НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КОВАЛЬОВА ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА

УДК: 615.07.014:615.24:615.322:615.451.16:634.511

РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ

ПРОТИВИРАЗКОВОГО ЗАСОБУ – ГУСТОГО

ЕКСТРАКТУ ЛИСТЯ ГОРІХУ ГРЕЦЬКОГО

15.00.01 – технологія ліків та організація фармацевтичної справи

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

ХАРКІВ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі косметології і аромології Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

БАШУРА ОЛЕКСАНДР ГЕННАДІЙОВИЧ,

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри косметології і аромології

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

СПИРИДОНОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ,

Державний науковий центр лікарських засобів

науковий редактор журналу “Фармаком”

кандидат фармацевтичних наук

БОКШАН ЄЛИЗАВЕТА ВАСИЛІВНА

Львівський державний медичний університет

ім. Данила Галицького

доцент кафедри технології ліків з курсом промислової

фармації

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти

ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра технології

ліків та клінічної фармації

Захист відбудеться “ 13 ” грудня 2002 року о 2002 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “ 9 ” листопада 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради Малоштан Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема лікування і профілактики гастроентерологіч-них захворювань залишається актуальною, не зважаючи на наявність широкого арсеналу лікарських засобів і методів для її вирішення.

Важливим завданням сучасної вітчизняної фармації в даному напрямку є розширення номенклатури ефективних лікарських препаратів для терапії запальних та виразкових уражень шлунково-кишкового тракту (ШКТ) на основі субстанцій природного походження. Властивості цих препаратів – висока біологічна активність, практична відсутність токсичних властивостей – відіграють вирішальну роль при проведенні комплексної терапії при хронічних формах захворювання, а також на стадіях загострення та під час ремісій.

Перспективним та цінним джерелом біологічно активних речовин для розробки противиразкових препаратів рослинного походження є листя горіху грецького. Це обумовлено його унікальним хімічним складом, багаторічним досвідом його використання в народній медицині, підтверджено рядом досліджень біологічної активності та розробкою лікарських препаратів на його основі, достатньою сировинною базою України.

У зв'язку з цим актуальною є проблема створення, дослідження та стандартизація нового біологічно активного засобу – густого екстракту листя горіху грецького для подальшого його використання у виробництві дозованих лікарських форм.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідницьких робіт Національного фармацевтичного університету (№ держреєстрації 0198U007008) і проблемної комісії "Фармація" МОЗ України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка та науково-експериментальне обгрунтування технології густого екстракту листя горіху грецького, а також його вивчення та розробка методів стандартизації.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- проаналізувати та узагальнити сучасні дані літератури з питань етіології, патогенезу і медичних аспектів терапії виразкової хвороби;

- провести аналіз номенклатури та механізмів дії сучасних лікарських препаратів для лікування виразкових уражень шлунка та дванадцятипалої кишки, представлених на фармацевтичному ринку України;

- проаналізувати стан фітохімічного виробництва в Україні;

на підставі вивчення технологічних властивостей сировини та вибору оптимальних умов екстрагування науково обгрунтувати оптимальну технологію густого екстракту листя горіху грецького для терапії виразкової хвороби;

- вивчити фізико-хімічні та технологічні властивості екстракту;

- розробити методики якісного і кількісного аналізу запропонованого фітозасобу;

- вивчити стабільність густого екстракту в процесі зберігання;

- розробити нормативно-технічну документацію на засіб для представлення матеріалів до Державного Фармакологічного центру МОЗ України з метою отримання дозволу на проведення клінічних випробувань;

- провести мікробіологічні та фармакологічні дослідження розробленого фітозасобу.

Об'єкт дослідження. Об'єктами дослідження є листя горіху грецького, водно-спиртові витяги та густий екстракт, одержані з указаної сировини.

Предмет дослідження. Предметом дослідження є розробка оптимальної технології лікарського засобу на основі листя горіху грецького у формі густого екстракту для використання в гастроентерології.

Методи дослідження. При вирішенні поставлених у роботі задач були використовували наступні фізико-хімічні, технологічні та біологічні методи:

- спектрофотометричне визначення сполук поліфенольної природи та диференційна спектрофотометрія для визначення флавоноїдів у екстракті;

- окисно-відновне титрування (перманганатометрія) для визначення дубильних речовин (у перерахунку на танін);

- тонкошарова хроматографія, кольорові та осадові реакції для ідентифікації флавоноїдів на рівні індивідуальних сполук;

- гравіметричне визначення масової частки вологи;

- дробна мацерація, реперколяція та вакуум-фільтраційна екстракція для одержання лабораторних зразків лікарського засобу.

Для вивчення антимікробної активності препарату використовували мікробіологічний метод дифузії в агар - метод “колодязів”.

Встановлення токсичності екстракту проводили в дослідженнях з постановкою орієнтованого експерименту визначення середньолетальних доз за методом Штабського Б.М. з співавторами.

Обробку експериментальних даних здійснювали за допомогою методів математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на підставі результатів фізико-хімічних, технологічних, біологічних досліджень теоретично та експериментально обгрунтовано технологію отримання густого екстракту листя горіху грецького (ГЕЛГГ) як фітозасобу для лікування виразкової хвороби та рекомендовано технологічні параметри для підприємства-виробника.

Вивчені фізико-хімічні властивості засобу, стабільність в процесі зберігання та біологічна активність.

Вперше вивчені деякі технологічні параметри листя горіху грецького та вплив на повноту виходу біологічно активних речовин з сировини наступних чинників: ступеня подрібнення сировини, природи екстрагенту, співвідношення сировина-екстрагент, а також умови екстрагування.

Обгрунтовано метод отримання фітозасобу в промислових умовах.

Розроблено методики якісного і кількісного аналізу засобу для створення аналітичної нормативної документації на ГЕЛГГ.

Встановлено спектр фармакологічної активності ГЕЛГГ і доведено його фармакологічну нетоксичність.

Визначено оптимальні умови та термін зберігання густого екстракту, які забезпечують його стабільність протягом двох років.

Практичне значення отриманих результатів. Створено та досліджено новий лікарський фітозасіб “Густий екстракт листя горіху грецького” для лікування запальних уражень шлунково-кишкового тракту.

Розроблено та апробовано технологію густого екстракту листя горіху грецького в умовах промислового виробництва, що викладена в технологічному регламенті, на базі ВАТ “ФФ “Здоров'я” (Акт апробації від 24 грудня 2001 р.).

Розроблено методики контролю якості густого екстракту листя горіху грецького, які відображено в проекті аналітичної нормативної документації.

Проведено доклінічні випробування густого екстракту, які показали, що він є ефективним засобом для лікування виразкової хвороби, колітів, гастритів, ентеритів, може бути рекомендований для медичного застосування.

Матеріали підготовлено для подання до Державного Фармакологічного центру МОЗ України.

Фітозасіб “Густий екстракт листя горіху грецького” планується до промислового випуску на базі ВАТ “ФФ “Здоров'я”.

Фрагменти роботи впроваджено до навчального процесу кафедри технології ліків та клінічної фармації Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика (акт впровадження від 20 квітня 2002 року) на циклі “Сучасні питання фармації”, кафедри технології ліків з курсом промислової фармації Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького (акт впровадження від 17 січня 2002 року), кафедри технології готових лікарських засобів Ташкентського фармацевтичного інституту (акт впровадження від 12 березня 2002 року) з розділу “Екстракційні препарати”.

Особистий внесок дисертанта. Автором особисто проведено:

- пошук і аналіз літературних даних з номенклатури та механізмів дії сучасних фітопрепаратів для терапії виразкової хвороби;

- технологічні дослідження властивостей листя горіху грецького та фізико-хімічне вивчення розробленого препарату;

- теоретично обгрунтовано і експериментально підтверджено технологію нового фітозасобу – густого екстракту листя горіху грецького;

- встановлено термін зберігання та розроблено методики контролю якості густого екстракту;

- на підставі проведених експериментальних досліджень створено проект аналітичної нормативної документації та промисловий регламент на виробництво густого екстракту листя горіху грецького;

- узагальнені результати експериментальних досліджень та сформульовані висновки.

В наукових працях, опублікованих із співавторами О.Г.Башурою, Є.В.Гладухом, Н.П.Половко, Л.М.Малоштан, Л.М.Бабковою, І.О.Журавель, дисертантом встановлено оптимальні умови одержання засобу, розроблено методики його стандартизації та вивчено біологічну активність і нешкідливість.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000), науковій конференції молодих вчених і студентів НФАУ (Харків, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 робіт, у тому числі 3 статті у наукових фахових виданнях України і 2 тези доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), об'єктів і методів дослідження (розділ 2), експериментальної частини (розділи 3-5), загальних висновків, списку використаних літературних джерел та додатків. Дисертація викладена на 129 сторінках машинопису, містить 10 рисунків, 35 таблиць і 7 додатків. Список використаної літератури включає 169 джерел, в тому числі 74 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

При розробці технології фітозасобу в формі густого екстракту нами була використана лікарська рослинна сировина – листя горіху грецького (ТУ У 23766377.004-98), а також спирт етиловий 96% (ФС 42У-001-97), спирт етиловий 40% (ФС 42У-135/162-232-97) та вода очищена (ФС 42-2619-89).

При дослідженні густого екстракту листя горіху грецького були застосовані загальноприйняті методи органолептичних, технологічних, фізико-хімічних, мікробіологічних та фармакологічних досліджень, які дозволили об'єктивно оцінювати якісні характеристики засобу.

Розробка технології та дослідження густого екстракту листя горіху грецького

При розробці технології фітозасобу завданням наших досліджень стало визначення таких умов процесу екстрагування даного виду сировини, які б забезпечували одночасно оптимальний вихід екстрактивних та діючих речовин.

Вивчення процесу екстрагування ми почали з дослідження певних технологічних параметрів сировини, які лежать в основі розробки раціональної технології більшості методів екстракції рослинної сировини. Для одержання об'єктивних і відтворюваних результатів при вивченні екстракційного процесу усі серії досліджень проводились на сировині одного характеру подрібнення. Такими параметрами стали: вологість (4,876±0,022 %), вміст загальної золи (11,75±0,35%) і золи, нерозчинної у соляній кислоті (1,78±0,17%).

Визначення екстрактивних речовин в перерахунку на абсолютно сухе листя горіху грецького проводили з використанням наступних екстрагентів: води, спирту етилового, н-бутанолу, хлороформу і етилацетату. Результати дослідження наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Вміст екстрактивних речовин в листі горіха грецького (в % на абс. суху вагу)

Екстрагент Екстрактивні речовини, % Метрологічні характеристики

Вода н-бутанол Хлороформ Спирт ет. 40% Спирт ет. 96% Етилацетат 17,90±0,35 12,53±0,82 13,16±1,13 31,02±1,24 14,92±0,14 23,45±0,06 Р=95% Р=95% Р=95% Р=95% Р=95% Р=95% S=0,1276 S=0,2955 S=0,4080 S=0,4461 S=0,3452 S=0,0236 Е відн=1,98% Е відн=2,53% Е відн=2,62% Е відн=3,44% Е відн=2,19% Е відн=1,76%

З даних, наведених в таблиці 1 видно, що найбільшу кількість екстрактивних речовин 31,02±1,24% вилучає 40% етиловий спирт, а найменшу 12,53±0,82% вилучає н-бутанол. Водою вилучається лише 17,9±0,35% екстрактивних речовин, хоча вода є більш полярним екстрагентом з використаних для визначення.

Повнота вилучення діючих речовин є одним з найважливіших показників рівня технології лікарського препарату і залежить від багатьох чинників, у тому числі і від ступеня подрібнення сировини. У зв'язку з цим нами був проведений ряд дослідів, спрямованих на вивчення впливу ступеня подрібнення листя горіху грецького на вихід екстрактивних та діючих речовин. Для цього попередньо було здійснено приготування методом дробної мацерації експериментальних зразків густого екстракту листя горіху грецького, для якого використали сировину з різним ступенем подрібнення.

Екстрагування усіх серій лабораторних зразків проводилося за однакових умов: співвідношення сировина-екстрагент (1:10), в якості екстрагенту був використаний спирт 40%. Результати досліджень, що представлені у табл.2, свідчать про незначний вплив ступеня подрібнення на вихід екстрактивних та діючих речовин. Так, розбіжність у зразках ГЕЛГГ при виході екстрактивних речовин складає 0,07%, дубильних речовин – 0,18%, флавоноїдів – 0,22%. До того ж, висушене листя горіху грецького досить крихке, легко довільно подрібнюється при зберіганні та завантаженні до екстрактора і не потребує спеціальних засобів для подрібнення.

Таблиця 2

Вихід екстрактивних, дубильних речовин та суми флавоноїдів в залежності від ступеня подрібнення сировини

Діаметр частин, мм Екстрактивні речовини в перерахунку на суху сировину, % Вміст в ГЕЛГГ

Дубильні речовини, % Флавоноїди, %

Не подрібнена сировина 20,40±0,02 8,41±0,02 4,73±0,01

1-1.5 20,49±0,02 8,52±0,01 4,73±0,02

5-7 20,48±0,02 8,48±0,01 4,51±0,02

10 20,45±0,01 8,34±0,03 4,64±0,02

Керуючись даними проведених досліджень, доцільним вважаємо рекомендувати для виробництва ГЕЛГГ використання неподрібненої сировини. Даний факт дозволяє значно знизити витрати на процес промислового виробництва густого екстракту з листя горіха грецького шляхом зменшення витрат електроенергії на подрібнення, виключення з нього обладнання для подрібнення сировини і скорочення часу технологічного процесу.

Таким чином, в подальшому використовували неподрібнену сировину.

З метою вибору оптимального екстрагента в технології густого екстракту листя горіха грецького нами було розглянуто ряд розчинників. Оскільки комплекс діючих речовин листя горіху грецького представлений в основному дубильними речовинами і флавоноїдами, необхідно було вибрати розчинник, який би однаково повно вилучав з сировини обидві групи речовин і був придатний для виготовлення густого екстракту. Приймаючи до уваги дані чинники як критерії вибору розчинника та екстрагента діючих речовин з листя горіху грецького, ми зупинилися на ацетоні, спирті етиловому та етилацетаті. Під час вибору концентрації етанолу ми керувалися дослідженнями по вибору оптимального екстрагента для листя горіху грецького при створенні настойки 1:5, проведені раніше Кісельовою Н.П., які вказують на етанол 40%-ний.

Екстрагування листя горіху грецького різними розчинниками проводили за однакових умов (листя горіху грецького неподрібнене, вміст вологи не більше 5,0%, співвідношення сировина-екстрагент 1:10) при періодичному перемішуванні, переслідуючи мету покращання умов вилучення екстрактивних речовин. У одержаних різними екстрагентами екстрактах були визначені: масова частка екстрактивних речовин, дубильних речовин у перерахунку на танін та суми флавоноїдів у перерахунку на гіперозид. Результати наведені у табл. 3.

Таблиця 3

Порівняльна характеристика виходу екстрактивних, дубильних речовин та флавоноїдів (%) у густому екстракті листя горіху грецького, одержаному при екстрагуванні різними розчинниками

Розчинник Вихід, %

Екстрактивні речовини Дубильні речовини Флавоноїди

Ацетон 14,25±0,02 4,10±0,02 2,59±0,02

Етилацетат 18,45±0,02 2,92±0,05 3,57±0,02

Спирт етиловий 40% 20,36±0,03 8,41±0,03 4,72±0,02

Одержані експериментальні дані свідчать, що за здатністю екстрагувати комплекс біологічно активних речовин з листя горіху грецького значну перевагу має спирт етиловий 40%, який забезпечує максимальний вихід вказаних сполук.

Вибір даного екстрагенту обумовлений також його загальною технологічністю (високою змочуючою здатністю, яка забезпечує добре проникнення через пори сировини, невисокою температурою кипіння, леткістю, що суттєво при виробництві густого екстракту та легкою можливістю регенерації), здатністю перешкоджати розвиткові у вилученні мікрофлори та порівняною дешевизною і доступністю.

Дослідження впливу співвідношення сировина-екстрагент на повноту вивільнення екстрактивних та діючих речовин важливо і є одним з критеріїв оптимізації виробничого процесу. Для вирішення даного завдання за однакових умов було отримано ряд експериментальних зразків густого екстракту листя горіху грецького з різним співвідношенням сировина-екстрагент. В отриманих зразках густого екстракту визначали масову частку екстрактивних і дубильних речовин в перерахунку на танін та суму флавоноїдів у перерахунку на гіперозид. Результати визначень представлені в табл. 4.

Таблиця 4

Вихід екстрактивних та діючих речовин ГЕЛГГ в залежності

від співвідношення сировина-екстрагент

Показники Співвідношення сировина: екстрагент

1:5 1:7,5 1:10 1:12,5 1:15

Екстрактивні речовини, % 18,08±0,02 19,08±0,02 20,40±0,02 20,59±0,02 20,62±0,02

Дубильні речовини, % 7,86±0,02 8,04±0,02 8,41±0,02 8,42±0,01 8,43±0,02

Флавоноїди, % 4,14±0,02 4,43±0,02 4,73±0.01 4,75±0,01 4,76±0,03

Дані таблиці свідчать, що при отриманні ГЕЛГГ зростання вмісту екстрактивних, дубильних речовин та суми флавоноїдів спостерігається при збільшенні кількості екстрагенту. Проте з підвищенням масової частки екстрагенту у співвідношеннях вище 10 (1:12,5; 1:15) їх вихід збільшується незначно (екстрактивних речовин – на 0,22%, дубильних речовин – на 0,02% і флавоноїдів – на 0,03%), тому ми вважаємо економічно недоцільним проводити процес екстрагування з використанням таких пропорцій. Навпаки, при зменшенні частки екстрагента (співвідношення 1:7,5, 1:5) неможливо досягти повноти вилучення цільових сполук, що також вказує на недоцільність проведення екстракції з використанням вказаних співвідношень.

Таким чином, для промислового виробництва ГЕЛГГ можна рекомендувати співвідношення сировина-екстрагент 1:10.

Найважливішою умовою ефективності процесу екстрагування з рослинного матеріалу є його тривалість. Тому актуальним стало вивчення динаміки вилучення діючих речовин з листя горіху грецького в кожній зі стадій процесу екстракції з метою виявлення оптимального балансу часу. Для цього була проведена серія експериментів, в ході яких оптимальний час екстрагування визначали з інтервалом від 12 годин до 7 діб з інтервалом 24 години. Після екстрагування через 12, а далі через кожних 24 години в одержаних рідких екстрактах визначали вихід екстрактивних речовин, вміст дубильних речовин та суми флавоноїдів. Результати досліджень представлені на рис. 1 і свідчать, що максимум виходу екстрактивних речовин забезпечує настоювання сировини протягом 72 та більше годин. Причому екстрагування, що триває 96, 120, 144 та 168 годин, збільшує вихід екстрактивних речовин незначно порівняно з 72 годинами, що вказує на недоцільність подальшого процесу настоювання.

Рис.1. Залежність виходу екстрактивних (ЕР), дубильних (ДР) речовин та флавоноїдів (Ф) (Х, %) в рідкий екстракт листя горіху грецького від часу екстракції (ф)

Як видно з рисунку, перші три серії рідкого екстракту листя горіху грецького, отримані після настоювання протягом 12, 24 та 48 годин, містять значно менше дубильних речовин (4,21±0,02, 6,13±0,02 та 7,45±0,02 відсотків відповідно), ніж наступні. Найбільший вихід дубильних речовин (8,16±0,02 % та 8,32±0,01 %) містять зразки ГЕЛГГ, отримані після 3 діб екстрагування. У решти екстрактів спостерігалося збільшення виходу дубильних речовин (8,41±0,01, 8,48±0,02, 8,51±0,02 %), проте результати визначення їх вмісту суттєво не відрізнялися від попередніх результатів. Отримані результати дають можливість рекомендувати для виробництва ГЕЛГГ час настоювання 72 години як оптимальний.

Даний факт підтверджують і результати визначення суми флавоноїдів, яка також збільшується пропорційно виходу дубильних речовин. Так, максимум їх виходу спостерігається у екстрактах, отриманих після настоювання на 3 та 4 добу і складає 4,44±0,02 % та 4,50±0,02 %, тоді як решта екстрактів, отриманих після подальшого настоювання, мають незначне збільшення виходу суми флавоноїдів (4,58±0,02, 4,60±0,02, 4,61±0,02 %), що також свідчить на користь обраного часу екстрагування.

Вивчення динаміки вилучення діючих речовин свідчить про те, що у більшості випадків вилучення протікає найбільш активно в перші години, а згодом швидкість процесу починає помітно спадати і повнота вилучення наступає через тривалий час.

Для визначення числа необхідних ступенів рівноваги та обгрунтування методу одержання густого екстракту листя горіху грецького нами було проведено ряд експериментів по вивченню стану системи листя горіху грецького-спирт етиловий 40%. Одержані експериментальні дані, наведені в табл. 5, були використані нами для побудови трикутної діаграми, яку прийнято використовувати для зображення рівноважної системи тверде тіло-рідина.

Таблиця 5

Рівноважні склади співіснуючих фаз в системі листя горіху грецького-етанол 40%

Стан системи У сировині В екстрагенті

Тверда фаза Екстр. речовини Екстрагент Екстр. речовини Екстрагент

г % г % г % г % г %

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

До рівноваги 199,0 79,6 51,0 20,4 - - - - 25000 100,0

Після 1-ї рівноваги 199,0 29,7 22,0 2,3 450,0 67,0 32,0 4,1 747,0 95,9

Після 2-ї рівноваги 199,0 30,37 6,0 0,92 450,0 68,71 16,0 2,01 796,0 97,99

Після 3-ї рівноваги 199,0 30,72 1,0 0,15 450,0 69,23 5,0 1,0 500,0 99,0

Після 4-ї рівноваги 199,0 30,66 0,1 0,01 450,0 69,33 0,9 0,18 500,0 99,82

Результати аналізу даних експерименту та теоретичних розрахунків з використанням діаграми рівностороннього трикутника підтверджують оптимальність визначеного нами співвідношення сировина-екстрагент 1:10 та вказують на три можливих ступені рівноваги для нього. На вірність даного висновку вказує результат визначення екстрактивних речовин у витяжці (0,18 %), одержаній після четвертого заливання свіжого екстрагента. Результат виявився настільки незначним, що не виправдує економічних витрат на одержання даної кількості екстрактивних речовин.

Таким чином, при співвідношенні фаз 1:10 необхідно сировину заливати екстрагентом 3 рази, доводячи систему до рівноваги кожний раз і зливаючи повністю попередню насичену витяжку.

Результати, одержані при проведенні досліджень по визначенню співвідношення, часу настоювання та кількості ступенів екстракції вказують на доцільність використання для одержання ГЕЛГГ двох методів: реперколяції та дробної мацерації. Ефективність того чи іншого метода оцінювали за виходом лабораторних зразків густого екстракту в грамах. Результати проведених досліджень показали, що найбільшу кількість готового продукту (51,47±2,27 г) можна одержати при використанні метода реперколяції, тоді як метод дробної мацерації дозволяє отримати лише 47,8±0,53 г густого екстракту.

З сучасних методів одержання екстрактивних препаратів нами було апробовано метод вакуум-фільтраційної екстракції з попереднім вальцюванням сухої сировини, запроваджений в ДНЦЛЗ проф. Литвиненко В.І. з співавт. Експериментальні дані, одержані нами при використанні вказаного методу, наведені в табл. 6.

Таблиця 6

Вміст екстрактивних, дубильних речовин та флавоноїдів в досліджуваних зливах, одержаних методом вакуум-фільтраційної екстракції

№ п/п зливу Кількісний вміст, %

екстрактивних речовин дубильних речовин флавоноїдів

1 14.6 0.15 0.61

2 5.3 0.61 0.28

3 1.8 0.30 0.12

4 0.5 0.18 0.05

5 >0.1 0.13 -

Результати визначень наведені на рис. 2 і свідчать про перспективність та економічну доцільність застосування даного метода у виробництві ГЕЛГГ на тих підприємствах, які мають необхідне для цього обладнання. Оскільки вказаний метод значно скорочує час та витрати на виробництво препарату, а придбання потрібного обладнання вимагає досить значних капіталовкладень та переобладнання існуючих ліній фітохімічних виробництв, ми рекомендуємо його як один з бажаних при одержанні ГЕЛГГ.

Рис. 2. Доброякісність зливів при одержанні витягів з листя горіху грецького методом вакуум-фільтраційної екстракції.

Примітка. А - доброякісність зливів, Ф – флавоноїди, ДР – дубильні речовини.

Таким чином, вивчення технологічних властивостей сировини та впливу ряду чинників на процес екстрагування дозволив визначити оптимальні умови для промислового виробництва густого екстракту листя горіху грецького та рекомендувати у якості бажаного методу екстрагування реперколяцію.

Схема технологічного процесу виробництва густого екстракту листя горіху грецького наведена на рис. 3 і складається зі стадії підготовки виробництва (ДР1), стадії одержання спирто-водного екстракту листя горіху грецького (ТП2), стадії одержання готового продукту (ТП3), стадії фасування, пакування і маркування густого екстракту листя горіху грецького (ПМВ4) і стадії регенерації екстрагенту (ПВ5).

Вивчення властивостей і розробка методики аналізу густого екстракту листя горіху грецького

З метою застосування одержаного густого екстракту листя горіху грецького як біологічно активної субстанції для розробки нових лікарських препаратів з означеною фармакологічною дією та створення аналітичної нормативної документації нами були проведені комплексні експериментальні дослідження зі стандартизації субстанції за основними показниками її якості.

ДР1 К1.1 К1.2 Підготовка виробництва ТхР 64-00481241-001-2002

ТП2 Одержання спирто-водного екстракту листя горіху грецького ТП2.1 К2.1 Приготування екстрагенту Реактор Р-4

Втрати

Шрот на ПВ5 ТП2.2 К2.2 Екстракція сировини Батарея екстракторів Р-7а-Р-7в

ТП2.3 К 2.3 Пресування Прес Ф-13

Осад у відвал ТП2.4 К2.4 Відстоювання Реактор Р-8

ТП2.5 К2.5 Фільтрація Нутч-фільтр Ф-9

ТП3 Одержання готового продукту ТП3.1 К3.1 Упарювання екстракту Вакуум-випарний апарат З-10

Втрати

Спирт відгін на ТП2

ПМВ4 К4.1 Фасування, пакування і маркування густого екстракту Автоматична лінія фасовки ГФ-18-ГФ-22

Втрати

Склад готової продукції

ПВ5 К5.1 Регенерація екстрагенту Екстрактори Р-7а-Р-7в

Спирт відгін на ТП2

Шрот у відвал

Рис. 3. Блок-схема технологічного процесу виробництва густого екстракту листя горіху грецького

За органолептичними властивостями ГЕЛГГ являє собою густу однорідну масу без зайвих включень від бурого до темно-бурого кольору, що зумовлено різним вмістом поліфенольних сполук у досліджуваних серіях ГЕЛГГ, має слабкий приємний, бальзамічний запах листя горіху грецького.

За даними хімічних досліджень густий екстракт листя горіху грецького містить речовини поліфенольної структури: флавоноїди та дубильні речовини. Результати визначення загальних показників густого екстракту листя горіху грецького наведені в табл. 7.

Таблиця 7

Органолептичні і фізико-хімічні показники

густого екстракту листя горіху грецького

Найменування показника Од. виміру Характеристика препарату

Зовнішній вигляд В'язка маса з характерним бальзамічним запахом горіху грецького однорідної густої консистенції

Колір Від бурого до темно-бурого

Смак Специфічний, без стороннього присмаку

Масова частка вологи % 15,74±0,2

Масова частка важких металів % 0,0076±0,0002

Примітка. Кількість проведених вимірювань n=5, задана довірча імовірність Р=95%.

Визначення розчинності проводили згідно ДФ України І видання, статті “Розчинність”. Одержані дані розчинності ГЕЛГГ в найбільш широко використовуваних розчинниках свідчать про його гідрофільну природу: ГЕЛГГ мало розчинний у гексані, петролейному ефірі, хлороформі (малополярні розчинники), практично нерозчинний у мінеральних та рослинних оліях; дуже легко розчинний у воді, водно-спиртових сумішах (95% і 40% спирт етиловий), ацетоні (полярні розчинники), помірно розчинний у слабких розчинах лугів та кислот, що має важливе технологічне значення.

Грунтуючись на одержаних даних, при наступних дослідженнях використовували водні та спиртові розчини густого екстракту.

Наявність в препараті поліфенольних сполук підтверджували груповими якісними реакціями та ідентифікували флавоноїди в індивідуальному стані сполук за допомогою хроматографії в тонкому шарі сорбенту.

На хроматограмах під час перегляду їх в УФ-світлі спостерігались чітко розподілені плями: жовта – гіперозиду (Rf=0,4±0,03), жовто-блакитна – кверцетину (Rf=0,7±0,03), зеленувато-блакитна – кемпферолу (Rf=0,8±0,03). Типова хроматограма наведена на рис. 4.

Рис. 4. Типова хроматограма: досліджуваного розчину препарату (1), гіперозиду (2), кверцетину (3) та кемпферолу (4) в системі етилацетат-кислота оцтова льодяна-96% спирт етиловий-вода (80:2:2:1).

З метою контролю якості густого екстракту було визначено кількісні показники вмісту поліфенольних сполук: дубильних речовин і флавоноїдів.

Кількісне визначення поліфенольних сполук у густому екстракті листя горіху грецького проводили методом спектрофотометрії в УФ-області при довжині хвилі 266 нм в перерахунку на величину питомого показника поглинання галової кислоти (540), вибраної нами в якості стандарту. Наявність в спектрі розчину препарату аналогічного максимуму дозволяє проводити дане визначення. Проведені дослідження вказують на вміст у складі ГЕЛГГ поліфенольних сполук в межах 12,89-17,36%.

Для кількісного визначення дубильних речовин у густому екстракті листя горіху грецького використали перманганатометричний метод. Результати досліджень свідчать, що вміст дубильних речовин в густому екстракті листя горіху грецького знаходиться в межах 8,87-10,56 %. Мінімальний вміст дубильних речовин в перерахунку на танін повинен бути не меншим 7 %, що відображено нами при створенні проекту аналітичної нормативної документації (АНД).

Визначення суми флавоноїдів у складі препарату проводили методом диференційної спектрофотометрії, який грунтується на властивості флавоноїдів утворювати забарвлений і флуоресцюючий комплекс з хлоридом алюмінію (ІІІ) при 412 нм. Розрахунки кількісного вмісту флавоноїдів проводили з використанням величини питомого показника поглинання комплексу гіперозиду з розчином алюмінію хлориду, що чисельно становить 330.

Результати досліджень свідчать, що вміст суми флавоноїдів в густому екстракті листя горіху грецького знаходиться в межах 4,38-4,81 %. Мінімальний вміст флавоноїдів в перерахунку на гіперозид повинен бути не меншим за 3,5 %, що відображено у проекті АНД на густий екстракт.

При порівнянні результатів кількісного аналізу ГЕЛГГ ми дійшли висновку, що визначення суми поліфенольних сполук дає не досить точний результат (14, 18±1,4%), не охоплюючи повністю усі наявні в засобі речовини, тоді як паралельне визначення флавоноїдів і дубильних речовин дає більш точний результат (14,42±1,02). Це дозволило нам при розробці аналітичної нормативної документації на ГЕЛГГ запропонувати стандартизацію препарату лише за кількісним вмістом дубильних речовин і флавоноїдів і внести дані методики до проекту АНД.

Точність і відтворюваність розроблених методик були визначені на дослідних зразках ГЕЛГГ. Технологія ГЕЛГГ та методики кількісного визначення дубильних речовин і флавоноїдів були апробовані на ВАТ “ФФ “Здоров?я” при аналізі густого екстракту листя горіху грецького промислового виготовлення. Отримані результати визначення свідчать про достатню точність і відтворюваність запропонованих методик.

При встановленні терміну придатності і стабільності в процесі зберігання в банках з оранжевого скла при кімнатній температурі (15-25оС) та в прохолодному місці (8-15оС) встановлено, що препарат протягом двох років не змінює основних показників якості.

Вивчення мікробіологічної забрудненості густого екстракту листя горіху грецького проводили на базі кафедри мікробіології НФАУ під керівництвом професора І.Л.Дикого. Результати контролю мікробної контамінації густого екстракту листя горіху грецького наведені в табл. 8.

Таблиця 8

Мікробіологічна чистота густого екстракту листя горіху грецького

Зразок Кількість посівного матеріалу Загальна кількість мікроорганізмів в 1 г препарату Наявність бактерій родини

бактерій грибів Enterobacteriaceae S. aureus P. aeru-ginosa

серія 1 серія 2 серія 3 5г 5г 5г до5 до20 до40 до90 до20 до15 відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні відсутні

Вивчення біологічних властивостей ГЕЛГГ

Вивчення впливу ГЕЛГГ на перебіг експериментальної виразки шлунка у тварин було проведено на моделях стресової експериментальної виразки та виразки, викликаної оцтовою кислотою.

Результати досліджень, наведені в табл. 9, свідчать, що на обох моделях густий екстракт листя горіху грецького виявив виражений противиразковий ефект у дозі 1 мг/кг, маючи практично однакову активність, а іноді навіть переважаючи препарат порівняння плантаглюцид.

Таблиця 9

Противиразкова активність ГЕЛГГ на моделі

стресової виразки у щурів

Умови досліду Доза Кількість тварин у групі Стан слизової шлунка

С, кількість виразок % тварин з виразками виразко-вий індекс

контроль не ліковані тварини ГЕЛГГ ГЕЛГГ Плантаглюцид - - 1 мг/кг 5 мг/кг 500 мг/кг 5 5 5 5 5 - 23,5±3,5 11,3±2,8* 13,1±3,8* 14,5±3,6* - 100,0 48,0 55,7 61,7 - 1,19 0,56 0,65 0,72

Примітка: Р>0,05* відносно контролю

Встановлені також протизапальні, антиоксидантні, антимікробні, ранозагоюючі властивості густого екстракту листя горіху грецького.

Експериментально було доведено нешкідливість засобу, вивчено гостру та хронічну токсичність.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. Теоретично доведено доцільність створення лікарського засобу на основі листя горіху грецького – густого екстракту.

2. Вивчено технологічні параметри листя горіху грецького: вміст загальної золи, золи, нерозчинної у соляній кислоті, вологість. Кількісно визначено вміст екстрактивних речовин у сировині при вилученні їх різними розчинниками.

3. Встановлено залежність впливу на процес екстрагування з листя горіху грецького наступних чинників: ступеня подрібнення сировини, природи екстрагенту, співвідношення сировина-екстрагент.

4. Вивчено кінетичні закономірності процесу екстрагування 40%-ним етанолом біологічно активних речовин з листя горіху грецького. Експериментально встановлено оптимальний час екстрагування (72 години) та кількість зливів (3), одержані дані підтверджено теоретично шляхом побудови трикутної діаграми.

5. Науково обгрунтовано та розроблено технологію густого екстракту листя горіха грецького. Запропоновано метод одержання ГЕЛГГ в умовах промислового виробництва з використанням методу реперколяції в батареї екстракторів.

6. Розроблено точні і відтворювані методики якісного аналізу основних за біологічною активністю компонентів ГЕЛГГ та їх кількісного визначення: дубильних речовин в перерахунку на танін та флавоноїдів в перерахунку на гіперозид. Вивчено стабільність ГЕЛГГ у процесі зберігання.

7. Розроблено та затверджено промисловий технологічний регламент на виробництво ГЕЛГГ, який апробовано в умовах виробництва на ВАТ “ФФ “Здоров'я”.

8. Проведено доклінічне вивчення фармакологічних властивостей густого екстракту листя горіху грецького. Встановлено виражену протизапальну, репаративну, противиразкову та антиоксидантну дію препарату. Фармакологічними дослідженнями на лабораторних тваринах доведено, що ГЕЛГГ є практично не токсичним фітозасобом. Це дає підстави рекомендувати його до подальшого вивчення у клінічних умовах у якості лікарського засобу для лікування виразкових уражень ШКТ.

9. За результатами проведених досліджень розроблена аналітична нормативна документація, яка підготовлена до подання до Державного Фармакологічного центру МОЗ України. Фрагменти роботи впроваджено до навчального процесу ряду вищих навчальних фармацевтичних закладів ІІІ-ІV рівнів акредитації, що підтверджено відповідними актами впровадження

Тема дисертації відображена в публікаціях:

1. Малоштан Л.М., Башура О.Г., Ковальова Т.М. Дослідження специфічної активності густого екстракту листя горіху грецького // Клінічна фармація. – 2001. – Т. 5, №3. – С. 71-74. (особистий внесок – проведено узагальнення даних фармакологічних досліджень).

2. Вивчення і стандартизація густого екстракту листя горіху грецького / Т.М.Ковальова, О.Г.Башура, Н.П.Кісельова, Л.М.Бабкова, І.О.Журавель // Фізіологічно активні речовини. – 2002. – №1. – С. 57-60. (особистий внесок – розробка методів стандартизації густого екстракту листя горіху грецького).

3. Дослідження деяких умов екстрагування біологічно активних речовин при одержанні густого екстракту листя горіху грецького / Т.М.Ковальова, О.Г.Башура, Є.В.Гладух, Н.П.Половко // Фармаком. – 2002. – №1. – С. 58-61. (особистий внесок – проведено дослідження процесу екстрагування з листя горіху грецького).

4. Башура О.Г., Ковальова Т.М. Розробка противиразкового препарату з листя горіху грецького // Мат-ли Всеукр. наук. практ. конф. “Вчені України – вітчизняній фармації”. – Х.: Вид-во НФАУ. – 2000. – С. 54-55. (особистий внесок – проведено огляд літератури лікарських препаратів, які застосовуються в терапії виразкової хвороби).

5. Ковальова Т.М. Кількісне визначення поліфенольних сполук в густому екстракті листя горіху грецького // Мат-ли наукової конференції молодих вчених та студентів. – Х.: Вид-во НФАУ. – 2001. – С. 207. (особистий внесок – проведено кількісний аналіз діючих речовин в густому екстракті).

Ковалева Т.Н. Разработка технологии и исследование противоязвенного средства – густого экстракта листа ореха грецкого. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2002.

В диссертации дано научное обоснование оптимальной технологии получения противоязвенного средства на основе лекарственного растительного сырья – листа ореха грецкого, а также изучены его физико-химические, технологические и фармакологические свойства, стабильность в процессе хранения.

Изучено влияние на процесс получения средства различных технологических факторов: степени измельчения сырья, природы экстрагента, соотношения сырье-экстрагент, длительности настаивания. На основании результатов эксперимента выбраны оптимальные условия экстрагирования и метод промышленного производства густого экстракта листа ореха грецкого. Для подтверждения полученных результатов была построена и описана модель треугольной диаграммы состояния системы твердое тело-жидкость (лист ореха грецкого-спирт этиловый 40%), из которой следует, что рациональное количество доброкачественных сливов составляет 3, а соотношение сырья и экстрагента 1:10.

Процесс получения предложенного средства апробирован следующими методами: дробной мацерации, реперколяции и вакуум-фильтрационной экстракции с предварительным вальцеванием сырья. Результаты исследований показали, что наиболее оптимальным для промышленного производства фитосредства является метод реперколяции. Доказана экономическая целесообразность и перспективность внедрения метода вакуум-фильтрационной экстракции для производства густого экстракта листа ореха грецкого.

Предложены рациональная технологическая и аппаратурная схемы производства густого экстракта листа ореха грецкого.

Разработан регламент на получение средства, который апробирован в условиях промышленного производства.

Разработаны методики качественного и количественного контроля качества густого экстракта, которые вошли в проект АНД. Доказана целесообразность стандартизации густого экстракта по количественному содержанию дубильных веществ в пересчете на танин и флавоноидов в пересчете на гиперозид.

Фармакологическими исследованиями доказана выраженная противоязвенная, антимикробная, ранозаживляющая, антиоксидантная активность густого экстракта, что дает возможность использовать его для лечения и профилактики воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта и язвенной болезни.

Изучены острая и хроническая токсичность средства. Доказано, что густой экстракт листа ореха грецкого относится к группе нетоксичных препаратов и при длительном введении не вызывает изменений органов и систем организма.

Установлено, что препарат стабилен в течение двух лет при хранении в сухом прохладном, защищенном от света месте в банках из оранжевого стекла.

На препарат разработана нормативно-техническая документация.

Ключевые слова: язвенная болезнь, лист ореха грецкого, густой экстракт, технология.

Ковальова Т.М. Розробка технології та дослідження противиразкового засобу – густого екстракту листя горіху грецького. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.01 - технологія ліків та організація фармацевтичної справи. - Національний фармацевтичний університет , Харків, 2002.

У дисертації дано наукове обгрунтування оптимальної технології одержання противиразкового засобу на основі лікарської рослинної сировини – листя горіху грецького, а також вивчені його фізико-хімічні, технологічні і фармакологічні властивості, стабільність в процесі зберігання.

Вивчено вплив на процес отримання засобу різних технологічних чинників, на підставі експерименту вибрано оптимальні умови екстрагування і метод промислового виробництва густого екстракту листя горіху грецького.

На препарат розроблена нормативно-технічна документація.

Ключові слова: виразкова хвороба, листя горіху грецького, густий екстракт, технологія.

Kovalyova T.M. Elaboration of formulation and investigation of antiulcer drug – a dense extract of walnut leaves. – Manuscript.

A thesis for Master of Pharmacy Degree in speciality 15.00.01- Drug Technology and Pharmacy Business Organization. - National University of Pharmacy, Kharkov, 2002.

The paper gives the scientific substantiantion of the optimal formulation for obtaining an antiulcer drug on the basis of medicinal plant raw material – walnut leaf.

Its physical and chemical, technological and pharmacological properties and its stability while storing have been studied.

The influence of different technological factors on the process of drug obtaining has been studied, and on the grounds of the experiment the optimal extraction conditions and industrial manufacture method of a dense extract of walnut leaves have been chosen.

The normatiwe technical documentation for this drug has been worked out.

Key words: ulcerated disease, walnut leaves, a dense extract, formulation.

Підписано до друку 6.11.2002.

Формат видання 60х90 1/16

Папір для множильних апаратів

Тираж 100 примірників. Зам. № 16

ПП “Азамаєв В.Р.”

61144, м. Харків-144, вул. Героїв Праці, 17 к. 284