активність супозиторіїв десептол щодо музейних штамів мікроорганізмів різних таксономічних груп (мкг\мл)

Штами мікроорганізмів | Десептол | Декаме-токсин | Десептол | Декаме-токсин

МБсК (Mm) | МБцК (Mm)

E.coli M-17 | 7,8+0 | 7,8+0 | 7,8+0 | 7,8+0

E.coli B | 15,6+0 | 15,6+0 | 31,2+0 | 15,6+0

E.coli ATCC | 3,9+0 | 3,9+0 | 7,8+0 | 7,8+0

E.coli O-111 | 3,9+0 | 3,9+0 | 15,6+0 | 15,6+0

E.coli O-124 | 7,8+0 | 7,8+0 | 31,2+0 | 15,6+0

S.typhimuriumТA | 15,6+0 | 15,6+0 | 15,6+0 | 15,6+0

S.typhimurium 441 | 62,5+0 | 15,6+0 | 62,5+0 | 31,2+0

K.pneumoniae | 31,2+0 | 31,2+0 | 31,2+0 | 31,2+0

P.vulgaris 89 | 31,2+0 | 31,2+0 | 62,5+0 | 62,5+0

P.vulgaris 4636 | 62,5+0 | 15,6+0 | 62,5+0 | 31,2+0

P.mirabilis 410 | 31,2+0 | 31,2+0 | 62,5+0 | 62,5+0

P.mirabilis F-392 | 62,5+0 | 31,2+0 | 62,5+0 | 62,5+0

I.enterocolitica | 31,2+0 | 15,6+0 | 62,5+0 | 31,2+0

P.aeruginosa F-51 | 62,5+0 | 31,2+0 | 62,5+0 | 62,5+0

P.aeruginosaATCC | 62,5+0 | 62,5+0 | 62,5+0 | 62,5+0

P.aeruginosa 9627 | 62,5+0 | 31,2+0 | 62,5+0 | 62,5+0

S.aureus 209 | 0,97+0 | 0,97+0 | 1,95+0 | 1,95+0

S.albus 138 | 0,03+0 | 0,015+0 | 0,12+0 | 0,03+0

S.saprophythicus | 0,03+0 | 0,03+0 | 0,12+0 | 0,12+0

S.aureusATCC | 3,9+0 | 0,48+0 | 3,9+0 | 1,95+0

C.albicans 43 | 7,8+0 | 15,6+0 | 15,6+0 | 15,6+0

B.antracoides | 7,8+0 | 7,8+0 | 62,5+0 | 62,5+0

B.cereus | 3,9+0 | 3,9+0 | 15,6+0 | 15,6+0

B.brevis | 3,9+0 | 3,9+0 | 62,5+0 | 62,5+0

B.subtilis | 3,9+0 | 3,9+0 | 15,6+0 | 15,6+0

Примітка:

МБсК (МФсК) – мінімальна бактеріостатична (фунгістатична) концентрація

МБцК (МФцК) – мінімальна бактерицидна (фунгіцидна) концентрація

Крім оцінки антимікробної активності субстанції декаметоксину та супозиторіїв десептол нами проведено порівняльне вивчення протимікробних властивостей супозиторіїв десептол та фарматекс, що містять бензалконію хлорид. Результатами досліджень встановлено, що бактерицидна активність супозиторіїв фарматекс для переважної більшості стафілококів, була нижчою порівняно з десептолом в 2-16 разів і становила 0,12-7,8 мкг/мл. Висока антистафілококова активність стала підставою для розширення вивчення антимікробної дії препаратів стосовно інших видів бактерій, зокрема грамнегативних. Щодо ентеробактерій супозиторії фарматекс з бензалконієм хлоридом дещо поступалися активності десептолу. Так, антимікробна активність фарматексу щодо музейних та клінічних штамів ентеробактерій була нижчою, порівняно з десептолом, в 2-32 разів (МБцК фарматексу для ентеробактерій становила 125-250 мкг/мл). Крім того, у супозиторіїв десептол було виявлено більш виражену протигрибкову активність, порівняно з препаратом порівняння. Так, фунгіцидна активність фарматексу для клінічних ізолятів дріжджоподібних грибів роду Candida була меншою в 2-8 разів і становила 20,8-62,5 мкг/мл. Підводячи підсумок, потрібно підкреслити, що супозиторії десептол характеризувються високою антимікробною активністю, що дає підстави для подальшого всебічного клінічного їх вивчення.

Взаємодія мікроорганізмів і антисептиків в умовах макроорганізму в присутності факторів, які можуть впливати на активність антимікробних сполук, може змінюватись в широких межах. Тому було цікавим вивчити вплив рН середовища і мікробного навантаження на антимікробну активність декаметоксину в супозиторній лікарській формі. Результати дослідження показали, що мала місце тенденція до незначного зниження активності препарату у слабо-кислому середовищі і збільшення її у слабо-лужному середовищі. Вивчення активності антимікробних препаратів в умовах різного мікробного навантаження дозволило встановити, що підвищення посівної дози мікроорганізмів на 3 lg супроводжувалось зменшенням активності препарату в 2-4 разів. Проте, зниження посівної дози на 6 lg сприяло підвищенню його активності в 2-32 разів.

В серії досліджень було вивчено особливості формування резистентності у мікроорганізмів різних таксономічних груп до антисептичних препаратів. Вивчення проводили на тест-штамах: S.aureus 209P, E.coli 0-124 та C.albicans. Для порівняння було використано декамін. Отримані результати ілюструє рис.1. Як видно з рисунку резистентність у тест-штамів мікроорганізмів до декаміну формувалася на поживних середовищах досить повільно. Після 40 пасажів у присутності декаміну чутливість S.aureus та E.coli зменшилась в 64 рази, порівняно з контролем, а C.albicans – в 32 рази. Поява стійких до декаметоксину мікроорганізмів також проходила поступово. Отримані результати вивчення виникнення резистентності у E.coli 0-124, C.albicans 43, S.aureus 209Р до декаметоксину дозволили відмітити, що культивування тест-штамів мікроорганізмів в присутності даного препарату призводило до зниження чутливості стафілокока в 32 рази, ешерихії – в 8 разів та C.albicans – в 16 разів. Утворення резистентних варіантів мікроорганізмів до декаметоксину в порівнянні з декаміном показало, що після 40 пасажів вона була нижчою для E.coli 0-124 в 4 рази, для C.albicans 43 – в 2 рази та для S.aureus 209Р – в 2 рази. Розвиток стійкості у мікроорганізмів до десептолу характеризувався наступними показниками. Культивування тест-штамів мікроорганізмів у присутності препарату призвело до зниження чутливості E.coli 0-124 в 4 рази, C.albicans 43 – в 16 разів, S.aureus 209 Р – в 32 рази. Порівняльне дослідження чутливості мікроорганізмів до антисептичних препаратів показало, що резистентність тест-штамів до декаміну не супроводжувалась розвитком перехресної стійкості до декаметоксину та десептолу, і навпаки резистентні варіанти мікроорганізмів до декаметоксину і десептолу зберігали чутливість до декаміну. Крім того, у резистентних до досліджуваних препаратів мікроорганізмів відмічали зміну форми клітин, уповільнення росту і розмноження їх на поживних середовищах, зниження біохімічної активності в порівнянні з вихідними штамами. Отже, дослідження біологічної активності супозиторіїв десептол дозволило встановити високу антимікробну його дію щодо музейних і госпітальних штамів мікроорганізмів.

Рис. 1. Характеристика формування резистентності у мікроорганізмів до декаміну, декаметоксину та десептолу

2. Фізико-хімічні властивості супозиторіїв десептол. Поряд із вивченням антимікробної активності супозиторіїв проводили дослідження їх фізико-хімічних властивостей. Оскільки супозиторії такого складу пропонуються вперше, нами були розроблені методи ідентифікації та кількісного визначення складових супозиторіїв.

Ідентифікацію декаметоксину проводили за характеристичним спектром поглинання забарвленого асоціату, утвореного при взаємодії препарату з еозином в слабокислому середовищі у присутності полівінілового спирту. Спектр даного розчину досліджували в межах від 500 до 600 нм порівняно зі спектром робочого стандартного зразка декаметоксину, знятому в тих же умовах. За ДФ X желатин і гліцерин заважають один одному при проведенні тотожності, оскільки дають ідентичну реакцію з сульфатом міді в лужному середовищі. Для усунення цього явища були підібрані умови розділення желатину і гліцерину. Розчинником було вибрано 96% етиловий спирт, в якому желатин майже не розчинявся, а гліцерин змішувався в будь-яких співвідношеннях. Після розділення желатину і гліцерину для ідентифікації желатину нами було використано осадову реакцію з таніном. Ідентифікацію гліцерину проводили з використанням сульфату міді в лужному середовищі. З метою кількісного визначення декаметоксину в супозиторіях було використано спектрофотометричний метод, що розробляли для ідентифікації декаметоксину. При утворенні асоціату декаметоксину з еозином спостерігали геперхромний ефект та батохромний зсув максимума поглинання порівняно з водним розчином декаметоксину. В серії досліджень було вивчено стабільність супозиторіїв в процесі зберігання. Результати спостереження за стабільністю закладених на зберігання супозиторіїв десептол терміном на 2 роки показали, що кількісний вміст інгредієнтів, їх зовнішній вигляд практично не змінювались. Тому склад супозиторіїв є оптимальним для створення стабільної лікарської форми. Так, вміст декаметоксину в десептолі, що визначали кожних 6 місяців після закладання на зберігання, коливався в межах від 0,0045 до 0,0055 г. Супозиторії залишалися напівпрозорими, однорідними, світло-жовтого кольору, характеристичний спектр поглинання відповідав вихідному, якісні реакції на желатин та гліцерин були позитивними, відхилення в дозуванні не перевищували 5%, мікробіологічна чистота відповідала вимогам ДФ ХІ. Відхилень від НТД не встановлено.

На етапі розробки нового антимікробного лікарського засобу та після встановлення оптимальних концентрацій активної та допоміжних речовин важливо було вивчити доступність супозиторної лікарської форми. Тому в роботі проводили вивчення швидкості дифузійного вивільнення декаметоксину із супозиторіїв за допомогою діалізного методу. Кінетику проходження декаметоксину через напівпроникливу мембрану вивчали в супозиторіях з різною концентрацією активної речовини та в залежності від рН середовища. Для порівняння цих показників було вибрано супозиторії фарматекс з бензалконієм хлоридом. Найактивніше проходила дифузія декаметоксину в фізіологічний розчин хлориду натрію із супозиторіїв з концентрацією його 0,125%. Через 8 год дослідження вона досягала 13% від загальної кількості активної речовини, тоді як із фарматексу вивільнялося за цей проміжок часу менше 1% бензалконію хлориду. Більш активну дифузію препаратів спостерігали в буферний розчин борної кислоти з рН середовища 5.0. При такій концентрації водневих іонів в діалізат переходило до 40% декаметоксину із супозиторіїв десептол. Активніше відбувалася дифузія і бензалконію хлориду. За 8 год з основи вивільнялося до 12% препарату. Така закономірність отриманих результатів дала можливість стверджувати, що швидкість вивільнення препаратів із досліджуваних супозиторіїв суттєво залежала від виду діалізату, концентрації активних речовин, допоміжних компонентів лікарської форми, а також від концентрації водневих іонів.

3. Вплив супозиторіїв десептол на організм тварин. Встановлені під час дослідження ряд позитивних біологічних властивостей супозиторіїв десептол обумовили доцільність вивчення їх смерміцидної, контрацептивної, токсичної, алергізуючої дії на організм тварин. Для виявлення токсичності супозиторної лікарської форми на основі декаметоксину в експерименті використовували самок щурів та кролів. В роботі досліджували гостру та хронічну токсичність, а також проводили вивчення загальнотоксичної дії препарату в динаміці за такими показниками, як реакція поведінки, маса тіла, виживання, гемограма, функція печінки та нирок.

При вивченні хронічної токсичності у піддослідних тварин, яким вводили супозиторії, не було виявлено відмінностей в поведінці та загальному стані, порівняно із контрольними. Не відмічали реакції на введення препарату (гіперемія, патологічні виділення), а також не спостерігали втрати ними маси. Дослідження периферичної крові показало, що тривале введення тваринам десептолу не здійснювало впливу на кількість і морфологію еритроцитів, вміст гемоглобіну, тромбоцитів, лейкоцитів. Деякі зміни, виявлені в кількісному співвідношенні лейкограми, не виходили за межі коливань видової норми. Швидкість осідання еритроцитів у кролів всіх груп протягом періоду спостереження була стабільною. Вміст загального білка у крові і показник тімолової проби відповідали вихідним величинам і не мали відмінностей від показників у тварин контрольних груп. В ході вивчення не було виявлено суттєвих змін рівня холестерину в сироватці крові тварин усіх груп, що вказувало на відсутність негативного впливу десептолу на ліпідний обмін. Застосування досліджуваного препарату не обумовлювало змін в ферментативній функції печінки кролів. Активність аланінамінотрансферази (АлАТ) через 30 днів після початку експерименту у кролів всіх груп відповідала вихідним величинам, активність аспартатамінотрансферази (АсАТ) підвищувалась відносно вихідного фону, але коливання були в межах норми. Крім того, тривале введення десептолу тваринам не змінювало рівня глюкози у крові. Про рівень азотвидільної функції нирок судили за показниками вмісту сечовини та залишкового азоту в сироватці крові. Отримані результати довели відсутність достовірних відмінностей цих параметрів у тварин різних груп. Вивчення токсичності в гострих дослідах на самках щурів та кролів показало, що інтравагінальне введення препарату протягом 14 діб не викликало видимих ознак інтоксикації та загибелі тварин.

Дослідження здатності супозиторіїв десептол викликати контактний дерматит неалергічного характеру, а також специфічну сенсибілізацію шкіри шляхом нашкірних аплікацій довели, що у тварин протягом усього періоду спостережень не відмічалося видимих змін на шкірі в місці нанесення препарату. За шкалою шкірних проб реактивність її становила 0 балів. Результати експериментального дослідження довели, що досліджуваний препарат також не викликав розвитку алергічного дерматиту, який може виникати на фоні загальної сенсибілізації організму тварин.

Оскільки у деяких із четвертинних амонієвих сполук виявлено сперміцидну активність, було проведено порівняльне вивчення сперміцидної активності десептолу, 0,1% водного розчину декаметоксину та 0,5% водного розчину бензалконію хлориду. Для вивчення було відібрано 31 еякулят тварин та людини без спермаглютинуючих та спермімобілізуючих антиспермальних антитіл. Після додавання 0,5% розчину бензалконію хлориду до еякуляту, відмічали пригнічення всіх процесів, що характеризують життєздатність сперміїв. Живих сперміїв виявлено не було, редукції метиленового синього не відбувалося порівняно з вихідними показниками. Еквілібрація сперми з 0,1% розчином декаметоксину також призводила до швидкого знерухомлення сперміїв. Редукції метиленового синього не відбувалося. Тест контакту сперміїв з цервікальним слизом був негативним. Ідентичними були результати сперміцидної активності десептолу. Еквілібрація сперми з супозиторіями десептол в розтопленому вигляді призводила також до миттєвого припинення руху сперматозоїдів: час їх переживання дорівнював нулю, тобто рухливих сперміїв виявлено не було відразу після додавання препарату. Тест контакту сперми з цервікальною рідиною після обробки десептолом був негативним.

Крім сперміцидної активності десептолу нами проводилося вивчення їх контрацептивної ефективності на самках щурів та кролів, яким інтравагінально вводили досліджуваний препарат, плацебо та очищену воду. В результаті дослідження було отримано наступні дані. При введенні десептолу вагітність у самок щурів не наступала у 92 % випадків, порівняно з контрольними групами. Із 20 кролів дослідної групи жодна самка не вагітніла, тоді як у контрольній групі при введенні основи не вагітніло лише 10 % самок кролів.

Отже, всебічне вивчення антимікробної активності, фізико-хімічних властивостей, доступності, алергізуючої та токсичної дії створює сприятливу перспективу для подальшого глибокого вивчення ефективності нової супозиторної лікарської форми десептол в умовах клінік.

ВИСНОВКИ

На основі аналізу здобутих результатів досліджень зроблені наступні наукові висновки:

1. Всебічне вивчення біологічної активності супозиторіїв з декаметоксином на гідрофільній основі дозволило створити новий вітчизняний препарат, застосування якого зможе покращити якість лікування гнійно-запальних захворювань геніталій у жінок.

2. Дослідження антимікробних властивостей декаметоксину та супозиторіїв десептол дозволило встановити у них високу протимікробну активність. Супозиторії десептол ефективно діють на стафілококи (МБцК – 0,12-3,9 мкг/мл), вегетативні форми спороутворюючих бацил (МБцК – 15,6-62,5 мкг/мл), ентеробактерії (МБцК – 7,8-62,5 мкг/мл), псевдомонади (МБцК – 62,5 мкг/мл), кандиди (МФцК – 15,6 мкг/мл).

3. Супозиторії десептол мають значно вищу протимікробну дію порівняно з фарматексом з бензалконію хлоридом. Так, стосовно стафілококів бактерицидна активність фарматексу є нижчою в 2-16 разів і становить 0,12-7,8 мкг/мл, стосовно ентеробактерій – в 4-16 разів і становить 125-250 мкг/мл, стосовно дріжджоподібних грибів роду Candida – в 2-8 разів і становить 20,8-62,5 мкг/мл.

4. Госпітальні полірезистентні до антибіотиків мікроорганізми зберігають високу чутливість до супозиторіїв десептол. МБцК десептолу для клінічних ізолятів S.aureus, S.epidermidis становить 0,24- 15,6 мкг/мл, для E.coli – 7,8-31,2 мкг/мл, для P.vulgaris, P.mirabilis– 31,2-62,5 мкг/мл, для P.aeruginosa - 125-250 мкг/мл). Для C.albicans МФцК дорівнює 7,8-62,5 мкг/мл. У мікроорганізмів різних груп повільно формується резистентність до супозиторіїв десептол і не є перехресною з іншими антисептичними препаратами.

5. Концентрація водневих іонів та різне мікробне навантаження істотно не впливають на активність десептолу. Посилення актимікробної активності десептолу спостерігається у слабо-лужному середовищі та незначне її зменшення - у слабо-кислому середовищі. Підвищення посівної дози мікроорганізмів на 3 lg зменшує біологічну активність препарату в 2-4 рази, а зменшення її на 6 lg призводить до підвищення антимікробної активності десептолу в 2-32 разів.

6. Гідрофільна основа є фармакологічно індиферентною, її компоненти не впливають на біологічну активність декаметоксину та його фізико-хімічні властивості. За 8 год спостереження із супозиторіїв десептол в оточуюче середовище вивільняється від 13% до 40% декаметоксину. Інтенсивність дифузії залежить від концентрації активної речовини, співвідношення компонентів основи, а також від рН середовища.

7. Супозиторії десептол проявляють виражений сперміцидний ефект. Еквілібрація еякулятів з десептолом призводить до миттєвої іммобілізації сперміїв та зміни проникливості цервікального слизу. Перевагою препарату є повна відсутність у нього побічної дії на організм тварин.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Проект Тимчасової Фармакопейної статті на супозиторії “Десептол” (Suppositoria Deseptolum) рекомендовано для використання на фармацевтичному заводі, який буде виготовляти цей лікарський препарат. Інструкція по медичному застосуванню створена для користування при дослідженні супозиторіїв десептол в умовах клініки.

2. Реакції ідентифікації та кількісного визначення компонентів супозиторіїв доцільно використовувати для проведення аналізу лікарського препарату десептол в умовах контрольно-аналітичних лабораторій заводів-виробників та аптечних управлінь.

3. Супозиторії десептол доцільно вивчити в умовах клініки для лікування неспецифічних трихомонадних та грибкових кольпітів; вагінітів, цервіцитів, вульвітів грибкового, хламідійного, бактеріального та змішаного генезу; метритів, параметритів, сальпінгітів; а також для санації в перед- та післяопераційному періодах при гінекологічних оперативних втручаннях; для допологової санації породіль з метою профілактики післяпологових запальних ускладнень.

ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Прокопчук З.М. Вивчення властивостей супозиторіїв з декаметоксином // Вісник Вінницького державного медичного університету. - 1998. - Т.2, № 2. - С.341-342.

2. Прокопчук З.Н. Антимикробные, физико-химические свойства суппозиториев Десептол на гидрофильной основе // Провизор. - 1999. - № 10. - С.47-48.

3. Пропокчук З.М. Антимікробні властивості Десептолу та фізико-хімічні властивості гідрофільної супозиторної основи // Експериментальна і клінічна медицина. - 1999. - № 2. - С.72-74.

4. Протимікробна дія супозиторіїв Десептол на клінічні штами мікроорганізмів, виділених при хронічних захворюваннях геніталій // Вісник Вінницького державного медичного університету. - 2000. - Т. 4, № 2. - С.343-344. (Співавт. Палій Г.К., Дзісь Н.П. Автором проведено виділення та ідентифікація клінічних ізолетів, вивчення їх чутливості до десептолу, статистична обробка результатів, оформлення статті).

5. Спосіб ідентифікації декаметоксину // Патент України на винахід № 27579. Бюлетень..., К., 2000, №4 С. 157 (Співавт. Палій В.Г., Когет Т.О., Мруг В.М., Вовк І.М., Палій І.К.).

6. Використання рефрактометрії та інтерферометрії в аналізі лікарських форм декаметоксину // Матеріали V національного з’ізду фармацевтів України. - Харків, 1999. - С. 517.

7. Методи ідентифікації та кількісного визначення антисептичних супозиторіїв Десептол // Матеріали V національного з’ізду фармацевтів України. - Харків, 1999. - С. 518.

8. Мікробіологічна характеристика засобів профілактики нозокоміальних захворювань // Матеріали симпозіуму “Синтез, експериментальне вивчення та клінічне застосування четвертинних амонієвих сполук. - Чернівці, 1995. - С. 48. (Співавт. Мруг В.М.).

9. Нові антисептичні засоби в профілактиці гнійно-запальних процесів // Матеріали V Республіканської учбово-методичної та наукової конференції завідуючих кафедрами загальної хірургії медвузів України. - Тернопіль, 1996. - С. 82-83.(Співавт. Мруг В.М.).

10. Передопераційна обробка рук хірурга декаметоксином в боротьбі з гнійною інфекцією // Матеріали V Республіканської навчально-методичної та наукової конференції завідуючих кафедрами загальної хірургії медвузів України. - Тернопіль, 1996. - С. 86-87.(Співавт. Чеснокова А.О.).

11. Клініко-лабораторне дослідження супозиторіїв з декаметоксином // Матеріали VІІ університетської науково-практичної конференції молодих вчених та фахівців. - Вінниця, 2000. - С. 7-8.(Співавт. Дзісь Н.П.).

12. Вивчення сперміцидної активності супозиторіїв Десептол у дослідах in vitro // Матеріали ІІ Національного з’їзду фармакологів України. - Дніпропетровськ, 2001. - С. 187.

Прокопчук Зоя Миколаївна. Порівняльне дослідження антимікробних та біологічних властивостей супозиторіїв. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України. Харків, 2001.

Дисертація присвячена проблемі розробки нового протимікробного вагінального лікарського засобу. В роботі дана мікробіологічна оцінка та проведено порівняльне експериментальне вивчення антисептичних супозиторіїв з декаметоксином та бензалконію хлоридом. Крім того, в роботі наведені результати досліджень зі швидкості формування резистентності у мікроорганізмів до антимікробних препаратів. Вивчені фізико-хімічні властивості препарату у процесі тривалого зберігання. В експерименті досліджено сперміцидну, токсичну та алергізуючу дію супозиторіїв. Експериментально доведена виражена антимікробна активність супозиторіїв з декаметоксином, визначено спектр їх дії щодо музейних та клінічних штамів мікроорганізмів, відмічена відсутність у них алергізуючої та токсичної дії на макроорганізм, а також сперміцидний ефект. Отримані результати створюють перспективу широкого застосування десептолу в умовах клініки.

Ключові слова: антисептики, супозиторії, мікроорганізми, декаметоксин, сперміциди.

Прокопчук Зоя Николаевна. Сравнительное исследование антимикробных и биологических свойств суппозиториев. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 – микробиология. Институт микробиологии и иммунологии АМН Украины. Харьков, 2001.

Диссертация посвящена разработке нового антимикробного лекарственного препарата на основе отечественного антисептика декаметоксина – суппозиториям Десептол. Целью этой работы были микробиологическая оценка и сравнительное экспериментальное обоснование свойств антисептических суппозиториев с декаметоксином и бензалкония хлоридом. В работе проведены исследования антимикробной активности препарата, изучены скорость формирования резистентности к препарату у разных групп микроорганизмов, физико-химические свойства суппозиториев, а также их влияние на организм животных.

В результате многоплановых исследований было установлено высокую антимикробную активность препаратов по отношению к музейным и клиническим штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжеподобных грибов рода Сandida. Показано, что разные неблагоприятные физико-химические (рН среды) и биологические (микробная нагрузка) факторы не оказывают существенного влияния на активность суппозиториев десептол.

В работе усовершенствованы и разработаны методы качественного и количественного определения компонентов суппозиториев, изучены закономерности скорости освобождения активных веществ из основ в зависимости от их концентрации и рН среды. Проведена коррелляция между показателями поверхностного натяжения суппозиториев и скоростью высвобождения декаметоксина из препарата. Экспериментально установлено отсутствие у суппозиториев десептол способности вызывать побочные явления в организме животных, такие как общую интоксикацию организма и аллергизирующее действие. Кроме того, десептол обладает выраженным спермицидным эффектом. Обработка эякулятов препаратом приводила к моментальной иммобилизации спермиев и отсутствию контакта с цервикальной слизью.

Ключевые слова: антисептики, суппозитории, микроорганизмы, декаметоксин, спермицид.

Procopchuk Zoya Micolaivna. Comparative investigation of antimicrobial and biological peculiarities of suppositories. Candidate’s of medical sciense (scientific degree) thesis, specialization - 03.00.07 – microbiology. Institute of microbiology