Українська академія аграрних наук

інститут агроекології та біотехнології

Димань Тетяна Миколаївна

УДК 636.082. 12:575.1/.2

генетична диференціація доместикованих та

диких видів копитних

03.00.15 – генетика

а в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

м.Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук

Науковий консультант: доктор сільськогосподарських наук, професор

Глазко Валерій Іванович,

завідувач відділу молекулярно-генетичних досліджень

Інституту агроекології та біотехнології УААН

Офіційні опоненти: член-кор.НАНУ, доктор біологічних наук, професор

Кунах Віктор Анатолійович,

завідувач відділу генетики клітинних популяцій

Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ

доктор біологічних наук

Трофименко Олексій Лукич,

професор кафедри генетики тварин і біотехнології

Національного аграрного університету

доктор сільськогосподарських наук, професор

Рудик Іван Адамович,

завідувач кафедри генетики та розведення

сільськогосподарських тварин

Білоцерківського державного аграрного університету

Провідна установа: Херсонський державний аграрний університет

Мінагрополітики України

Захист відбудеться “18” червня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.317.01 в Інституті агроекології та біотехнології УААН за адресою: 09111, м.Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН.

Автореферат розісланий 16 травня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Г.В Заякіна.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Процес диференціації сільськогосподарських тварин та близьких диких видів у історичному аспекті під впливом штучного та природного добору вивчений ще недостатньо. В ізольованих популяціях сільськогосподарських тварин проходять генетичні зміни в результаті рекомбінацій або “закріплення” генів за умови значного тиску штучного добору. Згідно з Майром (1973), наслідком цих процесів можуть бути розвиток ізоляційних механізмів відносно здатності давати потомство при схрещуванні з батьківськими формами та екологічна диференціація.

Для удосконалення порід необхідно знати їх генетичну структуру, закономірності формування цінних асоціацій генів у процесі добору, можливість використання блоків генів диких тварин. Вивчення генетичної структури популяцій домашніх та диких видів тварин, їх еколого-генетичної диференціації неможливе без використання генетичних маркерів. Різноманітність способів маркірування генетичного матеріалу надзвичайно велика, проте останнім часом вочевидь переваги молекулярно-генетичних маркерів високополіморфних районів ДНК. Порівняльний аналіз генетичної структури домашніх і споріднених їм диких видів тварин з використанням різних типів маркерів є важливим для виявлення систем, найбільшою мірою залучених до процесів диференціації цих видів, для спеціальної генетики, для формування нових знань щодо динаміки генетичної структури в малих ізольованих популяціях, для аналізу формоутворюючого процесу. Такі дослідження мають очевидне прикладне значення – можуть використовуватись для попередження негативних наслідків інбридингу, створення ефективних програм збереження рідкісних зникаючих видів.

У зв'язку з розробкою теоретичних основ збереження біорізноманітності не менш важливим є дослідження біологічних ресурсів заповідних територій, iзоляцiя яких протягом тривалого часу могла обумовити змiни їх генетичної рiзноманiтностi.

З розвитком ДНК-технологій особливого значення набувають дослідження наслідків конструювання генетично модифікованих організмів. Поряд із запрограмованими бажаними спадковими ознаками у трансгенних організмів з високою частотою виявляються аномалії розвитку (Wall et al., 1997). Молекулярно-генетичні маркери можуть бути використані для вивчення таких небажаних ефектів та диференціації генофондів вихідних і трансгенних організмів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконані у відповідності з тематичним планом науково-дослідних робіт Інституту агроекології та біотехнології УААН за темами: "Вивчити генетичні наслідки екологічних стресів у різних видів тварин. Здійснити моніторинг генофондів порід тварин з метою вивчення впливу на них екологічних умов, систем розведення і інтрогресії чужорідних генів та їх комплексів” (номер державної реєстрації 06 0196 U); “Вивчення генофондів рідкісних та зникаючих порід великої рогатої худоби, овець і коней України в різних еколого-географічних умовах розведення” (№ 0197U014671); “Еколого-генетичні методи підвищення резистентності сільськогосподарських видів до біотичних та абіотичних факторів” (№0197U01467); “Вивчення генетичних основ процесів доместикації” (проект Держкомітету науки і технологій України №5/276).

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було вивчити характеристики генетичних процесів у генофондах малочисельних ізольованих груп сільськогосподарських і диких видів тварин з врахуванням історичних особливостей їх формування.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Оцінити наявність закономірностей генетичних процесів у генофондах ізольованих малочисельних груп копитних.

2. Дослідити ефекти доместикації шляхом порівняння генетичної структури одомашнених (сільськогосподарських) і диких видів копитних за використання різних типів молекулярно-генетичних маркерів.

3. Вивчити генетично детермінований поліморфізм генетико-біохімічних систем і поліморфізм маркерів ISSR-PCR у зоопаркових видів – асканійських ізолятів.

4. Оцінити можливості використання поліморфізму структурних генів та анонімних послідовностей ДНК для виявлення генетичної диференціації видів.

5. Співставити рівень генетичної мінливості у одомашнених і диких видів копитних за використання різних типів молекулярно-генетичних маркерів.

6. Здійснити оцінку мікроеволюції локусу гена капа-казеїну у аутохтонних порід великої рогатої худоби України з допомогою методу ПЛР-ПДРФ.

7. Проаналізувати наслідки трансгенозу для тварин – дослідити вплив інтеграції екзогенної конструкції на органоспецифічний спектр ферментів загального внутрішньоклітинного метаболізму.

Об'єктом досліджень є ізольовані малочисельні групи сільськогосподарських і диких видів тварин.

Предмет дослідження – генетична структура порід і видів у процесі їх диференціації.

Методи дослідження. Використані наступні методи аналізу біологічного матеріалу: електрофоретичне розділення білків у горизонтальному крохмальному гелі та у вертикальному поліакриламідному гелі з їх подальшим гістохімічним фарбуванням; полімеразна ланцюгова реакція з подальшим рестрикційним аналізом; полімеразна ланцюгова реакція з використанням мікросателітних повторів як праймерів (ISSR-PCR); методи дослідження фізико-хімічних та технологічних властивостей молока; методи статистичної обробки результатів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично обгрунтовані і експериментально підтверджені особливості генетичної диференціації доместикованих (6 видів, 12 порід) та диких видів (12) копитних на основі досліджень 30 генетико-біохімічних систем та 9 маркерів ISSR-PCR, що в сукупності є значним досягненням для подальшого розвитку екологічної генетики тварин. Одержано нові дані щодо розподілу генотипів у тварин однієї породи, але різного екогенезу за частотами окремих алельних варіантів.

Вперше встановлено, що дикі зоопаркові види тварин навіть у малочисельних популяціях мають високий рівень генетичної мінливості, а за окремими поліморфними локусами спостерігається порушення рівноваги Харді-Вайнберга на користь гетерозигот. Доповнено і розширено сучасні уявлення про співставну генетичну мінливість за біохімічними маркерами у видів домашніх та диких тварин. Вперше одержані дані про високу інформативність маркерів ISSR-PCR для оцінки міжвидової диференціації генофондів домашніх та близьких диких видів копитних і виявлена невідповідність існуючої систематичної ієрархії видів їх взаємовідносинам, розрахованим на основі аналізу поліморфізму анонімних послідовностей ДНК. Одержані нові дані про те, що під впливом інтеграції чужинної генетичної інформації у геном тварин відбувається зміна експресії генів “домашнього господарства”, навіть за умови, коли трансген “мовчазний”, тобто не дає свого білкового продукту.

Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що: 1) використання молекулярно-генетичних маркерів сприятиме більшій точності добору тварин за ознаками продуктивності на ранніх стадіях онтогенезу ; 2) визначення генотипів гена капа-казеїну у великої рогатої худоби за використання ДНК-технологій сприятиме створенню стад корів, молоко яких придатне для виробництва високоякісних твердих сирів; 3) послідовності ДНК між інвертованими повторами мікросателітних локусів відображають гетерогенність ядерного геному і є видоспецифічними маркерами при генетичній паспортизації і для уточнення питань таксономії; 4) аналіз органоспецифічного спектру ферментів загального метаболізму у тварин може бути рекомендований для попереднього виявлення потенційних аномалій розвитку у генетично модифікованих організмів; 5) матеріали дисертації використовуються у навчальному процесі на зооінженерному факультеті та факультеті ветеринарної медицини Білоцерківського державного аграрного університету, в сільгосппідприємствах Херсонської та Сумської областей, у Біосферному заповіднику “Асканія-Нова” ім. Ф.Е.Фальц-Фейна.

Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні положення, постановка проблеми, розробка програм досліджень, а також узагальнення результатів досліджень і формулювання висновків належать автору. Накопичення первинних матеріалів, проведення серій лабораторних дослідів з визначення генотипів тварин за генетико-біохімічними та ДНК-маркерами, аналіз і статистична обробка експериментальних даних в основному здійснено автором. Із матеріалів наукових експериментів та публікацій дисертант використав за узгодженням із співавторами частину спільно одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були оприлюднені і отримали позитивну оцінку на звітних сесіях Інституту агроекології та біотехнології УААН (1995-2001рр.); на науково-практичних конференціях у Білоцерківському державному аграрному університеті (1994–2001 рр.); на наступних міжнародних конференціях: "Агробіотехнології рослин і тварин" (Київ, 1997), "Соnservation of endangered autochthonous animal breeds of Danubian countries" (Будапешт, 1998), "Молекулярно-генетичні маркери рослин і тварин" (Одесса, 1999), "Молекулярно-генетичні маркери тварин" (Київ, 1999), “Сучасний стан і перспективи розвитку селекції сільськогосподарських тварин” (Київ, 1999), “Сучасні проблеми зооінженерії та шляхи їх вирішення” (Львів, 1999), “Заповідна справа: стан, проблеми, перспективи” (Херсон, 1999), "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 2000), “Актуальные проблемы биологии в животноводстве” (Росія, Боровськ, 2000), “Шляхи формування конкурентоспроможної галузі вівчарства” (Асканія-Нова, 2001), присвяченій 90-річчю І.В.Смирнова (Київ, 2001); на VI міжнародному симпозіумі, присвяченому 100-річчю розведення коня Пржевальського у заповіднику “Асканія-Нова” (Київ–Асканія-Нова, 1999); на науково-практичному семiнарі (Київ–Чабани, 1999); на VIII міжнародній теріологічній школі-семінарі (Луганськ, 2001), на 11 міжнародному конгресі “Genes, Gene Families and Isozymes” (Стокгольм, 2001).

Публікації результатів досліджень. Матеріали дисертації опубліковані у монографії та 42 наукових роботах, в тому числі у 1 монографії, 8 статтях у наукових журналах, 18 статтях у збірниках наукових праць, 1 методичних рекомендаціях, 14 матеріалах і тезах конференцій.

Обсяг та структура роботи. Дисертація викладена на 310 сторінках машинописного тексту і включає: вступ, огляд літератури, матеріал і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення, заключення, висновки і пропозиції виробництву, список цитованої літератури (519 джерел, із них 236 іноземними мовами), містить 46 таблиць, 13 рисунків, 29 фотографій.

Основний зміст

Матеріали і методи досліджень. Загальна схема досліджень представлена на рисунку 1, об'єм проведених досліджень відображений у таблиці 1. Була вивчена генетична структура за різними типами молекулярно-генетичних маркерів 18 видів копитних ссавців (наведені у табл. 6).

Рис.1. Схема досліджень.

Матеріалом для досліджень були проби крові (еритроцити, лейкоцити, плазма) та органів представників дикої фауни, які відтворюються в умовах Біосферного заповідника “Асканія-Нова” ім. Ф.Е. Фальц-Фейна. Зразки для досліджень були представлені канд. біол.наук Н.І.Ясинецькою. Проби крові зубрів із Біловезької Пущі (Білорусь) та сніжного барана із Путоранського заповідника (Росія) належать колекції і були люб'язно надані для досліджень канд. біол. наук Сипко Т.П. Проби крові домашніх тварин відбирали в сільськогоподарських підприємствах Київської, Сумської, Закарпатської, Хмельницької областей України, а також у експериментальному господарстві “Черга” СО РАН (надані для досліджень докт.біол.наук Кушніром В.А.).

Таблиця 1

Об'єм проведених досліджень

Показник Одомашнені види тварин Дикі види тварин

Досліджено видів Досліджено порід та породних груп Протестовано особин Досліджено генетико-біохімічних систем Проаналізовано зразків крові і органів за 30 біохімічними маркерами Досліджено маркерів ISSR-PCR Проаналізовано продуктів ампліфікації Проаналізовано проб молока Проведено аналізів молока 6 12 533 30 15990 6 5040 62 868 12 – 146 30 4380 9 7560 – –

У видів копитних досліджували генетично детермінований поліморфізм генетико-біохімічних систем, серед яких виділяли три групи білків з різною функцією у системах загального метаболізму: транспортні білки, ферменти метаболізму екзогенних субстратів, ферменти внутрішньоклітинного енергетичного метаболізму. З метою аналізу поліморфізму ферментів еритроцитів і плазми крові проводили горизонтальний мікроелектрофорез у крохмальному гелі з подальшим гістохімічним фарбуванням (Harris, Hopkinson, 1976; Глазко, 1988). Гель готували на 13–15 %-ному гідролізованому крохмалі.

Для дослідження поліморфізму білків плазми крові великої рогатої худоби і споріднених з ними диких видів використано вертикальний поліакриламідний гель-електрофорез (PAGE): модифікована методика Gahne (1977). Вивчаючи поліморфізм білкового спектра плазми крові свійських коней і споріднених їм диких видів, також використали метод поліакриламідного гель-електрофорезу. Як основну, застосували методику Juneja et al (1978) зі змінами, внесеними Ouragh (1995).

При визначенні генотипів тварин за локусом гена капа-казеїну, а також для аналізу генофондів за маркерами ISSR-PCR використовували ДНК, екстраговану із крові. Виділення ДНК проводили за допомогою двох методів: методу сольової екстракції з перхлоратом натрію та з використанням СТАБ-буферу.

Визначення генотипів тварин за локусом гена капа-казеїну здiйснювали, застосовуючи стандартний метод полiмеразної ланцюгової реакцiї з подальшим рестрикційним аналізом. Для амплiфiкацiї фрагмента гена капа-казеїну використовували праймери:

5' – ATG TGC TGA GCA GGT ATC CTA GTT ATG G – 3';

5' – CCA AAA GTA GAG TGC AAC AAC ACT GG – 3',

пiдiбранi таким чином, щоб фрагмент ДНК мiж ними включав сайти пiзнавання, специфiчнi для алельних варiантiв А i В. Для рестрикцiйного аналiзу брали 5мкл амплiфiкованого продукту. Рестрикцiю проводили протягом 4 год при 37°С з ендонуклеазою Pst I (GibkoBRL; 7,5 од/15 мкл).

Для аналізу поліморфізму анонімних послідовностей ДНК використовували один із різновидів методу полімеразної ланцюгової реакції – ISSR-PCR (inter simple sequence repeats) (Zietkiewicz et al., 1994).

Для ампліфікації фрагментів ДНК, розміщених між різними мікросателітними локусами, використовували праймери з послідовностями (GA)9C, (AG)9C, (АС)9Т, (АС)9С, (TG)9C, (TG)9A, (AGC)6C, (AGC)6G, GT(CAC)6. Продукти ампліфікації розділяли в 1,5%-ному агарозному гелі і після фарбування бромистим етидієм візуалізували під УФ-променями. У роботі вивчені лише ті продукти ампліфікації, які відтворювались у 3–5 незалежно повторених PCR-процедурах з ДНК одних і тих же тварин. Для визначення розмірів продуктів ампліфікації використовували маркери молекулярних мас Step Ladder, 0,5 kb (Sigma), 0,1 kb DNA Ladder (Gibco BRL).

Дослідження фізико-хімічних та технологічних властивостей молока здійснювали за використання загальноприйнятих методик, регламентованих відповідною нормативно-технічною документацією, дисперсність казеїнових міцел – методом розсіювання світла (Инихов, Брио, 1972).

Біометричну обробку результатів досліджень здійснювали відповідно до загальноприйнятих популяційно-статистичних методів (Плохинский, 1969; Животовский, 1991), з допомогою комп'ютерних програм “BIOSIS-1”, “TREE”.

Дослідження поліморфізму генетико-біохімічних систем у доместикованих видів тварин. За 30 генетико-біохімічними системами була досліджена генетична структура таких аутохтонних (надалі для зручності вживається локальних) порід сільськогосподарських видів тварин: сірої української, білоголової української, лебединської, бурої карпатської, пінцгау та якутської порід великої рогатої худоби, кулундинської породи овець та багатоплідних каракульських овець асканійського породного типу, гуцульської та якутської порід коней, великої білої породи свиней.

Для кожної породи сільськогосподарських видів тварин були виявлені специфічні особливості поліморфізму структурних генів, отримана якісно нова інформація. Наприклад, для асканійської популяції сірої української породи та білоголової української породи худоби вперше виявлений поліморфізм за локусом манозофосфатізомерази з переважанням швидкого електрофоретичного варіанту. Поліморфним у даних порід був також локус лужної фосфатази, причому найшвидший варіант D, який рідко зустрічається у порід великої рогатої худоби, з відносно високою частотою виявлений у сірої української породи (0,117) і не виявлений у решти досліджених порід. Лише у білоголової української породи виявлений поліморфізм за локусом пептидази В. Присутність алельного варіанту F за даним локусом притаманна породам зебу, а у європейських порід зустрічається рідко.

Якутська порода великої рогатої худоби характеризується відсутністю алеля А і відносно високою частотою алеля Е (0,222) за локусом гена трансферину, що є нетиповим явищем для інших аборигенних порід (табл. 2).

Відносно висока частота зустрічальності алеля Tf E, яка була виявлена у асканійської популяції сірої української породи (жаркий, сухий клімат) і у якутської породи (умови Крайньої Півночі), є цікавою обставиною, оскільки даний алель притаманний африканській худобі. Таким чином виявилось, що алель Tf E бере участь не лише у терморегуляції, як прийнято вважати, а, можливо, обумовлює ще якісь важливі функції у організмі тварин, інакше він би нівелювався при переміщенні їх на північ.

Таблиця 2

Частоти зустрічальності алельних варіантів поліморфних локусів у

порід великої рогатої худоби

Локус, алель Сіра україн-ська Білого-лова україн-ська Бура карпат- ська Пінцгау Лебединська (Л) Швіць-ка (Ш) Помісі Л/Ш 1/2 Помісі Л/Ш ѕ, 7/8 Якут-ська

TF A D1 D2 E F 0,250 0,191 0,294 0,221 0,044 0,465 0,293 0,103 0,014 0,035 0,381 0,238 0,357 0,024 0,000 0,552 0,186 0,252 0,010 0,000 0,286 0,357 0,286 0,071 0,000 0,264 0,139 0,583 0,014 0,000 0,333 0,556 0,111 0,000 0,000 0,313 0,313 0,312 0,062 0,000 0,000 0,445 0,333 0,222 0,000

PTF F S 0,850 0,150 0,568 0,432 0,515 0,485 0,767 0,233 0,821 0,179 0,570 0,430 0,778 0,222 0,750 0,250 0,778 0,222

AMY-1 B C 0,721 0,279 0,518 0,482 0,737 0,263 0,737 0,263 0,786 0,214 0,738 0,262 0,500 0,500 0,438 0,562 0,500 0,500

CP A B 0,824 0,176 0,517 0,483 0,553 0,447 0,633 0,367 0,392 0,608 0,588 0,412 0,556 0,444 0,375 0,625 0,785 0,215

GC A B D 0,603 0,397 0,000 0,397 0,603 0,000 0,152 0,848 0,000 0,138 0,862 0,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,333 0,389 0,278

HB A B 1,000 0,000 1,000 0,000 0,952 0,048 0,943 0,057 0,964 0,036 0,736 0,264 0,889 0,111 0,875 0,125 0,833 0,167

NP H L 0,559 0,441 0,069 0,931 0,330 0,670 0,280 0,720 0,429 0,571 0,720 0,280 0,560 0,440 0,880 0,120 0,125 0,875

При дослідженні чистопородних тварин лебединської породи і їх помісей з імпортними плідниками швіцької виявили більшу близькість помісей (1/2, 3/4, 7/8 “крові” швіцької породи) до материнської лебединської породи, тобто генетичні відстані, розраховані за використання молекулярно-генетичних маркерів, не відповідали взаємовідносинам досліджуваних груп тварин за "часткою кровності". Слід зазначити, що до нинішнього часу традиційно прогнозують вияв різних фенотипових ознак у помісного потомства сільськогосподарських тварин, використовуючи "частку кровності". Така уява основана на припущенні про адитивну дію алелів генів, які беруть участь у контролі полігенних породоспецифічних морфофізіологічних ознак, і їх рівноймовірному розподілу у помісному потомстві. Проте донині реальні генетичні процеси, які відбуваються у потомстві від схрещування чистопородних тварин, залишаються недостатньо вивченими, про що свідчать наші експериментальні дані.

Виражена подібність виявлена між поліморфізмом у бурої карпатської породи та пінцгау, що може бути обумовлено подібністю еколого-географічних умов розведення даних порід.

Найбільш досліджений білок TF у асканійських багатоплідних каракульських овець був представлений всіма найпоширенішими електрофоретичними варіантами, які відповідають алелям Tf A, Tf B, Tf C, TfD, Tf E. Тварини даного породного типу статистично достовірно (P<0,01) відрізняються за частотою алеля TF A (0,148) від вихідних батьківських форм – каракульської та романівської.

Визначальною рисою кулундинської породи овець є відсутність у її генофонді алеля Tf E, який з тією чи іншою частотою зустрічається у популяціях багатьох порід. Така риса характерна для аборигенних порід овець. Можна припустити, що відсутність алеля Tf E у генофонді не є випадковою і свідчить про спрямовуючу дію природного добору у бік елімінації цього алеля під впливом специфічних еколого-географічних умов розведення. Таке пояснення достатньо обгрунтоване, оскільки у доступній нам літературі не знайдено даних про значні функціональні чи інші відмінності між алелями трансферину, як це встановлено, наприклад, для алелів локусу гемоглобіну чи карбоангідрази. Іншою особливістю кулундинської породи є наявність у її генофонді рідкісного алеля Tf Р (qP=0,029), характерного для локальних популяцій, які розводяться в екстремальних умовах. Низька частота зустрічальності виявлена для алеля Tf A (0,059), найчастіше зустрічається варіант D (0,529). За локусом TF у генофонді кулундинської вівці порушена генетична рівновага у бік надлишку гетерозигот (c2=39,14, P<0,001).

Щодо локальних порід коней, то для гуцульської породи вперше виявлений поліморфізм за локусами 6PGD, PGM, GPI, причому у системі 6PGD спостерігався найшвидший електрофоретичний варіант D. У якутської породи виявлений поліморфізм за локусом 6PGD, який інші автори при дослідженні даної породи не описують (табл.3).

У групі протестованих шетлендських поні встановлено статистично достовірне відхилення розподілу генотипів від рівноважного стану у бік надлишку гомозигот за локусами 6PGD (c2=12,75, P<0,001) та TF (c2=8,15, P<0,05).

Електрофоретичний аналіз проб крові (плазми, еритроцитів) ослів, які відтворюються в умовах Біосферного заповідника “Асканія-Нова”, дав змогу виявити навіть у такій малочисельній вибірці як 4 особини генетично детермінований поліморфізм ряду генетико-біохімічних систем. Серед них два транспортних білки – TF та ALB і два ферменти внутрішньоклітинного енергетичного метаболізму – PGM (цикл гліколізу) та 6PGD (пентозофосфатний шунт). Всі поліморфні системи у досліджених ослів виявились діалельними. У системі PGM гетерозиготні генотипи не були виявлені, що обумовило порушення рівноваги Харді-Вайнберга (c2=7,2, P<0,005).

Таблиця 3

Частоти зустрічальності алельних варіантів поліморфних локусів у доместикованих та диких видів родини Equidae

Локус, алелі Частоти зустрічальності

доместиковані види дикі види

гуцульська порода якутська порода поні осел кінь Пржеваль-ського кулан зебра Чапмана зебра Греві зебра Гранта

TF D(D) (E2) F(F) R А С 0,065 0,000 0,804 0,130 0,000 0,000 0,540 0,460 0,125 0,000 0,750 0,125 0,625 0,325 0,790 0,097 0,113 0,000 0,600 0,400 0,333 0,667 0,333 0,667 0,125 0,875

ALB А В 0,457 0,543 0,320 0,680 1,000 0,000 0,750 0,250 0,046 0,954 1,000 0,000 0,833 0,167 1,000 0,000 1,000 0,000

GC А В C 0,174 0,761 0,065 0,000 0,560 0,440 0,219 0,781 0,000 1,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,000 0,667 0,333 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000

A1B A B C 0,000 0,978 0,022 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 0,870 0,130 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000

6PGD D F S 0,100 0,875 0,025 0,000 0,775 0,225 0,000 0,281 0,719 0,000 0,875 0,125 0,032 0,887 0,081 0,000 0,350 0,650 0,000 0,833 0,167 0,000 1,000 0,000 0,000 0,875 0,125

G6PD F S 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,250 0,750 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

PGM F S 0,696 0,304 1,000 0,000 1,000 0,000 0,875 0,125 0,726 0,274 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

Продовження таблиці 3

GPI F I S 0,065 0,935 0,000 0,150 0,850 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,031 0,951 0,019 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000

EST F(H) G(I) H(P) 0,174 0,652 0,174 0,500 0,500 0,000 0,281 0,719 0,000 – 0,968 0,032 0,000 1,000 0,000 0,000 – – –

НК F S 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,250 0,750

AP F S 1,000 0,000 1,000 0,000 0,875 0,125 1,000 0,000 1,000 0,000 0,700 0,300 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

FH F S 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,400 0,600 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

ME F S 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,600 0,400 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

AK F S 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,800 0,200 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

У свиней великої білої породи виявлений поліморфізм за 5 біохімічними маркерами – TF, GPI, 6PGD, PGM, ADA. За всіма системами, за винятком 6PGD, переважають повільні електрофоретичні варіанти. Визначальною рисою даного виду є те, що за більшістю ферментів, за винятком ICD, AK та CK, у нього зустрічаються найшвидші серед представників родини Bovidae зони активності.

Таким чином, у результатi аналiзу генетично детермiнованого полiморфiзму 30 генетико-бiохiмiчних систем у чистопородних особин локальних порід сільськогосподарських видів тварин виявлено порівняно високий рівень генетичної мінливості. Досліджені групи тварин характеризуються специфічними особливостями розподілу алельних варіантів за поліморфними локусами, які можуть бути використані як додаткова генетична характеристика порід і є цінними маркерами для оцінки внутрішньовидової диференціації. Дослiдженi породи за чисельністю перебувають на даний час у критичному станi i потребують негайного втручання людини у процес їх розширеного вiдтворення. Отриманi матерiали стануть корисними для розробки генетично обгрунтованих програм їх збереження, раціонального використання генофондів та реконструкцiї бажаних генотипів iз помiсних груп тварин.

Характеристика генофонду диких та зоопаркових видів копитних. На прикладі Біосферного заповідника “Асканія-Нова” ім. Ф.Е.Фальц-Фейна нами була використана унікальна можливість вивчення впливу фактору ізоляції на генетичну різноманітність. Аналіз генетичної структури за 30 генетико-біохімічними системами для представників копитної фауни заповідника “Асканія-Нова” за 100-річну історію його існування був здійснений нами вперше. Раніше для окремих видів були досліджені локуси трансферину та гемоглобіну, за локусами транспортних білків детально вивчена генетична структура коня Пржевальського.

Для кожного виду виявлені свої специфічні особливості. У групі досліджених зубрів за локусами РЕР В та МЕ порушена генетична рівновага – виявлена тенденція елімінації гетерозиготних форм. Відхилення від рівноважного стану Харді-Вайнберга виявилось статистично достовірним у обох випадках. За даними системами поліморфізм виявлений також у 35 біловезьких зубрів польськими дослідниками. Середній рівень гетерозиготності у розрахунку на локус на особину для дослідженої групи тварин склав 0,065, що дещо вище від отриманих раніше польськими дослідниками оцінок зубрів біловезької лінії, які склали 0,035.

Відносно високий рівень поліморфізму за біохімічними маркерами виявлено у групі бізонів (Н=0,071). Серед поліморфних систем більша частка припадає на ферменти внутрішньоклітинного метаболізму. Відхилень від рівноваги Харді-Вайнберга у асканійській популяції бізонів не виявили.

У сніжного барана також не спостерігали відхилень розподілу генотипів від рівноваги Харді-Вайнберга за жодним локусом. Частка поліморфних локусів у даного виду 16,7 %, середня гетерозиготність у розрахунку на локус – 0,077 при очікуваному значенні цього параметра 0,089.

Скринiнг бiохiмiчних систем плазми, еритроцитiв та тканин у антилоп виявив поліморфізм за системами, наведеними у табл. 4.

У дослідженої групи антилоп канна нами вперше виявлений поліморфізм за локусом TF. Виявлено чотири генотипи – AD, BC, BD і DD, які контролюються 4 кодомінантними алелями, позначеними нами як А і В – “швидка” електрофоретична рухливість, С і D – “повільна” електрофоретична рухливість. Жоден iз генотипiв не був iдентичним з типами TF у коней чи великої рогатої худоби. Найбiльша частота зустрiчальностi була характерною для алельного варiанта D (0,456). Гомозиготи серед дослiджених тварин зустрічались лише за цим алелем. Локус TF у канни привертає увагу перш за все тому, що у решти дослiджених видiв антилоп вiн iнварiантний.

У групи досліджених коней Пржевальського Біосферного заповідника “Асканія-Нова” частка поліморфних локусів склала 23,3%, середня гетерозиготність у розрахунку на локус (7 поліморфних, 23 мономорфних) на особину – 0,045. Відповідно до отриманих даних, серед досліджених ферментних систем найбільш вагомий вклад у генетичну мінливість коня Пржевальського вносять ферменти пентозофосфатного шунта (6PGD, G6PD) і гліколізу (PGM, GPI).

Нестача гетерозигот спостерігалась у туркменського кулана за поліморфними локусами АК (c2=12,8, P<0,001) та G6PD (c2=5,65, P<0,05), проте середній рівень генетичної мінливості виявився відносно високим (Н=0,082).

Таблиця 4

Частота зустрiчальностi алельних варiантiв полiморфних локусiв

у видiв антилоп

Локуси, алелi Антилопа канна n=16 Нiльгау n=10 Сайгак n=6 Гну n=4

6PGD F S 0,500 0,500 0,550 0,450 0,250 0,750 0,334 0,666

G6PD F S 1,000 0,000 0,350 0,650 1,000 0,000 0,666 0,334

ME-1 F S 0,600 0,400 0,325 0,675 0,125 0,875 0,167 0,833

MЕ-2 F S 0,611 0,389 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

PGM F S 1,000 0,000 1,000 0,000 0,875 0,125 1,000 0,000

AK F S 1.000 0.000 0,600 0,400 0,625 0,375 0,500 0,500

СK F S 0,950 0,050 1,000 0,000 0,125 0,875 0,500 0,000

HK F S 0,429 0,571 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

FH F S 1,000 0,000 0,550 0,450 1,000 0,000 1,000 0,000

TF A B C D 0,191 0,206 0,147 0,456 1,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 0,000

LAP A B 0,900 0,100 0,900 0,100 1,000 0,000 1,000 0,000

АP A B 0,444 0,556 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000

Види зебр у біосферному заповіднику “Асканія-Нова” представлені невеликою кількістю особин, у зв'язку з чим аналізували генетичну структуру незначної вибірки тварин даних видів. Однак поліморфізм у зебр тестували за 30 генетико-біохімічними системами. Ряд авторів вважають, що для порівняння генофондів достатньою є кількість локусів не менша 14 (Левонтин, 1978). Параметри, які характеризують генетичну мінливість зебр, наведені у табл.3.

Таким чином, на прикладі малочисельних ізольованих груп диких видів, які відтворюються у заповіднику “Асканія-Нова”, виявили відносно високий рівень генетичної мінливості за генетико-біохімічними системами, проте цей процес локус-специфічний. Виявлення видоспецифічних особливостей такого поліморфізму може бути суттєвим для відтворення популяцій у “штучних” умовах, які контролюються людиною.

Порівняльний аналіз поліморфізму структурних генів у сільськогосподарських та диких видів копитних. Співставлення генетичної мінливості конкретних біохімічних маркерів у видів, близьких до предкових форм сільськогосподарських тварин, і у локальних порід на даному етапі досліджень виявилось інформативним для вияснення формоутворюючої ролі білкового поліморфізму. Такий аналіз дав змогу вичленити ті метаболічні ланцюги, пластичність яких найбільш суттєва для залучення тварин до процесів доместикації, і, може статись, що саме вони супряжені з широкою внутрішньовидовою фенотипічною мінливістю домашніх тварин.

Дослідження білкового поліморфізму у трьох видів, які мають спільного історичного предка і належать до родини бичачих – сірої української та білоголової української худоби, зубра і американського бізона (табл.5), показало, що у порід великої рогатої худоби поліморфізм більшою мірою спостерігається за локусами транспортних білків (TF, PTF, GC, CP). У зубра і бізона найбільш поліморфна система доместикованого виду TF виявилась мономорфною, а у внутрішньовидовій диференціації брали участь в основному ферменти внутрішньоклітинного енергетичного метаболізму (PGM, GPI, ICD, DP).

Таблиця 5

Частоти алелів поліморфних локусів трьох видів підродини Bovinae

Локус, алелі Породи великої рогатої худоби Дикі види

Сіра українська Білоголова українська Зубр Бізон

Трансферин A D1 D2 E F 0,250 0,191 0,294 0,221 0,044 0,465 0,293 0,103 0,035 0,014 1,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Посттрансферин F S 0,850 0,150 0,568 0,432 1,000 0,000 1,000 0,000

Амілаза-1 A B C 0,000 0,721 0,279 0,000 0,482 0,518 0,440 0,560 0,000 0,250 0,750 0,000

Церулоплазмін A B 0,824 0,176 0,517 0,483 0,712 0,288 0,700 0,300

Продовження таблиці 5

Рецептор до вітаміну D A B 0,603 0,397 0,397 0,603 1,000 0,000 1,000 0,000

Фосфоглюкомутаза F S 1,000 0,000 1,000 0,000 0,400 0,600 0,650 0,350

Глюкозофосфатізомераза F S 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,650 0,350

Пептидаза В F S 1,000 0,000 0,743 0,267 0,850 0,150 0,500 0,500

Малік-ензим F S 1,000 0,000 1,000 0,000 0,650 0,350 1,000 0,000

Ізоцитратдегідрогеназа F S 1,000 0,000 1,000 0,000 0,900 0,100 1,000 0,000

Нуклеозидфосфорилаза F H L 0,000 0,559 0,441 0,000 0,069 0,931 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000

Діафораза-1 F S 1,000 0,000 1,000 0,000 1,000 0,000 0,400 0,600

Манозофосфатізомераза F S 0,647 0,353 0,776 0,224 1,000 0,000 1,000 0,000

Карбоангідраза F S 0,177 0,823 0,190 0,810 1,000 0,000 1,000 0,000

Лужна фосфатаза F S D 0,177 0,706 0,117 0,190 0,810 0,000 1,000 0,000 0,000 1,000 0,000 0,000

Статистично достовірні відхилення від рівноваги Харді-Вайнберга у бік надлишку гетерозигот виявили у сірої української породи за локусом TF, у білоголової української – за локусами TF, A1B, GC, AP. У популяції зубра, навпаки, за локусами PEP B та ME спостерігалась нестача гетерозигот. Достовірних відхилень від рівноважного стану популяції бізона не виявлено. При порівнянні електрофоретичної рухливості ферментів у досліджених видів за більшістю систем швидші зони активності були характерними для одомашненого виду (табл.6).

За генетико-біохімічними системами аналізували генетичну мінливість та генетичну диференціацію генофондів видів роду Ovis – асканійського типу багатоплідних каракульських овець, рідкісної локальної кулундинської породи овець та їх дикого родича із Путоранського заповідника – сніжного барана. Транспортні білки TF та HB, ферменти метаболізму екзогенних субстратів ES та LAP, а також ферменти внутрішньоклітинного метаболізму з вузькою субстратною специфічністю ME та NP були виявлені поліморфними у доместикованого виду. Більшість поліморфних систем сніжного барана (табл.7) є ферментами внутрішньоклітинного метаболізму. Для обох видів за локусом TF найчастіше зустрічався алельний варіант D. За електрофоретичною рухливістю більшості систем відмінностей між дослідженими видами роду баранів не спостерігали. За локусом НК зони активності у сніжного барана були швидшими, ніж у порід овець, а за локусом РЕР В – повільнішими.

Виявлені специфічні особливості поліморфізму різних біохімічних маркерів у кулундинської вівці і сніжного барана сприятимуть формуванню "генетичного портрету" цих унікальних зникаючих видів.

Цікавими виявились особливості генетично детермінованого поліморфізму біохімічних маркерів і їх електрофоретична рухливість у представників родини Equidae. У гуцульської породи коней виявлений поліморфізм за 8 локусами, у якутської породи – за 6, у їх близького дикого родича коня Пржевальського – за 7 (див.табл.3). За рядом локусів у гуцульської породи з невисокою частотою зустрічаються найшвидші алельні варіанти, відомі для коней, а у дослідженій вибірці якутських коней ці варіанти не виявлені. Наприклад, за локусом 6PGD у гуцульської породи з частотою 0,100 зустрічається самий швидкий варіант D, а у якутської породи присутні лише F і S – з більш низькою електрофоретичною рухливістю. За локусами TF і GC найшвидші електрофоретичні варіанти у якутської породи також відсутні. Як і у гуцульської породи коней, у дикого виду виявлені найшвидші електрофоретичні варіанти у системах TF і 6PGD. Розмах генетичної мінливості у дикого виду співставний з таким у порід коней.

Електрофоретична рухливість зон активності більшості ферментів у коня Пржевальського і порід коней співпадала (табл.6). Відмінність спостерігалась за рухливістю ферментів LDH, DP, AK і GOT. Зони з відносно більшою рухливістю за локусом LDH виявлені у коня Пржевальського. Більш швидкі варіанти спектру фермента GOT притаманні якутським коням, а найвища електрофоретична рухливість DP і AK спостерігалась у гуцульської породи. За використання методів розрахунку генетичної ідентичності та генетичних відстаней між групами досліджених тварин був проведений аналіз генетичних взаємин. Найменше значення генетичних відстаней виявлено між породами коней (DN=0,015). Між конем Пржевальського і якутською породою виявлена більша схожість (DN=0,055), ніж між першим і гуцульською породою (DN=0,071).

За більшістю генетико-біохімічних систем три види зебр мали схожий поліморфізм, відмінності між ними спостерігались за електрофоретичною рухливістю ферментів основних шляхів внутрішньоклітинного енергетичного метаболізму – циклу трикарбонових кислот (MDH, ICD) і гліколізу (GPI, LDH, HK).

За локусами транспортних білків види зебр вирізнялись серед інших досліджених видів родини Equidae більш низькою електрофоретичною рухливістю і відсутністю зон активності естерази плазми крові. Внутрішньовидовий поліморфізм за електрофоретичною рухливістю у зебри Чапмана спостерігався за локусами TF, ALB, GC, у зебри Гранта – за локусами TF, 6PGD і HK, у зебри Греві – за локусом TF. А1В у всіх видів зебр був мономорфним. На дендрограмі (рис.2) зебри утворюють один кластер, що відповідає їх таксономічним взаємовідносинам.

************************* зебра Чапмана

*******

******************** ************************* зебра Гранта

* *

* ******************************* зебра Греві

*

* ******************************* кулан

* *********

* ********* ******************************* осел

* * * кінь

**** *************************************** Пржевальського

*

* ******************************************** поні

****

* ***************************************** гуцульський

**** кінь

***************************************** якутський кінь

+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+

1.00 .83 .67 .50 .33 .17 .00

Рис.2. Дендрограма генетичних взаємовідносин між різними видами родини Equidae, розрахованих на основі порівняльного аналізу електрофоретичної рухливості

генетико-біохімічних систем.

Визначною рисою виду Equus asinus є відсутність зон активності естераз плазми крові, як у зебр, і найнижча серед досліджених видів родини коней електрофоретична рухливість альбуміну. В той же час у ослів, а також у поні спостерігались найшвидші електрофоретичні зони за локусом MDH. Внутрішньовидовий поліморфізм виявлено у системах 6PGD, PGM, ALB і TF. Локус GPI у ослів був мономорфним і за електрофоретичною рухливістю відповідав варіанту GPI I коня Пржевальського. У поліморфних системах ослів переважали швидко мігруючі алельні варіанти (табл.3).

У кулана виявлена більша електрофоретична рухливість систем GPI та А1В, ніж у інших видів родини коней. За рухливістю різних генетико-біохімічних систем даний вид виявляв велику схожість з ослом (на дендрограмі утворюють один субкластер), проте, на відміну від осла, у плазмі крові кулана виявлена естеразна активність. Поліморфізм у даного виду спостерігали у системах TF, 6PGD, G6PD, AK, ME, АР і FH.

У поні виявлені найповільніші за електрофоретичною рухливістю зони активності у системах ICD, PEP A і AK, а також найповільніші естеразні зони. За рештою маркерів найбільшу схожість поні виявляли із свійськими кіньми. Поліморфізм у цього виду виявлено за локусами TF, ES, 6PGD, AP та GPI.

Електрофоретична рухливість рецептора до вітаміну D виявилась подібною у всіх