НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
УДК 616.017.1:616-089.843
ЛУНЬОВА ГАННА ГЕННАДІЇВНА
РОЛЬ Т-ХЕЛПЕРНОЇ ЛАНКИ ІМУНІТЕТУ
В РЕАКЦІЇ ВІДТОРГНЕННЯ АЛОГЕННОГО
ТРАНСПЛАНТАТА НИРКИ ЛЮДИНИ
14.03.08 - імунологія та алергологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
Київ – 2003
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано в Інституті урології АМН України
Наукові консультанти: доктор медичних наук, професор Драннік Георгій Миколайович, завідувач лабораторією імунології Інституту урології АМН України
доктор медичних наук, професор Баран Євген Якович, завідувач відділом трансплантації нирки Інституту хірургії та трансплантології АМН України
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Лісяний Микола Іванович, завідувач відділу нейроімунології Інституту нейрохірургії АМН України
доктор медичних наук Базика Димитрій Анатолійович, заступник генерального директора з наукової роботи Наукового центру радіаційної медицини АМН України
доктор медичних наук Самбур Марина Борисівна, головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та імунології Інституту отоларингології ім.О.С.Коломійченка АМН України
Провідна установа: Інститут фтизіатрії і пульмонології ім.Ф.Г.Яновського АМН України, лабораторія імунології, м. Київ
Захист дисертації відбудеться 29.01.2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті ім.О.О.Богомольця, МОЗ України (010023, м. Київ, вул. Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (м.Київ, вул.Зоологічна, 1)
Автореферат розісланий 11.11.2003 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук С.Г.Свирид
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Завдяки успіхам клінічної трансплантології, в останні три десятиріччя операція пересадки донорської нирки стала загальноприйнятим методом лікування хворих на хронічну ниркову недостатність (ХНН).
Поширення ХНН є дуже значним і становить 100-250 нових хворих на 1 мільйон населення за рік; 2/3 з них за відсутності адекватного лікування вмирають протягом року [Возіанов О.Ф. із співавт., 2000]. Особливість полягає не стільки у високому поширенні захворювань нирок, скільки в тому, що серед хворих переважають особи молодого віку з тривалим латентним перебігом основного захворювання. Термінальна стадія ХНН є основним показанням до трансплантації нирки. Доля пересадженого органа, безумовно, залежить від умов його функціонування в організмі реципієнта. Провідну роль у вирішенні цієї проблеми відіграють питання передтрансплантаційної підготовки реципієнтів з метою створення умов для найкращого приживлення трансплантата й профілактики посттрансплантаційних ускладнень. Основним ускладненням післяопераційного періоду є відторгнення трансплантата, що виникає внаслідок генетично зумовлених антигенних розбіжностей між донором і реципієнтом [Драннік Г.М., 1999].
Імунологічна природа реакції несумісності тканин визначає важливу роль імунологічних досліджень у комплексі заходів, кінцева мета яких – запобігти відторгненню трансплантованого органа. Імунна система розглядається як тонко збалансована сіть імунокомпетентних клітин, які взаємодіють між собою шляхом безпосереднього контакту і з участю розчинних медіаторів. Зміни цього взаємозв`язку при патологічному стані характеризуються імунологічним дисбалансом, тобто кількісним і функціональним дефектом окремих ланок імунної системи і, передусім, Т-лімфоцитів, що мають імунорегулюючі властивості [Ярилін О.О., 1999]. Відомо, що популяція CD4+ Т-лімфоцитів-хелперів складається принаймні з двох субпопуляцій: Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів (Тх1 та Тх2). Різниця між цими двома субпопуляціями полягає перш за все в їхній здатності продукувати різні цитокіни, які, у свою чергу, визначають подальший “сценарій” розвитку імун-ної відповіді: клітинний або гуморальний. Розуміння ролі Т-лімфоцитів-хелперів в реакції відторгнення трансплантата має важливе фундаментальне значення. Крім цього, відповідь на питання “який тип Т-лімфоцитів-хелперів активується і наскільки після пересадки нирки?” має суттєве практичне значення. Вона дозволяє розробити нові підходи до прогнозування реакції відторгнення ниркового алотрансплантату. Проте складність післяопераційного періоду, що вимагає призначення імуносупресивної терапії, зумовлює також інші ускладнення: розвиток пухлинних і значний спектр інфекційних захворювань. Запобігти цим ускладненням або знизити ступінь ризику їх розвитку можливо лише за умови виконання оптимальних протоколів імуносупресивної терапії. У клінічній трансплантології перелік імуносупресивних препаратів розширився до двох десятків. Переважно використовуються сандимун-неорал, програф, селсепт, сиролімус, мізорибін, бреквінар, ОКТ-3 тощо. Використання одночасно двох-трьохкомпонентної і більше терапії з різними точками дії призводить до блокування різних етапів реакції відторгнення, але при цьому немає чітких уявлень про напрямок взаємодії цих препаратів, а саме синергічний, адитивний чи антагоністичний. Експериментальні дослідження “in vitro” взаємодії сучасних імуносупресивних препаратів, а також їхній вплив на функцію Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів і продукцію інтерлейкінів, дозволить оптимізувати підходи до імуносупресивної терапії.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Робота виконувалася в Інституті урології АМН України в межах тем плану МОЗ України: “№ держреєстрації 0193015785; шифр теми 1.12/068 Розробити нові критерії індивідуального підходу до імуносупресії циклоспорином на підставі вивчення продукції й чутливості клітин реципієнта до лімфокінів для поліпшення діагностики і лікування кризу відторгнення ниркового алотрансплантату”, “№ держреєстрації 0198000487; шифр теми ВК.21 Вивчити у хворих з нирковим трансплантатом функцію Т-лімфоцитів-хелперів І та Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу для з`ясування механізмів імуноадаптації реципієнтів до алогенного органа”, “№ держреєстрації 0196013013; шифр теми ВК.13 Розробити наукову методику підготовки реципієнтів, селекції трансплантаційної пари та раціональної терапії хворих у посттрансплантаційному періоді після повторної пересадки нирки”, а також плану Інституту урології АМН України “№ держреєстрації 0101002182; шифр теми ІН.5 Розробити алгоритм формування індивідуальної імуносупресивної терапії для реципієнтів ниркового трансплантата на підставі вивчення механізмів взаємодії сучасних супресантів та їх впливу на функцію Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів in vitro (експериментальні дослідження)”. У всіх цих наукових темах дисертантка була співвиконавцем.
Мета роботи
Поліпшити результати пересадки алогенної нирки в клініці шляхом оптимізації діагностики реакції відторгнення трансплантата на підставі вивчення особливостей функціонування та розробки спрямованої імуномодуляції субпопуляцій Т-хелперів периферичної крові реципієнта.
Задачі дослідження:
1. Виявити особливості функціональної активності Т -хелперів І типу за продукцією інтерлейкіну-2 та інтерферону–g і Т-хелперів ІІ типу за продукцією інтерлейкіну-4 та інтерлейкіну-10 у хворих на ХНН до і після пересадки алогенної нирки.
2. Дослідити взаємозв`язок HLA-фенотипу з продукцією інтерлейкіну-2 та експресією ІЛ-2Р+-клітин у потенційних реципієнтів алогенної нирки.
3. Розробити критерії до- і посттрансплантаційного імуно-моніторингу з урахуванням співвідношення та індивідуальних особливостей функціонування Т-хелперів І та ІІ типів у реципієнтів алогенної нирки.
4. Вивчити в експерименті in vitro можливості взаємовпливу сандимуну-неоралу, дексаметазону, селсепту і прографу на функціональну активність імунокомпетентних клітин здорових осіб і пацієнтів, на підставі чого обгрунтувати новий підхід до комбінаційної імуносупресивної терапії.
5. Дослідити in vitro вплив комбінацій імуносупресивних препаратів та їх різних доз на проліферативну активність лімфоцитів і секрецію інтерлейкіну-2.
6. Виявити особливості продукції інтерферону-g мононуклеарами периферичної крові під впливом пептидного комплексу (ПК) нирок in vitro.
7. Розробити рекомендації щодо вибору комбінацій імуно-супресивних препаратів та їх оптимальних доз.
Об`єкт дослідження
Реакції трансплантаційного імунітету.
Предмет дослідження
Функціонування субпопуляцій Т-хелперів периферичної крові та спрямована їх імуномодуляція при трансплантації алогенної нирки у людини.
Методи дослідження
Для визначення концентрації ІЛ-10, ІЛ-4, ІНФ-g використано твердофазний імуноферментний метод з використанням наборів. Для визначення інтерлейкін-2-продукуючої здатності мононуклеарів периферичної крові використано метод, заснований на здатності ІЛ-2 відновлювати блоковану гідрокортизоном проліферативну відповідь тимоцитів мишей на конковалін А. Визначення кількості клітин, що несуть рецептори до ІЛ-2 та DR-антигенів здійснювали за допомогою флюоресцентного аналізу, використовуючи моноклональні антитіла і проточний цитометр FACSCAN (“Becton Dickinson”, США).
Дослідження дії пептидного комплексу нирок на продукцію ІНФ-g лімфоцитами периферичної крові реципієнтів виконували твердофазним імуноферментним методом з використанням набору “Interferon gamma human” фірми “Intero, Ltd”.
У моделях in vitro вивчалась індивідуальна чутливість імунокомпетентних клітин потенційних реципієнтів до субоптимальних й оптимальних доз циклоспорину А в реакції бластної трансформації лімфоцитів, яку здійснювали радіометричним методом і виражали як індекс стимуляції у відповідь на ФГА і мітоген лаконосу. Дослідження спрямованості взаємодії імуносупресивних препаратів in vitro проведено з використанням рівняння середньої дії, або медіанного ефекту. Взаємодію препаратів оцінювали коефіцієнтом сполучення.
Алотрансплантацію нирки здійснювали з урахуванням сумісності донора й реципієнта за результатами перехресної проби на лімфоцитотоксичність. HLA-фенотип донора та реципієнта визначали типуванням лімфоцитів периферичної крові за допомогою стандартного мікролімфоцитотоксичного тесту та анти-HLA-сироваток.
Об`єктивні обстеження реципієнтів проводили за допомогою комплексу клініко-інструментальних (сонографічне та радіонуклідне дослідження трансплантата) та лабораторних засобів дослідження (загальноклінічні, біохімічні, коагулологічні та мікробіологічні).
Всі цифрові показники, одержані під час досліджень, оброблялися методом варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента-Фішера.
Наукова новизна одержаних результатів
Ё вперше вивчено роль Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів у патогенезі розвитку термінальної стадії ХНН. Доведено, що стан імунітету у цієї категорії хворих характеризується тенденцією до зниження інтерлейкін-2-продукуючої функції лімфоцитів і вірогідним зниженням індукованої продукції ІНФ-g з одночасно підвищеною як спонтанної, так й індукованої секреції ІЛ-10 та ІЛ-4;
Ё вперше встановлено особливості функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів у реципієнтів з урахуванням особливостей посттрансплантаційного періоду;
Ё необоротна реакція відторгнення корелює із зростанням спонтанної продукції ІНФ-g, а також підвищенням доопераційного рівня продукції ІЛ-2, високим рівнем продукції ІЛ-4 і низьким рівнем продукції ІЛ-10;
Ё встановлено, що оборотні реакції відторгнення з наступною стабільною функцією трансплантата характеризуються зниженням рівня продукції ІЛ-2 порівняно з доопераційним рівнем і зниженням рівня продукції ІНФ-g, а також зниженням продукції ІЛ-4 та ІЛ-10;
Ё у реципієнтів із задовільною функцією трансплантата у ранньому післяопераційному періоді встановлено зниження продукції ІЛ-2 порівняно з доопераційним рівнем, а також зниження індукованої продукції ІНФ-g, за незмінної динаміки спонтанної продукції ІНФ-g, низький рівень продукції ІЛ-4 і високі показники спонтанної та індукованої продукції ІЛ-10;
Ё вперше встановлено диференційний критерій гострої реакції відторгнення й маніфестації інфекційного процесу – підвищення рівнів спонтанної та індукованої продукції ІЛ-10;
Ё вперше встановлено зв`язок підвищеної експресії рецепторів до ІЛ-2 в поєднанні з високою продукцією ІЛ-2 і наявністю в HLA-фенотип DR2-антигену, що дозволило віднести реципієнтів до групи ризику розвитку гострої реакції відторгнення;
Ё виявлено циклоспорин-А-чутливих і циклоспорин-А-резистентних потенційних реципієнтів на підставі проліферативної активності Т-лімфоцитів на мітогени;
Ё розроблено метод дослідження in vitro взаємодії імуносупресивних препаратів: сандимуну-неоралу, прографу, дексаметазону і селсепту на підставі проліферативної активності лімфоцитів і продукції ними інтерлейкіну-2;
Ё вперше доведено імунорегуляторну дію пептидного комплексу нирок на підставі продукції інтерферону-g мононуклеарами периферичної крові потенційних реципієнтів.
Практичне значення одержаних результатів
· розроблено моніторинг до- і посттрансплантаційного періоду реципієнтів алогенної нирки на підставі факторів міжклітинної кооперації;
· визначено комплекс диференційно-діагностичних ознак реакції відторгнення трансплантата;
· наявність у HLA-фенотипі DR2-антигену і зв`язок з продукцією інтерлейкіну-2 та експресією рецептора до інтерлейкіну-2 у потенційних реципієнтів алогенної нирки визначають групу ризику розвитку реакції відторгнення трансплантації нирки;
Ё вперше розроблено новий підхід у призначенні комбінацій імуносупресивних препаратів та їх доз, заснований на дослідженні спрямування взаємодії препаратів in vitro з використанням рівняння середньої дії;
· виявлено in vitro пригнічення продукції інтерферону-g мононуклеарами периферичної крові реципієнтів під впливом пептидного комплексу нирок, що дозволяє запропонувати цей тканинний пептид як можливий імуносупресор.
Впровадження результатів дослідження у практику
Розроблені методи імуномоніторингу реципієнтів і нові підходи до оптимізації протоколів імуносупресивної терапії впроваджені в практику роботи відділу трансплантації нирки Інституту хірургії та трансплантології АМН України, відділення трансплантації нирки Донецького обласного клінічного територіального медичного об`єднання.
Результати досліджень використовуються в лекціях і на практичних заняттях студентів на кафедрі клінічної імунології та алергології з курсом дитячої клінічної імунології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.
Особистий внесок дисертанта
Ідею дисертаційної роботи запропоновано науковим консультантом д.м.н., професором Дранніком Г.М. Дисертанткою створено методологічну основу роботи, адекватну меті і завданням дисертації. Особисто нею проведені дослідження інтерлейкін-4 та 10, а також інтерферон-g-продукуючої здатності лімфоцитів периферичної крові здорових осіб і реципієнтів, дослідження продукції інтерферону-g мононуклеарами периферичної крові під впливом пептидного комплексу нирок, виконання експериментів in vitro з дослідження впливу сандимуну-неоралу, дексаметазону, селсепту і прографу на проліферативну активність і інтерлейкін-2-продукуючу здатність лімфоцитів волонтерів. Провела експериментальні дослідження in vitro з вивчення спрямування взаємодії імуносупресивних препаратів. Спільно з науковим консультантом д.м.н., професором Бараном Є.Я. аналізувала відповідність клінічній картині результатів досліджень імунологічного статусу реципієнтів, а також оптимальні комбінації ліків і їх доз в імуносупресивній терапії. Самостійно готувала статті до публікацій.
Комп’ютерний аналіз екпериментальних даних і статистичну обробку одержаних результатів проведено на базі кафедри статистики і теорії ймовірності математичного факультету (зав. кафедрою Бондарєв Б.В.) Донецького національного університету.*
Апробація результатів дисертації
Основні результати були викладені на конференціях і з`їздах:
І Національному конгресі України з імунології, алергології й імунореабілітації (Алушта, 1998); Всеукраїнській науковій конференції хірургів (Івано-Франківськ, 1999); Нараді-семінарі з клінічної лабораторної діагностики (Конча-Заспа, Київ, 1999); IV Українській науково-практичній конференції з актуальних питань алергології, клінічної і лабораторної імунології (Київ, 1999); V Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології та алергології (Київ, 2000); ІІ з`їзді трансплантологів України (Київ, 2000); Науково-практичній конференції “Нове в хірургії та трансплантології” (Київ, 2002); VI науково-практичній конференції Українського товариства спеціалістів з імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2002).
На міжнародних симпозіумах та конгресах: XIV Міжнародному конгресі нефрологів (Сідней, Австралія, 1997); XV Міжнародному конгресі нефрологів (Буенос-Айрес, Аргентина, 1999); XVIII Міжнародному конгресі трансплантологів (Рим, Італія, 2000).
Публікації
З теми дисертації опубліковано 19 статей у виданнях, визнаних ВАК України. Одну статтю видано англійською мовою; 17 – в матеріалах і тезах конференцій і конгресів. Одержано патенти на 2 винаходи.
Структура дисертації.
Дисертацію викладено на 260 сторінках. Робота складається з вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, узагальнення, висновків та списку літератури, який містить 509 джерел. Робота ілюстрована 15 таблицями та 33 рисунками.
* Велика вдячність співробітникам лабораторії імунології Інституту урології АМН України за допомогу в роботі.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Клінічний матеріал цієї роботи базується на аналізі історій хвороби 149 пацієнтів, які перебували на лікуванні у відділенні трансплантації нирки Інституту урології та нефрології АМН України у період 1994-2000 р.р., а також даних виконаних досліджень та робіт in vitro. Усі пацієнти перебували на програмному гемодіалізі у зв`язку з термінальною стадією хронічної ниркової недостатності (ХНН). Дослідження функції Т-хелперів І та ІІ типів за продукцією ІЛ-2, ІНФ-g, ІЛ-4 та ІЛ-10 лімфоцитами периферичної крові здійснювали в групі з 66 пацієнтів з термінальною стадією ХНН, яка була зумовлена розвитком хронічного гломерулонефриту у 53 пацієнтів, аномалією розвитку сечовидільної системи і сечокам`яною хворобою у 13 пацієнтів, у двох з 13 мав місце також хронічний пієлонефрит. Групу хворих склали 24 жінки і 42 чоловіки віком 16-54 роки. Всі пацієнти були потенційними реципієнтами і входили до “аркуша чекання” донорського органа. 20 реципієнтам було виконано первісну трансплантацію алогенної трупної нирки на клубові судини, 12 реципієнтам виконано повторну трансплантацію органа. Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб.
Для визначення концентрації інтерлейкіну-10, інтерлейкіну-4 та ІНФ-g ми виконували твердофазний імуноферментний метод з використанням наборів “IL-10, Immunotech” (Франція), “ProCon IL-4” ООО, “Протеїновий контур” (С.-Петербург, Росія) та “Interferon gamma [(h) INF-g] human” фірми “Biotrak”, Amersham Pharmacia Biotech UK Limited) відповідно. Оптичну щільність вмісту комірок визначали за допомогою фотометра для мікропланшет “Stat Fax 303” (США).
Дослідження індивідуальної чутливості імунокомпетентних клітин до субоптимальних і оптимальних доз циклоспорину А проведено в групі 22 потенційних реципієнтів до пересадки алогенної нирки. Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб.
У моделях in vitro вивчалась індивідуальна чутливість імунокомпетен-тних клітин потенційних реципієнтів до субоптимальних (1 мкг/мл) й оптимальних (5 мкг/мл) доз циклоспорину А в реакції бластної трансформації лімфоцитів, яку здійснювали радіометричним методом і виражали як індекс стимуляції (ІС) у відповідь на ФГА і мітоген лаконосу (МЛ – RWM).
Вивчення інтерлейкіну-2-продукуючої функції лімфоцитів реципієнтів до й після алотрансплантації нирки проведено в групі 32 пацієнтів з термінальною стадією ХНН, яких лікували гемодіалізом і яким було виконано пересадку ниркового алотрансплантату. Контрольну групу склали 10 здорових донорів крові.
Для визначення інтерлейкін-2-продукуючої здатності мононуклеарів периферичної крові використано метод, заснований на здатності ІЛ-2 від-новлювати блоковану гідрокортизоном проліферативну відповідь тимоцитів мишей на конковалін-А (КонА). Рівень інтерлейкіну-2 визначали за вклю-ченням Н3-тимідину індикаторними клітинами, зокрема тимоцитами мишей лінії BALB у присутності супернатанту, що містить ІЛ-2. Кількість інтер-лейкіну-2 виражали в одиницях активності (ОД акт/мл) з допомогою пробіт-аналізу. За стандарт використовували рекомбінантний ІЛ-2 (МНТК “Біоген” Інституту біоорганічного синтезу АН Латвії) у концентрації 10 Од/мл.
Дослідження корелятивного зв`язку інтерлейкін-2-продукуючої функції лімфоцитів з експресією рецепторів до ІЛ-2 та антигенів гістосумісності ІІ класу проведено нами в групі 22 потенційних реципієнтів з термінальною стадією ХНН, що чекали на трансплантацію трупної нирки. Контрольну групу у цьому дослідженні склали 20 практично здорових осіб. Визначення кількості клітин, що несуть рецептори до ІЛ-2 та DR-антигенів здійснювали з допомогою методу флюоресцентного аналізу, використовуючи моноклональні антитіла і проточний цитометр FACSCAN (“Becton Dickinson”, США).
Вивчення впливу пептидного комплексу нирок на продукцію ІНФ-g мононуклеарами периферичної крові виконано нами в групі, до складу якої увійшли 14 реципієнтів з термінальною стадією ХНН, 7 реципієнтів у ранньому посттрансплантаційному періоді із задовільною функцією алогенної нирки та 8 волонтерів.
Проводили дослідження дії пептидного комплексу нирок у концентраціях 0,05 мкг/мл та 0,5 мкг/мл на продукцію ІНФ-g лімфоцитами периферичної крові з використанням набору “Interferon gamma [(h) INF-g] human” фірми “Intero, Ltd” та фотометром “Stat Fax 303” (США).
Дослідження спрямованості взаємодії імуносупресивних препаратів in vitro проведено нами в групі 15 хворих з термінальною стадією ХНН і 15 волонтерів.
З цією метою ми використовували рівняння середньої дії, або медіанного ефекту, що описував Chou Т.С., та яке припускає точний підхід до аналізу співвідношення між дозою та ефектом окремих ліків, а також їх комбінацій. Принцип базується на припущенні того, що дія кожних ліків зв`язана з їх дозою у відповідності з рівняннями:
де fa є елементом системи, на який здійснювався вплив, а fu - елемент, на який ліки у дозі D не справили впливу. Dm - доза, яка здійснює 50% впливу (середню дію), аm - коефіцієнт Хілла, що описує сигмоподібність кривої “доза-ефект”.
Розпізнавання лімфоцитами антигенів та обмін сигналами з іншими клітинами імунної системи є умовами прояву активації лімфоцитів – процесу, на якому базуються практично усі імунологічні реакції, прояви імунної відповіді. Передумовою виконання функцій лімфоцитами завжди служить їх проліферація.
Ми аналізували ступінь імуносупресивної дії препаратів на лімфоцити периферичної крові in vitro з урахуванням їх проліферативної відповіді на мітогени – ФГА та анти СД3-моноклональні антитіла.
План експерименту складався з послідовних етапів:
перший – розведення стандартних розчинів обраних нами імуносупресивних препаратів для експерименту;
другий – виділення лімфоцитів з гепаринізованої венозної крові й дослідження ступеня імуносупресії кожної дози препаратів окремо. Для подальшого етапу відбирали ті дози кожного препарату, які призводили до інгібування проліферації лімфоцитів у діапазоні 50-100%;
третій етап – in vitro на лімфоцити одночасно діяли обидва імуносупресивні препарати у тих дозах, які давали рівної сили ефект супресії, потім ми міняли комбінацію доз препаратів для досягнення вираженої імуносупресивної дії, одночасно намагаючись знизити дози препаратів.
Для вимірювання клітинної проліферації ми використали колориметричний метод, заснований на здатності мітохондріальних ферментів живих клітин відновлювати тетразолієву сіль ММТ до ММТ-формазану.
Потім одержані дані використовували у побудові кривих “доза-ефект” для кожного препарату. Для цього на осі абсцис відкладали концентрації в мг/мл, а на осі ординат – рівень інгібіції проліферативної відповіді лімфоцитів (у %), що відповідає кожній концентрації препаратів і розраховується за вказаною вище формулою.
Для того, щоб оцінити дію у сполученні двох препаратів, спочатку ми аналізували ті дози, які окремо справляли однаковий ефект, а потім у різних пропорціях по всьому діапазону доз.
Взаємодію двох препаратів оцінювали коефіцієнтом сполучення КСх:
де сполучені Д1 та Д2 - це дози препаратів першого і другого (1 та 2), необхідні у суміші, щоб справити дію х (це рівень інгібіції), а тільки Д1 та Д2 – це дози тих же препаратів відповідно, необхідні для здійснення такої ж дії х, якщо їх використовувати окремо (не в суміші).
Якщо величина КС не перевищувала 1,0, тобто КС < 1,0, то ми могли припустити, що імуносупресивні препарати справляли при взаємодії синергічний ефект; при КС = 1,0 – адитивний ефект і при KC > 1,0 – антагоністичний ефект взаємодії.
Алотрансплантацію нирки здійснювали з урахуванням сумісності донора й реципієнта за еритроцитарними антигенами, резус-фактором, результатами перехресної проби на лімфоцитотоксичність. HLA-фенотип донора та реципієнта визначали типуванням лімфоцитів периферичної крові з допомогою стандартного мікролімфоцитотоксичного тесту.
Реципієнтам пересаджували нирки від трупних донорів з періодом теплової ішемії від 10 до 45 хвилин. Трансплантат зберігали протягом 8-22 годин за допомогою гіпотермічної безперфузійної консервації розчином інтрацелюлярного типу (розчин Коллінза).
Перед вилученням нирок проводився їх попередній фармакологічний захист в організмі потенційного донора.
У післяопераційному періоді пацієнти одержували трикомпонентну імуносупресивну терапію (ІСТ): циклоспорин А (ЦсА) (сандимун), азатіоприн (Аз), преднізолон (Пр). ЦсА призначали у дозі 7 мг/кг маси тіла на добу перорально відразу після операції. У випадку розвитку олігоанурії дозу ЦсА знижували до 3 мг/кг на добу з наступним підвищенням до вихідних рівнів за відсутності постішемічної гострої ниркової недостатності трансплантата. Надалі дозу ЦсА корегували індивідуально відповідно до показників моніторування концентрації препарату у сироватці крові реципієнтів із розрахунку оптимальної – 200-250 нг/мл. Преднізолон у першу добу призначали в дозі 1,5-2,0 мг/кг на добу, потім знижували до 0,5 мг/кг на добу, а потім до мінімальних доз, які були б спроможні підтримувати у реципієнтів толерантність до трансплантата. Азатіоприн пацієнти одержували з першої доби у дозі 1,5-2,0 мг/кг на добу з наступним зниженням до 0,5 мг/кг/доба. У період розвитку клінічної картини гострого кризу відторгнення призначали ударні дози імуносупресантів: 250-500 мг/кг на добу метилпреднізолону залежно від кількості лейкоцитів у периферичній крові протягом 3-7 днів. З серпня 1998 року хворим у післяопераційному періоді призначали селсепт у дозі 2 г на добу. Поряд з селсептом до протоколу ІСТ входив сандимун у дозі 6 мг/кг тіла на добу з наступною корекцією дози і преднізолон у початковій дозі 1,5-2,0 мг/кг з поступовим зниженням її до 20 мг на добу у кінці 2 тижня після операції.
В основі діагностики реакції відторгнення ниркового трансплантата були клінічні прояви та лабораторно-інструментальні показники. Найбільш важливими і такими, що часто зустрічаються, були дані: підвищення температури тіла, зниження діурезу, підвищення артеріального тиску, збільшення розмірів й ущільнення трансплантата, зміни в аналізах крові і сечі, а також функціонального стану пересадженого органа, зміни в імунному статусі реципієнта.
Імунологічні дослідження здійснювали 2-3 рази на тиждень: а) протягом раннього післяопераційного періоду; б) у випадку розвитку реакції відторгнення трансплантата; в) на фоні інфекційних і запальних посттрансплантаційних ускладнень; г) також із задовільно функціонуючим алогенним органом через 2, 4 та 6 місяців після операції.
Всі цифрові показники, одержані під час досліджень, оброблялися методом варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента-Фішера. Основною метою таких математичних підходів є оцінка найбільш імовірного значення необхідної величини, визначення помилки обчислення і можливості її появи. Достовірність різниці між показниками, які порівнювалися, визначалася з допомогою критерію Стьюдента. За мінімальний поріг достовірності брали значення p<0,05. Статистична обробка цифрових даних здійснювалася з використанням комп`ютера IBM PC/AT і програм Data Base 4.24; Harvard Graphic 2.3; Fox Graph.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
У роботі відбиті дослідження функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів у реципієнтів ниркового алотрансплантату. Ці дослідження проведені для обгрунтування нашої тактики посттрансплантаційного моніторингу.
* Передусім нами було вивчено інтерлейкін-2-продукуючу здатність лімфоцитів периферичної крові у реципієнтів до і після трансплантації алогенної нирки.
Більшість хворих на термінальну стадію хронічної ниркової недостатності до пересадки мали знижену продукцію ІЛ-2 порівняно з пацієнтами контрольної групи (здорові особи), що обумовлено розвитком уремії. У посттрансплантаційному періоді лише під час розвитку гострої реакції відторгнення відзначена достовірна різниця динаміки рівня ІЛ-2. Так, у групі пацієнтів з кризами відторгнення, що купіруються, і наступною стабільною функцією трансплантата відзначено зниження рівня продукції ІЛ-2 на 35-50% порівняно з фоновим рівнем, і воно відбувалося незалежно від величини показника продукції ІЛ-2 до пересадки. В групі реципієнтів з необоротними реакціями відторгнення рівень ІЛ-2 залишався без змін, а іноді й збільшувався в середньому на 10-20%. Ці дані дозволили нам зробити висновок, що коли у реципієнтів з відторгненням, яке розвивається, після початку антикризової терапії рівень цитокіну не знижувався, то це було ознакою необоротності гострої реакції відторгнення. Причиною цього може бути те, що функція Т-лімфоцитів-хелперів І типу не повною мірою інгібується при проведенні стандартної імуносупресивної терапії з базовим препаратом – циклоспорином А. В механізмі дії останнього головним є пригнічення продукції ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами, при цьому препарат не руйнує імунних клітин. Як і у випадку розподілу пацієнтів на стероїдчутливих і резистентних, ми розподілили потенційних реципієнтів на чутливих і резистентних до циклоспорину А, що важливо для тактики післяопераційної терапії. У ранньому посттрансплантаційному періоді у реципієнтів із задовільною функцією трансплантата відбувалося зниження продукції ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами на 65% порівняно з доопераційним рівнем. У реципієнтів з оборотними реакціями відторгнення рівень продукції ІЛ-2 залишався майже без змін, тобто таким, як після купірування кризу. Ми визначили, що не існує тісного зв`язку між дотрансплантаційною величиною показника ІЛ-2 та ризиком розвитку гострої реакції відторгнення. Тільки динамічне дослідження рівня продукції ІЛ-2 дає можливість уже в найбільш ранні строки припустити характер розвитку гострої реакції відторгнення (ГРВ) трансплантата.
* Ми також виявили зв`язок між HLA-фенотипом, продукцією ІЛ-2 та експресією ІЛ-2Р+-клітин. У групі хворих, в яких була виявлена продукція ІЛ-2 на 8,8 од.акт. вища, ніж у середньому по групі, і на 8,5 од.акт. вища, ніж у контрольній групі, найбільш достовірно часто зустрічались антигени гістосумісності HLA-А2 (50%), DR7 (50%) та DR2 (64%). У пацієнтів, в яких експресія ІЛ-2Р+-клітин була в 2,2 рази вищою, ніж у середньому по групі, ці антигени зустрічались, але з іншою частотою А2 (50%), DR7 (43%), DR2 (72%). У вісьмох хворих обидва показники були підвищеними й вісім з них мали в HLA-фенотип антиген DR2.
Отже, проведені дослідження дозволили зробити висновок, що у хворих з ХНН у дотрансплантаційному періоді визначається підвищена експресія рецепторів до ІЛ-2, що, за умови високої продукції ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами І типу і наявності в HLA-фенотипі DR2-антигену, може бути фактором ризику гострої реакції відторгнення.
* Ми дослідили також особливості продукції ІНФ-g Т-хелперами І типу у реципієнтів до і після алотрансплантації нирки. Для з`ясування резервних можливостей продукції ІНФ-g лімфоцитами реципієнтів ми здійснювали активацію клітин міногеном – ФГА, після чого визначали рівень продукції ІНФ-g у них.
У групі реципієнтів до алотрансплантації спонтанна продукція ІНФ-g відповідала показникам контрольної групи (26,1+2,2 пг/мл), а індукована була значно нижчою і в 78% обстежених - нижчою за рівень 100 пг/мл, що свідчило про відсутність резервних можливостей Т-хелперів І типу продукувати ІНФ-g. Це можна пояснити впливом уремії у пацієнтів, а також комплексом медикаментозної терапії та лікувальних процедур (гемодіаліз, плазмаферез), які впливають на імунну систему і фактори міжклітинної кооперації. У зв`язку з тим, що ІНФ-g є одним з основних медіаторів ефекторної ланки імунної відповіді на трансплантат, ми віднесли до групи ризику розвитку ГРВ реципієнтів з підвищеними показниками продукції ІНФ-g Тх1-клітинами.
У реципієнтів, що перенесли розвиток гострої реакції відторгнення, незважаючи на ударні дози імуносупресивної терапії (метилпреднізолон у дозі 250-500 мг/кг на добу), спонтанна продукція ІНФ-g зростала більше, ніж удвічі – втричі порівняно з доопераційним рівнем, а індукована, разом з тим, дещо знижувалась – до 44,2+5,6 пг/мл. У реципієнтів, в яких на фоні ударних доз ІСТ рівень спонтанної продукції ІНФ-g становив не вище, ніж 35,1 пг/мл, а індукованої – 59,2 пг/мл, мали місце оборотні реакції відторгнення, а потім трансплантати функціонували стабільно. Підвищені показники спонтанної продукції ІНФ-g – понад 100 пг/мл, асоціювались з розвитком необоротної реакції відторгнення з наступною трансплантатектомією. ІНФ-g посилює активацію цитотоксичних Т-лімфоцитів і посилює імунну реакцію, що триває, шляхом регулювання експресії як HLA, так і костимулюючих молекул на паренхіматозних клітинах трансплантата й АПК.
Аналізуючи рівень продукції ІНФ-g у хворих у ранньому післяопераційному періоді (1,5-2 місяці) при стабільній функції алогенної нирки, виявили, що спонтанна продукція становила 21,7+1,5 пг/мл, тобто відповідала рівневі контрольної групи й доопераційному рівневі. Показник індукованої продукції ІНФ-g знизився порівняно з результатами, одержаними до пересадки і у період розвитку ГРВ з наступним купіруванням, і становив 32,6+1,9 пг/мл. У пацієнтів при стабільній функції алогенної нирки на фоні підтримуючих доз ІСТ відзначався низький рівень продукції ІНФ-g, що може бути одним з факторів пригнічення факторів відторгнення. Отже, наші дослідження функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І типу підтвердили їхню участь у патогенезі гострої реакції відторгнення трансплантата. Показники імунологічної фази конфлікту дають можливість більш ранньої діагностики ускладнення ще до появи морфологічних критеріїв кризу. Ця обставина дозволяє рекомендувати для імуномоніторингу дослідження продукції Т-хелперами І типу ІЛ-2 та ІНФ-g. На нашу думку, інформативним діагностичним критерієм ГРВ є підвищення спонтанної продукції ІНФ-g у 2-3 й більше разів. Про необоротність імунного конфлікту можуть свідчити доопераційні (фонові) показники продукції ІЛ-2, що зберігаються, і рівень ІНФ-g – 100 пг/мл і понад. Стабільна функція трансплантата характеризується зниженням рівнів ІЛ-2 та ІНФ-g на фоні здійснюваної імуносупресивної терапії.
Нами також виявлено фактор ризику розвитку гострої реакції відторгнення – наявність у реципієнтів у HLA-фенотипі антигену DR2 у поєднанні з вираженими експресією рецепторів до ІЛ-2 та продукцією ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами І типу у доопераційному періоді.
** Для того, щоб з`ясувати цитокіновий профіль, який сприяв би зниженню клітинної імунної відповіді, ми дослідили особливості функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу реципієнтів.
** При дослідженні ІЛ-4 продукуючої здатності лімфоцитів у пацієнтів до трансплантації було виділено дві групи: з високим і низьким рівнем секреції цитокіну. У 60% випадків рівень продукції був значно підвищеним і становив 553+62 пг/мл, а індукована стимуляція лімфоцитів ФГА не призводила до посилення їхньої активності і практично не відрізнялась від величини спонтанної – 573+48 пг/мл (p<0,5). У 40% пацієнтів значення спонтанної продукції ІЛ-4 становили 65+18 пг/мл, а індукованої 78+20 пг/мл (p<0,5). У 2 пацієнтів з 15 ми виявили можливість додаткової продукції ІЛ-4 Т-хелперами ІІ типу у відповідь на мітоген, що визначається як резерв реагування. Коли вичерпані резервні можливості клітин реагувати на додатковий антигенний стимул, то цей факт може розглядатися як сприятливий фактор для успішної трансплантації. Підтвердженням може служити те, що всі ці хворі були виписані із задовільною функцією трансплантата, і лише у двох з високими потенційними можливостями реагування Тх2 клітин відбулася втрата трансплантата.
Ретроспективний аналіз даних після трансплантації у хворих показав, що у передкризовий період (за 5 діб) відзначалася тенденція до збільшення активності як спонтанної, так і індукованої ІЛ-4 продукції, і становили в середньому 8% від показників раннього післяопераційного періоду. У момент клінічної маніфестації гострої реакції відторгнення спостерігалося значне зниження активності Тх2 (p<0,05), про що свідчать низькі рівні ІЛ-4. У випадку, коли у хворого відсутній резерв реагування Тх2 клітин додатковою продукцією ІЛ-4, то криз купірувався, а якщо резерв реагування залишався більшим, то криз купірувати не вдавалося. Ми не могли одержати доказів, що підвищена активність ІЛ-4 до трансплантації передрікає ризик гострої реакції відторгнення алотрансплантату. У той же час на підставі індивідуального аналізу можна відзначити, що збереження високого рівня ІЛ-4 після пересадки порівняно з вихідним є несприятливим фактором і корелює з розвитком необоротної реакції відторгнення.
** Нами було проведено дослідження продукції ІЛ-10 Т-лімфоцитами-хелперами ІІ типу для з`ясування його ролі в патогенезі посттрансплантаційних ускладнень і вдосконаленні тактики післяопераційного моніторингу. У хворих з ХНН відзначено достовірне підвищення спонтанної та індукованої секреції ІЛ-10 Тх2 клітинами порівняно з контрольною групою – 144,6+21,6 пг/мл та 94,4+14,7 пг/мл (p<0,05). Відзначимо, що у хворих до пересадки в 55% випадків стимуляція клітин мітогеном не призводила до підвищення кількості ІЛ-10, тобто можна припустити відсутність резервних можливостей Тх2 виробляти ІЛ-10.
Отже, високі показники ІЛ-10 у хворих з ХНН свідчать про активацію Тх2, причиною якої, можливо, є багатократні гемотрансфузії. Враховуючи думку, що ІЛ-10 має імуносупресивні властивості, хворі з низькими показниками його продукції можуть входити до групи ризику розвитку гострого кризу відторгнення, а високі цифри можуть свідчити про те, що ці хворі схильні до значної дії імуносупресивної терапії і їм може загрожувати розвиток інфекційних ускладнень.
Дані, що відбивають продукцію ІЛ-10 у хворих у різні періоди після пересадки нирки, свідчать, що на третю добу після операції, за наявності функції ниркового алотрансплантату, рівень спонтанної й індукованої продукції достовірно знизився порівняно з доопераційним – 45,1+3,2 пг/мл та 52,1+2,6 пг/мл (p<0,05). При індукованій оцінці показників виявили, що різке зниження продукції ІЛ-10 було відзначено у хворих з високими фоновими показниками. В середньому по групі відзначали зниження показника в 1,5-2 рази порівняно з доопераційним рівнем. Можна припустити, що на продукцію ІЛ-10 великий вплив справляє імуносупресивна терапія, механізм дії якої спрямований на пригнічення проліферації Т-лімфоцитів-хелперів. Обстеження хворих під час розвитку гострої реакції відторгнення показало пригнічення спонтанної продукції ІЛ-10, яка в середньому становила 25,6+3,2 пг/мл. Однак при цьому рівень індукованого ІЛ-10 практично не змінився порівняно з показниками у ранньому післяопераційному періоді 44,6+5,3 пг/мл. При маніфестації гострої реакції відторгнення хворим призначали болюсні внутрішньовенні вливання метипреду у дозі 250-500 мг/кг/доба.
У хворих з показниками ІЛ-10, що досягають нормальних величин на фоні ГРВ й ударної імуносупресії (не нижче за 20 пг/мл – спонтанної і 62 пг/мл – індукованої продукції), реакції відторгнення були оборотними, і надалі трансплантат функціонував стабільно. Низькі показники продукції цитокіну – менші від 15 пг/мл – призводили до необоротних реакцій відторгнення. Відомо, що при пересадці нирки основними ускладненнями посттрансплантаційного періоду є інфекційні, які можуть бути причиною летального наслідку реципієнта.
Враховуючи те, що Тх2 відповідають за гуморальний імунітет, нами було вивчено продукцію ІЛ-10 у хворих у період інфекційних ускладнень. З 14 обстежених хворих у 5 відзначені цитомегаловірусна й герпетична інфекції. Аналіз даних показав підвищену продукцію спонтанної та індукованої продукцій ІЛ-10 при інфекційних ураженнях – 46,8+2,1 пг/мл та 84,8+4,2 пг/мл, які перевищували такі у період гострої реакції відторгнення ниркового трансплантата (p<0,05). Можна припустити, що на фоні імуносупресивної терапії здійснюється блокування Тх1 та активуються лімфоцити Тх2, які відповідають за гуморальну імунну відповідь, спрямовану на пригнічення інфекційних агентів в організмі реципієнта. Враховуючи той факт, що показники продукції ІЛ-10 лімфоцитами Тх2 у період розвитку реакції відторгнення трансплантата і у період маніфестації інфекції достовірно відрізняються, можна використати визначення рівня продукції ІЛ-10 для диференційної діагностики посттрансплантаційних ускладнень і включити до імунологічного моніторингу. Аналізуючи функцію Тх2 у реципієнтів із задовільно функціонуючим трансплантатом через 1,5-2 місяці після операції, напередодні виписки з стаціонару, виявили високі показники спонтанної та індукованої продукцій ІЛ-10 порівняно з групою здорових осіб і фонових значень до пересадки 127,7+10,6 пг/мл та 173,7+12,4 пг/мл (p<0,05) на фоні підтримуючих доз імуносупресантів, що, з нашої точки зору, є проявом спрямованої реверсії імунної відповіді. Разом з тим, привертає увагу той факт, що у частини наших хворих розвинулась реакція відторгнення, що не купірується, на фоні зниженої продукції ІЛ-10. Це свідчить про існування певної частини реципієнтів, чиї Т-лімфоцити чутливі до дії циклоспорину і кортикостероїдів у плані продукції ІЛ-10.
**Ми також вивчали особливості продукції ІЛ-10 у реципієнтів до і після повторної трансплантації нирки. Середній показник спонтанної продукції ІЛ-10 до пересадки становив 102,4+26,2 пг/мл, що порівняно з контрольною групою – 21,4+5,4 пг/мл – було достовірно вище (p<0,05).
Рівень індукованої продукції ІЛ-10 під впливом продигіозану у реципієнтів до повторної операції перебував у межах від 46,51 пг/мл до 362,63 пг/мл, а середнє значення становило по групі 122,7+64,4 пг/мл, що перевищило цей показник у контрольній групі – 37,2+9,8 пг/мл. Причому у 47,3%
