??????????? ???????? ???? ???????
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ
СМУТОК Олег Володимирович
УДК 579.6: 577.152.1+
СКРИНІНГ МІКРОБНИХ ПРОДУЦЕНТІВ, ОЧИСТКА ТА БІОАНАЛІТИЧНЕ ВИКОРИСТАННЯ L-ЛАКТАТ:ЦИТОХРОМ c-ОКСИДОРЕДУКТАЗИ
Hansenula polymorpha
03.00.07 – мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2007
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Гончар Михайло Васильович
Інститут біології клітини НАН України,
завідувач відділу аналітичної біотехнології.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Дзядевич Сергій Вікторович
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, провідний науковий співробітник лабораторії
біомолекулярної електроніки;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Федорович Дарія Василівна
Інститут біології клітини НАН України,
провідний науковий співробітник відділу
молекулярної генетики та біотехнології.
Захист відбудеться “14“ вересня 2007 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.
Автореферат розісланий “10“ серпня 2007 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Молочна кислота – універсальний метаболіт живих організмів, кінцевий продукт утилізації цукрів у молочнокислих бактерій та важливий компонент багатьох харчових продуктів, вихідна сировина для синтезу біодеградабельного полімеру - полілактату.
Визначення вмісту лактату має важливе значення у клінічній діагностиці, бродильному виробництві та контролі якості харчових продуктів. Рівень молочної кислоти у крові служить важливим клініко-діагностичним індикатором гіпоксії, молочнокислого ацидозу, шокового стану, гострого інфаркту міокарду і має значне прогностичне значення в реанімаційній терапії. Моніторинг рівня цього метаболіту в крові спортсменів є важливим засобом контролю за тренувальним процесом і використовується для оцінки ефективності відповідних тренажерів та тренувальних режимів.
Засвоєння молочної кислоти пекарськими дріжджами Saccharomyces cerevisiae здійснюється через селективне окислення L- і D- лактату, яке каталізується мітохондріальною L-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.3; флавоцитохром b2, ФЦ b2) і D-лактат:ферицитохром с-оксидоредуктазою (КФ 1.1.2.4). Ці білки кодуються генами CYB2 і DLD1, відповідно. Фермент, отриманий із S. cerevisiae та Hansenula anomala, - гомотетрамер, кожна субодиниця якого містить по одній молекулі флавінмононуклеотиду і протогему ІХ. Флавоцитохром b2 завдяки своїм унікальним каталітичним властивостям (абсолютна специфічність до L-лактату, відсутність у потребі екзогенного кофактора) може мати важливе біоаналітичне значення, оскільки може замінити NAD+-залежну лактатдегідрогеназу (ЛДГ) м’язів ссавців або бактерійну лактатоксидазу (ЛО) при визначенні вмісту L-лактату в біологічних рідинах та харчових продуктах за допомогою ензиматичних та біосенсорних підходів. Широке використання ФЦ b2 із S. cerevisiae у біоаналітиці гальмується високою лабільністю фермента та складністю процедури його виділення. З огляду на це, скринінг дріжджів - потенційних продуцентів стабільних форм ФЦ b2 є дуже актуальним.
Дана дисертаційна робота є результатом досліджень, проведених автором на базі Інституту біології клітини НАН України, в якому одним із напрямків досліджень є розробка нових ензиматичних та біосенсорних підходів для аналізу вмісту деяких практично важливих аналітів у біологічних рідинах, бродильних культурах та харчових продуктах.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі аналітичної біотехнології Інституту біології клітини НАН України. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу і виконувалась у рамках бюджетних тем: “Біотехнологічне отримання та функціональна характеристика білків, важливих для діагностики та лікування“ (№ держреєстрації 0102U000614), “Створення нових біоаналітичних систем на основі оксидоредуктаз” (№ держреєстрації 0106U002598) та проекту “Конструювання ферментних елементів біосенсорів на основі оксидоредуктаз для контролю вмісту лактату і етанолу в біологічних рідинах та бродильних культурах” (№ держреєстрації 0103U004741) комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження в галузі сенсорних систем та технологій”.
Робота виконувалась також у рамках міжнародного наукового гранту INTAS FOOD CALL 00-0715 “Novel technology for fermentation process monitoring and quality control of alcoholic beverages based on enzyme еlectrodes and kits” та міжнародних індивідуальних проектів: INTAS for Young Scientists OPEN CALL 2005 Nr. 05-109-5207 “Construction of flavocytochrome b2-overproducing strain by the use of CYB2 gene-containing expression cassette, bioanalytical application of the recombinant enzyme as a bioselective element of an analytical kit and amperometric sensor”; FEMS-2006 (І) “Application of cells of methylotrophic yeast Halsenua polymorpha and enzyme from this source for development of new L-lactate selective bioanalytical approaches” та West-Ukrainian BioMedical Research Center (WUBMRC-2006) “Development of a novel L-lactate selective enzymatic kit based on flavocytochrome b2 from methylotrophic yeast Hanlsenua polymorpha and its biomedical testing”.
Мета та завдання роботи. Метою роботи був пошук мікробних продуцентів стабільної форми ФЦ b2 та створення на основі цього ферменту нових ензиматичних і біосенсорних методів аналізу L-лактату.
Для виконання роботи необхідно було вирішити такі завдання:
· провести скринінг різних видів та штамів дріжджів за підвищеним синтезом та стабільністю ФЦ b2;
· дослідити механізми регуляції синтезу ФЦ b2 у найперспективнішого продуцента стабільного ферменту;
· оптимізувати умови культивування дріжджів з метою підвищення рівня синтезу ФЦ b2;
· розробити оптимальну схему виділення та очистки ФЦ b2 з клітин відібраного продуцента;
· отримати в препаративних кількостях високоочищений препарат ФЦ b2 H. polymorpha та провести його фізико-хімічну характеристику;
· розробити L-лактат-селективні амперометричні біосенсори з використанням вільнодифундуючих медіаторів та синтетичних осмій-вмісних редокс-полімерів;
· розробити новий ензиматичний підхід аналізу L-лактату з використанням ФЦ b2 H. polymorpha;
· порівняти аналітичні параметри розроблених методів аналізу та апробувати їх на модельних та реальних зразках.
Об’єктом дослідження був пошук продуцента термостабільної форми ФЦ b2 H. polymorpha, виділення і очистка ферменту та дослідження його фізико-хімічних характеристик.
Предметом дослідження було вивчення регуляції синтезу ФЦ b2 H. polymorpha та створення на його основі нових ензиматичних та біосенсорних аналітичних підходів визначення вмісту L-лактату.
Методи дослідження: спектрофотометричний аналіз активності фермента, нативний та денатуруючий електрофорез білків, йонообмінна хроматографія, фізико-хімічні методи аналізу ферментів, циклічна вольтамметрія, амперометрія, ензиматичний та біосенсорний аналіз, статистичний і кореляційний аналіз.
Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено новий метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофоретичного розділення білків. Проведено скринінг різних видів та штамів дріжджів - потенційних продуцентів стабільного ФЦ b2 та відібрано штам H. polymorpha 356 як найперспективніший. Досліджено особливості регуляції синтезу та деякі фізико-хімічні характеристики ФЦ b2 клітин H. рolymorpha.. Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату ФЦ b2 з клітин цього виду дріжджів.
Розроблено лабораторні прототипи амперометричних біосенсорів на основі високоочищеного препарату ФЦ b2 H. polymorpha з використанням вільнопроникаючих медіаторів та осмій-вмісного полімерного медіатора. Досліджено аналітичні характеристики біосенсорів. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату з використанням флавоцитохрому b2 H. polymorpha.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофорезу значно полегшує процедуру скринінгу мікробних продуцентів ферменту та контроль його хроматографічної очистки і може бути використаний в інших наукових дослідженнях, пов’язаних із ФЦ b2. Ензиматично-фотометричний метод аналізу та амперометричні біосенсори використано для кількісного визначення L-лактату в реальних зразках вин. Висока селективність і простота визначення запропонованими підходами значно полегшують процедуру аналізу L-лактату і можуть замінити використовувані у практиці низькоселективні хімічні та дорогі ензиматичні методи на основі NAD+-залежної ЛДГ та ЛО.
Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано здобувачем самостійно. Розроблено новий метод візуалізації ферментативної активності ФЦ b2 в ПААГ після нативного електрофоретичного розділення білків. Проведено скринінг різних видів та штамів дріжджів - потенційних продуцентів стабільного ФЦ b2. Досліджено особливості регуляції синтезу ФЦ b2 Hansenula polymorpha. Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату ФЦ b2 з клітин цього виду дріжджів (у співпраці із канд. хім. наук Гайдою Г.З.). Вивчено деякі фізико-хімічні характеристики ФЦ b2 клітин H. рolymorpha. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату на основі ФЦ b2 та супряженого відновлення нітротетразолієвого синього (НТЗС) до формазану.
Розробка лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів для аналізу L-лактату на основі ФЦ b2 H. polymorpha та вивчення їх аналітичних характеристик проводилась в лабораторії електроаналітичної хімії та сенсорики Рурського університету (м. Бохум, Німеччина) під керівництвом професора Вольфганга Шумана (W. Shuhmann).
У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Планування, аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – д. б. н., проф. Гончаром М.В.
Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були особисто представлені дисертантом на XXI Міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Львів, Україна, 2001), IV Міжнародній Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (Вроцлав, Польща, 2002), ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, Польща, 2003), конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, Україна, 2003), V Міжнародній Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling” (Київ, Україна, 2005), І Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2005), ІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2006), XVII науковій сесії наукового товариства ім. Шевченка (Львів, Україна, 2006), Українському біохімічному з'їзді (Харків, Україна, 2006), наукових конференціях молодих вчених Інституту біології клітини НАН України (Львів, Україна, 2002 – 2006 рр.).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 31 наукову працю, включаючи 5 статей у фахових виданнях (4 - у закордонних та 1 – у вітчизняному виданні), 26 тез доповідей на міжнародних та всеукраїнських наукових конференціях.
Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, аналіз і обговорення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 140 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 54 рисунками та 2 таблицями. Список літератури охоплює 167 найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді літератури аналізуються сучасні уявлення про таксономічне положення метилотрофних дріжджів, хімізм та ензимологію метаболізму лактату у досліджених видів дріжджів. Особлива увага приділена ензимологічній характеристиці та генетичній регуляції синтезу домінантного ферменту метаболізму лактату у дріжджів – флавоцитохрому b2. Проведено аналіз літератури та порівняно основні характеристики різних методів визначення вмісту лактату (хімічні, ензиматичні та біосенсорні), зокрема, із використанням м’язевої NAD-залежної лактатдегідрогенази та бактерійної лактатоксидази.
Матеріали та методи дослідження. У роботi використовували наступні штами дріжджів із колекції Інституту біології клітини НАН України: Candida boidinii T2A; Hansenula polymorpha 356 лінії DL1; Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 catX) – безкаталазний мутант метилотрофних дріжджів з порушеною катаболітною репресією; Saccharomyces cerevisiae S-288С; Pichia guilliermondii АТСС 9058; штами термотолерантних дріжджів Saccharomyces cerevisiae IZR-42, Saccharomyces cerevisiae IZR-106, виділені із Еволюційних Каньйонів, передані професором Eviator Nevo (Institute of Evolution, University of Haifa, Ізраїль); штами, отримані із ВКМ: Hansenula anomala Y-155; Kluyveromyces lactis Y-762; Kluyveromyces thermotolerans Y-894; Pichia fermentas Y-1375; Rhodotorula pilimanae Y-1977; Yarrowia lipolytica Y-917; штам із колекції кафедри мікробіології ЛНУ ім. І.Франка (Львів, Україна): Schizosaccharomyces pombe D-9-S.
Дріжджі вирощували до середини логарифмічної або стаціонарної фази росту (в залежності від експерименту) в колбах Ерленмейера на круговому шейкері (240 об./хв) при 30 0С в середовищі Беркгольдера - СБ [Шавловский та ін., 1978] наступного складу (г/л): КН2РО4 – (0,5 – 1); (NH4)2SO4 – (3 – 3,5); MgSO47H2O – (0,2 - 0,5); CaCl2 – 0,1; сіль Мора – 0,2 мг/л. До СБ додавали дріжджовий екстракт "Дiфко" до 0,075 %. В залежності від мети експерименту, використовувались різні джерела вуглецю та енергії: глюкоза (Glc); L-лактат натрію (Lact), етанол (EtOH), гліцерол (GlОН) чи їх суміші в різних співвідношеннях. Безклітинні екстракти для визначення активності ферментів отримували як описано в роботі [Смуток та ін., 2006].
Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали методом Лоурі [Lowry et al., 1951]. Калібрувальним стандартом служив альбумін сироватки бика. Визначення активностi флавоцитохрому b2 проводили за [Appleby et al., 1959, Appleby et al., 1960]. Визначення вмісту лактату в культуральному середовищі ензиматичним методом проводили за [Schon et al., 1965]. Проведення нативного електрофорезу та виявлення білкових зон в ПААГ здійснювали за [Ornstein et al., 1964]. SDS-електрофорез вели за [Laemmly, 1970]. Проявлення зон лактатдегідрогеназної активності ФЦ b2 проводили при інкубації ПААГ протягом 15–20 хв при кімнатній температурі, у відсутності прямих сонячних променів із сумішшю наступного складу: 0,1 М L-лактат натрію; 1 мМ К3Fe(CN)6; 1 мМ EDTA; 25 мМ тріс-гліциновий буфер, рН 8,0. Остаточне проявлення гелів проводили протягом 10 хв у 10 мМ розчині FeCl3 у 0,25 М HCl [Гайда та ін., 2003].
Виділення та очищення ФЦ b2 із клітин метилотрофних дріжджів H. polymorpha проводили за [Celerier et al., 1989]. Джерелом фермента служив штам H. polymorpha 365 лінії DL1 (дикий тип). Клітини вирощували у 0,5 л колбах при температурі 30 0С до середини стаціонарної фази росту з наступним осадженням на центрифузі К 70 D при +4 0С, 4000 об./хв. Тричі відмиті 20 мМ фосфатним буфером, рН 7,0 осади клітин відбирали і висушували. Загальна схема виділення цільового фермента включала низку послідовних стадій: Лізис клітин. Висушені клітини (20 г) лізували в присутності 12 мл бутанолу при кімнатній температурі з додаванням 100 мл буферу А: 0,1 М лактат натрію рН 6,5; 0,025 мМ ЕДТА; 1 мМ фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ). Суміш витримували 12 год при 4 0С. Отримання безклітинних екстрактів. Відстояну суміш центрифугували 30 хв при 0 0С, 4000 об./хв на центрифузі К 23, супернатант відбирали, осад повторно екстрагували. Йонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі. Безклітинні екстракти наносили на колонку (1,0 х 20 см) з ДЕАЕ– целюлозою Toyopearl 650 M (1-7-7, AKASAKA TOKYO, Японія), зрівноваженою буфером А. Колонку промивали буфером А (70 мл), пізніше 50 мл буфера Б, що містив буфер А з 0,1 М натрій-калій-фосфатом, рН 7,6. Елюцію проводили 15 % (від насичення при 0 0С) сульфатом амонію в буфері Б. Ступінь очищення цільового фермента від баластних білків характеризували, визначаючи його активність у фракціях елюатів та за допомогою електрофорезу в ПААГ у присутності SDS. Висолювання ферменту проводили додаванням до елюату сухого сульфату амонію до 70 % (від насичення при 0 0С). Стабілізований таким чином фермент зберігав свою активність протягом шести місяців при - 25 0С.
Амперометричні біосенсори конструювали у трьохелектродній конфігурації. Електродом порівняння служив срібло-хлорсрібний (Ag/AgCl/3МKCl) або насичений каломельний електрод (НКЕ), а як допоміжний використовували стержневий платиновий електрод. Застосовували різні типи робочих електродів: на основі графітового стержня (тип RW001, діаметр 3,05 мм), скловидно-карбонового стержня (діаметр 3,25 мм), платинового дроту (діаметр 1 мм). Амперометричні дослідження проводили з використанням біпотенціостату “Biometra” (EP 30, Gцttingen, Germany) або “Autolab” (PGSTAT302, Utrecht, Nederland), приєднаних до персонального комп’ютера через порт RS232. Імобілізацію фермента на поверхні робочого електроду проводили шляхом електроосадження в шарі полімерів, синтезованих в лабораторії аналітичної хімії та електросенсорики Рурського університету (м. Бохум, ФРН) [Ngounou et al., 2004].
Графічну та статичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою програм Origin 6,0 та Excel.
Результати досліджень та їх обговорення
Розробка методу візуалізації активності ФЦ b2 в ПААГ. Для полегшення процедури скринінгу продуцентів ФЦ b2 нами було розроблено новий чутливий метод виявлення активності цього фермента на електрофореграмах [Гайда та ін., 2003], який ґрунтується на взаємодії медіаторного фероціаніду, що утворюється в ході ензиматичної реакції, з йонами заліза (ІІІ) з утворенням інтенсивно забарвленої нерозчинної Берлінської блакиті:
Перевагами розробленого методу є висока чутливість виявлення фермента (у зручному режимі часу нижня межа виявлення близька до 0,003 од. активності) та стабільність забарвлення електрофореграми (Рис. 1). Порогова межа візуалізації ферменту – близько 0,1 мкг (у перерахунку на білок). Метод може використовуватись для оцінки рівня активності ФЦ b2 у безклітинних екстрактах при скринінгу продуцентів фермента, моніторингу ходу хроматографічної очистки ФЦ b2, а також в інших випадках, пов’язаних із оцінкою активності ферменту [Смуток та ін., 2006].
Рис. 1. Оцінка чутливості методу виявлення активності ФЦ b2 в ПААГ за утворенням Берлінської блакиті: (1-6) – безклітинні екстракти H. polymorpha з різними кількостями ферменту (в од. активності): (1) - 0,03, (2) - 0,015, (3) - 0,010, (4) - 0,005, (5) - 0,003, (6) - 0,001.
Скринінг видів та штамів дріжджів - продуцентів стабільної форми флавоцитохрому b2. Первинний скринінг показав, що більшість досліджених штамів дріжджів практично не ростуть на 1 % L-лактаті як єдиному джерелі вуглецю і енергії, тому для вирощування клітин використовували середовище, яке містило суміш 1 % глюкози і 0,2 % L-лактату натрію. Порівняння ростової здатності показало, що на суміші глюкози із лактатом краще ростуть клітини H. рolymorpha 356 і H. рolymorpha К-105 – до значення біомаси 6,9 ± 0,84 мг/мл, Ya. lipolytica Y-917 - 6,85 ± 0,35 мг/мл, S. сerevisiae IZR-42 - 6,40 ± 0,78 мг/мл. Найвища активність ФЦ b2 була виявлена в безклітинних екстрактах термотолерантних штамів дріжджів: S. сerevisiae IZR-106 – 0,658 ± 0,06; H. рolymorpha 356 – 0,51 ± 0,03; H. рolymorpha К-105 – 0,43 ± 0,05; S. сerevisiae IZR-42 – 0,4 ± 0,02 мкмоль·хв-1·мг-1 білку (Рис. 2). |
Рис. 2. Ріст клітин різних видів і штамів дріжджів на середовищі, що містило 1 % глюкозу і 0,2 % L-лактат (60 год), та рівні L-лактат-залежної активності ФЦ b2 і неспецифічної фериціанідредуктазної активності безклітинних екстрактів.
Для відбору можливих продуцентів стабільної форми ФЦ b2, аналіз активності ферменту у свіжоотриманих безклітинних екстрактах проводили без додавання інгібіторів протеїназ. З цією метою також використовували порівняно жорсткі для даного ферменту умови проведення нативного електрофорезу (більше шести годин при 180 В, 25 мА, без охолодження камери), із наступним проявленням зон активності ФЦ b2 на 7,5 % ПААГ-пластинках (Рис. 3).
|
Рис. 3. Скринінг стабільних форм ФЦ b2 безклітинних екстрактів різних видів і штамів дріжджів. Штами: 1 – P. guilliermondii АТСС 9058; 2 – P. fermentas Y-1375; 3 – Rh. pilimanae Y-1977; 4 – C. boidinii T2A; 5 – S. сerevisiae S-288С; 6 – S. cerevisiae IZR-42; 7 – S. cerevisiae IZR-106; 8 – Sch. pombe D-9-S; 9 - Ya. lipolytica Y-917; 10 – K. lactis Y-762; 11 – K. thermotolerants Y-894; 12 – H. anomala Y-155; 13 – H. polymorpha 356; 14 – H. polymorpha K-105.
Як видно з отриманих результатів, більшість видів дріжджів не володіють стабільними формами ФЦ b2 і лише Rh. pilimanae Y-1977, K. lactis Y-762, H. рolymorpha 356 і H. рolymorpha К-105 зберігають L-лактатоксидоредуктазну активність за вказаних вище умов. Ці штами були відібрані для більш детального вивчення термостабільності ФЦ b2. Було показано, що після прогрівання безклітинних екстрактів при 60 0С зони активності ФЦ b2 лише термотолерантних штамів H. рolymorpha 356 і H. рolymorpha К-105 не змінюють своєї електрофоретичної рухливості, що свідчить про збереження нативної структури холоферменту. Саме тому для детальних досліджень регуляції синтезу ФЦ b2 та вивчення можливості біоаналітичного використання був відібраний штам H. рolymorpha 356.
Регуляція синтезу ФЦ b2 у дріжджів H. polymorpha. При дослідженні росту клітин H. рolymorpha 356 за різних умов було використано низку середовищ, що містили як джерело вуглецю та енергії: глюкозу (Glc), лактат (Lact), етанол (EtOH), гліцерол (GlОН) або їх суміші. Середовище, що містило 1 % Glc та 0,2 % Lact, забезпечувало як хороший ріст (Рис. 4), так і індукцію синтезу ФЦ b2, зумовлену лактатом (Рис. 5). Оскільки ріст клітин на 1 % Lact як єдиному вуглецевому джерелі протікав дуже повільно, культуру дріжджів, попередньо вирощену на 1 % Glc протягом 24 год, стерильно відмивали від середовища та переносили на свіже середовище, що містило 1 % Lact. При цьому біомаса клітин підвищувалась незначно, а питома активність ФЦ b2 суттєво зростала (Рис. 4 та 5).
Рис. 4. Криві росту H. polymorpha 356 на різних джерелах вуглецю. У випадку 1 % Lact клітини попередньо вирощували на 1 % Glc з наступною інкубацією у новому середовищі. |
Рис. 5. Залежність активності ФЦ b2 від джерела вуглецю в ростовому (у випадку 1 % Lact – інкубаційного) середовищі.
Вивчення можливої репресії синтезу флавоцитохрому b2 у H. polymorpha 356 глюкозою показало, що підвищення її концентрації від 0,5 до 5 % значним чином не впливало на синтез ферменту. Для дослідження природи індукції синтезу ФЦ b2 L-лактатом, було використано інгібітор білкового синтезу – циклогексимід [Schindler et al., 1975]. Попередній аналіз інгібуючого впливу циклогексиміду на ріст клітин H. polymorpha 356 показав, що зниження росту клітин вдвічі спостерігається при концентрації інгібітора 0,1 мг/мл. |
Рис. 6. Вплив циклогексиміду (0,1 мг/мл) на синтез ФЦ b2 при інкубації клітин H. polymorpha 356 в середовищі, що містило 1 % Lact. Вказана активність ФЦ b2 в безклітинних екстрактах без внесення в культуру інгібітора (А) та в його присутності (Б).
При внесенні інгібітора в такій концентрації в середовище, що містить 1 % Lact, суттєво знижується синтез ФЦ b2 в клітинах (Рис. 6). Це свідчить про те, що індукція синтезу ФЦ b2 L-лактатом відбувається на рівні синтезу de novo (найвірогідніше, на транскрипційному рівні).
Щоб дослідити залежність питомої активності ФЦ b2 від фази росту культури дріжджів, проводилось її вимірювання в динаміці росту клітин (Рис. 7). Середовище містило 1 % Glc та 0,2 % Lact, температура – 30 0С. Як видно із профілю кривих, для H. polymorpha максимальна питома активність ФЦ b2 (0,74 мкмоль·хв-1·мг-1 білка) досягається у стаціонарній фазі росту. Для вивчення кінетики споживання глюкози та L–лактату в культурі клітин H. polymorpha, було досліджено швидкість їх утилізації в середовищі з вихідними концентраціями: 1 % Glc та 1 % Lact (Рис. 8).
Рис. 7. Залежність питомої активності ФЦ b2 від фази росту культури дріжджів H. polymorpha в середовищі, що містило 1 % Glc та 0,2 % Lact: (А) – ростова біомаса, (Б) – активність ФЦ b2. | Рис. 8. Кінетика зміни концентрацій глюкози та L-лактату в культурі H. polymorpha 356 при рості в середовищі з 1 % (56 мМ) Glc та 1 % (89 мМ) Lact.
Як видно із рис. 8, першою споживається глюкоза (фаворитний субстрат), і лише після повного її вичерпання починає засвоюватись лактат (альтернативний субстрат). При цьому спостерігається чітка діауксія, що підтверджує перехід засвоєння клітинами одного джерела вуглецю та енергії на альтернативне джерело.
Виділення та очистка ФЦ b2 із клітин H. рolymorpha. За основу оптимальної схеми препаративної очистки ФЦ b2 із клітин H. рolymorpha послужив метод, описаний для дріжджів H. anomala [Lederer et al.,1974]. Клітини дріжджів H. polymorрha 356 вирощували в колбах при 30 0С. На початку стаціонарної фази росту, клітини осаджували та двічі відмивали від компонентів середовища. Відмиті клітини ліофільно висушували та проводили їх фізичне руйнування скляними кульками Болотіні (3-5 мм), з наступним лізисом 1,2 % бутанолом. Безклітинні екстракти відокремлювали та визначали білок за Лоурі і активність ФЦ b2 [Appleby et al.,1959, Lederer et al.,1974]. Екстракти фракціонували хроматографією на йонообмінному сорбенті DЕАЕ–Toyopearl 650M (1-7-7, AKASAKA TOKYO, Японія).
Ступінь очищення цільового фермента від баластних білків характеризували, визначаючи його активність та концентрацію білка в кожній фракції елюату та за допомогою електрофорезу в ПААГ за денатуруючих умов у присутності SDS (Рис. 9). |
Рис. 9. Електрофоретична характеристика безклітинних екстрактів (1) та очищеного препарату ФЦ b2 H. polymorрha (2) після проведення SDS-електрофорезу за денатуруючих умов (12 % SDS-ПААГ, білки забарвлені Kумасі R-250).
Фракції елюату рожевого забарвлення з активністю ФЦ b2 не менш як 5 од./мл об’єднували. Вихід ферменту після хроматографічної стадії очистки близький 90 %. Найвища питома активність в окремих фракціях досягала 12 од./мг білку зі ступенем очистки 31,7 раза. До об’єднаних фракцій елюату додавали сухий сульфат амонію - до 70 % від насичення при 0 0С, підтримуючи рН близько 7,5. Безпосередньо перед використанням осад збирали центрифугуванням. Питома активність ферменту після висолювання зростала ще в 1,5 рази і складала 18 од./мг білка. Стабілізований таким чином фермент не втрачав своєї активності протягом 6 місяців зберігання при -25 0С.
Дослідження деяких фізико-хімічних характеристик очищеного ФЦ b2 H. polymorpha. Визначення молекулярної маси очищеного ФЦ b2 H. polymorрha проводили за електрофоретичною рухливістю білку в SDS-ПААГ у порівнянні із електрофоретичною рухливістю аналогічного маркеру з відомою молекулярною масою (Рис. 10).
|
Рис. 10. Електрофоретичний аналіз та визначення молекулярної маси очищеного ФЦ b2 H. polymorрha в 12 % SDS-ПААГ (білки забарвлені Kумасі R-250): 1 - препарат ФЦ b2 з питомою активністю 20 од./мг; 2 - маркери молекулярної маси.
Білкова зона очищеного ФЦ b2 має молекулярну масу близько 60 кДа (відповідно тетрамерного холоензиму - близько 240 кДа), що добре корелює із даними літератури відносно молекулярної маси ФЦ b2 із S. cerevisiae та Н. anomala.
Оцінку термостабільності препарату ФЦ b2 Н. polymorpha проводили за його термоінактивацією за підвищених температур. При цьому порівнювали динаміку інактивації нестабілізованого препарату ФЦ b2 Н. polymorpha із стабілізованим сульфатом амонію препаратом фермента S. cerevisiae. Динаміку термоінактивації ФЦ b2 простежували шляхом нативного електрофорезу прогрітих зразків ферментів та фарбуванням електрофореграми за активністю ФЦ b2 (Рис. 11).
Рис. 11. Електрофореграма препаратів ФЦ b2 (нативний електрофорез у 8 % ПААГ) після їх термічної обробки. Проявлення за ферментативною активністю. а – стабілізований ФЦ b2 S. cerevisiae, б – нестабілізований ФЦ b2 Н. polymorpha; 1-2 - 20 0С (60 хв); 3-4 - 30 0С (50 хв); 5-6 - 40 0С (20 хв); 7-8 - 50 0С (10 хв); 9-10 - 60 0С (10 хв); 11-12 - 100 0С (10 хв).
Щоб дослідити термоінактивацію стабілізованого препарату лабільного ФЦ b2 із пекарських дріжджів, фермент вносили в гель у значно більшій концентрації білку, ніж для термостабільного нестабілізованого препарату ФЦ b2 Н. polymorpha. Як видно із електрофореграми, ФЦ b2 Н. polymorpa має суттєво підвищену термостабільність.
Розробка і оптимізація біосенсорів на основі ФЦ b2 та електроосаджуваних редокс-полімерів. Для імобілізації ФЦ b2 на поверхні робочих електродів нами було відібрано електроосаджуваний [Os(Me2bpy)2Cl2]-вмісний анодний (AР59-Os) та катодний (СР9) полімери, синтезовані в лабораторії електроаналітики та біосенсорики Рурського університету (м. Бохум, ФРН). Перший полімер містить ковалентно привитий осмій-біпіридиловий комплекс, який служить в ролі медіатора, здатного каталізувати електронний перенос між ферментом та електродом. Принцип осадження анодних/катодних полімерів ґрунтується на протонуванні/депротонуванні карбоксильних/аміногруп полімеру внаслідок електролітичного анодного окислення води (при +2200 мВ - 0,2 с та 0 мВ - 5 с [Kurzawa et al., 2002, Neugebauer et al., 2003]) або її катодного відновлення (при -1200 мВ – 0,2 с та 0 мВ 5 с [Ngounou et al., 2004, Reiter et al., 2004]).
Для вивчення ефективності перенесення електронів із відновленої форми ФЦ b2 через посередництво AP59-Os на поверхню графітового електроду було проведено циклічне вольтамметричне дослідження (ЦВА) електроосадженої суміші ферменту та AP59-Os (ФЦb2-AP59-Os). На отриманій вольтаммограмі (Рис. 12) видно чітку відмінність між кривою, отриманою без внесення лактату (А) та після додавання 2 мМ L-лактату (Б). |
Рис. 12. Циклічна вольтаммограма (ЦВА) ФЦb2-AP59-Os-модифікованого графітового електроду без внесення лактату (А) та після додавання 2 мМ L-лактату (Б). Умови проведення ЦВА: потенціал від 0 до 0,5 В проти НКЕ, швидкість сканування 5 мВ/с в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,6.
Отримані результати свідчать про електрохімічне супряження реакції окислення L-лактату із анодним окисленням осмієвого комплексу в системі ФЦb2-AP59-Os. Таким чином, окислення L-лактату за каталізу ФЦ b2 супроводжується ефективним відновленням осмієвого комплексу (Os3+> Os2+) у складі анодного полімеру і завершується термінальним окисленням осмієвого медіатора (Os2+> Os3+) на поверхні робочого електроду. При цьому максимальне значення піку окислення (0,5 мкА) припадає на потенціал +250 мВ (проти каломельного електроду), і саме цей потенціал було вибрано нами як робочий у подальших дослідженнях.
Детальний аналіз різних схем приготування біочутливої мембрани показав, що електроосадження ФЦ b2 із максимальним збереженням активності досягається при двоетапному осадженні полімерів: на поверхню робочого електроду спершу проводили анодне електроосадження AP59-Os, який виконував функцію медіатора, поверх якого здійснювали наступне катодне електроосадження суміші ФЦ b2 та CP9, який забезпечував іммобілізацію фермента. Внаслідок такої поетапної схеми електроосадження формувалась двошарова архітектура біоселективного шару.
Біоаналітична характеристика ФЦ b2-модифікованих електродів. Нами досліджено типовий відгук ФЦ b2-модифікованих електродів на L-лактат. Максимальний відгук для електродів із двошаровою архітектурою (AP9-Os-ФЦb2-CP59) спостерігався близько 1100 нА, а для одношарової архітектури (AP9-Os-ФЦb2) - 650 нА (Рис. 13).
|
Рис. 13. Динаміка розвитку відгуку біосенсора на L-лактат для AP9-Os-ФЦb2-модифікованого електроду (a) та електроду із двошаровою структурою (AP9-Os-ФЦb2-CP59) (б). Стрілками відмічено поступові внесення аліквот аналіту.
Позірні величини константи Міхаеліса-Ментен (KM) для L-лактату обраховано із концентраційних залежностей відгуку обидвох типів ФЦ b2-модифікованих електродів: для AP9-Os-ФЦb2 та двошарової структури складали 0,132±0,004 мM і 0,121±0,003 мM, відповідно. 95 % відгуку біосенсора досягалось за 1 хв після внесення L-лактату.
Рівень селективності сенсора оцінювали у відносних одиницях (%), відповідно до величини відгуку на L-лактат, прийняту за 100 %. Жодної перехресної селективності до L-малату, пірувату, L,D-ізоцитрату та ацетату у ФЦ b2-модифікованих електродів не спостерігалось. Проте D-лактат викликав незначний відгук (1,8 ± 0,3 %), який, можливо, викликаний слідовими домішками D-лактатдегідрогенази в отриманому препараті ФЦ b2.
Для вивчення стабільності, сенсори з архітектурою AP9-Os-ФЦb2 та зі двошаровою архітектурою (AP9-Os-ФЦb2-CP59) тестувались при 24 0C на автоматичному аналізаторі інжекційного типу “OLGA” (від англ. on-line general analyzer), розробленому в лабораторії проф. В. Шумана (Рурський університет, ФРН) (Рис. 14).
|
Рис. 14. Операційна стабільність L-лактатного біосенсора, інтегрованого в аналізатор “OLGA”, з AP59-Os-ФЦb2-архітектурою (а) та двошаровою структурою (б) (швидкість протоку 5 мл/хв; збір даних кожні 2 хв).
Надійність та можливість практичного використання сконструйованого біосенсора вивчали на реальних зразках вин, виготовлених науково-виробничим об’єднанням “Маґарач”, методом “повторного додавання стандарту”. Концентрацію L-лактату в зразках було визначено шляхом екстраполяції до точки „нульового додавання” стандарту.
Розробка нового ензиматично-фотометричного методу кількісного аналізу L-лактату на основі ФЦ b2. Метод грунтується на ферментативному окисленні L-лактату до пірувату з відновленням ФЦ b2. Останній окислюється медіатором, з наступним перенесенням електронів на
нітротетразолієвий синій. Нітротетразолієвий синій відновлюється до формазану і реакційна суміш набуває стабільного кольорового забарвлення. Залежно від концентрації L-лактату забарвлення може варіювати від рожевуватого до насиченого вишневого. Діапазон лінійності розробленого методу представлено на Рис. 15. |
Рис. 15. Діапазон лінійності розробленого методу. Умови проведення реакції: 20-40 хв; 25 0С. Концентрація ФЦ b2 в кінцевій суміші - 0,02 од./мл.
Розроблений метод було апробовано на реальних зразках вин, наданих науково-виробничим об’єднанням „Маґарач” (Крим): “Кабeрне-Совіньйон” (сухе червоне), “Шардоне” (сухе біле), “Херес” (кріплене біле). Дослідження проводили в декількох повторах при різних розведеннях зразків. Результати визначення вмісту L-лактату в реальних зразках вин порівнювались із контрольними методами: поєднанням йонообмінної хроматографії і колориметричного аналізу (ЙОХ +КА) та біосенсорним підходом (Табл. 1).
Таблиця 1
Порівняння результатів визначення вмісту L-лактату кількома методами
Зразок вина Метод | Метод
ЙОХ + КА, г/л | Розроблений біосенсорний метод, г/л | Розроблений ензиматично-фотометричний метод, г/л
“Кабарне-Совіньйон” (сухе червоне) | 2,5 ± 0,2 | 2,4 ± 0,28 | 2,15 ± 0,13
“Шардоне” (сухе біле) | 3,0 ± 0,2 | 1,16 ± 0,11 | 0,97 ± 0,12
“Херес” (кріплене біле) | 1,1 ± 0,2 | 0,58 ± 0,05 | 0,49 ± 0,04
Розбіжність між результатами, отриманими за допомогою створеним нами методом та методом, прийнятим у промисловій практиці, можна пояснити низькою селективністю останнього (він не є достатньо селективним і дає позитивний відгук на інші гідрокси- і кетокислоти – при низькій роздільній здатності ЙОХ).
Встановлено надійний кореляційний зв’язок результатів визначення L-лактату ензиматично-фотометричним та біосенсорним методами (R = 0,999) (Рис. 16).
|
Рис. 16. Кореляційний зв’язок результатів визначення L-лактату ензиматично-фотометричним та біосенсорним методами.
ВИСНОВКИ
У результаті експериментальних досліджень проведено скринінг дріжджових продуцентів флавоцитохрому b2, виділено та охарактеризовано фермент із клітин найперспективнішого продуцента, встановлено деякі його фізико-хімічні властивості, створено нові ензиматичні та біосенсорні аналітичні підходи визначення L-лактату з використанням цього ферменту.
Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках:
1. Розроблено новий метод виявлення активності флавоцитохрому b2 на електрофореграмах, який ґрунтується на взаємодії фероціаніду, що утворюється в ході L-лактат-залежної ензиматичної реакції, з йонами заліза (III) з утворенням інтенсивно забарвленої нерозчинної Берлінської блакиті.
2. Проведено скринінг низки видів та штамів дріжджів за здатністю до синтезу стабільного флавоцитохрому b2, відібрано кращий продуцент ферменту – Hansenula роlymorpha 356.
3. Показано, що метилотрофні дріжджі H. роlymorpha, нездатні до росту на лактаті як єдиному джерелі вуглецю та енергії, мають високий рівень активності флавоцитохрому b2 (до 0,7 мкмоль·хв-1 на 1 мг білку безклітинного екстракту). Синтез фермента мало залежить від природи вуглецевого субстрату (глюкоза, етанол, гліцерол), проте індукується L-лактатом і підвищенням інтенсивності аерації. При вирощуванні H. роlymorpha у середовищі з глюкозою та лактатом спостерігається діауксія, причому, лактат засвоюється після вичерпання глюкози.
4. Оптимізовано умови культивування клітин H. роlymorpha - продуцента флавоцитохрому b2, розроблено просту та ефективну схему очистки цільового ферменту. Показано, що фермент із H. роlymorpha володіє підвищеною термостабільністю у порівнянні з аналогічним білком пекарських дріжджів. Отримано очищений препарат флавоцитохрому b2 з питомою активністю
12 мкмольхв-1мг-1 білка, придатний для біоаналітичних цілей.
5. Проведено дослідження деяких фізико-хімічних властивостей флавоцитохрому b2: молекулярної маси субодиниці (60 кДа), спектрів поглинання та його термостабільності.
6. На основі термостабільного флавоцитохрому b2 H. роlymorpha сконструйовано амперометричні біосенсори для кількісного визначення L-лактату. Завдяки використанню двоетапної схеми електроосадження ферменту і опосередкування електронного перенесення через осмій-вмісний редокс-полімер, біосенсори характеризуються високою селективністю та чутливістю до L-лактату, хорошою операційною стабільністю.
7. Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату з використанням флавоцитохрому b2 H. polymorpha. Проведено скринінг електронних медіаторів та хромогенних систем, оптимізовано умови протікання реакції та визначено діапазон лінійності методу (0,02 - 0,15 мM L-лактату).
8. Запропоновані аналітичні методи на основі флавоцитохрому b2 апробовано на реальних зразках вин. Порівняльний аналіз різних підходів визначення L-лактату виявив високий рівень кореляції між ензиматичним та біосенсорним методами (R = 0,99).
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Гайда Г.3., Стельмащук С.Я., Смуток О.В., Гончар М.В. Новый метод обнаружения ферментативной активности флавоцитохрома b2 на электрофореграммах // Прикл. биохим. и микробиол. – 2003. – Т. 39, № 2. - С. 249-252. (Дисертант брав участь у розробці методу та проводив деякі електрофоретичні дослідження).
2. Smutok O., Gayda G., Gonchar M., Schuhmann W. A novel L-lactate-selective biosensor based on the use of flavocytochrome b2 from methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Biosens. Bioelectron. – 2005. - V. 20. – P. 1285-1290. (Дисертант розробив та дослідив основні характеристики L-лактат селективного біосенсора на основі флавоцитохрому b2).
3. Смуток О.В., Осьмак Г.С., Гайда Г.З., Гончар М.В. Скрининг дрожжей – продуцентов стабильной формы L-лактат-цитохром с-оксидоредуктазы и исследование регуляции ее синтеза // Микробиология. – 2006. – Т. 75, № 1. – С. 29-34. (Дисертант провів скринінг низки дріжджів за здатністю підвищеної стабільності флавоцитохрому b2 та дослідив регуляцію синтезу ферменту).
4. Smutok O., Ngounou B., Pavlishko H., Gayda G., Gonchar M., Schuhmann W. A reagentless bienzyme amperometric biosensor based alcohol oxidase/peroxidase and an Os-complex modified electrodeposition paint // Sensors and Actuators B. – 2006. – 113, N 2. – P. 590-598. (Дисертант розробив оптимальну архітектуру біосенсора із використанням осмій-вмісних електроосаджуваних
