НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

КОРНІЙЧУК ГАННА МИКОЛАЇВНА

УДК 612.35:612.014.3:615.015.44

ВПЛИВ БЛОКАТОРІВ ЛІПОКСИГЕНАЗ ТА ЕКЗОГЕННИХ ЛЕЙКОТРИЄНІВ В4 ТА С4 НА АПОПТОЗ І НЕКРОЗ ГЕПАТОЦИТІВ ЩУРІВ У ПЕРВИННІЙ КУЛЬТУРІ

03.00.13. - Фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі імунології та цитотоксичних сироваток

Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

Алексєєва Ірина Миколаївна

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

завідувач відділом імунології і цитотоксичних

сироваток

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Матишевська Ольга Павлівна

Київський національний університет імені Тараса

Шевченка

професор кафедри біохімії

доктор медичних наук,

Маньковська Ірина Микитівна

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця

провідний науковий співробітник відділу по вивченню

гіпоксичних станів

Провідна установа: Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України

Захист відбудеться 10/09/2002 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26. 198. 01 при Інституті фізіології

ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ-24, вул.Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології

ім.О.О.Богомольця НАН України (01024, м.Київ-24, вул.Богомольця, 4).

Автореферат розісланий27.06.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Механізми загибелі клітин знаходяться в центрі уваги сучасної біології, як і розробка нових терапевтичних засобів, що здатні коригувати ці процеси. Вивчення регуляторної та патогенетичної ролі похідних арахідонової кислоти (АК) за ліпоксигеназним шляхом її метаболізму у механізмах апоптозу та некрозу є однією з актуальних проблем фізіології та патофізіології. Останнім часом ліпоксигеназні похідні АК розглядаються як важливі регулятори виживання та апоптозу клітин. Порушення регуляції апоптозу в печінці призводить до виникнення різних захворювань, пов'язаних з посиленням чи, навпаки, пригніченням апоптозу. Так, індукція апоптозу була показана при аутоімунному гепатиті, вірусному гепатиті С та В, ішемії-реперфузії, ендотоксичному ураженні, холестазі та інших захворюваннях печінки [Cielecka-Kuszyk J. et al., 1999; Hayashi N. et al., 1999; Kohli V. et al.,1999; Wang XD. et al., Miyoshi H. et al., 1999]. На підставі вивчення механізмів запрограмованої загибелі розробляється та використовується ряд терапевтичних препаратів з метою регуляції цього процесу в окремих типах клітин. Оскільки апоптоз та некроз в різних співвідношеннях мають місце при різних патологічних станах печінки, вивчення механізмів їх розвитку в гепатоцитах дозволить певним шляхом коригувати ці процеси. Більшість досліджень щодо участі ліпоксигеназ та їх продуктів в процесах апоптозу і некрозу було проведено на клітинних лініях та на злоякісно трансформованих клітинах. Дані стосовно впливу блокаторів ліпоксигеназ на життєздатність клітин є суперечливими. Так, було показано, що загальні та селективні блокатори ліпоксигеназ індукували апоптичну загибель клітин [Tang D.G. et al., 1996]. З іншого боку, показана здатність блокаторів ліпоксигеназ інгібувати апоптоз в деяких клітинах [Powell C.B. et al., 1995; Wagenknecht B. et al., 1997; Матышевская О.П. и др., 1998; Zhou Y.P. et al.,1998]. Все це призводить до необхідності детального вивчення участі окремих ліпоксигеназ та їх продуктів в регуляції життєздатності клітин, зокрема гепатоцитів, та балансу процесів некрозу і апоптозу. Відомо, що в гепатоцитах утворюються ліпоксигеназні похідні АК (5-НЕТЕ, 15-НЕТЕ, лейкотриєни В4, С4 та інші) [Huwyler J. et al., 1991; Otomo Y. et al., 1993; Titоs E. et al., 1999]. Однак участь ліпоксигеназ в процесах апоптозу в гепатоцитах практично не вивчена, є лише окремі відомості, отримані на трансформованих паренхімних клітинах печінки [Muhlenfeld K. et al., 1998].

У зв'язку з вищенаведеним актуальним є вивчення впливу блокаторів ліпоксигеназного шляху метаболізму АК та дії екзогених лейкотриєнів В4 і С4 - продуктів 5-ліпоксигенази, на життєздатність і співвідношення некрозу і апоптозу гепатоцитів. Адекватною експериментальною моделлю для вивчення безпосередньої дії екзогенних лейкотриєнів і блокаторів ліпоксигеназ на процеси апоптозу і некрозу є первинна культура гепатоцитів, оскільки такі гепатоцити є нетрансформованими. Ця модель дозволяє вивчати зміни в гепатоцитах, не опосередковані процесами, що відбуваються на органному і організменному рівнях.

Мета і задачі дослідження. Вивчити вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 на процеси некрозу та апоптозу гепатоцитів щурів у первинній культурі. Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1.Одержати і охарактеризувати первинну культуру гепатоцитів.

2.Охарактеризувати процеси некрозу і апоптозу у первинній культурі гепатоцитів за даними подвійного забарвлення ядер гепатоцитів, електронно-мікроскопічного дослідження, активності аланінамінотрансферази в культуральному середовищі, а також оцінити активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, як інтегрального показника фізіологічного стану живих клітин.

3.Вивчити зміни зазначених показників під впливом загального блокатора ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретової кислоти і блокатора 5-ліпоксигенази – кофейної кислоти.

4.Вивчити ефекти екзогенних лейкотриєнів В4 і С4.

5.Вивчити ефекти екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 на гепатоцити на фоні дії блокаторів ліпоксигеназ.

6.На підставі виявлених закономірностей проаналізувати роль продуктів ліпоксигеназ у співвідношенні апоптозу і некрозу гепатоцитів у первинній культурі, а також взаємозв'язок між активністю електрон-транспортного ланцюга мітохондрій і шляхом загибелі гепатоцитів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження впливу блокаторів ліпоксигеназ, екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 (окремо та на фоні блокади синтезу ендогенних ліпоксигеназних похідних АК) на некроз і апоптоз гепатоцитів у первинній культурі. Вперше показано, що загальний блокатор ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретова кислота і блокатор 5-ліпоксигенази – кофейна кислота індукують апоптоз та пригнічують некроз у первинній культурі гепатоцитів. Вперше встановлено, що екзогенні ЛТ В4 і С4 зменшували апоптоз, індукований блокаторами ліпоксигеназ. Встановлено, що індукція апоптозу блокаторами ліпоксигеназ пов'язана з активацією електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, а збільшення некрозу при дії лейкотриєнів – з пригніченням функції мітохондрій.

Теоретичне і практичне значення роботи. Результати дослідження мають фундаментальне значення для з'ясування механізмів регуляції апоптичної та некротичної загибелі клітин та обгрунтування необхідності диференційованого вивчення некротичної і апоптичної загибелі клітин в складних випадках захворювань печінки. В практичному аспекті одержані дані можуть бути важливими для розуміння ролі ліпоксигеназних похідних АК у розвитку патологічних станів печінки та обгрунтування методів їх корекції за допомогою використання специфічних блокаторів метаболізму АК.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведені науковий пошук і обгрунтування вибраного напрямку досліджень. Виконані експерименти по вивченню впливу блокаторів ліпоксигеназного шляху метаболізму АК, екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 (окремо, і за умов блокади синтезу ендогенних ліпоксигеназних похідних АК). Проведено аналіз одержаних результатів, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень. Експериментальна робота по одержанню і культивуванню гепатоцитів проведена спільно з співробітниками відділу імунології та цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на ХV з'їзді українського фізіологічного товариства (Донецьк, 12-15 травня 1998 р.), на пленумі товариства патофізіологів України (Чернівці, 20-22 травня 1998 р.), на ІІІ національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одесса, 2000), на міжгалузевій конференції молодих вчених-2001 (Київ, 22 травня, 2001), на XVI з'їзді Українського фізіологічного товариства (м.Вінниця, 28-31 травня, 2002).

Публікації. Результати дисертації викладені в 11 публікаціях: статті - 5, тези конференцій, сімпозіумів, з'їздів, пленумів - 6.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 122 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 34 рисунками та фотографіями. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу описання матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, розділу аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Список літератури охоплює 174 джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. Об'єктом дослідження була первинна культура гепатоцитів. Для отримання гепатоцитів були використані дорослі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г. Виділення гепатоцитів проводили за методом Сеглена (1976). Тварин наркотизували нембуталом (40 мг/кг) та вводили гепарин (100 од.) у хвостову вену. Далі здійснювали перфузію ізольованої печінки через нижню порожнисту вену спочатку безкальцієвим розчином Хенкса, після чого продовжували перфузію розчином колагенази. Після виділення гепатоцити додатково очищали центрифугуванням в дискретному градієнті густини перколу.

Культивування клітин проводили в оброблених колагеном планшетах для культур клітин (“Sigma”, США) у поживному середовищі RPMI 1640, що містило 15 ммоль/л HEPES, 10 % ембріональною телячою сироваткою та антибіотики. Густина клітин становила 1ґ105 на лунку. Через 3 год після посадки гепатоцити відмивали шляхом заміни середовища. Після 18 год культивування при 37оС у вологій камері з 5 % СО2 клітини відмивали, замінювали середовище інкубації на середовище RPMI 1640 без ембріональної телячої сироватки та продовжували культивування клітин за експериментальних умов протягом різних проміжків часу. Нордигідрогуаяретову кислоту (НДГК, “Sigma”, США) та кофейну кислоту (КК, “Sigma”, США) додавали до кінцевої концентрації 10-6 та 2*10-5 моль/л. Лейкотриєни В4 або С4 (“Sigma”, США) вносили в культуральне середовище до кінцевої концентрації в діапазоні 10-7 - 10-12 моль/л. З метою вивчення впливу лейкотриєнів на гепатоцити у присутності блокаторів ліпоксигеназ в культуральне середовище вносили лейкотриєни В4 або С4 в концентраціях 10-8 моль/л через 15 хв після додавання блокаторів (у концентрації 2*10-5моль/л).

Активність аланінамінотрансферази (АЛТ) у культуральному середовищі визначали колориметричним методом в мікромодифікації [Коровкін Б.Ф., 1965].

Активність електрон-транспортного ланцюга (ЕТЛ) мітохондрій гепатоцитів визначали за допомогою МТТ-тесту [Reichner J.et al., 1995].

Культури клітин прижиттєво забарвлювали розчином ядерних барвників Хехсту 33342 і пропідіум йодиду, що дало можливість диференціювати живі, некротичні та апоптичні клітини. Барвник Хехст 33342 проникає крізь мембрани як живих, так і мертвих клітин та забарвлює ядра в зелений колір. Пропідіум йодид проникає крізь мембрани лише мертвих клітин і забарвлює ядра в оранжевий колір. Ядра апоптичних клітин переважно мають зелене забарвлення, містять конденсований та фрагментований хроматин, чи утворюють так звані апоптичні тільця. Підрахунок живих, некротичних і апоптичних клітин здійснювали за допомогою люмінесцентного мікроскопа (МЛ-2) (х40). В кожному експерименті оцінювали стан не менш ніж 600 клітин.

Для електронно-мікроскопічних досліджень гепатоцити культивували в оброблених колагеном 8-лункових планшетах. Препарати готували за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи (40-50 нм) контрастували і вивчали на електронному мікроскопі JEM 100 – CX (Jeol, Японія).

Представлені дані є результатом трьох-шести окремих експериментів для кожного показника. В кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно в триплікатах культур клітин. Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію t Стьюдента для пар даних [Ойвин И., 1960].

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Адекватною експериментальною моделлю для дослідження впливу екзогенних лейкотриєнів і блокаторів ліпоксигеназ на життєздатність гепатоцитів є первинна їх культура, оскільки ця модель дозволяє вивчити ефекти, не опосередковані нейтрофілами, судинними реакціями та іншими процесами, що відбуваються на органному і організменному рівнях.

Морфологічна оцінка суспензії гепатоцитів, що були використані для одержання первинної культури, показала, що клітини мали високий ступінь життєздатності і чистоти. Кількість живих гепатоцитів в суспензіїї перед їх посадкою становила 93,8±1,0%, вміст непаренхіматозних клітин - біля 6%. Через 3 год після посадки у планшети для культивування клітини прикріплялися до колагенового субстрату. Через 18 год після посадки первинна культура гепатоцитів мала вигляд моношару полігональних клітин, яку можна віднести до культур високої щільності.

Вплив загального блокатора ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретової кислоти та блокатора 5-ліпоксигенази – кофейної кислоти на апоптоз і некроз гепатоцитів у первинній культурі. Оскільки проявлення активності цитозольного ферменту гепатоцитів аланінамінотрансферази (АЛТ) у культуральному середовищі є наслідком його виходу з клітин внаслідок ушкодження плазматичної мембрани, вивчення активності АЛТ дає можливість оцінити некротичні процеси в гепатоцитах. За умови культивування гепатоцитів у присутності блокаторів ліпоксигеназ - нордигідрогуаяретової кислоти (НДГК) та кофейної кислоти (КК) в концентрації 2*10-5 моль/л спостерігалось зниження активності АЛТ у середовищі інкубації гепатоцитів. Більш значним був вплив загального блокатора ліпоксигеназ - у присутності НДГК активність АЛТ у культуральному середовищі була нижчою на 48% (Р<0,001), 18% (Р<0,05) та 23% (Р<0,01) порівняно з контрольною культурою через 1, 4 та 24 год культивування відповідно. Дія КК була однонаправленою з дією НДГК, хоча і менш вираженою - активність АЛТ у культуральному середовищі знижувалась на 18% (Р<0,05) через 4 години після впливу. Отримані дані свідчать, що у присутності блокаторів ліпоксигеназ спостерігається зменшення виходу цитозольного ферменту АЛТ з гепатоцитів у культуральне середовище на протязі 24 год культивування, що може вказувати на зменшення некротичного ушкодження мембран гепатоцитів. Зменшення показника було більш виражене при дії НДГК, яка є блокатором 5-, 12- і 15-ліпоксигеназ, ніж при дії блокатора 5-ліпоксигенази – КК, що свідчить про участь у підтриманні життєздатності гепатоцитів не тільки 5-ліпоксигенази, а й інших ліпоксигеназ. Наші результати співпадають з даними інших авторів, одержаних переважно in vivo та на перфузованій печінці. Так було показано, що блокада ліпоксигеназ діетилкарбамазином, кофейною кислотою, АА-864 та НДГК призводила до суттєвого зменшення ушкодження печінки in vivo, викликанного ССL4, ішемією-реперфузією та іншими впливами [Meng X., Wang J., 1994; Gonzalez R. et al, 1994; Reyes M. et al, 1995]. При цьому знижувався рівень активності АЛТ, аспартатамінотрансферази, лактатдегідрогенази та лужної фосфатази в сироватці крові, тобто блокада ліпоксигеназ запобігала порушенню цілісності плазматичних мембран гепатицитів та їх цитолізу.

Застосування МТТ-тесту дозволило оцінити активність електрон-транспортного ланцюга (ЕТЛ) мітохондрій - інтегральний показник фізіологічного стану живих клітин. За умов додавання НДГК у середовище інкубації зміни активності ЕТЛ гепатоцитів мали фазний характер. Через 1 год спостерігалось підвищення активності ЕТЛ на 26% (Р<0,01) порівняно з контролем. Через 24 год відмічено зменшення цього показника на 21% (Р<0,05). За умов дії КК також виявлено підвищення активності ЕТЛ мітохондрій через 1 год на 15% (Р<0,05). Однак через 24 год після додавання КК, на відміну від НДГК, спостерігалось вірогідне підвищення цього показника на 11% (Р<0,05) порівняно з контролем. Таким чином, у ранній термін культивування виявлена однонаправленість впливу блокаторів ліпоксигеназ на ЕТЛ, а саме підвищення його активності. Це може свідчити про негативний регуляторний вплив продуктів ліпоксигеназ на функціональну активність мітохондрій. Ефект НДГК був більш вираженим, тобто в змінах активності ЕТЛ мітохондрій, можливо, приймають участь не тільки 5-ліпоксигеназа, а й інші ліпоксигенази. Механізм такого ефекту блокаторів ліпоксигеназ може бути частково пов'язаний з порушенням гомеостазу активних кисневих метаболітів, а також з негативно спрямованим впливом продуктів ліпоксигеназ на мітохондрії. Крім того, однією з можливих причин зміни показника МТТ-тесту (зменшення активності ЕТЛ) є загибель клітин у первинній культурі.

Аналіз впливу НДГК на життєздатність гепатоцитів у первинній культурі за показниками АЛТ і МТТ-тесту привів нас до припущення, що протягом 24 годинного терміну може мати місце загибель гепатоцитів (спостерігали зменшення активності ЕТЛ мітохондрій), але не за рахунок некрозу (оскільки не відбувалось збільшення виходу АЛТ з клітин), а за рахунок апоптозу, що і стало предметом подальшого дослідження. Це припущення базується також на встановленій останнім часом ролі ліпоксигеназних похідних АК як важливих регуляторів виживання та апоптозу клітин. Так, показано, що НДГК індукувала апоптичну загибель клітин карциносаркоми щурів W256 [Tang D.G. et al., 1996], пухлинних клітин лінії Р-388 [Korystov Yu.N. et al., 1998] та стимульованих гладеньком'язових клітин судин [Nishio E., Watanabe Y., 1997]. Вміст апоптичних та некротичних гепатоцитів у культурі при дії блокаторів ліпоксигеназ вивчали за допомогою подвійного забарвлення ядер. Встановлено, що у присутності блокаторів кількість апоптичних клітин у культурі збільшувалась (рис.1). Вперше було показано, що загальний блокатор ліпоксигеназ – НДГК і блокатор 5-ліпоксигенази – КК викликають процеси апоптозу в первинній культурі гепатоцитів, які морфологічно виявляються вже через 4 год і посилюються через 24 год. Так, у присутності НДГК кількість апоптичних клітин збільшувалась у порівнянні з контролем через 4 год у 2 рази, а через 24 год – у 3,6 рази. У присутності КК вміст апоптичних гепатоцитів у культурі через 4 і 24 год також зростав, хоча і в меншій мірі порівняно з НДГК (Р<0,05). Через 24 год після впливу НДГК, більш ефективного блокатора, було виявлено деяке зменшення кількості живих клітин (Р<0,05), але не за рахунок некрозу (оскільки не спостерігалось збільшення кількості некротичних клітин), а в результаті індукції апоптозу в первинній культурі гепатоцитів.

***Р<0,001 – відносно інтактних культур;

#Р<0,05 – відносно культур, обробленних НДГК;

Рис.1. Кількість апоптичних клітин (в %) у первинній культурі гепатоцитів через 4 і 24 год після додавання блокаторів ліпокигеназ НДГК або КК (2*10-5 моль/л).

Електронно-мікроскопічне дослідження підтвердило, що за умов ведення первинної культури гепатоцитів, у присутності блокаторів ліпоксигеназ протягом 4 і 24 годин, виявлялася значна кількісті клітин з типовими для апоптозу морфологічними змінами ядра - значною конденсацією хроматину, зміною форми ядра та його фрагментацією. На поверхні клітин спостерігалися вип'ячування плазматичної мембрани, характерні для апоптозу. Клітини округлювались, міжклітинні контакти руйнувались, утворювались апоптичні тільця. Виявлялися також гепатоцити, що повністю розпались на апоптичні тільця. В окремих клітинах, поряд з типовими ознаками апоптозу (конденсація хроматину) спостерігали ознаки некрозу - порушення цілісності ядерної та плазматичної мембран, набухання мітохондрій. Ці спостереження свідчать на користь концепції некро-апоптозу [Lemasters J.J., 1999; Pieper A. et al., 1999], згідно якої апоптоз і некроз є крайніми проявленнями широкого спектру проміжних форм загибелі клітин.

Вплив екзогенних лейкотриєнів В4 та С4 на апоптоз і некроз у первинній культурі гепатоцитів. Відомо, що лейкотриєни (ЛТ) циркулюють у крові щурів у концентраціях порядка 10-12моль/л, а впливають на метаболічні процеси - у наномолярних концентраціях (10-9моль/л) [Iwai M., Jungermann K, 1988]. З метою дослідження дозозалежності ефектів ЛТ В4 та С4, а також їх можливої токсичної дії на гепатоцити, визначали активність АЛТ у культуральному середовищі за умов інкубації гепатоцитів у присутності ЛТ у кінцевих концентраціях: 10-7, 10-8, 10-10 та 10-12моль/л. Показано, що через 30 хв після додавання ЛТ в усіх застосованих концентраціях спостерігалось збільшення виходу ферменту АЛТ з культивованих гепатоцитів, що свідчить про посилення некротичних процесів (табл.1). Таким чином, екзогенні ЛТ В4 та С4 в широкому діапазоні концентрацій від 10-7 до 10-12 моль/л викликають швидке збільшення виходу цитозольного ферменту АЛТ у культуральне середовище, що свідчить про високу чутливість гепатоцитів до дії ЛТ. Виявлений ефект є короткочасним, оскільки через 4 і 24 год після додавання ЛТ активність АЛТ у культуральному середовищі гепатоцитів, вірогідно не змінювалась порівняно з контролем.

Табл.1.Активність аланінамінотрансферази (в % по відношенню до контролю) у культуральному середовищі гепатоцитів через 30 хв після додавання ЛТ В4 або С4.

Концентрація екзогенних ЛТ, моль/л ЛТ В4 ЛТ С4

10-7 130,7 (Р<0,05) 135,8 (Р<0,01)

10-8 134,5 (Р<0,05) 163,5 (Р<0,001)

10-10 143,5 (Р<0,05) 144,1 (Р<0,01)

10-12 147,3 (Р<0,01) 128,9 (Р<0,05)

При дослідженні впливу екзогенних ЛТ В4 і ЛТ С4 на активність ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів у первинній культурі було виявлено невеликі, але вірогідні зміни через 4 год після додавання ЛТ у концентраціях 10-7 та 10-8 моль/л. Так, ЛТ В4 у концентрації 10-7 моль/л пригнічував активність ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів на 15,5% (Р<0,05), а в концентрації 10-8 моль/л - на 14,5% (Р<0,05) відносно контролю. ЛТ С4 також зменшував цей показник – на 8% (Р<0,05) та 12% (Р<0,05) відповідно, хоча й в меншій мірі ніж ЛТ В4. Через одну та 24 год дослідження після додавання ЛТ у культуральне середовище не виявлено змін активності ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів.

З метою дослідження впливу ЛТ на морфологічний стан гепатоцитів використовували екзогенні ЛТ В4 і С4 у концентрації 10-8 моль/л, за якої посилювався вихід АЛТ з гепатоцитів та пригнічувалась активність ЕТЛ мітохондрій. Показано вірогідне зменшення кількості живих клітин і збільшення кількості некротичних клітин через 1 год після додавання ЛТ В4 та ЛТ С4. Так, у присутності ЛТ В4 кількість живих клітин зменшувалась на 9,3% (Р<0,05), а кількість некротичних клітин збільшувалась на 9,2% (Р<0,05) відносно контролю через 1 год після впливу. У присутності ЛТ С4 також кількість живих клітин зменшувалась на 7,7% (Р<0,05), а некротичних збільшувалась на 7,3% (Р<0,05) відносно контролю. Через 24 год культивування у присутності ЛТ не виявлено вірогідних змін життєздатності клітин. Обидва ЛТ не викликали суттєвих змін кількості апоптичних клітин в дослідженні строки. Таким чином, екзогенні ЛТ В4 і С4 викликають вірогідне зменшення кількості живих клітин і збільшення кількості некротичних клітин через 1 год культивування, але суттєво не змінюють кількість апоптичних клітин.

Електронно-мікроскопічні дослідження гепатоцитів, культивованих у присутності екзогенних ЛТ В4 і С4 протягом 1 та 24 год, також показали істотне збільшення кількості клітин з типовими рисами некрозу. Було виявлено клітини на початкових стадіях некрозу, для яких характерне просвітлення цитоплазми, формування вакуолей, набухання та просвітлення матриксу мітохондрій та їх вакуолізація, просвітлення та гомогенізація вмісту ядра; при цьому ядерна мембрана зберігала свою цілістність. Спостерігалась значна кількість клітин на кінцевих стадіях некрозу, а саме: з великою кількістю вакуолей, деструкцією мітохондрій, порушенням цілістності ядерної та плазматичної мембран, та, як наслідок, вимиванням вмісту ядра. Таким чином, сукупність отриманих даних за показниками виходу АЛТ з гепатоцитів, функціональної активності мітохондрій, кількості живих і некротичних клітин та ультраструктурних змін свідчить про ушкоджуючий вплив ЛТ на гепатоцити. Ці дані підтверджують уявлення про патогенетичну роль ЛТ в ураженні паренхіми печінки при збільшенні їх концентрації в умовах патології. Можливе пояснення механізмів дії продуктів ліпоксигенази та їх блокаторів дає концепція некроапоптозу [Pieper A. et al., 1999; Lemaster J.J., 1999]. Згідно цієї концепції, запускати процеси некрозу або апоптозу можуть одні й ті ж сигнали, але той чи інший напрямок загибелі клітини залежить від її життєвого і функціонального стану. Наприклад, утворення мітохондріальних пор розглядається як механізм розвитку як некрозу, так і апоптозу. Якщо утворення мітохондріальних пор призводить до виснаження енергетичного запасу клітини (АТФ), вона гине в результаті некрозу. Якщо утворення мітохондріальних пор не супроводжується виснаженням АТФ, розвивається апоптоз. За умов виснаження АТФ під час прогресуючого апоптозу некротична загибель клітини буде відбуватися як вторинний некроз, який часто ототожнюють з апоптозом [Lemasters J.J.,1999]. Встановлено, що ЛТ у фізіологічних концентраціях мають регуляторну дію на функції гепатоцитів [Iwai M. et al., 1988; 1989; Rodriguez-Ortigisa C.M. et al., 1995]. Можливо, підвищення концентрації екзогенних ЛТ, як і посилення їх синтезу при патологічних станах печінки змінює гомеостаз внутрішньоклітинних процесів, що призводить до виснаження енергетичних запасів та як наслідок - до некротичної загибелі клітини.

Вплив екзогенних лейкотриєнів В4 та С4 на апоптоз і некроз гепатоцитів у первинній культурі за умов дії блокаторів ліпоксигеназ. Відомо, що гепатоцити здатні синтезувати похідні АК за ліпоксигеназним шляхом її метаболізму [Huwyler J. et al., 1991, Otomo Y. et al., 1993; Titos E. et al.,1999]. Нами також встановлен апоптоз-індукуючий ефект блокатора 5-ліпоксигенази, що передбачає можливий антиапоптичний ефект її продуктів, тому вважали доцільним вивчити дію екзогенних ЛТ В4 і С4 на життєздатність гепатоцитів за умов блокади синтезу ендогенних похідних АК.

Виявлено істотне збільшення активності АЛТ у культуральному середовищі після додавання ЛТ В4 або С4 в концентрації 10-8 моль/л до гепатоцитів культивованих у присутності НДГК і КК. Так, через 1 і 4 год після додавання ЛТ В4 до культивованих у присутності НДГК гепатоцитів, активність АЛТ збільшувалась на 59% (Р<0,001) та 32% (Р<0.05). Дія ЛТ С4 була подібною до ЛТ В4: через 1 год після внесення ЛТ С4, активність АЛТ підвищувалась на 77% (Р<0,001), через 4 год - на 19% (Р<0,05). Через 24 год культивування обидва ЛТ не викликали суттєвих змін активності АЛТ у культуральному середовищі. У присутності КК також спостерігалось збільшення активності АЛТ через 1 і 4 год після внесення екзогенних ЛТ, однак ці зміни були менш вираженими, ніж ефект ЛТ на фоні НДГК. Підвищення активності АЛТ по відношенню до контролю через 1 год становило 18% та 19% (Р<0,05), а через 4 год – 15% (Р<0,05) та 18% (Р<0,05) при дії ЛТ В4 і С4 відповідно. Таким чином, за умов дії блокаторів ліпоксигеназ екзогенні ЛТ В4 і С4 викликають порушення цілісності плазматичних мембран гепатоцитів, що призводить до виходу АЛТ з клітин у культуральне середовище через 1 і 4 год після впливу.

Показано, що за умов дії блокаторів ліпоксигеназ екзогенні ЛТ В4 та С4 пригнічують активність ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів у первинній культурі. Так, додавання ЛТ В4 в концентрації 10-8 моль/л на фоні дії загального блокатора ліпоксигеназ НДГК, через 1 год після впливу, викликало зменшення активності ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів на 17% (Р<0,01), а ЛТ С4 - на 15% (Р<0,05). Додавання лейкотриєнів за умов дії блокатора 5-ліпоксигенази – КК також призводило до зниження активності ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів через 1 год після впливу, а саме: ЛТ В4 на 14% (Р<0,05), а ЛТ С4 на 13% (Р<0,05), відносно культур, обробленних КК.

Встановлено, що у присутності екзогенних ЛТ посилювався некроз гепатоцитів, оброблених блокаторами ліпоксигеназ. У присутності НДГК в первинній культурі гепатоцитів кількість некротичних клітин після додавання ЛТ В4 збільшувалась до 44% (Р<0,05) (відносно культур, обробленних НДГК, де цей показник складав 25%) через 24 год культивування. У присутності КК спостерігалось збільшення кількість некротичних клітин до 31% (Р<0,05) та до 32% (Р<0,05) після додавання ЛТ В4 та С4 відповідно (відносно культур, оброблених КК, де цей показник складав 23%).

В той же час виявлено вірогідне зменшення кількості апоптичних клітин при дії екзогенних ЛТ В4 та С4 на первинну культуру гепатоцитів, оброблену блокаторами ліпоксигеназ (рис.2). Так, кількість апоптичних клітин після додавання ЛТ В4 становила 6,2%, а ЛТ С4 – 7,4%, тоді як в культурах, оброблених НДГК, цей показник становив 11%, тобто у присутності ЛТ В4 та С4 кількість апоптичних клітин зменшувалась у 1,8 та 1,5 рази відповідно. У присутності КК через 24 год культивування також показано вірогідне зменшення кількості апоптичних клітин у первинній культурі гепатоцитів при дії екзогенного ЛТ В4 до 5%, а ЛТ С4 до 5,1% в порівнянні з культурами, обробленними КК, де вміст апоптичних клітин складав 7,5%. Таким чином, внесення екзогенних ЛТ В4 і С4 за умов дії блокаторів ліпоксигеназ мало суттєвий вплив на культури гепатоцитів, зменшуючи кількість живих і апоптичних та підвищуючи кількість некротичних клітин. Цей результат вказує на те, що ЛТ В4 та С4 можуть брати участь в регуляції апоптозу та проявляють антиапоптичний ефект.

Дані стосовно участі конкретних ліпоксигеназ в ініціації апоптозу є суперечливими. Так, блокатори 5-ліпоксигенази, зокрема КК, не індукують апоптоз в клітинах карциносаркоми W256 [Tang D.G. et al., 1996], а загальний блокатор ліпоксигеназ – НДГК- і селективні блокатори 12- та 15-ліпоксигеназ призводять до апоптозу цих клітин. З іншого боку, КК індукувала апоптоз в тимоцитах мишей, що вказує на участь у цьому процесі 5-ліпоксигенази [Mirzoeva O.K. et al., 1996]. За даними Myers з співавторами [1999], пригнічення синтезу 5-НЕТЕ призводило до апоптозу ракових клітин простати людини, а екзогенна 5-НЕТЕ захищала ці клітини від загибелі, що узгоджується з нашими результатами, згідно яких пригнічення 5-ліпоксигенази індукує апоптоз у культурі гепатоцитів, а екзогенні продукти 5-ліпоксигенази – лейкотриєни - захищали клітини від апоптичної загибелі.

Сукупність отриманих нами даних дозволяє встановити закономірний взаємозв'язок між активністю ЕТЛ мітохондрій і шляхом загибелі гепатоцитів.

***Р<0,001 - відносно контролю; ***Р<0,001- відносно контролю;

###Р<0,001–відносно культур, оброблених НДГК; #Р<0,05-відносно культур, оброблених КК;

##Р<0,01- відносно культур, оброблених НДГК; ##Р<0,01- відносно культур, оброблених КК;

Рис.2. Кількість апоптичних гепатоцитів (в %), культивованих у присутності НДГК або КК (2*10-5 моль/л) через 24 год після додавання екзогенних ЛТ В4 або С4 (10-8 моль/л).

Так, при посиленні некротичних процесів спостерігається пригнічення функціональної активності мітохондрій, тоді як розвиток апоптозу супроводжується підвищенням активності ЕТЛ мітохондрій. Це дає підстави вважати, що одним з механізмів дії ліпоксигеназ та ліпоксигеназних похідних АК на життєздатність гепатоцитів є зміни функціональної активності мітохондрій.

В И С Н О В К И

1. Первинна культура гепатоцитів щурів є адекватною експериментальною моделлю для дослідження безпосередньої дії блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів на життєздатність клітин та співвідношення процесів апоптозу і некрозу гепатоцитів, що є недостатньо вивченим.

2. У присутності в культуральному середовищі загального блокатора ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретової кислоти в концентрації 2*10-5 моль/л - зменшувався вихід аланінамінотрансферази з гепатоцитів і підвищувалась кількість апоптичних клітин (за даними подвійного забарвлення та електронної мікроскопії) у всі строки дослідження, що свідчить про антинекротичну і апоптоз-індукуючу його дію. Ефект блокатора 5-ліпоксигенази – кофейної кислоти в концентрації 2*10-5 моль/л – був однонаправленим з ефектом нордигідрогуаяретової кислоти, але проявлявся у меншій мірі. Це свідчить про те, що в регуляції апоптозу і некрозу в гепатоцитах задіяна як 5-ліпоксигеназа, так і інші ліпоксигенази.

3. Додавання нордигідрогуаяретової кислоти і, в меншій мірі, кофейної кислоти у культури гепатоцитів викликало підвищення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. Це дає підстави пов'язати антинекротичну та проапоптичну дію блокаторів ліпоксигеназ з посиленням функціональної активності мітохондрій гепатоцитів.

4. Додавання екзогенних лейкотриєнів В4 або С4 в ранній строк досліджень в діапазоні концентрацій від 10-7 до 10-12 моль/л викликало збільшення виходу аланінамінотрансферази у культуральне середовище, що свідчить про посилення некротичних процесів в клітинах. За даними подвійного забарвлення і електронної мікроскопії, у присутності лейкотриєнів В4 або С4 в концентрації 10-8 моль/л збільшувалась кількість некротичних і зменшувалась кількість живих клітин. Ефект лейкотриєнів за умов дії блокаторів ліпоксигеназ був подібним, однак дещо більш вираженим.

5. За даними подвійного забарвлення клітин додавання лейкотриєнів В4 і С4 в концентраціїи 10-8 моль/л істотно пригнічувало апоптоз, індукований блокаторами ліпоксигеназ у культурі гепатоцитів.

6. Додавання лейкотриєнів В4 і С4 в концентраціях 10-7 і 10-8моль/л, окремо та на фоні блокаторів ліпоксигеназ, призводило до зниження активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, що дає підстави пов'язати пронекротичну та антиапоптичну дію лейкотриєнів з пригніченням функціональної активності мітохондрій гепатоцитів.

7. Аналіз і узагальнення отриманих результатів дозволяють зробити висновок, що ліпоксигеназний шлях метаболізму арахідонової кислоти є важливим регулятором життєздатності і загибелі гепатоцитів. Ліпоксигеназні похідні арахідонової кислоти, зокрема лейкотриєни В4 і С4, зміщують співвідношення між апоптичною та некротичною загибеллю клітин в бік останньої. Такий механізм реалізується через зміни функціональної активності мітохондрій.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті:

1. Makogon N., Lushnikova I., Korneitchuk A., Alexeyeva I. Effects of nordihydroguaiaretic acid and indomethacin on the viability and functional activities of normal and carbon tetrachloride-injured rat hepatocytes cultured alone and with Kupffer cells // Acta Physiol. Pharmacol. Bulg.- 1998.-23, N 2.- P.33-38.

2. Makogon N.V., Korneitchuk A.N., Lushnikova I.V., Alexeyeva I.N. Effects of exogenous leukotrienes B4 and C4 on the viability of cultured rat hepatocytes // Acta Physiol. Pharmacol. Bulg.-2000.-25. – P.87-91.

3. Алексєєва І.М., Корнійчук Г.М., Лушнікова І.В., Макогон Н.В. Експериментальне дослідження патологічної дії похідних арахідонової кислоти за ліпоксигеназним шляхом її метаболізму на гепатоцити щурів в культурі // Збірник наукових праць співробітників КНАПО ім.Шупика Київ.-2000.-Випуск 9, книга 4.-Стр.11-15.

4. Корнійчук Г.М., Макогон Н.В., Лушнікова І.В., Алексєєва І.М. Блокатори ліпоксигеназ індукують апоптоз гепатоцитів щурів у первинній культурі // Укр. біохім. журн.- 2002.-№1.-С.125-127.

5. Корнійчук Г.М., Макогон Н.В., Лушнікова І.В., Алексєєва І.М. Вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 на апоптоз та некроз гепатоцитів щурів у первинній культурі // Фізіол. журнал.-2002.-т.48, №3.-С.34-40.

Тези:

6. Алексєєва І.Н., Макогон Н.В., Лушнікова І.В., Корнейчук А.М. Роль ейкозаноїдів в аутокринній та паракринній регуляції функцій клітин печінки в культурі // Тези докл. на ХV з'їзді Укр.фізіол.тов. (Донецьк, 12-15 травня 1998 р.), Фізіол.журн.- 1998.- Т.44, № 3.- С.181.

7. Алексєєва І.Н., Бризгіна Т.М., Алексюк Л.І., Павлович С.І., Макогон Н.В., Мартинова Т.В., Портниченко А.Г., Лушнікова І.В., Корнійчук А.М., Сухіна В.С. Роль ейкозаноїдів в аутокринній і паракринній регуляції функцій клітин печінки та імунокомпетентних клітин за умов печінкової патології // Тези докл. на Пленумі тов.патофізіологів України (Чернівці, 20-22 травня 1998 р.), Фізіол.журн.- 1998.- Т.44, № 4.- С.52.

8. Alexeyeva I., Makogon N., Lushnikova I., Korneitchuk A. The influence of arachidonic acid metabolism inhibitors on some functions of normal and carbon tetrachloride-injured rat hepatocytes culrured alone and with Kupffer cells // XIIIth International Congress of Pharmacology (Munchen, 26-31 July, 1998).

9. Макогон Н.В., Алексєєва І.М., Лушнікова І.В., Корнійчук Г.М. Вплив лейкотриєнів В4 та С4 на гепатоцити щурів в культурі // ІІІ Національний конгрес патофізіологів України з міжнародною участю (Одесса, 2000), Фізіол. журн.-2000.-Том 46, №2.-С.89.

10. Корнійчук Г.М., Макогон Н.В., Лушнікова І.В., Алексєєва І.М. Блокатори ліпоксигеназ індукують апоптоз гепатоцитів щурів в первинній культурі // Міжгалузева Конференція молодих вчених-2001 (Київ, 22 травня, 2001).

11. Алексєєва І.М., Корнійчук Г.М., Макогон Н.В., Лушнікова І.В. Роль ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти в регуляції апоптозу гепатоцитів щурів в первинній культурі // XVI З'їзд фізіологів (Вінниця, травень 2002 р.)

АНОТАЦІЇ:

Корнійчук Г.М. Вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 на апоптоз і некроз гепатоцитів щурів у первинній культурі.- Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин – Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2002 р.

Вивчення регуляторної та патогенетичної ролі похідних арахідонової кислоти за ліпоксигеназним шляхом її метаболізму в загибелі клітин є однією з актуальних проблем фізіології та патофізіології. В даній роботі показано, що загальний блокатор ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретова кислота і блокатор 5-ліпоксигенази – кофейна кислота в концентрації 2*10-5моль/л зменшують некроз і індукують апоптоз гепатоцитів у первинній культурі (за даними активності аланінамінотрансферази у культуральному середовищі, прижиттєвого подвійного забарвлення клітин ядерними барвниками Хехстом 33342 і пропідіум йодидом та електронно-мікроскопічного дослідження). При цьому спостерігається підвищення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів (за даними МТТ-тесту). Більш ефективною була дія загального блокатора, що вказує на участь в цих процесах не лише 5-ліпоксигенази, а й інших ліпоксигеназ. При додаванні екзогенних лейкотриєнів (ЛТ) В4 або С4 в широкому діапазоні кінцевих концентрацій від 10-7 до 10-12 моль/л показано посилення некрозу гепатоцитів у первинній культурі. Пронекротична дія ЛТ супроводжувалась пригніченням активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів. Пронекротичний ефект ЛТ за умов дії блокаторів ліпоксигеназ був подібним до ефекту ЛТ окремо, однак дещо більш вираженим. В той же час, ЛТ В4 і С4 істотно знижували апоптоз, індукований блокаторами ліпоксигеназ.

Отримані результати свідчать, що ліпоксигеназний шлях метаболізму арахідонової кислоти є важливим регулятором життєздатності і загибелі гепатоцитів. Блокатори ліпоксигеназ індукують апоптоз і зменшують некроз гепатоцитів, а ліпоксигеназні похідні арахідонової кислоти, зокрема ЛТ В4 і С4, зміщують співвідношення апоптичної та некротичної загибелі клітин в бік останнього. Одним з механізмів посилення апоптичних процесів може бути підвищення функціональної активності мітохондрій, а посилення некротичного шляху загибелі клітин – пригнічення їх функцій.

Ключові слова: гепатоцити, апоптоз, некроз, ліпоксигенази, нордигідрогуаяретова кислота, кофейна кислота, лейкотриєни, активність аланінамінотрансферази, активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, подвійне забарвлення ядер клітин, електронна мікроскопія.

Корнийчук А.Н. Влияние блокаторов липоксигеназ и экзогенних лейкотриенов В4 и С4 на апоптоз и некроз гепатоцитов крыс в первичной культуре. – Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных – Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2002 г.

Два варианта гибели клеток – апоптоз и некроз – в разных соотношениях наблюдаются при патологии печени. Важным является изучение регуляции этих процессов с целью возможного на них влияния. Есть данные о том, что продукты липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты участвуют в регуляции апоптической гибели некоторых типов клеток. Их роль в процессах гибели гепатоцитов практически не изучена. В данной работе изучали влияние экзогенных лейкотриенов (ЛТ) В4 и С4, а также блокаторов липоксигеназ на апоптоз и некроз гепатоцитов крыс в первичной культуре.

Адекватной экспериментальной моделью для изучения непосредственного действия экзогенных лейкотриенов и блокаторов липоксигеназ на апоптическую и некротическую гибель клеток