КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Кир’яченко Сергій Сергійович

УДК 578.85/.86

Вплив ізолятів ВТМ на організми та клітини різного походження

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі вірусології Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Бойко Анатолій Леонідович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри вірусології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук

Карпов Олександр Вікторович,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного

НАН України, м. Київ, провідний науковий співробітник

відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів

кандидат біологічних наук

Мельничук Максим Дмитрович,

Національний аграрний університет, м. Київ, завідувач

кафедри фізіології, вірусології та біотехнології

Провідна установа: Інститут сільськогосподарської

мікробіології УААН, м. Чернігів

Захист відбудеться 11 червня 2002р. о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект Глушкова, 2.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка,

вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 10 травня 2002р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення штамового різноманіття вірусів завжди привертало увагу вчених. Останнім часом дослідження зосередились на генетичних, біофізичних, імунологічних характеристиках патогенів. Разом з тим на особливий інтерес заслуговують нетрадиційні напрямки у дослідженнях фітовірусів, до яких слід віднести можливий вплив на організм тварин, вивчення трансфекційних властивостей їх нуклеїнових кислот, поведінка вірусів у модельних системах та ін.

Одним з найконтагіозніших фітовірусів, який уражує велику кількість видів рослин є вірус тютюнової мозаїки (ВТМ). На даний час ідентифіковано біля 400 штамів цього вірусу, що уражують рослини дикої і культурної флори. Виходячи з цього є актуальним проведення таких досліджень з цим широко розповсюдженим вірусом. При цьому важливо вивчити вплив даного патогену на різні біологічні системи: рослини, протопласти, клітини ссавців.

Поступово накопичуються відомості, що окремі фітопатогенні віруси (або їх нуклеїнові кислоти) за певних умов проявляють трансфекційні властивості та, можливо, здатні впливати на клітини непритаманних цим патогенам хазяїв, зокрема, ссавців (Жданов, 1971; Бойко, 1981). Тому для подальшої розробки проблеми взаємодії фітовірусів з клітинами невластивих їм хазяїв доцільним є вивчення ефектів і механізмів їх впливу на широкий спектр клітин-мішеней таких хазяїв, які різнилися б за гістогенезом, фенотипічними та іншими характеристиками. Результати таких досліджень дадуть змогу більш ширше збагнути еволюційні ланцюги різних вірусів.

Разом з тим існує достатня кількість даних, які свідчать про безперечний вплив фітовірусів на організм ссавців, і не тільки про тривале перебування цих вірусів в організмі тварин, але навіть про можливу їх репродукцію з появою симптомів інфекції. На особливу увагу заслуговує здатність вірусів рослин викликати утворення інтерферону і чинити захисну дію від деяких вірусів на білих мишей (Коренева, 1974). З цієї точки зору досить вірогідною виглядає можливість імуномодулюючої дії фітовірусів по відношенню до інфекцій людини і тварин. Важливим для вивчення впливу вірусів є один з основних природних клітинних механізмів – макрофаги, які відносяться до високо реактивних клітин, здатних миттєво втручатись до розвитку патологічного процесу. Відповідно до вище зазначеного нагальним є встановлення можливого впливу ВТМ на функціональну активність макрофагів.

Використання у фітовірусології вже звичної модельної системи такої, як протопласти, дозволяє вивчати люмінесцентні характеристики рослинних клітин і їх реакцію на інфікування відповідним вірусом, що дає змогу мати додаткові характеристики патогенів вірусної природи. Відомо, що рослини висвітлюють власну люмінесценцію в синьо-зеленій та червоній ділянках спектру. В синьо-зеленому діапазоні флуоресціює цілий ряд важливих з точки зору структурно-функціональних властивостей клітин речовин, і тому синьо-зелену ділянку вважають надзвичайно інформативною для діагностики стану рослинного організму (Chappel, 1984). Особливе значення має можливість вивчення зміни мінорних компонент при дії стресів. В зв’язку з цим протопласти є оптимальним модельним об’єктом, який відповідає головним вимогам: відсутність клітинної стінки, протікання вірусної інфекції як першого і єдиного циклу розмноження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з науковою темою кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету (реєстраційний номер №01БФ036-01) “Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”.

Мета і завдання досліджень. Метою наших досліджень було: визначити вплив інтактного ВТМ та його РНК на клітини лімфоїдного і епітеліального походження; оцінити можливість впливу ВТМ на функціональну активність макрофагів тварин; виявити тонку структуру синьо-зеленої люмінесценції та чутливість окремих її компонент до ВТМ.

Для досягнення поставленої мети до завдань роботи входило:

Відібрати із біоценозів ізоляти ВТМ і отримати дані про їх біологічні та фізичні властивості.

Оцінити інформативність люмінесценції в синьо-зеленій ділянці світла на прикладі протопластів тютюну, і дослідити реакцію її компонент на інфікування ВТМ.

Вивчити вплив ВТМ на макрофаги білих мишей.

Провести аналіз сумісної дії грипозної інфекції та ВТМ на макрофаги білих мишей.

Дослідити вплив ВТМ і його РНК на клітини ссавців різного походження.

Об’єкт дослідження – ВТМ, клітини рослин та ссавців.

Предмет дослідження – взаємодія та вплив ВТМ на клітини специфічних і неспецифічних хазяїв.

Методи дослідження. Для виділення вірусу використовували метод диференційного ультрацентрифугування. За допомогою аналітичного ультрацентрифугування та електронної мікроскопії вивчали фізичні властивості ізолятів; протопласти ізолювали ферментативним методом, а інфікували за умов відсутності полікатіонів; дослідження спектрів люмінесценції проводили методом флуориметрії; РНК ВТМ виділяли перхлоратним методом, трансфекцію клітин проводили ДЕАЕ-декстрановим методом, за допомогою імуноферментного та імунофлуоресцентного аналізів тестували на наявність антигенів ВТМ.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показана чітка структура люмінесценції протопластів тютюну в синьо-зеленій області світла та встановлений вплив ВТМ на її компоненти.

Отримано дані, які свідчать про вплив ВТМ на функціональну активність макрофагів білих мишей та доведено можливість імуномодулюючої дії по відношенню до грипозної інфекції.

Дослідження по трансфекції клітин ссавців РНК ВТМ дістали подальший розвиток і отримано нові експериментальні дані щодо особливостей впливу нуклеїнової кислоти на клітини різного походження. Показана залежність морфологічних змін від типу клітин.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень спектральних характеристик протопластів тютюну доповнили та розширили відомості стосовно впливу вірусу на рослинну клітину.

Дані, які було отримано під час дослідження впливу ВТМ на функціональну активність макрофагів білих мишей, розширюють відомості і сприяють більш комплексному розумінню взаємодії фітовірусів з організмом ссавців.

Результати досліджень можуть бути важливими при науковому обґрунтуванні ефектів дії вірусів рослин на непритаманних їм хазяїв, переносників та розробці заходів по обмеженню вірусного навантаження.

Особистий внесок здобувача. Здійснення інформаційного пошуку та оцінка літературних даних, відбір зразків рослин, виділення та накопичення вірусів, проведення імуноферментного, імунофлуоресцентного аналізів, електронна мікроскопія, виділення та інфікування протопластів, трансфекція клітин ссавців, аналіз та теоретичне обґрунтування результатів досліджень виконані дисертантом особисто. Планування та розробка методичних підходів виконання комплексу лабораторних досліджень проведені разом з науковим керівником д.б.н., проф. Бойком А.Л. Дослідження впливу ВТМ на функціональну активність макрофагів білих мишей проводилися на базі кафедри вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка разом із співробітниками кафедри к.б.н. Н.В. Тайковою та ст. інж. Т.О. Ігнатенко.

Проведення досліджень люмінесцентних характеристик протопластів проводилося на базі Інституту фізіології рослин та генетики НАНУ за участю д.б.н. Т.М. Шадчиної.

Дослідження трансфекційних властивостей РНК ВТМ проводили в лабораторії кафедри вірусології, а також в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАНУ разом з к.б.н. О.Ю. Юдіною та д.м.н. З.Д. Савцовою.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені на 2 Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, вересень 1998), 3 Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, вересень 2001).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 5 статтях наукових журналів та 1 тезах матеріалів конференції.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 46 рисунками та 8 таблицями, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних, висновків та списку використаних джерел, який містить 199 літературних джерел (із них 52 вітчизняних та 147 іноземних).

ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. На підставі робіт вітчизняних та зарубіжних авторів висвітлені сучасні відомості про вірус тютюнової мозаїки та його ізоляти. Виділені основні модельні системи, що використовуються при вивченні вірусу і проаналізовані дані щодо впливу вірусу на них.

Матеріали та методи досліджень. Відбір природних ізолятів ВТМ здійснювали на території Канівського природного заповідника. Проводили первинний скринінг рослин за зовнішніми симптомами (мозаїка, хлоротичність, скручування, некрози та ін.). Для ідентифікації вірусу та встановлення біологічних особливостей використовували рослини-індикатори Datura stramonium, Nicotiana glutinosa, Nicotiana rustica, Chenopodium amaranticolor. Чисту лінію вірусів отримували через некрозоутворюючі рослини Datura stramonium, Nicotiana glutinosa. Як рослини-накопичувачі використовували рослини Nicotiana tabacum cv. Samsun, що інфікуються системно.

Ізоляти для кожного варіанту дослідів відбирались за схемою: первинний скринінг за симптомами, стійкість за інфекційністю, рівнем вивченості. Всі ізоляти на перших етапах дослідів тестувались на відповідних варіантах модельних систем, що давало змогу підібрати ізоляти ВТМ для відповідних досліджень.

Вірус виділяли методом диференційного ультрацентрифугування. Константу седиментації розраховували на підставі результатів аналітичного центрифугування (Атабеков, 1981). Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі СФ-46 та обраховували за формулою: CA260N/Ke, де С – концентрація вірусу в мг/мл, А260 – екстинкція при довжині хвилі 260 нм, N – розведення вірусного препарату, Ке – коефіцієнт екстинкціі для ВТМ становить 2,7.

Морфологію вірусних часток вивчали методом електронної мікроскопії вірусних препаратів за допомогою електронного мікроскопу ЕМВ-100БР.

Протопласти виділяли ферментативним методом з рослин виду Nicotiana tabacum, вирощених в умовах in vitro (Глеба, 1974). Інфікували протопласти за умов відсутності полікатіонів за методикою Юдакової, (1983) в модифікації: 0,1 М фосфатний буфер, 0,4 М маніт, 0,1 М сахароза, 100 мкг/мл ВТМ, рН 7,0. Спектральний аналіз протопластів тютюну проводили на автоматичному лазерному флуориметрі ЛФК-12, який застосовують для дослідження спектрів люмінесценції хлорофілвмісних рослин в діапазоні довжин хвиль від 300 до 800 нм.

РНК з ізолятів ВТМ виділяли за допомогою додецилсульфату натрію (ДСН) і перхлорату (Атабеков, 1981). Чистоту препаратів РНК визначали спектрофотометрично, для подальших досліджень відбирали препарати РНК, що характеризувалися величиною Е260/Е280 = 2,4-2,6 і Е260/Е230 =2,1-2,3.

Для вивчення функціональної активності фагоцитуючих клітин використовували макрофаги перитонеального ексудату і селезінки (Пастер, 1989) білих мишей лінії BALB. Трансфекцію клітин ліній ОН-1 (клітинна лінія, одержана з лімфоми, що виникла у мишей лінії А після введення їм у черевну порожнину культури Bac. megaterium H (Затула, 1981)), та ПТП (нетрансформовані клітини яєчка поросяти) проводили з використанням ДЕАЕ-декстрану (Sambrook, 1989).

Імуноферментний (ІФА) (сендвіч-метод) та імунофлуоресцентний (ІФ) аналізи проводили за стандартними методиками (Гнутова, 1993).

Результати досліджень обробляли статистично (Урбах, 1985). Розрахунки проводились за допомогою ПЕОМ на базі Pentium-II з використанням прикладних програм Microsoft.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Діагностика та аналіз відібраного матеріалу з симптомами вірусного ураження. Для пошуку нових ізолятів ВТМ, необхідних у подальшій роботі, проводили обстеження Канівського природного заповідника. При цьому обслідували ділянки як віддалені від агроценозів і з меншим антропогенним впливом, так і ділянки, що межують з агроценозами або систематичним антропогенним впливом (наприклад, ділянки, що викошуються). Нами було виявлено особини рослин із симптомами вірусного ураження Sambucus nigra L, Sambucus ebulus L, Arctium lappa L, Plantago major L, Asarum europaeum L та Melilotus albus Medik.

Після діагностики на наявність антигенів ВТМ у відібраному матеріалі методом ІФА встановлено: сік відібраних особин P.major та S.nigra містив збудник, який мав серологічну спорідненість з ВТМ. У соці відібраних рослин S.ebulus, A.lappa, A.europaeum та M.albus такий збудник не виявлявся. Симптоми ураження на цих рослинах можуть бути спричинені іншими вірусами або мати невірусну природу.

Біологічні властивості виявлених вірусів вивчали на загально прийнятих рослинах-індикаторах, після інфікування рослин соком відібраних уражених рослин було отримано такі результати (табл. 1). Спектр симптомів, що викликають ізоляти ВТМ із P.major і S.nigra, дуже близький до спектру ВТМ U1 та К1. Виявлено відмінності по відношенню до штаму U1 на рослинах N.var. Samsun, спостерігали різницю в зовнішніх симптомах і значно пізніший розвиток системної інфекції (13-15 діб для ВТМ-U1 і 20  діб для наших ізолятів).

Основні фізичні характеристики виділених ізолятів вивчали методами електронної мікроскопії, максимального розведення інфекційного соку (МРС), температурної інактивації в нативному соку (ТТІ) та аналітичного центрифугування (табл. 2.).

Штами ВТМ U1 і ефіроолійної троянди, люб’язно надані Бойком А.Л (КНУ імені Тараса Шевченка, Київ), К1, люб’язно наданий Заврієвим С.К. (Інститут сільськогосподарської біотехнології РАСН, Москва), та виділені нами ізоляти використовували в подальшій роботі.

Таблиця 1.

Порівняння симптомів, що викликаються ізолятами ВТМ з Канівського природного заповідника та штамами ВТМ U1 та К1

Ізоляти та штами ВТМ | Рослини-індикатори

Chenopodium amaranticolor | Datura stramonium | Nicotiana tabacum | Nicotiana rustica | Nicotiana glutinosa

Ізол. P.major | Л.Н | Л.Н | Ж-З М | М | Л.Н

Ізол. S.nigra | Л.Н, М | Л.Н | Хл. М | М | Л.Н

ВТМ U1 | Л.Н | Л.Н | С-З М | М | Л.Н

ВТМ К1 | Л.Н | Л.Н | Ж-З М | Л.Н, М | Л.Н

М – мозаїка, С-З – світло-зелена, Ж-З – жовто-зелена, Хл. – хлоротична, Л.Н – локальні некрози.

Таблиця 2.

Основні фізичні показники виділених ізолятів ВТМ

Ізолят ВТМ | Розмір вірусних

часток, нм | МРС | ТТІ, ?С | Константа седиментації (s?)

Ізол. P.major | 280-310х18-20 | 10-6 | 90 | 179±5

Ізол. S.nigra | 280-310х18-20 | 10-5 | 87 | 176±5

Дослідження спектральних характеристик протопластів тютюну, інфікованих ВТМ. З отриманих нами результатів було відмічено, що інтенсивність люмінесценції хлорофілу у протопластів тютюну слабка і відсутній пік з максимумом при 735 нм. Тому на клітинному рівні неможливо визначати зміну концентрації хлорофілу по співвідношенню піків, як це роблять на листових пластинках. Люмінесценція в синьо-зеленій області чітко спостерігається як на листовій пластинці, так і на протопластах. Крім того, є дані, що вона чутлива до стресів і може використовуватись для їх діагностики (Chappel, 1984). Дія вірусної інфекції на рослини є також стресовим фактором, але не всі аспекти її впливу вивчені на клітинному рівні. Дослідженню змін спектральних характеристик заважає клітинна стінка, особливо вивченню мінорних компонент, які світять в цій області. Як видно з графіків спектрів люмінесценції листової пластинки та протопластів тютюну (рис. 1а.), використання протопластів дозволяє вивчати тонку структуру синьо-зеленої люмінесценції. Це дає можливість визначення

Рис. 1. а - спектри люмінесценції листової пластинки (1) та протопластів тютюну (2), б - спектри люмінесценції протопластів тютюну: контроль (1) та інфікованих ВТМ (2) після 24 год. інкубації

інформативних параметрів при дії вірусної інфекції у випадку зміни їх структури. Тому для подальших досліджень використовували протопласти, як модельну систему для вивчення змін спектральних характеристик, викликаних вірусом.

Встановлено, що через 8 год. після інфікування протопластів різниці в спектрах люмінесценції, по максимумам інтенсивності компонент між контрольними та інфікованими протопластами майже немає. В обох випадках спостерігали одинадцять компонент при однакових довжинах хвиль. Це вимірювання відповідає, в залежності від умов інкубації, закінченню лагфази і початку фази логарифмічного росту в репродукції вірусу, коли вже почалась реплікація вірусної РНК і синтез неструктурних білків, в першу чергу це 130К і 180К білки, які відповідають за синтез субгеномних мРНК для білка оболонки (БО) і білка руху.

Станом на 12 год. після інфікування на спектрах люмінесценції контрольних і інфікованих протопластів залишається сім чітких компонент. В обох випадках відсутні компоненти з максимумами при 462, 468, 478 і 486 нм, вони відповідають відновленим НАД і НАДФ, що може бути свідченням зниження кількості цих речовин, яке спостерігається в обох випадках. Можливо, це є наслідком ізоляції протопластів, що само по собі є стресовим фактором для клітин. У інфікованих протопластів компоненти з максимумами при 400, 424 і 454 нм слабкіші за інтенсивністю, ніж відповідні компоненти у контрольних, а компонента з максимумом при 412 нм незначно перевищує за інтенсивністю. Різниці в інтенсивностях компонент з максимумами при 418, 440 і 446 нм не відмічається. Цей вимір відповідає фазі логарифмічного росту репродукції вірусу.

При порівнянні спектрів люмінесценції контрольних та інфікованих протопластів через 16 год. після інфікування відмічено, що компоненти з максимумами при 400 і 412 нм у інфікованих протопластів перевищують такі ж у контрольних. Позиція з максимумом при 400 нм навіть перевищує за інтенсивністю попередні результати, станом на 12 год. досліду і контролю. Компоненти з максимумами при 418, 424, 446 і 454 нм у контрольних протопластів перевищують за інтенсивністю відповідні у інфікованих. Компонента з максимумом при 446 нм, як вже говорилось, ймовірно відповідає зв’язаним з дегідрогеназами НАД·Н і НАДФ·Н, що може бути свідченням додаткових витрат енергії, яких потребують процеси біосинтезу чужорідних молекул. Компоненти з максимумом при 440 нм майже не відрізняються. На цей час вже йде середина логарифмічної фази репродукції вірусу. Через 20 год. після інфікування на спектрах люмінесценції компоненти з максимумами при 400 і 412 нм у інфікованих протопластів все ще перевищують такі ж у контрольних. Компонента з максимумом при 400 нм за інтенсивністю майже така, як вісім годин тому. Позиції з максимумами при 418, 424, 440 і 446 нм слабкіші за інтенсивністю у інфікованих протопластів. Компонента з максимумом при 454 нм однакова за інтенсивністю у контрольних і інфікованих протопластів. Час цього запису відповідає закінченню фази логарифмічного росту репродукції вірусу. Вже накопичилася велика кількість мРНК, але вона ще не інкапсульована і чутка до РНКази.

При порівнянні графіків спектрів люмінесценції, записаних через 24 год. після інфікування, контрольних і інфікованих протопластів (рис. 1б.) видно, що компонента з максимумом при 454 нм, у інфікованих протопластів, не виявляється. Це може бути свідченням того, що концентрація її в клітині помітно знизилася. Вона, як свідчать джерела літератури, відповідає фенольним сполукам, але невідомо яким саме. Інтегральна інтенсивність (усіх компонент) люмінесценції значно нижча у інфікованих протопластів.

Після 32 год. від інфікування на спектрі люмінесценції інфікованих протопластів компонента з максимумом при 454 нм не ідентифікується, хоч в контролі вона присутня. Інтегральна інтенсивність в обох випадках сильно знижується, що, очевидно, можна пояснити початком відтворення клітинної стінки, яка сильно приглушує сигнали інших сполук. Складові з максимумами при 400, 412, 440 і 446 нм у інфікованих протопластів нижчі за інтенсивністю. А інтенсивність компонент з максимумами при 418 і 424 нм майже однакова. Це вимірювання відповідає закінченню фази пропорційного росту репродукції вірусу. Подальші дослідження ускладнюються клітинною стінкою, що відновлюється і приглушує сигнал.

Отже, що до інформативної компоненти для діагностики стресового стану рослин, викликаного вірусною інфекцією, то нею може бути позиція з максимумом при 454 нм. Разом з тим слід відмітити, що визначення її природи і порівняння її зміни на інших видах рослин буде мати надзвичайний науковий інтерес.

Вплив ВТМ на функціональну активність макрофагів білих мишей. Проведено вивчення можливого впливу ВТМ на функціональну активність макрофагів перитонеального ексудату і селезінки. Після виконання скринінгових дослідів подальші дослідження проводили із звичайним штамом ВТМ (U1) та ізолятом ВМТ із троянди ефіроолійної.

Результати досліджень показують, що активність фагоцитозу (кількість макрофагів, що фагоцитували, по відношенню до загально підрахованих) макрофагів селезінки мишей, інокульованих ВТМ, збільшувалась в порівнянні з контролем в 1,2 рази. Наявність розпластаних макрофагів селезінки після введення ВТМ мишам збільшувалась в 1,6 рази, а агрегованих макрофагів селезінки зростала в 1,2 рази. Інтенсивність фагоцитозу (кількість дріжджів, яку може поглинути один фагоцит) макрофагів селезінки після введення ВТМ суттєво не змінювалась в порівнянні з контролем і складала 1,5, тоді як у контролі цей показник дорівнював 1,3.

Аналогічна картина має місце і при вивченні активності макрофагів перитонеального ексудату. Активність фагоцитозу макрофагів перитонеального ексудату білої миші після введення ВТМ збільшувалась в порівнянні з контролем в 1,5 рази. Значно зростала (в 2 рази) і наявність розпластаних макрофагів перитонеального ексудату при інокульованні мишей ВТМ в порівнянні з контролем. При підрахунку кількості агрегованих макрофагів перитонеального ексудату після введення ВТМ спостерігали їх збільшення в 1,3 рази по відношенню до контрольних. Інтенсивність фагоцитозу макрофагів перитонеального ексудату після інокулювання ВТМ набувала збільшення в 1,6 рази. Отримані розбіжності в активності макрофагів дослідних і контрольних мишей достовірні при різниці значущості Р?0,1

Слід відмітити, що в обох випадках введення вірусу тютюнової мозаїки чи внутрішньочеревно, чи перорально білим мишам призводило до збільшення різних показників активності макрофагів. Найбільш суттєві зміни торкались розпластаних макрофагів, що свідчить про збільшення фагоцитарної активності макрофагів. Особливої різниці в показниках активності макрофагів при введенні відібраних нами штамів ВТМ не встановлено.

Супресія активності макрофагів вірусом тютюнової мозаїки по відношенню до грипозної інфекції білих мишей. Виявлене достовірне збільшення функціональної активності макрофагів селезінки та перитонеального ексудату мишей, інокульованих ВТМ, в порівнянні з контролем стало підставою для з’ясування можливої імуномодулюючої дії фітовірусу по відношенню до інфекцій вірусами людини і тварин. Для з’ясування цього ми через 24 год. після інокуляції ВТМ (тими ж штамами) цим тваринам вводили інтраназально вірус грипу А/Гонконг/68(Н3N2).

Встановлено, що активність фагоцитозу макрофагів селезінки білих мишей, інокульованих тільки вірусом грипу або тільки ВТМ, завжди зростала в порівнянні з контролем відповідно в 1,5 і 1,2 рази. В дослідах, коли спочатку мишам було введено ВТМ, а потім вірус грипу, навпаки, показники активності фагоцитозу макрофагів селезінки знижувались і майже не відрізнялись від контрольних - відповідно 14,3% і 14,6%. Схожа картина спостерігалась з показниками активності фагоцитозу макрофагів перитонеального ексудату.

При введенні білим мишам вірусу грипу активність фагоцитозу макрофагів перитонеального ексудату збільшувалась в 1,4 рази, а після введення ВТМ – в 1,5 рази в порівнянні з контролем. Якщо ж ми інокулювали мишей спочатку ВТМ, а потім вірусом грипу, то фагоцитуюча активність макрофагів перитонеального ексудату ставала нижчою за контроль (13,2%, тоді як контроль становив 14,6%). Тобто при введенні білим мишам рослинного вірусу відмічалось значне зниження імунної відповіді організму на введення вірусу тварин.

Відомо, що найбільшою фагоцитуючою активністю володіють розпластані макрофаги. Кількість розпластаних макрофагів селезінки після введення білим мишам окремо вірусу грипу і ВТМ збільшується в порівнянні з контролем в 1,6 рази в обох випадках. Якщо ж мишей спочатку інокулювали ВТМ, а потім вірусом грипу, то наявність розпластаних макрофагів лише незначно збільшувались в порівнянні з контролем - 11,8% і 10,8% відповідно (рис. 3.).

Рис. 3. Кількість розпластаних макрофагів селезінки (1) та перитонеального ексудату (2) білих мишей після введення вірусів

Кількість розпластаних макрофагів перитонеального ексудату мишей, інокульованих як ВТМ, так і вірусом грипу, зростала в порівнянні з контролем відповідно в 2 і 1,9 рази. Якщо спочатку мишам вводили ВТМ, а потім вірус грипу, то ці показники падали і становили 13,5% відповідно до 9,1% контрольних. Тобто загалом відмічалась супресія імунної відповіді організму на вірус грипу після введення білим мишам ВТМ.Важливе значення при формуванні загальної реакції мають агреговані макрофаги. Відмічено, що кількість агрегованих макрофагів селезінки мишей, інокульованих вірусом грипу, збільшувалась в порівнянні з контролем в 1,2 рази. При введенні мишам ВТМ чисельність агрегованих макрофагів селезінки зростала і становила 17,4%, тоді як в контролі була 10,8%. В досліді, коли спочатку вводили ВТМ, а потім вірус грипу, кількість агрегованих макрофагів селезінки зменшувалась і становила 11,8%, що незначно більше, ніж у контролі. При підрахунку агрегованих макрофагів перитонеального ексудату ми спостерігали протилежну картину. Якщо після окремого введення мишам вірусу грипу і ВТМ кількість агрегованих макрофагів перитонеального ексудату збільшувалась в порівнянні з контролем в 1,6 і 1,2 рази, то після інокулювання тварин ВТМ і вірусом грипу разом супресії імунної відповіді, як у всіх вищезгаданих випадках, не відбувалось. Навпаки, мало місце збільшення імунної відповіді. Чисельність агрегованих макрофагів перитонеального ексудату після введення ВТМ і вірусу грипу збільшувалась в 2 рази (рис. 4.).

Показники інтенсивності фагоцитозу макрофагів селезінки після введення білим мишам ВТМ та ВТМ і вірусу грипу разом збільшувались в порівнянні з контролем в 1,2 рази. Після інокулювання мишей тільки вірусом грипу інтенсивність фагоцитозу макрофагів селезінки збільшувалась в 1,5 рази. Показники інтенсивності фагоцитозу макрофагів перитонеального ексудату після інокулювання мишей тільки ВТМ і тільки вірусом грипу відмічалось збільшення інтенсивності фагоцитозу в 1,6 і 1,7 рази відповідно. Після введення мишам спочатку ВТМ, а потім вірусу грипу інтенсивність фагоцитозу зменшувалась і дорівнювала контролю (рис. 5.).

Можливо отримана неспецифічна імуномодуляція вірусом тютюнової мозаїки грипозної інфекції пов’язана з токсичністю введених вірусів, оскільки це була подвійна доза в білковому відношенні. З цією метою одним мишам вводили подвійну дозу ВТМ, а іншим подвійну дозу вірусу грипу. При підрахунку показників активності макрофагів результати виявились подібними до отриманих раніше.

Рис. 4. Кількість агрегованих макрофагів селезінки (1) та перитонеального ексудату (2) білих мишей після введення вірусів

Рис. 5. Показники інтенсивності фагоцитозу макрофагів селезінки (1) та перитонеального ексудату (2) білих мишей після введення вірусів

Дослідження трансфекційних властивостей ізолятів ВТМ та їх РНК. В дослідах по вивченню впливу ВТМ та його РНК на клітини невластивих йому хазяїв після аналізу та попередніх тестувань використовували штам ВТМ троянди ефіроолійної та ізолят, виділений із S.nigra.

Результати порівняння культур клітин ліній ОН-1 (лімфоїдного походження) і ПТП (епітеліального походження), оброблених ДЕАЕ-декстраном, з інтактними клітинами показали, що після такої обробки обидві лінії практично не змінені. Відмічено, що після інфікування (або трансфекції) клітини обох типів пересадились нормально, тобто початковий етап інфекції (первинна взаємодія вірусних часток з клітинами-мішенями) не вплинув на життєздатність ні лімфоїдних, ні епітеліальних клітин.

Порівнявши клітини лінії ПТП після 3 діб культивування від інфікування, з контрольними при візуальній оцінці після фарбування їх гематоксилін-еозином, можна стверджувати, що видимих змін у їх формі та структурі клітин немає. Стосовно культури клітин ОН-1 слід відмітити, що серед дослідних зустрічаються поодинокі багатоядерні клітини, зрідка вони виявляються і в контрольних клітинах оброблених ДЕАЕ-декстраном. У моношарі лінії ПТП такі клітини не виявляються. Методом ІФ аналізу встановлено, що в культурах зустрічаються поодинокі клітини, що містять антигени ВТМ.

На 5 добу культивування обох ліній в інфікованих клітинах виявляються такі, що відрізняються від контрольних. Відмінності полягають в тому, що, як і у попередньому випадку, в моношарі лінії ОН-1 виявляються багатоядерні, інколи значно збільшені за розміром клітини, у яких цитоплазма рихла з вакуолізованими ділянками. В моношарі лінії ПТП зрідка виявлялись сильно вакуолізовані клітини (заповнені “пухирцями”). Змін у вигляді ЦПД в моношарі клітин обох ліній не спостерігаємо. За допомогою ІФ аналізу було виявлено, що у досить невеликої кількості клітин і ПТП, і ОН-1 (3-4виявляються антигени ВТМ. Це може свідчити про наявність в цих клітинах вірусних часток або БО, але не можна стверджувати, що вони новосинтезовані, так як це можуть бути занесені нами ззовні віріони. Разом з тим слід відмітити, що за різної поведінки культур клітин після дії на них ДЕАЕ-декстрану на ефективність інфікування це не впливало. Останнє порівняння препаратів проводили через 7 діб культивування: у інфікованих клітин обох ліній виявляються ті ж самі зміни, але цитоплазма більш вакуолізована. Результати проведення ІФ аналізу аналогічні попереднім.

В ході досліджень відмінностей у поведінці культур клітин по відношенню до наших двох ізолятів ВТМ не виявили.

Отримані дані показують, що використання нативного ВТМ не може дати достовірної відповіді на питання про можливість збірки нових вірусних часток в клітинах невластивих йому хазяїв.

Результати порівняння відібраних контрольних і дослідних (інкубація з РНК ВТМ) клітин лінії ОН-1 і ПТП через 3 доби від часу трансфекції вказують, що у дослідних клітин проявлялися морфологічні зміни. Для культури ОН-1 вплив РНК ВТМ проявлявся в тому, що в моношарі з’являлися клітини (від 12% до 20%), які значно збільшені за розміром, їх цитоплазма рихла з вакуолізованими ділянками, часто зустрічається багатоядерність (рис. 6.). Однак чітких змін у структурі моношару клітин не спостерігали. Стосовно культури ПТП можна відмітити, що за розміром та морфологією контрольні і дослідні клітини не відрізняються. Але

Рис. 6. Клітини ОН-1: а – контроль: інтактні клітини, б – дослід: трансфекція РНК ВТМ (5-а доба після трансфекції) (світлова мікроскопія, х 400)

моношар останніх був менш щільним, і в ньому зустрічалися сильно вакуолізовані клітини (заповнені “пухирцями”). Характер змін клітин обох ліній співпадає зі змінами, що виникали при інфікуванні нативним ВТМ, але кількість морфологічно змінених клітин набагато більша. За допомогою ІФ аналізу було виявлено, що у клітин обох ліній виявляються антигени ВТМ.

При порівнянні препаратів, відібраних після 5 діб від часу трансфекції, відмічено, що в моношарі дослідних клітин виявляються клітини з морфологічними змінами, які аналогічні попереднім. Слід відмітити, що у морфологічно змінених клітин обох ліній більш чіткіше і значніше проявлялась вакуолізація. ІФ аналізом встановлено, що в культурах клітин і ПТП, і ОН-1 виявляються антигени ВТМ.

Подальший аналіз показав, що через 7 діб після трансфенкції у дослідних клітин виявляються ті ж самі зміни, але цитоплазма ще більш вакуолізована. Проте в жодній з культур ми не спостерігали появи типових апоптичних тілець. Результати проведення ІФ аналізу були аналогічні попереднім.

У гомогенаті інфікованих РНК ВТМ клітин (і ПТП, і ОН-1) за допомогою електронної мікроскопії виявлялися вірусоподібні частки розміром 120-350 нм, що мали типову для ВТМ морфологію. Крім того, в полі зору електронного мікроскопа спостерігались окремі субодиниці та фрагменти часток різного розміру. Ці гомогенати виявляли інфекційність на таких рослинах, як Ch. amaranticolor, Ch. album, D. stramonium, які на 10-14 день проявляли чітко відмічену некротичну реакцію та часткове скручування листя. Симптоми спостерігали у 70-80інокульованих рослин.

Основною відмінністю між інфікуванням культур ВТМ і РНК вірусу було збільшення кількості морфологічно змінених клітин у варіанті з РНК. Результати ІФ аналізу дають змогу простежити, що вищий відсоток флуоресценції клітин у випадку з РНК ВТМ співпадає зі збільшенням морфологічно змінених клітин при цьому варіанті інфікування.

ВИСНОВКИ

Проведено скринінг біоценозів, який дав змогу виділити із рослин декілька ізолятів ВТМ. Останні відрізнялись між собою за біологічними критеріями та фізичними показниками: точкою температурної інактивації, максимальним розведенням інфекційного соку, константами седиментації.

Синьо-зелена люмінесценція протопластів виділених із рослин неінфікованого тютюну має складну природу, про що свідчить наявність в спектрі люмінесценції в діапазоні 372 - 502 нм 11 компонент різної інтенсивності.

Компоненти синьо-зеленої люмінесценції по-різному реагують на тривалість культивування протопластів та на інфікування їх вірусом. Стресовий стан протопластів тютюну, інфікованих ВТМ, може бути виявлений по зменшенню інтенсивності синьо-зеленої люмінесценції, особливо довгохвильової позиції з максимумом при 454 нм.

При трансфекції клітин ссавців РНК ВТМ збірка ВТМ-подібних часток, що мають інфекційну активність, спостерігається в клітинах різного походження – епітеліальних (ПТП) та лімфоїдних (ОН-1).

Морфологічні зміни інфікованих ВТМ культур залежать від типу клітин: для культури ОН-1 характерними ознаками є збільшення розмірів клітин та їх багатоядерність, для ПТП –порушення моношару і вакуолізація.

Вивчено вплив ВТМ на функціональну активність макрофагів перитонеального ексудату і селезінки білих мишей, виявлено збільшення активності фагоцитозу, кількості розпластаних і агрегованих макрофагів у 1,2-2,0 рази в порівнянні з контролем.

Доведено можливість імуномодулюючої дії ВТМ по відношенню до грипозної інфекції. У мишей, яким вводили спочатку ВТМ, а потім інфікували їх вірусом грипу, показники функціональної активності макрофагів були достовірно нижчими, ніж у мишей, яким вводили ВТМ, або тільки вірус грипу.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Кир’яченко С.С., Компанець Т.А., Поліщук В.П., Бойко А.Л., Шадчина Т.М. Люмінесценція інфікованих вірусом тютюнової мозаїки протопластів тютюну в синьо-зеленій області спектра // Вісник КУ ім. Т. Шевченка Сер. Біологія.-1999.-Вип. 29.-С. 51-53.

Бойко А.Л., Муж Г.В., Сенчугова Н.А., Бойко О.А., Капустіна Н.О., Кир’яченко С.С., Поліщук В.П. Здорові лікарські росини // Захист рослин.-1999.-№ .-С. 24-25.

Кир’яченко С.С. Вірус тютюнової мозаїки на рослинах Канівського природного заповідника // Укр. Фітоцен. Зб. Сер. С.-1999.-№1 (15).-С. .

Чернюк С.О., Кир’яченко С.С. Характеристика ізолятів ВТМ рослин заповідника Асканія-нова та Канівського державного заповідника // Вісник КНУ ім. Т. Шевченка Сер. Інтродукція та збереження рослинного різноманіття.-2000.-Вип. 3.-С. 69-71.

Бойко А.Л., Кир’яченко С.С., Юдіна О.Ю., Савцова З.Д. Вплив вірусу тютюнової мозаїки та його РНК на культури клітин різного походження // Біополімери і клітина.-2001.-Т.17, №4.-С. 314-318.

Тайкова Н.В., Ігнатенко Т.О., Кир’яченко С.С., Молчанець О.В. Вплив ВТМ на функціональну активність макрофагів білих мишей // 2-га Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”, Київ.- 1998.- С.104.

АНОТАЦІЯ

Кир’яченко С.С. Вплив ізолятів ВТМ на організми та клітини різного походження. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка. Київ, 2002.

Виділено ізоляти ВТМ з Канівського природного заповідника, вивчено їх біологічні властивості та фізичні показники.

Показана тонка структура синьо-зеленої люмінесценції протопластів тютюну та встановлена чутливість її компонент до вірусу тютюнової мозаїки.

Виявлено збільшення функціональної активності макрофагів селезінки і перитонеального ексудату білих мишей після введення їм ВТМ, та встановлено зростання фагоцитарної активності макрофагів селезінки і перитонеального ексудату мишей при введенні вірусу грипу і ВТМ окремо і супрессію імунної відповіді організму тварини на введення вірусу грипу, якщо перед цим тварині вводили ВТМ.

Встановлено, що при трансфекції клітин ссавців епітеліального та лімфоїдного походження РНК ВТМ за допомогою ДЕАЕ-декстранового методу в інфікованих клітинах виявляються антигени ВТМ, що призводить до морфологічних змін клітин. Гомогенат з інфікованих клітин проявляв інфекційність на таких рослинах-індикаторах як Ch. amaranticolor, Ch. album та D. stramonium.

Ключові слова: вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), модельні системи, протопласти, люмінесценція, трансфекція.

Кирьяченко С.С. Влияние изолятов ВТМ на организмы и клетки различного происхождения. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.06 – вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко. Киев, 2002.

Выделено изоляты ВТМ из Каневского естественного заповедника, изучены их биологические свойства – установлены отличия относительно штамма U1 на растениях N.tabacum var. Samsun, наблюдали разницу в наружных симптомах и поздние развитие системной инфекции (13-15 суток для ВТМ-U1 і 20  суток для наших изолятов). Изоляты также отличались между собой и от штамма U1 физическими показателями (точкой температурной инактивации, максимальным разведением инфекционного сока и константой седиментации (s?)).

Показана тонкая структура сине-зеленой люминесценции протопластов табака. Установлена чувствительность компонент сине-зеленой люминесценции к вирусу табачной мозаики, влияние ВТМ возможно выявить по уменьшению интенсивности сине-зеленой люминесценции протопластов табака, особенно длинноволновой компоненты с максимумом при 454 нм.

Выявлено увеличение функциональной активности макрофагов селезенки и перитонеального эксудата белых мышей после введения им ВТМ, установлено возрастание фагоцитарной активности макрофагов селезенки и перитонеального эксудата мышей при введении вируса гриппа и ВТМ в отдельности и супрессию иммунного ответа макрофагами животного на введение вируса гриппа, если перед этим животному вводили ВТМ.

Показано, что при трансфекции клеток млекопитающих эпителиального (линия ПТП, получена из клеток яичка поросенка) и лимфоидного происхождения (линия ОН-1, получена из лимфомы мышей линии А, возникшей после введения Bac. megaterium H), РНК ВТМ с помощью ДЭАЭ-декстранового метода, в инфицированных клетках обнаруживаются антигены ВТМ, что одновременно приводит к морфологическим изменениям клеток. Морфологические изменения культур зависят от типа клеток: для культуры ОН-1 характерными признаками были увеличение клеток в размерах и их многоядерность, для ПТП – нарушения монослоя и вакуолизация клеток.

Гомогенат из инфицированных клеток проявлял инфекционность на таких растениях-индикаторах как Ch. amaranticolor, Ch. album и D. stramonium.

Ключевые слова: вирус табачной мозаики (ВТМ), модельные системы, протопласты, люминесценция, трансфекция.

Kyryachenko S.S. Influence TMV on organisms and cells of a different origin. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of the Candidate of Biological Science (PhD) by speciality 03.00.06 - virology. Тaras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2002.

Isolates of TMV are extracted from Kaniv natural reserve, their biological properties and physical parameters are investigated.

The accurate structure of blue-green luminescence of tobacco