Харківський національний університет

ім. В.Н.Каразіна

Суханова Ірина Прохорівна

УДК 575.16 : 575.222.78 : 576.3–0.83.3 : 595.777

Генетичні відміни у порід і гібридів

шовковичного шовкопряда за стійкістю до хвороб,

клітинний імунітет і гетерозис

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті шовківництва Української академії аграрних наук,

м. Мерефа Харківської обл.

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор,

заслужений діяч науки і техніки України

Шахбазов Валерій Гайович,

Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, завідувач кафедрою генетики та цитології

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник

Кириченко Іван Олександрович,

Інститут шовківництва УААН, завідувач лабораторією захисту шовкопряда від хвороб та шкідників

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Бондаренко Юрій Васильович, завідувач відділом генетики Інституту птахівництва УААН, с. Борки, Харківської обл.

кандидат біологічних наук, Нікольченко Зінаїда Титівна, доцент кафедри генетики та цитології Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики

Захист дисертації відбудеться “ 26 ” квітня 2001 р. о 1500 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.18 при Харківському національному університеті ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи 4, ауд. 3-15

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи 4

Автореферат розісланий “ 23 ” березня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Некрасова А.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Вступ. Ефект гетерозису у гібридних організмів зумовлює високий рівень функціонування їх систем гомеостазу (Шахбазов и др., 1990), забезпечуючи відповідний адаптаційний потенціал в змінюваних умовах довкілля. Це пояснює пріоритетне промислове використання гетерозисних гібридів як рослин, так і тварин, і має особливе значення для пойкілотермних організмів, в т.ч. шовковичного шовкопряда (Bombyx mori L.), оскільки хід і напрямок їх фізіологічних процесів суттєво модифікуються під впливом середовищних факторів (Злотин, Головко, 1998).

Широке практичне застосування гетерозисних гібридів шовкопряда зумовлене, в першу чергу, підвищеним рівнем їх стійкості до хвороб (Головко та ін., 1994, Головко и др., 1996), серед яких найбільш поширеними в Україні та інших шовківничих регіонах світу є ядерний поліедроз і бактеріози (Головко, Кириченко, 1993; Кириченко и др., 1996; Кириченко та ін., 1997).

В реалізації протиінфекційної резистентності шовковичного шовкопряда, як і інших видів комах, провідну роль відіграють складні імунологічні механізми, серед яких пріоритетне місце займають клітинні. Однак, значна кількість питань, пов’язаних з генетичною детермінацією зазначених процесів, а також - природою стійкості порід і гетерозисних гібридів до хвороб, є недостатньо вивченою.

Актуальність теми. Існує ряд даних щодо наявності у шовковичного шовкопряда певних залежностей між функціонуванням клітинних механізмів захисту, зокрема фагоцитарної реакції, та генотипом особин (Головко и др., 1996 та інші). Разом з цим, отримані результати свідчать про необхідність комплексного підходу при вивченні даних взаємозв’язків. Нез’ясованою є і роль гетерозису у функціонуванні механізмів клітинного імунітету. Отже, дослідження, спрямовані на вирішення представлених проблем, є досить актуальними, оскільки дозволять системно охарактеризувати реалізацію зазначених процесів у різних генотипів шовкопряда і, особливо, гетерозисних гібридів. Цілком доцільним є і порівняльний аналіз ознак його протиінфекційної та неспецифічної резистентності, що відкриє нові можливості для розуміння генетичної природи стійкості шовковичного шовкопряда до хвороб.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в межах республіканської науково-технічної програми “Шовківництво” - “Розробити ефективні технології виробництва шовкової сировини на основі високопродуктивних нових порід і гібридів шовковичного шовкопряда та сортів шовковиці” (№ державної реєстрації 03.04 - МВ/14-96).

Мета і задачі досліджень. Метою досліджень було з’ясування ролі гетерозису та інших генетичних факторів у функціонуванні клітинних механізмів резистентності, зокрема, реакції фагоцитозу у порід і гібридів шовкопряда при стресуючих навантаженнях, а також - залежностей між його стійкістю до хвороб та неспецифічною резистентністю.

Для досягнення цієї мети були поставлені слідуючі задачі:

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження - природа стійкості порід і гетерозисних гібридів шовкопряда до хвороб та роль клітинних механізмів захисту в її реалізації.

Предмет дослідження - вплив гетерозису і інших генетичних факторів на функціонування клітинних механізмів захисту, зокрема фагоцитозу, та генетична обумовленість взаємозалежностей між неспецифічною резистентністю порід і гібридів шовкопряда, їх стійкістю до хвороб і факторами клітинного імунітету.

Для оцінки рівня неспецифічної стійкості порід і гібридів шовкопряда використовували метод термотесту. Їх стійкість до хвороб визначали за показниками життєздатності гусениць, заражених збудниками відповідних захворювань. Для оцінки гемограм та фагоцитарної активності гемоцитів гусениць порід і гібридів шовкопряда використовували методи, прийняті в гематологічній і імунологічній практиці. Ефект гетерозису у гібридів за фенотипічними ознаками визначали за середніми значеннями показників у порід і гібридів шовкопряда, а також - по відношенню до кращої з вихідних порід. При визначенні впливу екологічних факторів на ознаки резистентності порід і гібридів шовкопряда використовували різні екологічні фони на вигодівлях та субоптимальні температурні умови проведення реакції фагоцитозу. Для оцінки впливу генотипу і стресуючих навантажень на фагоцитарну активність гемоцитів використовували дисперсійний аналіз, взаємозв’язків між досліджуваними показниками - кореляційний.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті дисертаційної роботи автором вперше встановлено:

- нові прояви ефекту гетерозису у гібридів шовкопряда на клітинному рівні - за показником сумарної фагоцитарної активності гемоцитів гусениць;

- наявність достовірної позитивної кореляції між рівнем неспецифічної та протиінфекційної резистентності порід і гібридів шовкопряда, а також – сумарної фагоцитарної активності гемоцитів гусениць;

- істотний вплив генотипу на зміни співвідношення формених елементів гемолімфи, їх фагоцитарної активності і сумарної фагоцитарної активності гемоцитів гусениць, залежно від умов вигодівель та субоптимальних температур при проведенні реакції фагоцитозу in vitro;

- генетичні відміни між породами і гетерозисними гібридами шовкопряда за гемоцитарним складом та динамікою цих показників в умовах фізіологічної норми;

- обгрунтовано доцільність оцінки рівня неспецифічної та протиінфекційної резистентності порід і гетерозисних гібридів шовкопряда за показником сумарної фагоцитарної активності гемоцитів гусениць та рядом особливостей гемоцитарного складу;

- позитивний взаємозв’язок у сімей шовкопряда, різних за рівнем неспецифічної стійкості, між їх ембріональною терморезистентністю, життєздатністю гусениць та вмістом макронуклеоцитів в гемолімфі, їх фагоцитарною активністю і сумарною фагоцитарною активністю гемоцитів;

- генетичні відміни у порід шовкопряда за змінами співвідношення формених елементів гемолімфи, фагоцитарною активністю окремих типів клітин і сумарною фагоцитарною активністю гемоцитів при вірусній інфекції;

- активацію системи фагоцитозу у гусениць шовкопряда при вірусній інфекції, що найбільш чітко простежується у особин, виживших після зараження;

- генетичні відміни у порід і гібридів шовкопряда за фагоцитарною активністю окремих типів гемоцитів та сумарним фагоцитозом щодо різних бактерій, виділених з поверхні грени.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи дозволяють рекомендувати проведення прогнозування стійкості шовкопряда до ядерного поліедрозу, а також - оцінки ступеня його неспецифічної та протиінфекційної резистентності шляхом врахування сумарної фагоцитарної активності гемоцитів гусениць та ряда гематологічних особливостей. На основі цього розроблені і передані виробництву дві науково-методичні рекомендації, одні з яких видані масовим тиражем. Їх застосування у селекційному процесі в шовківництві дозволить відбирати породи і гібриди шовкопряда з підвищеною до 24,3 % життєздатністю при несприятливих умовах довкілля, бактеріальних і вірусних інфекціях, а також - істотно знизити трудовитрати.

З метою зниження інфекційного фону на вигодівлях шовкопряда практичному шовківництву рекомендовано препарат Естостерил-У для знезараження грени, який не чинить негативної дії на основні біологічні і господарчо-цінні показники шовкопряда різних генотипів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконані пошук, аналіз і узагальнення літературних відомостей щодо тематики роботи, підготовка і проведення її експериментальної частини, врахування гемограм, фагоцитарної активності гемоцитів гусениць, статистична обробка одержаних даних. Вибір основних напрямків досліджень, аналіз їх результатів, формулювання головних положень та висновків роботи - при консультативній допомозі наукових керівників.

Дані щодо ембріональної терморезистентності (А1, А2) та життєздатності гусениць (А1) сімей породи Б-2пол. надані лабораторією біотехнології та генетики шовковичного шовкопряда Інституту шовківництва УААН.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на річних засіданнях вченої ради Інституту шовківництва УААН (Мерефа, 1993-1999), на Міжнародній науковій конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження І.І.Мечникова (Харків, 1996), на міжнародній науковій конференції “Проблеми світового шовківництва кінця ХХ сторіччя” (Враца, Болгарія, 1996), на науково-практичній конференції “Шляхи підвищення якості продукції шовківництва в Республіці Узбекистан” (Ташкент, 1997), на Міжнародній науковій конференції, присвяченій 110-річчю Харківського НДІ мікробіології і імунології ім. І.І.Мечникова (Харків, 1997), на науково-практичній конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми” (Харків, 1997), на Міжнародному симпозіумі “Перспективи розвитку шовківництва у ХХІ сторіччі” (сел. Високий (Харків), 1998), на І Всеукраїнській науково-методичній конференції ветеринарних фармакологів і токсикологів (Київ, 1998), на Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 85-річчю від дня народження академіка ВАСГНІЛ І.М.Гладенка (Харків, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 робіт: 1 брошура, 4 статті – у фахових виданнях, 5 – у інших наукових журналах і 3 – тези та матеріали конференцій.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 205 сторінках друкованого тексту і містить вступ, 5 розділів, 4 додатки (на 30 с.), 23 рисунки (на 17 с.), 36 таблиць (на 18 с.), список використаних джерел (267 найменувань, з них - 96 зарубіжних авторів, на 27 с.).

Матеріали та методи досліджень

Робота виконана в 1993-1999 рр. на базі Інституту шовківництва УААН (лабораторія захисту шовкопряда від хвороб і шкідників). Ряд досліджень проведено в Харківському НДІ мікробіології і імунології ім. І.І.Мечникова та у виробничих умовах - на Миргородському гренажному заводі.

Основним матеріалом досліджень були породи шовковичного шовкопряда (Bombyx mori L.): Білококонна-1 поліпшена (Б-1пол.), Блококонна-2 поліпшена (Б-2пол.), Мерефа-6 (Мер.-6), Мерефа-7 (Мер.-7), Українська-1 (Укр.-1), Українська-2 (Укр.-2), їх реципрокнi гібриди першої генерації Б-1пол.Б-2пол., Б-2пол. Б-1пол., Мер.-6Мер.-7, Мер.-7Мер.-6, Укр.-1Укр.-2, Укр.-2Укр.-1 та породи Дайзо Українська нова (УН). Інкубацію грени, вигодiвлю гусениць проводили згідно прийнятим у шовківництві методам (Злотин, Плугару, 1989; Кириченко та ін., 1991).

Відродження гусениць з грени (ВГ), життєздатність гусениць (ЖГ), урожай коконв з 1 г гусениць, вміст сортових коконв та їх шовконосність визначали згідно прийнятим в шовківництві методикам (Злотин, 1989).

При визначенні ефекту гетерозису (ЕГ) у гібридів шовкопряда за фенотипічними ознаками використовували формули:

, (1)

де MF1 - середнє значення показників гібридів,

MP – середнє значення показників батьківських порід.

, (2)

де F1 – показник гібрида,

PMAX – показник кращої з батьківських порід.

При дослідженні впливу екологічних факторв на фагоцитарну активність (ФА) гемоцитв гусениць шовкопряда їх вигодівлю проводили на оптимальному (ОФ) та песимальному (ПФ) фоні. На ОФ гігротермічний режим у вигодівельному приміщенні, кількість та якість годівель відповідали оптимальним для шовкопряда параметрам (Кириченко та ін., 1991). На ПФ - температура i вологість повітря були зниженими на 5-6 С та 5-10 %, відповідно, кількість годівель - на 50-70 %.

Неспецифічну стійкість порід і гібридів шовкопряда оцінювали за показниками ембріональної терморезистентності (ЕТ), яку визначали методом термотесту В.Г.Шахбазова (1966), адаптованим для шовковичного шовкопряда (Шахбазов та ін., 1996)

Гемограми визначали шляхом врахування співвідношення гемоцитів (пролейкоцитів, макро-, мікронуклеоцитів, фагоцитів, еозинофілів, еноцитоїдів), їх ФА - загальноприйнятим в імунологічній практиці методом (Олейникова и др., 1975), адаптованим для шовкопряда (Шахбазов и др., 1996). Ідентифікували гемоцити згідно прийнятої більшістю дослідників класифікації (Гур’єв, 1970; Злотин, 1989 та інші), в мазках, забарвлених за Романовським-Гімза.

Мiкрооб’єктом фагоцитозу був Staph. aureus (штам № 209), а також - Bac. thuringiensis var. galleriae, et. dendrolimus, виділені з поверхні грени.

При визначенні стійкості порід і гібридів шовкопряда до хвороб проводили пероральне зараження гусениць суспензіями збудників відповідних захворювань з подальшим врахуванням ЖГ.

Зараження гусениць при вивченні змін співвідношення гемоцитів, їх ФА при ядерному поліедрозі (ЯП) проводили індивідуально, розробленим нами (Кириченко, Суханова, Казмірук) крапельним методом.

Бактеріологічне дослідження грени, ідентифікацію мікроорганізмів, виділених з її поверхні, проводили за прийнятими в мікробіології методами (Селибер, 1962; Лабинская,1968), згідно визначникам мікроорганізмів (Полтев, 1969 та інші). Їх ентомопатогенні властивості - шляхом бiопроби на грені та гусеницях шовкопряда.

Бактерициднi та фунгіциднi властивості препаратів визначали шляхом висіву обробленої ними грени на відповідні живильні середовища. Ноземациднi - лабораторним способом за Л.Ф.Кашкаровою та Г.К.Огурцовим (1990). Їх вплив на основні біологічні та господарчо-цiннi показники шовкопряда - шляхом врахування останніх при вигодiвлi гусениць, відроджених з обробленої препаратами грени.

Математичну обробку експериментальних даних проводили за прийнятими в біології методами варіаційної статистики, дисперсійного та кореляційного аналізів (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив генетичних та екологічних факторів на показники неспецифічної стійкості шовковичного шовкопряда

При дослідженні життєздатності порід і гібридів шовкопряда, залежно від умов вигодівель, та їх ЕТ встановлено, що гібриди Мер.-6Мер-7 і зворотній та Укр.-1Укр.-2 і зворотній перевищували на 4,28-34,83 % вихідні породи за рівнем термостійкості, хоча достовірні відміни встановлено лише по відношенню до менш резистентних з них (Укр.-1, Мер.-6).

При порівняльному аналізі ЖГ порід і гібридів шовкопряда, як ознаки їх стійкості до хвороб при природньому зараженні, встановлено, що на ОФ вигодівель Мер.-6Мер-7 і зворотній на 18,65 і 16,25%, відповідно, переважали Мер.-6 (P<0,05), а Укр.-1Укр.-2 і зворотній - на 17,50 і 15,50 % - Укр.-1 (P<0,01). На ПФ - в обох пород-гібридних комбінаціях встановлена достовірна (P<0,01) перевага гібридів над обома вихідними породами. Це зумовлено наявністю ЕГ у гібридів за ЖГ, які на ОФ (форм. 1) складали 12,67 і 7,91 % для мереф’янських і українських гібридів, відповідно; на ПФ - 20,60 і 11,00 %.

Отже, ступінь генетичних відмін за ЖГ суттєво зростала при вигодівлі гусениць на ПФ, що зумовлено меншими відхиленнями показників у гібридів від значень для ОФ.

Дисперсійний аналіз підтвердив встановлені залежності. Зміни ЖГ в більшій мірі були обумовлені генотипом - сила впливу фактора складала 66,24 і 64,58 % - для мереф’янської і української пород-гібридних комбінацій, відповідно.

При кореляційному аналізі даних щодо ЕТ порід і гібридів шовкопряда та їх ЖГ виявлено достовірні позитивні кореляції між ними (ОФ - r = 0,91, ПФ - r = 0,87). Отже, стійкість шовкопряда до хвороб при природньому зараженні залежить від рівня його неспецифічної резистнтності.

При дослідженні впливу генотипу і середовища на гемоцитарний склад гемолімфи гусениць порід і гібридів шовкопряда встановлено, що порода Мер.-7 та гібрид Мер.- 7 Мер.-6 при вигодівлі на ОФ (рис. 1) характеризувались більш значним, ніж Мер.-6 (на 12,34 і 17,37 %, відповідно, Р0,01) вмістом мікронуклеоцитів. Українські гібриди переважали вихідні породи за числом макронуклеоцитів (на 12,80-20,00, Р0,01-0,001), а гібрид Укр.-1Укр.-2 - породу Укр.-1 і за вмістом пролейкоцитів (на 6,71 %, Р0,05).

На ПФ (рис.2) порода Мер.-7 та гібрид Мер.-6Мер.-7 також переважали Мер.-6, але за числом макронуклеоцитів (на 15,60 (Р0,01) і 11,56 % (Р0,05), відповідно). В українській пород-гібридній групі зміна умов вигодівель призвела до більш значної диференціації генотипів за кількістю макронуклеоцитів.

Разом з цим, отримані дані свідчать, що перевагу тих чи інших генотипів за числом певного типу клітин в гемолімфі гусениць не слід приймати за цілковитий критерій оцінки рівня життєздатності. Це зумовлено зміною їх типу, залежно від фону вигодівель, що було встановлено для мереф’янських порід і гібридів. Результати досліджень також підтверджують протиречивість літературних даних, де життєздатність особин пропонують оцінювати за числом мікронуклеоцитів в гемолімфі гусениць (Мадаминов, 1975), а також - макронуклеоцитів (Ованесян, 1951; Иобашвили, 1955; Канарев, 1980).

Отже, для оцінки рівня резистентності шовкопряда за клітинними показниками, необхідним є комплексний підхід у їх вивченні, який, окрім характеристики гемограм, включав би і дослідження функціональної активності гемоцитів.

При вивченні ФА гемоцитів порід і гібридів шовкопряда, залежно від умов середовища, встановлено, що на ОФ порода Мер.- 7 і гібрид Мер- 6Мер.- 7 переважали Мер-6 за ФА мікронуклеоцитів (на 6,22 (Р0,05) і 13,87 % (Р0,001), відповідно); українські гібриди - обидві вихідні породи за ФА пролейкоцитів, макронуклеоцитів і фагоцитів (Р0,05-0,001). На ПФ Мер-6Мер.-7 достовірно переважав обидві вихідні породи за ФА макронуклеоцитів, Мер-7Мер.-6 - за ФА пролейкоцитів і макронуклеоцитів (Р0,05), а породу Мер.-7 - ще й за ФА мікронуклеоцитів (Р0,01). В українській пород-гібридній групі генетичні відміни за ФА гемоцитів подібні до встановлених для ОФ, але більш значимі.

Найбільш яскравою ознакою, яка відображала вплив генотипу і середовища на функціональну активність клітин, а також її залежність від проявів резистентності на організменному рівні, виявилась інтегральна характеристика функції фагоцитуючих гемоцитів - сумарна фагоцитарна активність гемоцитів гусениць (СФАГГ) (рис. 3). В обох пород-гібридних групах виявлено перевагу гібридів над вихідними породами за цим показником, ступінь якої залежав від фону вигодівель. На ОФ - гібрид Мер-6Мер.-7 на 16,00 % (Р0,05) переважав породу Мер.-6, Укр.-1Укр.-2 і зворотній - на 8,00 (Р0,05) і 6,60 % (Р0,05), відповідно, - кращу з батьківських порід Укр.-2. На ПФ обидва мереф’янські гібриди на 7,04-12,20 % (Р0,05-Р0,001) переважали вихідні породи, а в українській групі – зріс рівень значимості відмін (Р0,05 - ОФ, Р0,001 - ПФ).

Рис. 1 Співвідношення формених елементів гемолімфи гусениць порід і гібридів шовкопряда при їх вигодівлі в оптимальних умовах

Рис. 2 Співвідношення формених елементів гемолімфи гусениць порід і гібридів шовкопряда при їх вигодівлі в песимальних умовах

Встановлено наявність ЕГ у гібридів за СФАГГ. У мереф’янських гібридів він становив 23,83 % - ОФ, 65,38 % - ПФ (форм. 1), при цьому Мер-7Мер.-6 характеризувався більш високими значеннями ЕГ (форм. 2) (126,0 і 153,9 %, відповідно фону), порівняно з реципрокним (103,0 і 145,7 %). Серед українських гібридів кращим був Укр.-2 Укр.-1.

Отже, вплив гетерозису на рівні клітинних механізмів резистентності проявляється у підвищенні функціональної активності фагоцитуючих гемоцитів, сумарна дія яких забезпечує відповідний рівень протиінфекційної стійкості гетерозисних генотипів.

Рис. 3 Сумарна фагоцитарна активність гемоцитів гусениць порід і гібридів шовкопряда, залежно від умов вигодівель.

Як і у випадку з ЖГ, гібриди в разі ПФ характеризувались меншим відхиленням показників СФАГГ від значень для ОФ, що зумовлено покращеною їх здатністю до підтримки гомеостазу (Шахбазов и др., 1990), зокрема імунного, а також свідчить про підвищені адаптивні можливості системи клітинного імунітету у гетерозисних генотипів.

При дисперсійному аналізі даних встановлено, що для обох вивчених пород-гібридних комбінацій варіювання показника СФАГГ достовірно залежить від фону вигодівель та генотипної основи матеріалу (в більшості випадків Р0,001).

При кореляційному аналізі даних щодо рівнів ЕТ, ЖГ та СФАГГ порід і гібридів шовкопряда встановлено наявність достовірних позитивних кореляцій: між ЕТ і СФАГГ r = 0,68, ЖГ і СФАГГ r = 0,59 - на ОФ та 0,56 і 0,77, відповідно, на ПФ. Це дозволяє характеризувати СФАГГ як ознаку неспецифічної стійкості шовкопряда та його стійкості до хвороб при природньому зараженні.

При дослідженні впливу генотипу та субоптимальних температур (20 і 30С) in vitro на ФА гемоцитів встановлено, що при 20 і 30 С показники окремих типів клітин і, відповідно, СФАГГ суттєво знижувались, а генетичні відміни за цих умов були найбільш істотними. При 25С (оптимальна температура) лише порода Мер.-7 достовірно (Р0,05) переважала Мер.-6 за ФА пролейкоцитів. При 20 С гібриди Мер.-6Мер.-7 і зворотній достовірно (Р0,001) переважали породу Мер.-7, а Мер.-6Мер.-7 - і породу Мер.-6 за ФА пролейкоцитів; обидва гібриди - вихідні породи за ФА макронуклеоцитів (на 3,45 - 6,71 %, Р0,01-Р0,001).

В цілому, гібриди при субоптимальних температурах характеризувались меншими відхиленнями ФА гемоцитів від значень для 25 С. Це найбільш яскраво простежувалось для їх СФАГГ (табл. 1). Показники Мер.-6Мер.-7 при 20 і 30 С відрізнялись від значень при 25 С в 1,61 та 1,85 раз, відповідно, а Мер.-6 - в 2,31 та 3,01 раз.

Таблиця 1

Вплив генотипу та температури in vitro на СФАГГ (%)

Темпе- | Генотипи

ратура | Мерефа- 6 | Мерефа- 7 | Мер.- 6Мер.- 7 | Мер.- 7Мер.- 6

20 С

25 С

30 С | 14,001,58

32,383,78

10,753,54 | 9,802,33

38,603,96

18,563,36 | 24,562,70

39,441,47

21,272,70 | 21,864,62

48,335,53

25,301,83

Менші коливання СФАГГ у гібридів, які свідчать про підвищені адаптивні можливості їх імунної системи, і призводили до зростання ступеня генетичних відмін між ними і породами за цим показником: при 25 С Мер.-6 Мер.-7 на 7,06 % переважав породу Мер.-6, а Мер.-7 Мер.-6 - на 15,95 і 9,73 % Мер.-6 і Мер.-7, відповідно (в усіх випадках Р0,05). При 20 С обидва гібриди переважали породи за СФАГГ (на 7,86-14,76 %, в більшості випадків Р0,001).

За допомогою дисперсійного аналізу встановлено, що рівень СФАГГ істотно (Р0,001) залежить від температури і генотипу. Підтверджено відміни між породами і гібридами за динамікою показника при зміні температури - гібриди характеризувались меншим ступенем його відхилень при субоптимальних умовах.

Виявлені залежності простежувались і при розгляді ЕГ гібридів за СФАГГ. При 25 С ЕГ (форм. 2) складали: 102,2 і 125,2 % - для Мер.-6Мер.7 і зворотнього, а при 20 і 30 С - 250,6 і 114,6 %, відповідно, - у Мер.-6Мер.-7 та 223,1 і 136,3 % - у Мер.-7Мер.-6.

При вивченні клітинних показників у сімей породи Б-2пол., різних за рівнем неспецифічної стійкості, встановлено, що в А1 “+”-сім’ї характеризувалися достовірно вищим (Р0,05), порівняно з “-”, показником ЖГ (на 23,4 %), ФА макронуклеоцитів (на 10,8 %, Р0,01) та СФАГГ (на 10,0 %, Р0,05). В А2 “+” - сім’ї достовірно (Р0,05) переважали “-” лише за числом макронуклеоцитів в гемолімфі гусениць.

Генетичні відміни за стійкістю порід і гібридів шовкопряда до ядерного поліедрозу

При дослідженні генетичних відмін за неспецифічною резистентністю порід і гібридів шовкопряда та їх стійкістю до ЯП (табл. 2) встановлено, що гібриди Б-1пол.Б-2пол. і зворотній на 6,49 - 9,12 % (Р0,001) і на 6,03 - 18,00 % (в більшості випадків достовірно), відповідно показникам, перевершували вихідні породи.

Виявлено наявність ЕГ у гібридів за ознакою стійкості до ЯП, який складав 19,60 % (форм.1) і був більш значним (форм. 2) у Б-2пол.Б-1пол. (117,6 %).

В цілому, серед досліджених генотипів найбільш резистентною до ЯП виявилась порода Дайзо, яку і Є.М.Михайлов (1984) визначав виключно стійкою до жовтяниці, найменш резистентними - Б-1пол. та УН.

Таблиця 2

ЕТ та стійкість до ЯП порід і гібридів шовкопряда

Порода, гібрид | ЕТ, % | Стійкість до ЯП, %

Б-1пол.

Б-2пол.

Б-1пол.Б-2пол.

Б-2пол.Б-1пол. | 87,571,26

89,421,41

95,910,39

96,690,66 | 58,001,16

64,641,34

70,672,67

76,000,0

Дайзо

УН | 27,261,47

23,660,67 | 84,000,82

62,001,116

При порівняльному аналізі ЕТ та стійкості порід і гібридів до ЯП встановлено наявність достовірних позитивних кореляцій між ними. Для білококонної групи - r=0,74, для Дайзо та УН - r=0,35. Це може свідчити про істотну залежність стійкості шовкопряда до ЯП від рівня його неспецифічної резистентності.

Разом з цим, дані табл.2 свідчать про досить низький рівень ЕТ породи Дайзо, за яким вона достовірно не відрізнялась від УН. Це, поряд із виключною стійкістю Дайзо до ЯП, може свідчити про специфічність природи резистентності цієї породи до даної хвороби, генетичний контроль якої потребує свого вивчення.

При дослідженні змін гемоцитарного складу гемолімфи гусениць у порід і гібридів шовкопряда за умов фізіологічної норми та при зараженні вірусом ЯП (ВЯП) встановлено, що в умовах норми досліджені генотипи відрізнялись за направленістю динамік чисельності різних типів гемоцитів. Однак, яскравих виразів зазначені відміни не набували.

Зараження гусениць ВЯП призводило до перерозподілу чисельності гемоцитів та прояву суттєвих генетичних відмін між породами, найбільш яскраво виражених у особин, виживших після зараження. У порід Б-2пол. та Дайзо зниження вмісту молодих форм гемоцитів (в основному пролейкоцитів) супроводжувалось істотним зростанням числа зрілих - фагоцитів, рівень яких в другу - третю доби після зараження в 3,7 - 5,1 раз перевершував контроль (Р0,05-Р0,001). У порід Б-1пол. і УН - мікронуклеоцитів (на 7,50-20,20 %, Р0,05-Р0,001). У гібридів спостерігалось почергове зростання вмісту різних типів фагоцитуючих гемоцитів, залежно від періоду досліджень, що може свідчити про перерозподіл функціонального навантаження фагоцитуючих клітин при вірусній інфекції у гетерозисних генотипів.

При патогенезі ЯП, що призвів до загибелі гусениць, генетичні відміни між породами Дайзо та УН простежувались лише на перших стадіях захворювання і полягали в підвищеній реактивності системи гемопоезу у Дайзо у відповідь на зараження ВЯП.

При аналізі отриманих даних з огляду на відміни між породами та гібридами за гемоцитарним складом в межах певної доби досліджень встановлено, що в умовах фізіологічної норми порода Б-2пол. та гібриди Б-1пол.Б-2пол. і зворотній на 7,20-29,40 % (Р0,05-Р0,001) переважали Б-1пол. за вмістом мікронуклеоцитів. Однак, при зараженні генетичні відміни за вмістом мікронуклеоцитів практично нівелювались. Крім того, високостійка порода Дайзо суттєво не відрізнялась від УН за вмістом певного типу клітин в гемолімфі. Це підтверджує необхідність комплексного підходу при оцінці рівня резистентності шовкопряда за клітинними показниками.

При вивченні генетичних відмін у порід шовкопряда за показниками клітинного імунітету в умовах фізіологічної норми та при зараженні ВЯП встановлено, що в умовах норми Дайзо характеризувалась більш пластичними, ніж УН, динаміками ФА окремих типів клітин і СФАГГ, а також достовірно перевершувала останню за ФА пролейкоцитів, фагоцитів та СФАГГ (на 9,85 і 6,95 %, Р0,05 - в 1 і 2 доби після зараження, відповідно).

Найбільш суттєві генетичні відміни виявлено при оцінці СФАГГ порід Дайзо та УН, гусениці яких вижили після зараження. У Дайзо протягом першої - третьої діб дослідження значення цього показника на 4,88 - 8,49 % переважали контроль (в більшості випадків достовірно), що свідчить про активацію системи фагоцитозу та, відповідно, її задіяність в боротьбі організму з ВЯП. Очевидно, клітинні механізми захисту відіграють значну роль у формуванні рівня противірусної резистентності цієї породи. У породи УН, поряд із зростанням вмісту мікронуклеоцитів у гемолімфі гусениць, суттєвих відхилень СФАГГ від контролю не виявлено. Те ж саме відмічено у гусениць обох порід, загиблих від жовтяниці.

Зростання показника СФАГГ у Дайзо зумовило більш значний, порівняно з умовами фізіологічної норми, прояв генетичних відмін між нею та УН за цим показником: Дайзо в першу-третю доби на 7,50-20,20 % (Р0,05-Р0,001) перевершувала УН.

Встановлено наявність достовірної позитивної кореляції між стійкістю порід до ЯП та СФАГГ протягом першої - третьої діб дослідження. Кореляційні коефіцієнти складали - 0,31 - 0,69, залежно від доби. Це дозволяє характеризувати СФАГГ як ознаку стійкості шовкопряда до ЯП.

Генетичні відміни за стійкістю порід і гібридів шовкопряда щодо бактерій, виділених з поверхні грени

При бактеріологічному дослідженні грени шовкопряда різних генотипів, відібраної на грензаводах України, встановлено її зараженість бактеріальною флорою на 99,97 %, незалежно від генотипу. Мікроорганізми, ізольовані з поверхні грени, представлені споровими і безспоровими паличковидними і кулястими бактеріями роду Bacillus та видів Staph. aureus, Str. bombycis (Ent. faecium), Bact. album. Монокультури бактерій, їх суміші, а також - суміші з грибом мускардини чи збудником ЯП володіють значними ентомопатогенними властивостями, знижуючи життєздатність грени і гусениць шовкопряда в 1,5-2,5 рази порівняно з контролем (Р0,05-Р0,001).

З метою зниження інфекційного фону на вигодівлях шовкопряда, проведено скринінг 31 протимікробного засобу (грилен, дезонол, КГН-Б, Естостерил-У, Естостерил-1 та ін.) на предмет знезараження грени. Встановлено, що препарат Естостерил-У в концентрації 0,4 % та експозиції обробки грени 10 хв. володіє значними (ефективність 99-100 %) бактерицидними, фунгіцидними та ноземацидними властивостями і не чинить негативної дії на основні біологічні і господарчо-цінні показники шовкопряда різних генотипів.

При дослідженні генетичних відмін за стійкістю порід і гібридів шовкопряда щодо Bac. thuringiensis var. galleriae, виділеної з поверхні грени (табл. 3), встановлено, що гібриди Б-1полБ-2пол. і зворотній на 11,70-23,30 % (Р0,05-Р0,01) переважали вихідні породи за цією ознакою, а також - характеризувались меншими відхиленнями показника від контрольних значень при зараженні (в 1,19 і 1,16 разів - у гібридів, та в 1,39 і 1,60 раз - у порід).

Таблиця 3

Стійкість порід і гібридів шовкопряда щодо Bac. thuringiensis var. galleriae

Порода, гібрид | Стійкість, % | ЖГ, % (контроль)

Б-1пол.

Б-2пол.

Б-1пол.Б-2пол

Б-2пол.Б-1пол | 68,301,67

60,002,89

80,002,89

83,301,67 | 95,331,33

96,000,00

95,330,67

96,670,67

Встановлено наявність ЕГ у гібридів за стійкістю до даної бактерії, який в середньому (форм. 1) складав 27,2 % і був кращим у Б-2полБ-1пол. (форм.2) - 121,96 (у Б-1полБ-2пол. - 117,13 %).

Виявлено достовірну позитивну кореляцію з r=0,74 між рівнями ЕТ порід і гібридів шовкопряда та їх антибактеріальної резистентності, що може свідчити про істотну залежність стійкості шовкопряда до бактеріальних хвороб від рівня його неспецифічної резистентності.

При дослідженні генетичних відмін за реакцією системи фагоцитозу порід і гібридів шовкопряда щодо бактерій, виділених з поверхні грени, встановлено, що Б-1пол.Б-2пол. і зворотній на 3,30-7,59 % (в більшості випадків Р0,001) переважали вихідні породи за ФА пролейкоцитів та на 5,66-12,88 % (Р0,05-Р0,001) - макронуклеоцитів, а також - на 5,70-19,80 (Р0,05-Р0,001) % - за СФАГГ (табл. 4).

Таблиця 4

СФАГГ (%) порід і гібридів шовкопряда щодо бактерій, виділених з поверхні грени |

Види бактерій

Породи, гібриди | Bac. thuringiensis var. galleriae | Bac. thuringiensis var. dendrolimus | Staph. aureus

Б-1пол.

Б-2пол.

Б-1пол.Б-2пол.

Б-2пол.Б-1пол. | 36,701,22

33,803,84

43,501,09

45,500,95 | 39,891,95

40,671,72

50,253,07

47,781,63 | 39,331,46

46,901,20

52,600,56

59,111,34

У варіанті з використанням Staph. aureus встановлено перевагу гібридів над породою Б-1пол і за ФА мікронуклеоцитів (на 4,84 і 5,33 %, Р0,05, відповідно гібридам), а також - міжпорідні відміни за СФАГГ: Б-2пол. на 7,57 % (Р0,001) перевершувала Б-1пол.

У всіх варіантах досліджень виявлено ЕГ у гібридів шовкопряда за СФАГГ. В середньому (форм. 1) вони складали 21,69 - 29,55 % і в більшості випадків були істотнішими (на 5,45 і 16,56%, залежно від варіантів) у гібрида Б-2полБ-1пол. (форм.2).

При порівняльному аналізі показників стійкості порід і гібридів шовкопряда до Bac. thuringiensis var. galleriae та СФАГГ щодо цієї бактерії встановлено наявність достовірної позитивної кореляції (r=0,67) між показниками, що дозволяє характеризуватит СФАГГ як ознаку стійкості шовкопряда до бактерій.

В дослідженні також виявлено, що у варіантах з використанням Staph. aureus СФАГГ значно вища (39,33 - 59,11 %), ніж у інших (36,70 - 50,25 %). Це свідчить про вибіркову направленість реакції фагоцитозу в бік кулястих бактерій і узгоджується з літературними даними (Metalnikoff, 1927).

Висновки

1. У дисертаційній роботі наведене теоретичне узагальнення наукової проблеми щодо природи генетичних відмін у порід і гетерозисних гібридів шовковичного шовкопряда за протиінфекційною резистентністю та генетичної детермінації клітинних механізмів захисту. Встановлено нові генетично обумовлені взаємозалежності між рівнями неспецифічної і протиінфекційної резистентності порід і гетерозисних гібридів шовковичного шовкопряда та функціонуванням факторів клітинного імунітету.

2. Підтверджено наявність генетичних відмін у порід і гетерозисних гібридів шовковичного шовкопряда за ознаками неспецифічної та протиінфекційної резистентності. Гібриди суттєво (Р0,05-0,001) переважали вихідні батьківські породи (різниця значень досягала 34,8%), а в ряді випадків встановлено і міжпорідні відміни.

3. Встановлено наявність достовірних позитивних кореляцій (r = 0,35-0,91) між рівнями неспецифічної стійкості різних генотипів шовкопряда, визначеної методом термотесту, та їх стійкості до хвороб при природному та штучному зараженні.

4. Генетичні відміни за неспецифічною та протиінфекційною резистентністю порід і гетерозисних гібридів шовкопряда та сімей породи Б-2пол. на клітинному рівні пов’язані зі вмістом, переважно, макро- чи мікронуклеоцитів в гемолімфі гусениць, їх фагоцитарною активністю і сумарною фагоцитарною активністю гемоцитів.

5. Встановлено нові прояви ефекту гетерозису у гібридів шовкопряда на клітинному рівні - за сумарною фагоцитарною активністю гемоцитів гусениць.

6. Для визначення рівня резистентності порід і гібридів шовкопряда за клітинними показниками запропоновано враховувати не лише гемограми, але і сумарну фагоцитарну активність гемоцитів гусениць, оскільки гемоцитарний склад гемолімфи суттєво модифікується під впливом факторів біогенної та абіогенної природи.

7. Встановлено наявність достовірних позитивних кореляцій між рівнями неспецифічної та протиінфекційної стійкості порід і гетерозисних гібридів шовкопряда та сумарною фагоцитарною активністю гемоцитів гусениць (r = 0,43-0,77), що дозволяє використовувати метод врахування сумарного фагоцитозу для оцінки ступеня неспецифічної та протиінфекційної резистентності порід і гібридів шовкопряда.

8. За допомогою дисперсійного аналізу встановлено суттєвий вплив генотипу на зміни показників життєздатності гусениць та сумарної фагоцитарної активності гемоцитів, залежно від фону вигодівель і температурних умов при проведенні реакції фагоцитозу in vitro. В субоптимальних умовах гетерозисні гібриди характеризувались меншими, порівняно з вихідними породами, відхиленнями показників від значень для оптимального фону. Це зумовлено підвищеною їх здатністю до підтримки гомеостазу.

9. Генетичні відміни у порід і гетерозисних гібридів шовкопряда за стійкістю до ядерного поліедрозу пов’язані з різними динаміками гемоцитарного складу гемолімфи гусениць при їх зараженні: високорезистентні породи характеризувалися зростанням вмісту фагоцитів (в 3,7-5,1 раз, порівняно з контролем, Р<0,05-0,001), менш резистентні - мікронуклеоцитів (на 9,4-24,0 %, Р<0,05-0,001), гібриди - почерговим зростанням вмісту різних типів фагоцитуючих гемоцитів.

10. Встановлено суттєві генетичні відміни у порід шовкопряда з різним рівнем противірусної резистентності за сумарною фагоцитарною активністю гемоцитів гусениць при зараженні їх вірусом ядерного поліедрозу: високостійка порода Дайзо переважала на 7,5-20,2 % менш резистентну УН (Р0,05-0,001). Отримано дані щодо активації системи фагоцитозу при вірусній інфекції у шовкопряда.

11. Грена шовковичного шовкопряда, відібрана на грензаводах України, заражена на 99-100 % споровими і безспоровими ентомопатогенними бактеріями, незалежно від її генотипу. Для знезараження грени запропоновано новий препарат Естостерил-У в розроблених режимах застосування (ефективність 99-100 %), який не чинить негативної дії на основні біологічні показники шовкопряда різних генотипів.

12. Генетичні відміни у порід і гетерозисних гібридів шовкопряда за реакцією системи фагоцитозу щодо бактерій, виділених з поверхні грени, полягали в істотній (Р0,001-0,05) перевазі гібридів над вихідними породами за фагоцитарною активністю окремих типів клітин і сумарним фагоцитозом.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації:

1?

2?

3?

4?

5?

6?

7?

8?

9?