Академія медичних наук України

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ЛУЦЕНКО Руслан Володимирович

УДК 615.217.3+616.36-08

ПОПЕРЕДЖЕННЯ УШКОДЖЕНЬ ПЕЧІНКИ ПРИ ГОСТРОМУ СТРЕСІ ЗА ДОПОМОГОЮ НЕЙРОТРОПНИХ ЗАСОБІВ

(експериментальне дослідження)

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі експериментальної та клінічної фармакології Української медичної стоматологічної академії МОЗ України, м. Полтава.

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор Дев’яткіна Тетяна Олексіївна, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, професор кафедри експериментальної та клінічної фармакології |

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, професор Громов Леонід Олександрович, Інститут фармакології та токсикології

АМН України, завідувач відділу нейрофармакології; |

доктор медичних наук, професор Дроговоз Світлана Мефодіївна, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри фармакології |

Провідна установа: |

Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології та медичної рецептури |

Захист відбудеться " 15 " жовтня 2003 р. о 13 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14).

Автореферат розісланий " 11 " вересня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук І.В. Данова

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Стрес є актуальною проблемою біології і медицини, провідною ланкою численних захворювань (К.В. Судаков, 1996; М.И. Хананашвили, 1998). Дія стресорних факторів призводить до порушення обміну речовин у печінці та її функцій, що негативно позначається на організмі вцілому (В.Н. Синицький и соавт., 1996; И.С. Заводская и соавт., 1998; М.Г. Пшенникова, 2000). Тому пошук і вивчення антистресорних препаратів та їх вплив на печінку є актуальним завданням фармакології. Такими засобами можуть бути нейротропні препарати, які регулюють центральні ланки стрес-реакції. До їх числа належать ноотропи. Вони відомі, як коректори різноманітних порушень діяльності ЦНС, серцево-судинної системи, гіпоксичних станів та інтоксикацій (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 1998; Л.Т. Киричок, Э.В. Карнаух, 1999; Л.Д. Лукьянова, 1999; Л.Т. Киричок, 2001; J. Vaglenova, 2001). Широко впровадженим у клінічну практику ноотропним засобом є пірацетам. При стресі він позитивно впливає на метаболізм і функції головного мозку (В.Й. Кресюн, Я.В. Рожковский, 1990; Т.А. Воронина, 1998; О.Г. Куликова и соавт., 1992; S. Shorvon, 2001). Пірацетаму властиві екстрацеребральні ефекти, які виявляються в профілактичній і терапевтичній дії при інфаркті міокарду (В.Й. Кресюн, Я.В. Рожковский, 1990; Л.Т. Киричок, Э.В. Карнаух, 1999; Л.Т. Киричок, 2001), аритміях (Э.В. Карнаух, 2000), стресорному ушкодженні імунокомпетентних органів (Я.В. Рожковський, 2000) та в прискоренні процесів репаративної регенерації при переломах кісткової тканини за умов стресу (Л.І. Волошина, 1996). Щодо впливу пірацетаму на стресорні зрушення метаболізму в печінці є тільки поодинокі роботи (В.М. Виноградов та соавт., 1987), на підставі яких неможливо зробити висновки про його гепатотропні властивості і доцільність застосування при стресорних ушкодженнях печінки.

Високоефективним препаратом, який має багатофункціональну дію на мозок, є пептидергічний нейротропний засіб церебролізин, ефекти якого детально вивчені тільки стосовно нервової тканини (А.Т. Гречко, 1998; Б.С. Виленский, 1999; R.J. Boado, 1998). Однак екстрацеребральні ефекти препарату насьогодні за умов стресу зовсім не досліджено. Враховуючи, що стресорні фактори справляють негативний вплив на метаболізм в печінці та її функції, важливо дослідити наявність у церебролізину гепатопротекторного ефекту за умов стресу.

Серед нових засобів перспективним є синтетичний антиоксидант мексидол, який має широкий діапазон церебральних і екстрацеребральних властивостей, виявляє анксиолітичні, протисудомні, ноотропні, антигіпоксичні і ангіопротекторні ефекти (Т.А. Девяткина и соавт., 1993; К.М. Дюмаев и соавт., 1995; Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 1998; Л.Д. Лукьянова, 1999), зменшує негативну дію гострого і хронічного стресу (Дюмаев и соавт., 1995; О.М. Важнича, 2001). Однак вплив мексидолу на метаболічні процеси і функціональний стан печінки при стресі вивчено недостатньо.

Наведені вище дані свідчать про доцільність дослідження ефективності нейротропних засобів для попередження ушкоджень печінки за умов гострого стресу, як прояву їх екстрацеребральних властивостей.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної теми Української медичної стоматологічної академії “Запальні та незапальні хвороби органів і систем людини, що формуються під впливом екологічних, стресових, імунних, метаболічних та інфекційних факторів. Стан гемо-гомеостазу, гемодинаміки при застосуванні традиційних та нетрадиційних засобів лікування” (№ державної реєстрації 0198U000134).

Мета і завдання дослідження. Мета дисертаційної роботи – експериментальне обґрунтування доцільності застосування нейротропних засобів для профілактики стресорних ушкоджень печінки.

Завдання, які необхідно було вирішити для досягнення поставленої мети:

1. Провести поглиблене дослідження впливу гострого стресу на активність ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів, функціональний стан, вуглеводний обмін, процеси перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) і антиоксидантний захист печінки білих щурів та мишей;

2. Вивчити дію пірацетаму на активність ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів, функціональний стан, вуглеводний обмін, процеси ПОЛ і антиоксидантний захист печінки тварин при гострому стресі в умовах профілактичного застосування;

3. Дослідити ефекти церебролізину при ушкодженні печінки тварин за умов гострого стресу;

4. Вивчити профілактичний вплив мексидолу на активність ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів, функціональний стан, вуглеводний обмін, процеси ПОЛ і антиоксидантний захист печінки тварин при гострому стресі;

5. Дослідити вплив пірацетаму, церебролізину і мексидолу на процеси гліколізу і ПОЛ в модельних системах на основі гомогенатів печінки щурів;

6. З’ясувати механізми позитивного впливу пірацетаму, церебролізину і мексидолу на функціональний стан печінки тварин при гострому стресі.

Об’єкт дослідження. Характер змін активності ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів, функціонального стану, обміну вуглеводів, а також процесів перекисного окиснення ліпідів і антиоксидантного захисту печінки тварин (білих щурів і мишей) за умов гострого стресу.

Предмет дослідження. Профілактична ефективність пірацетаму, церебролізину і мексидолу за умов стресорного ушкодження печінки.

Методи дослідження. Поставлена мета досягнута шляхом застосування фармакологічних, біохімічних і функціональних методів дослідження та методів математичної статистики і системного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено поглиблене вивчення ефективності пірацетаму при стресорних ушкодженнях печінки, показано, що препарат попереджує порушення функціонального стану, обміну вуглеводів і процесів пероксидації в органі. В дослідах in vitro доведено прямий вплив пірацетаму на процеси гліколізу і ПОЛ в гепатоцитах.

Уперше експериментально виявлено позитивний вплив церебролізину на печінку при гострому стресі. Препарат попереджує зростання в сироватці крові активності альдолази і гама-глутаматтранспептидази, зменшує вміст лактату і продуктів, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБКАП). В дослідах in vitro встановлено прямий характер дії церебролізину на процеси гліколізу і ПОЛ у печінці і виявлена дозозалежна активність препарату.

Вперше показано протективну дію мексидолу на тканину печінки за умов гострого стресу, яка виявляється у попередженні підвищення в сироватці крові активності ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів, покращенні дезінтоксикаційної функції і метаболічних процесів у органі. Встановлено, що препарат, окрім центрального стреспротективного ефекту, має пряму гепатопротекторну дію.

Механізми захисної дії пірацетаму, церебролізину і мексидолу на печінку при гострому стресі в значній мірі обумовлені впливом на метаболічні процеси в органі. Спільним з них є зменшення вмісту проміжних продуктів ПОЛ і молочної кислоти в печінці.

Практична значимість одержаних результатів. Експериментально обгрунтовано доцільність використання пірацетаму, церебролізину і мексидолу для профілактики ушкоджень печінки стресорного генезу, які супроводжуються функціональними змінами, порушеннями обміну вуглеводів та активацією ПОЛ в органі.

За матеріалами дисертації опубліковані методичні рекомендації “Доклінічне дослідження стреспротективної дії фармакологічних засобів” (Київ, 2001). Видано два інформаційні листи: “Применение пирацетама для профилактики повреждений иммунокомпетентных органов и печени стрессорного генеза” і “Экстрацеребральные эффекты церебролизина и возможности их клинического использования”.

Результати дисертаційної роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах фармакології Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова (акт впровадження від 03.06.2002 р.), Луганського державного медичного університету (акт впровадження від 05.06.2002 р.), Івано-Франківської державної медичної академії (акт впровадження від 14.05.2002 р.), а також на кафедрі експериментальної та клінічної фармакології Української медичної стоматологічної академії, м. Полтава (акт впровадження від 02.09. 2002 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було здійснено патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням пошукового індексу “Medlion” в мережі Internet, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації, визначені мета і завдання дослідження, відпрацьовані дослідні моделі, виконані всі експериментальні дослідження, а також проведено аналіз, систематизацію та статистичну обробку отриманих результатів і оформлено їх у вигляді таблиць та рисунків, сформульовано основні положення і висновки роботи. Персональний внесок у всіх опублікованих наукових працях зі співавторами вказується за висновками дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на XV з’їзді Українського фізіологічного товариства (м. Донецьк, 1998); VII Россійському національному конгресі “Человек и лекарство” (г. Москва, 2000); ІІ Російському конгресі патофізіологів “Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы” (г. Москва, 2000); II Національному з’їзді фармакологів України (м. Дніпропетровськ, 2001); Міжнародній науково-практичній конференції “Досягнення та перспективи фармакотерапії органів травлення” (м. Полтава, 2001); науково-практичній конференції “Сучасні проблеми фармацевтичної науки і практики” (м. Харків, 2001); Научно-практической конференции “Лекарства – человеку” (м. Харьков, 2001; 2002); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених “Актуальні проблеми клінічної, експериментальної та профілактичної медицини (м. Донецьк, 2002); ХVI з’їзді Українського фізіологічного товариства (м. Вінниця, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 22 наукові праці, в тому числі 13 статей (4 без співавторів) у фахових виданнях, ліцензованих ВАК України, 6 тез у матеріалах доповідей конференцій, конгресів та з’їздів, а також методичні рекомендації і два інформаційні листи.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 167 сторінках друкованого тексту і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів дослідження, 3 розділи власних експериментальних досліджень, обговорення отриманих даних, висновки, список використаної літератури (287 джерел, з них – 245 зарубіжних). Робота ілюстрована 39 таблицями, 4 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експерименти виконані на 129 нелінійних статевозрілих білих щурах-самцях масою 200 - 250 г та 48 білих мишах масою 35 - 45 г. Проведено 147 дослідів in vitro з гомогенатами печінки щурів.

У щурів моделювали гострий іммобілізаційний стрес (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983). Гострий стрес у мишей відтворювали шляхом атравматичного підвішування тварин за шкірну складку шиї (И.В. Дардымов, 1976).

Евтаназію щурів здійснювали під тіопенталовим наркозом (50 мг/кг маси тіла, внутрішньоочеревинно) через 1,5 год після завершення стресорного впливу шляхом забирання крові з серця до його зупинки. Евтаназію мишей проводили під ефірним наркозом шляхом декапітації.

Для попередження стресорних ушкоджень печінки використовували такі препарати: пірацетам у дозах 100 і 300 мг/кг (фармацевтична фірма “Дарниця”, Київ, Україна), церебролізин у дозі 0,1 мл/кг (ЕВЕWE, Унтерах, Австрія), а також препарат мексидол (“Наука-Центр Фарма”, Москва, Росія) і субстанцію мексидолу в дозі 100 мг/кг, люб’язно надану проф. Л.Д. Смирновим (Національний дослідницький центр біологічно активних речовин, Стара Купавна, Росія). Препарати розводили стерильним 0,9% розчином натрію хлориду ex temporаe та вводили тваринам внутрішньоочеревинно за 30 хв до початку гострого іммобілізаційного стресу. При дослідженні механізмів дії мексидолу використано аналоги його структурних компонентів: емоксипін (2-етил-6-метил-3-оксипіридин у вигляді хлорводневої солі) у дозі 100 мг/кг (Талліннський хіміко-фармацевтичний завод, Таллінн, Естонія), піридоксину гідрохлорид – 5% розчин в ампулах у дозі 100 мг/кг (“Львів-лікпрепарати”, Львів, Україна) і натрію сукцинат – у дозі 50 мг/кг (ВАТ “Фармак”, Київ, Україна).

Вибір доз і шляхів введення препаратів здійснювали на основі літературних даних щодо їх ефективності за умов стресу або за іншої патології (В.М. Виноградов и соавт., 1987; Т.А. Девяткина, 1990; Э.Г. Коваленко, 1994; B. Hurterpaier et. al., 1996; M. Windisch et al., 1987, 1998). Одночасно з профілактикою стресу аналогічні дози препаратів вводили інтактним тваринам.

Для оцінки стану печінки при гострому стресі визначали активність ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів – аланінамінотрансферази (АЛТ), аспартат-амінотрансферази (АСТ), альдолази, лужної фосфатази, гама-глутаматтранспептидази (ГГТП), рівень загального білірубіну та його фракцій в сироватці крові ( В.В. Меньшиков и соавт., 1987).

Дезінтоксикаційну функцію печінки оцінювали за допомогою бромсульфалеїнового тесту (Л.И. Израйлет и соавт., 1976).

В гомогенатах печінки і сироватці крові визначали вміст глюкози (A.A. Hyvдrinen, E.A. Nikkilд, 1962), ?іровиноградної і молочної кислоти (Н.Е. Кучеренко и соавт., 1988). В гомогенатах печінки досліджували також вміст глікогену (S. Seifter et al., 1950).

У печінці визначали показники ПОЛ і антиоксидантного захисту: вміст продуктів, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБКАП) (В.Б. Гаврилов и соавт., 1987), активність супероксиддисмутази (СОД) (О.С. Брусов и соавт., 1976; Т.В. Сирота, 1999) і активність каталази (М.А. Королюк и соавт., 1988).

З метою вивчення механізмів дії пірацетаму, церебролізину і мексидолу на процеси гліколізу, ПОЛ та активність антиоксидантних ферментів в печінці, були проведені досліди in vitro. Ферментативний розпад вуглеводів досліджували при інкубації 20% гомогенату печінки інтактних щурів за аеробних і анаеробних умов. Для створення анаеробних умов на реакційну суміш нашаровували вазелінову олію (Т.Т. Берёзов и соавт., 1967). Процеси гліколізу оцінювали за рівнем глюкози, піровиноградної і молочної кислоти (С.Е. Северин, 1989). Модельна система складалася з: 1 мл 20% гомогенату печінки; 0,2 мл 0,15 M розчину MgCl2 ·6H2O; 0,5 мл 48 мМ розчину АТФ; 0,5 мл 6 мМ розчину НАД+, рН 6,5.

В модельній системі для дослідження впливу препаратів на процеси пероксидації використовували 10% гомогенат печінки інтактних білих щурів. Перекисне окиснення ліпідів ініціювали додаючи водний розчин FeSO4 ·7H2O до кінцевої концентрації 10 мМ, що відповідало співвідношенню 3,7 мг FeSO4 на 1 мл гомогенату в інкубаційному середовищі (Д.И. Кузьменко, 1999). В обох випадках гомогенати печінки інкубували в термостаті (370 С) при постійному струшуванні. Проби для дослідження відбирали на початку та через 90 хв індукції.

З метою оцінки стреспротективної дії пірацетаму, церебролізину і мексидолу досліджували класичні загальносоматичні ознаки стрес-синдрому: відносну масу тимусу і надниркових залоз та виразкоутворення в шлунку (В.М. Виноградов, В.А. Полонский, 1983).

Одержані результати піддавали математичній обробці з обчисленням середньої М та її помилки m. Вірогідність даних оцінювали, використовуючи критерій t Ст’юдента. Взаємозв’язок між показниками визначали методом попарної лінійної кореляції (В.Я. Гельман, 2001). Для оцінки фармакологічної ефективності препаратів застосовували дискримінантний аналіз (С.Н. Лапач и соавт., 2000). Обчислення виконано на персональному комп’ютері ІВМ РС Pentium III-1000 за програмами С.Н. Лапача і співавт. (2000).

Результати досліджень та їх обговорення. Дослідженнями встановлено, що гострий стрес викликав підвищення проникності мембран гепатоцитів, порушував білірубінутворюючу і дезінтоксикаційну функцію печінки. Це виявлялось вірогідним підвищенням активності АЛТ, АСТ, альдолази, лужної фосфатази та ГГТП в сироватці крові (рис. 1). Підвищувались концентрація

Рис. 1. Вплив пірацетаму (100 мг/кг), церебролізину (0,1 мл/кг) і мексидолу (100 мг/кг) на активність ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів у сироватці крові щурів при стресі.

Примітки: на цьому та рис. 2-4.

1 - Інтактні тварини;

2 - Стрес (контроль);

3 - Стрес + пірацетам;

4 - Стрес + церебролізин;

5 - Стрес + мексидол;

6 - * - p<0,05 у порівнянні з інтактними тваринами;

7 - ** - p<0,05 у порівнянні з контролем.

загального білірубіну в сироватці крові в 1,3 рази (p<0,02) за рахунок непрямого білірубіну і рівень бромсульфалеїну в ній в 3,4 рази (р<0,001). В основі стресорних ушкоджень печінки знаходились порушення вуглеводного обміну в органі у вигляді зменшення запасів глікогену в 1,7 рази (p<0,001), вмісту глюкози в 1,5 рази (p<0,01) і накопичення молочної кислоти (рис. 2), а також надлишкова пероксидація – вміст ТБКАП і активність каталази підвищувались в 2,3 (p<0,001) і в 1,5 рази (p<0,05) відповідно (рис. 3). Гострий стрес призводив до вірогідного зменшення відносної маси тимусу і гіпертрофії надниркових залоз порівняно з показниками інтактних тварин та розвитку виразково-ерозивних ушкоджень слизової оболонки шлунку в 70% щурів (рис. 4).

Рис. 2. Профілактичний вплив пірацетаму (100 мг/кг), церебролізину (0,1 мл/кг) і мексидолу (100 мг/кг) на показники вуглеводного обміну в печінці щурів при гострому стресі.

Рис. 3. Профілактичний вплив пірацетаму (100 мг/кг), церебролізину (0,1 мл/кг) і мексидолу (100 мг/кг) на процеси перекисного окиснення ліпідів і активність каталази в печінці щурів при гострому стресі.

Встановлено, що профілактичне введення пірацетаму зменшувало в сироватці крові активність ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів і покращувало білірубінутворюючу і дезінтоксикаційну функцію печінки, порушену при гострому стресі (див. рис. 1). Така дія препарату характеризувалась зниженням рівня бромсульфалеїну в сироватці крові в 1,8 рази (р<0,02) порівняно з контролем. В основі профілактичного впливу пірацетаму було підвищення вмісту глікогену і глюкози в 1,5 рази (p<0,02), піровиноградної кислоти в 1,6 рази (p<0,01) та

Рис. 4. Профілактичний вплив пірацетаму (100 мг/кг), церебролізину (0,1 мл/кг) і мексидолу (100 мг/кг) на загальносоматичні показники щурів при гострому стресі.

зменшення вмісту лактату в 1,7 рази (p<0,02) у печінці тварин, підданих стресу (див. рис. 2). Іншим важливим фармакодинамічним ефектом пірацетаму на печінку була його антиоксидантна дія, яка характеризувалась вірогідним зменшенням вмісту ТБКАП в печінці і сироватці крові та нормалізацією активності каталази в органі (див. рис. 3). В цілому, дію пірацетаму на печінку можна розцінювати як захисну, що підтверджувалось даними дискримінантного аналізу і узгоджувалось з ознаками стреспротективної дії на рівні цілого організму. Препарат вірогідно попереджував інволюцію тимусу, гіпертрофію надниркових залоз та зменшував ушкодженя слизової оболонки шлунку (див. рис. 4).

З метою вивчення механізмів впливу пірацетаму на гепатоцити досліджували його ефекти в модельних системах на основі гомогенатів печінки. Експерименти з відтворенням in vitro процесів гліколізу показали, що препарат запобігав накопиченню лактату і сприяв зростанню вмісту піровиноградної кислоти, тобто прямо впливав на вказані процеси. За умов ПОЛ, індукованого йонами Fe2+, пірацетам обмежував приріст ТБКАП, підвищував активність СОД і каталази (табл.). Це свідчило, що препарат виявляв властивості антиоксиданта прямої дії. В дослідах in vitro найбільш ефективною виявилась концентрація препарату 10-1 мг/г тканини, що відповідає дозі 100 мг/кг в експериментах на тваринах.

Таким чином, пірацетам захищає печінку при стресі. В цьому, поряд з відомими центральними стреспротективними ефектами пірацетаму, значне місце займають його периферичні метаболічні властивості, які виявляються у попередженні зменшення вмісту глікогену, глюкози і піровиноградної кислоти в органі та підтриманні прооксидантно-антиоксидантного балансу в печінці на рівні такого в інтактних тварин за рахунок впливу на центральні і периферичні стрес-лімітуючі системи.

Запобіжне введення церебролізину зменшувало стресорні ушкодження печінки, що виявлялось в зниженні активності альдолази в 1,5 рази (p<0,02) і ГГТП в 2,3 рази (p<0,01) в сироватці крові (див. рис. 1). Мало місце вірогідне зниження рівня загального білірубіну в 1,5 рази за рахунок непрямого білірубіну. В основі впливу церебролізину на печінку при гострому стресі знаходилась його здатність модифікувати процеси вуглеводного обміну і ПОЛ (див. рис. 2 і рис. 3). Це супроводжувалось зменшенням вмісту лактату в тканині печінки в 1,5 рази (p<0,05), а також зниженням вмісту проміжних продуктів ПОЛ в печінці і сироватці крові. Такий вплив церебролізину на функції печінки можна розцінювати як позитивний, але він був менше виражений, ніж у пірацетаму, що узгоджується з відсутністю попередження розвитку класичних загальносоматичних ознак стресу і даними дискримінантного аналізу (див. рис. 4).

В дослідах in vitro церебролізин попереджував накопичення молочної кислоти, нормалізував співвідношення піруват/лактат, а за умов індукованого ПОЛ зменшував концентрацію ТБКАП і підтримував високу активність СОД та каталази (див. табл.). Це свідчило, що препарат, подібно до пірацетаму, мав прямий вплив на процеси гліколізу і ПОЛ в гепатоцитах. За цих умов максимально ефективною виявилась концентрація церебролізину 10-4 мл/г тканини печінки, що відповідає дозі 0,1 мл/кг маси тварин.

Таким чином, позитивні фармакодинамічні ефекти церебролізину на печінку при гострому стресі зумовлені локальними стрес-лімітуючими факторами у вигляді обмеження ПОЛ і зменшення вмісту лактату в органі.

Мексидол – антиоксидант з ноотропною дією виявляв гепатопротекторні властивості при одноразовому застосуванні перед гострим стресом. Препарат зменшував в сироватці крові активність АЛТ в 1,6 рази (p<0,05), альдолази в 1,7 рази (p<0,01), активність лужної фосфатази і ГГТП в 1,4 (p<0,01) і 1,5 рази (р<0,05) відповідно (див. рис. 1). Мексидол нормалізував дезінтоксикаційну і коньюгаційно-екскреторну функцію печінки, зменшуючи в сироватці крові рівень бромсульфалеїну в 1,7 рази (p<0,05), і попереджував розвиток стресорної гіпербілірубінемії за рахунок зменшення концентрації непрямого білірубіну в сироватці крові в 1,6 рази (p<0,01). Серед гепатопротекторних ефектів мексидолу при гострому стресі важливо відмітити, що він нормалізував вміст глікогену і зменшував в 1,5 рази (p<0,05) рівень молочної кислоти в тканині печінки, запобігав розвитку гіперлактатемії (див. рис. 2). Препарат попереджував зростання вмісту ТБКАП в печінці і сироватці крові в 1,4 (p<0,05) і в 1,5 рази (p<0,01) відповідно і підтримував на рівні норми активність каталази в органі (див. рис. 3). Захисний вплив мексидолу на печінку тварин супроводжувався попередженням змін класичних загальносоматичних ознак стресу. Препарат вірогідно запобігав інволюції тимусу і гіпертрофії надниркових залоз, відносна маса яких була в 1,4 рази (p<0,05) менша порівняно з контролем, а також зменшував ушкодження слизової оболонки шлунку (див. рис. 4).

В дослідах in vitro мексидол модифікував процеси гліколізу, сприяв переважному утворенню піровиноградної кислоти. За умов модельної системи з індукованим ПОЛ йонами двохвалентного заліза мексидол запобігав накопиченню ТБКАП і підтримував активність СОД і каталази на належному рівні (див. табл.). Це означало, що в механізмах гепатопротекторної дії мексидолу при стресі важливе місце займає прямий вплив на ферментні системи гліколізу і антиоксидантного захисту, а також на стан клітинних мембран. Слід відмітити, що в дослідах in vitro мексидол виявляв антиоксидантні властивості в широкому діапазоні концентрацій, на відміну від інших досліджуваних препаратів. Вони знаходились в межах від 10-2 до 1 мг/г і відповідали ефективним дозам 10-1000 мг/кг маси тіла, що узгоджувалось з даними літератури (Т.А. Воронина и соавт., 2000).

Таблиця

Вплив пірацетаму, церебролізину і мексидолу на процеси пероксидації в гомогенатах печінки щурів (М+m)

Характер дослідів | ТБКАП, нмоль/г | СОД, % гальмування | Каталаза, ммоль/хв·г | базальний рівень | 90 хв | базальний рівень | 90 хв | базальний рівень | 90 хв | Спонтанне перекисне окиснення | 121+7,7 | 492+34# | 66,4 +4,9 | 32,8+6,4# | 2,18+0,18 | 3,95+0,28# | Індукція (контроль) | 126+7,0 | 622+44*, # | 63,7+5,0 | 26,2+4,5# | 2,16+0,18 | 0,96+0,14*, # | Пірацетам, 10-1 мг/г | 125+11,6 | 359+15**, # | 68,1+6,1 | 47,86,7**, # | 2,21+0,21 | 1,85+0,23** | Індукція +

церебролізин,10-4 мл/г | 121,7+11,0 | 370+42**, # | 70,6+8,3 | 58,6+6,9** | 2,07+0,19 | 2,43+0,34** | Індукція +

мексидол, 10-2 мг/г | 124+8,0 | 350+38**, # | 66,1+4,8 | 36,8+4,2# | 2,23+0,19 | 1,80+0,21** | Індукція +

мексидол, 10-1 мг/г | 123+7,5 | 367+40**, # | 67,3+4,7 | 52,4+5,9** | 2,27+0,18 | 2,36+0,31** | Індукція +

мексидол, 1 м/г | 121+8,1 | 447+40**, # | 65,8+5,4 | 67,6+7,2** | 2,21+0,18 | 3,74+0,36**, # |

Примітки:

1.

2.

3.

Результати дослідження свідчать про прямий вплив мексидолу на вуглеводний обмін, процеси ПОЛ і стан антиоксидантного захисту в тканині печінки. Аналізуючи дані літератури, можна стверджувати, що поряд з безпосереднім впливом на гепатоцити в механізмах гепатопротекторної дії мексидолу при гострому стресі мала місце анксиолітична дія препарату (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 1998; Т.А. Воронина, 2001), яка призвела до обмеження активності провідних стрес-реалізуючих систем і, відповідно, до зменшення зрушень у печінці за умов стресу. Мексидол, подібно до пірацетаму і церебролізину, мав виражений вплив на процеси гліколізу, який супроводжувався накопиченням енергетичних субстратів, і поряд з цим, він виявляв високу антиоксидантну активність. Ці зміни сприяли підтриманню нормального функціонального стану гепатоцитів і епітелію жовчних ходів, що підтверджувалося відсутністю гіперферментемії та існуванням міцних вірогідних кореляцій між показниками, які характеризували зазначені процеси, і активністю ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів, рівнем білірубіну та бромсульфалеїну в сироватці крові. За даними дискримінантного аналізу сукупність біохімічних показників, що характеризували стан печінки при профілактичному застосуванні мексидолу, належало до класу “умовна норма”. Це свідчило про здатність мексидолу попереджувати ушкодження печінки за умов гострого стресу.

При порівнянні впливу мексидолу і аналогів його структурних компонентів (емоксипіну, піридоксину гідрохлориду і натрію сукцинату) на метаболічні процеси в печінці встановлено, що мексидол наслідував гепатопротекторні властивості від свого структурного попередника піридоксину, а наявність сукцинату в його молекулі підсилювала захисну дію препарату на печінку.

Таким чином, нейротропні препарати – пірацетам, церебролізин і мексидол попереджували ушкодження печінки при гострому стресі. Спільним у механізмах профілактичної дії препаратів є прямий вплив на вуглеводний обмін, процеси ПОЛ і антиоксидантний захист у органі.

Одержані результати розширюють уявлення про фармакодинаміку нейротропних засобів і експериментально обгрунтовують доцільність застосування пірацетаму, церебролізину і мексидолу для профілактики ушкоджень печінки стресорного генезу. Ці нейротропні засоби, вочевидь, можуть бути використані не тільки при стресорних ушкодженнях печінки, а і в комплексній терапії іншої патології гепатобіліарної системи.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, що полягає в експериментальному обгрунтуванні доцільності застосування для фармакопрофілактики стресорних ушкоджень печінки нейротропних засобів (пірацетаму, церебролізину і мексидолу).

1. Гострий стрес викликає підвищення проникності мембран гепатоцитів, порушує дезінтоксикаційну функцію печінки білих щурів, що виявляється вірогідним підвищенням активності аланінамінотрансферази в 1,9 рази, аспартатамінотрансферази – в 1,6 рази, альдолази – в 2,5 рази, лужної фосфатази – в 2,0 рази та гама-глутаматтранспептидази – в 2,3 рази в сироватці крові, підвищенням концентрації загального і непрямого білірубіну в 1,3 рази (р<0,02) та рівня бромсульфалеїну в сироватці крові в 3,4 рази (р<0,001). При цьому порушується вуглеводний обмін у органі – зменшуються запаси глікогену в 1,7 рази (р<0,001) і глюкози в 1,5 рази (р<0,01), зростає вміст лактату в 1,8 рази (р<0,02), реєструється активація процесів перекисного окиснення ліпідів і порушення антиоксидантного захисту – підвищуються вміст ТБКАП в 2,3 рази (р<0,001) і активність каталази в 1,5 рази (p<0,05).

2. Одноразове введення пірацетаму білим щурам (100 мг/кг внутрішньо-очеревинно) за 30 хв до початку гострого стресу попереджує порушення функціонального стану печінки тварин, що виявляється в зменшенні в сироватці крові активності ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів: аланінамінотран-сферази – в 1,5 рази (p<0,05), альдолази – в 1,7 рази (p<0,01), лужної фосфатази – в 1,6 рази (p<0,01), гама-глутаматтранспептидази – в 1,5 рази (p<0,05) і попередженні порушення дезінтоксикаційної функції органу порівняно з контролем. Пірацетам в печінці попереджує зменшення запасів глікогену в 1,5 рази (p<0,02) і глюкози – в 1,5 рази (p<0,02), вмісту піровиноградної кислоти – в 1,6 рази (p<0,01), попереджує зростання вмісту лактату в 1,7 рази (p<0,02) і вірогідно запобігає збільшенню вмісту ТБКАП та активності каталази в органі. Препарат також вірогідно попереджує інволюцію тимусу, гіпертрофію надниркових залоз та зменшує ушкодження слизової оболонки шлунку.

3. Застосування церебролізину (0,1 мл/кг внутрішньоочеревинно) одноразово за 30 хв перед гострим стресом справляє позитивний вплив на функціональний стан печінки щурів, що виявляється зниженням в сироватці крові активності альдолази в 1,5 рази (p<0,02), гама-глутаматтранспептидази в 2,3 рази (p<0,01) і попередженням гіпербілірубінемії порівняно з контролем. Профілактична дія препарату при гострому стресі супроводжується зменшенням вмісту лактату в 1,6 рази (p<0,01) і вмісту ТБКАП у печінці в 1,7 рази (p<0,01).

4. Мексидол (100 мг/кг) при одноразовому профілактичному внутрішньо-очеревинному введенні за 30 хв до початку гострого стресу справляє гепатопротекторну дію, що виявляється зменшенням у сироватці крові активності ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів: аланінамінотрансферази – в 1,6 рази (p<0,05), альдолази – в 1,7 рази (p<0,01), лужної фосфатази – в 1,4 рази (p<0,01), гама-глутаматтранспептидази – в 1,5 рази (p<0,05) і покращенням дезінтоксикаційної функції печінки. Препарат попереджує зменшення вмісту глікогену (p<0,05) і накопичення лактату в печінці (p<0,05) та в сироватці крові (p<0,02), вірогідно запобігає накопиченню ТБКАП в печінці і сироватці крові та зміні активності каталази в органі. Мексидол вірогідно попереджує інволюцію тимусу і гіпертрофію надниркових залоз, відносна маса яких в 1,4 рази (p<0,05) менша порівняно з контролем.

5. За даними дискримінантного аналізу найбільш ефективно попереджує стресорні ушкодження печінки мексидол (значення константи -3,07Е+17; середнє значення дискримінантної функції 2,3Е+17), менш активними виявляються пірацетам (середнє значення дискримінантної функції 1,18Е+17) і церебролізин (середнє значення дискримінантної функції -4,1Е + 17).

6. Механізм гепатопротекторної дії пірацетаму, церебролізину і мексидолу може бути обумовлений прямим позитивним впливом препаратів на процеси гліколізу в печінці і наявністю у них антиоксидантних властивостей. Це підтверджується тим, що в модельній системі на основі гомогенатів печінки з відтворенням процесів гліколізу пірацетам (10-1 мг/г) підвищує вміст піровиноградної кислоти в 1,6 рази (р<0,05), знижує вміст лактату в 1,5 рази (р<0,02), а за умов індукованого ПОЛ препарат знижує вміст ТБКАП в 1,7 рази (р<0,001), підвищує активність супероксиддисмутази в 1,8 рази (р<0,05) і каталази в 1,9 рази (р<0,01) порівняно з контролем. Церебролізин (10-4 мл/г) в дослідах in vitro вірогідно запобігає накопиченню молочної кислоти, підтримує на рівні норми співвідношення піруват/лактат, а також на фоні індукованого ПОЛ вірогідно зменшує концентрацію ТБКАП і підвищує активність супероксиддисмутази і каталази порівняно з такими в гомогенатах без препарату. Мексидол (10-1 мг/г, 1 мг/г) за аналогічних умов, подібно до пірацетаму, корегує процеси гліколізу і пероксидації в гомогенатах печінки.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Девяткина Т.А., Важничая Е.М., Луценко Р.В. Особенности процессов перекисного окисления липидов в различных тканях при остром стрессе и его коррекции пирацетамом и церебролизином // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2000. - Т.63, № 4. - С. 38-41. (Здобувач особисто визначав біохімічні показники в печінці, здійснював їх статистичну обробку та аналіз, написав частину тексту статті).

2. Важнича О.М., Дев’яткіна Т.О., Луценко Р.В. Розвиток вчення про стрес на сучасному етапі // Одеський медичний журнал. - 2000. - №6 (62). - С. 108-110. (Здобувачем особисто проведено пошук і аналіз частини літератури).

3. Дев’яткіна Т.О., Важнича О.М., Луценко Р.В. Порівняльна характеристика антиоксидантної активності мексидолу, емоксипіну і натрію сукцинату при гострому стресі // Фармацевтичний журнал. - 2000. - № 2. - С. 65-69. (Здобувачем особисто виконано визначення показників перекисного окиснення ліпідів в тканині печінки і їх статистичну обробку).

4. Луценко Р.В. Пірацетам, мексидол та церебролізин у корекції порушень обміну глюкози за умов гострого стресу // Ліки. - 2001. - №5-6. - С. 97-100.

5. Луценко Р.В. Вплив мексидолу на перекисне окиснення ліпідів в модельній системі на основі гомогенатів печінки // Матер. научн.-практ. конф. "Лекарства - человеку". Харьков. - 2001. - Т. XV, №1-2. - С. 332-336.

6. Луценко Р.В., Важнича О.М. Вплив пірацетаму на кореляції між біохімічними показниками гепатолієнальної системи при стресі // Вісник фармації. - 2001. - №3(27). - С. 145. (Здобувач особисто виконав дослідження біохімічних показників у печінці та їх статистичну обробку, оформив статтю до друку).

7. Луценко Р.В., Важнича О.М. Екстрацеребральні ефекти церебролізину при гострому стресі та їх механізми // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісник УМСА. – 2001. - Т.1, вип. 1-2. - С. 28-30. (Здобувачем особисто виконані експериментальні дослідження, що стосуються тканини печінки, проведено їх статистичну обробку і підготовлено статтю до друку).

8. Луценко Р.В., Важнича О.М. Порівняння вираженості морфо-функціональних і метаболічних зрушень при різних видах гострого стресу // Медицина сьогодні і завтра. - 2001. - №3. - С. 9-11. (Здобувач особисто визначав всі біохімічні показники в печінці, провів статистичний аналіз).

9. Дев’яткіна Т.О., Луценко Р.В. Стресорні пошкодження печінки і їх корекція пірацетамом // Міжвідомчий збірник “Гастроентерологія.“ – 2001. - Вип.32. - С. 235-240. (Здобувачем особисто виконані всі біохімічні дослідження, їх статистичну обробку і написано текст статті).

10. Важнича О.М., Луценко Р.В., Дев’яткіна Т.О. Ноотропні засоби і перспективи їхнього застосування при стресі // Матер. научн.-практ. конф. "Лекарства - человеку". Харьков. - 2001. - Т. XVІ, №1-2. - С. 95-101. (Здобувачем особисто зроблено аналіз частини літератури за темою роботи і написано частину тексту статті).

11. Луценко Р.В. Дослідження антиоксидантної активності церебролізину за умов індукованого перекисного окиснення ліпідів у гомогенатах печінки // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісник УМСА. - 2002 - Т.2, вип.1. - С. 29-31.

12. Луценко Р.В. Особливості антиоксидантної дії пірацетаму в дослідах in vitro // Медична хімія. - 2002. - Т.4, №1. - С. 56-58.

13. Луценко Р.В., Дев’яткіна Т.О. Гепатопротекторна активність церебролізину при гострому стресі // Матер. научн.-практ. конф. "Лекарства - человеку". Харьков. - 2002. - Т. XVII, №1. - С. 241-245. (Здобувач особисто виконав експериментальні дослідження, статистичну обробку результатів, оформив статтю до друку).

14. Дев’яткіна Т.О., Луценко Р.В., Важнича О.М. Вуглеводний обмін в печінці білих мишей при стресі та його корекція мексидолом і структурними аналогами // Фізіологічний журнал. - 1998. - Т.44, №3. - С. 329-330.

15. Девяткина Т.А., Важничая Е.М., Луценко Р.В. Использование корреляционного анализа и информационных показателей для оценки системных механизмов стресса // Второй Российский Конгресс патофизиологов “Патофизиология органов и систем. Типовые патоло-гические процессы”. - Москва, 2000. - С. 211.

16. Девяткина Т.А., Луценко Р.В., Важничая Е.М. Влияние пирацетама на биохимические показатели печени в условиях стресса // VІІ Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”. - Москва, 2000. - С. 401.

17. Луценко Р.В. Порівняння активності різних доз пірацетаму при гострому стресі // Матер. ІІ Нац. з’їзду фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок у майбутнє”. – Дніпропетровськ. - 2001. - С. 155.

18. Луценко Р.В., Олійник Н.О. Антистресорна дія пірацетаму в амбулаторних хворих і її антиоксидантні механізми // Матер. Всеукраїнської науково-прак. конф. студентів та молодих вчених “Актуальні проблеми клінічної, експериментальної та профілактичної медицини”. - Донецьк, 2002. - С. 38.

19. Дев’яткіна Т.О., Луценко Р.В., Важнича О.М. Роль порушень вуглеводного обміну та процесів перекисного окиснення ліпідів у стресорному пошкодженні печінки та імунокомпетентних органів // Фізіологічний журнал. – 2002. – Т.48, №2. – С. 95.

20. Дев’яткіна Т.О., Важнича О.М., Луценко Р.В. Доклінічне дослідження стреспротективної дії фармакологічних засобів: Методичні рекомендації. - Киів, 2001. - 24 с. (Здобувачем особисто проведено пошук і аналіз частини літератури та оформлення до друку).

21. Важничая Е.М., Луценко Р.В., Девяткина Т.А. Применение пирацетама для профилактики повреждений иммунокомпетентных органов и печени стрессорного генеза: Информационный листок №1 - Харьков: ХЦНТЭИ, 2002. - 2 с. (Здобувач особисто визначав всі біохімічні показники в печінці і підготував інформаційний листок до друку).

22. Важничая Е.М., Луценко Р.В., Девяткина Т.А. Экстрацеребральные эффекты церебролизина и возможности их клинического использования: Информационный листок №2 - Харьков: ХЦНТЭИ, 2002. - 2 с. (Здобувачем особисто виконані дослідження біохімічних показників у печінці та їх статистична обробка).

АНОТАЦІЇ

Луценко Р.В. Попередження ушкоджень печінки при гострому стресі за допомогою нейротропних засобів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена вивченню гепатопротекторної дії пірацетаму (100 мг/кг і 300 мг/кг), церебролізину (0,1 мл/кг) і мексидолу (100 мг/кг) при гострому стресі. Показано, що за умов стресу препарати попереджують підвищення активності ферментів-маркерів ушкодження гепатоцитів (аланінамінотрансферази і альдолази) і епітелію жовчних ходів (лужної фосфатази і гама-глутаматтранспептидази), знижують рівень білірубіну і поліпшують дезінтоксикаційну функцію печінки в тесті з бромсульфалеїном. Ці ефекти розвиваються на фоні пригнічення перекисного окиснення ліпідів і зрушень співідношення піруват/лактат в печінці вбік пірувату. В дослідах in vitro встановлено, що пірацетам, церебролізин і мексидол мають прямий вплив на процеси