НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

МОГИЛЬНИЦЬКА Лілія Анатоліївна

УДК 616-091-08: 616-008.9.397-08

ПОКАЗНИКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ЕНДОТЕЛІЮ ПРИ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ 2-ГО ТИПУ

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ендокринології та обміну речовин АМН України ім. В. П. Комісаренка, м. Київ

Науковий керівник - доктор медичних наук, старший науковий співробітник Маньковський Борис Микитович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділення профілактичної діабетології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Колесник Юрій Михайлович,

ректор Запорізького державного медичного університету, завідувач кафедрою патологічної фізіології

доктор медичних наук, доцент

Ткаченко Михайло Миколайович,

провідний науковий співробітник Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Провідна установа:

Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, кафедра патологічної фізіології, м. Київ

Захист відбудеться “_2_____“__грудня___________2003 р. о____14____годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 26.198.01 в Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.)

Автореферат розісланий “_1__”__листопада________ 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми: Цукровий діабет є однією з основних медико-соціальних проблем сучасного суспільства, насамперед, внаслідок значної розповсюдженості захворювання та частого розвитку ускладнень (Єфімов А.С., Скробонська Н.А., 1998). В індустріально розвинених країнах розповсюдженість цукрового діабету складає 2-4% в загальній популяції, а в групі осіб старше 65 років величина даного показника зростає до 10% (Zimmet P.Z., 1999).

В даний час цукровий діабет 2-го типу розглядається як неоднорідне захворювання за етіологією, патогенезом, клінічним перебігом, схильністю до розвитку та прогресування ускладнень. Великі розходження відзначаються між пацієнтами з нормальною та підвищеною масою тіла (WHO, 1999). Незважаючи на велику кількість експериментальних та клінічних досліджень, спрямованих на розкриття патогенезу цукрового діабету 2-го типу, багато факторів та механізмів розвитку хвороби та її судинних ускладнень залишаються до кінця не вивченими.

В останні роки з’явились дані про важливу роль біологічно активних речовин, що виробляються ендотелієм, у регуляції кровообігу, судинного тонусу, місцевих процесів гемостазу, проліферації, міграції клітин крові (Luscher T.F., 1997; Мойбенко О.О. та співав., 1997; Ткаченко М.М., 1997). Порушення цих процесів – ендотеліальна дисфункція - є одним з патогенетичних механізмів розвитку атеросклерозу (Ross R., 1998; Williams K.J., Tabas I., 1995). Разом з тим відомо, що ендотеліальна дисфункція є проявом метаболічного синдрому (Hsueh W.A., Quinones M.J., 2003), який включає порушення вуглеводного обміну, інсулінорезистентність, артеріальну гіпертензію, абдомінальне ожиріння, дисліпідемію, мікроальбумінурію, і являє собою важливий фактор ризику серцево-судинної патології (Reaven G.M., 2002).

Експериментальними та клінічними дослідженнями останніх років встановлено, що ендотеліальна дисфункція часто розвивається у хворих на цукровий діабет, що має своїми проявами порушення ендотелій-залежної вазодилятації у відповідь на фармакологічні або механічні подразники (Eschwege E., 2003). Разом з цим, механізми розвитку ендотеліальної дисфункції при цукровому діабеті вивчені недостатньо. Не висвітлено вплив гіперглікемії та ожиріння на показники функціонального стану ендотелію у хворих на цукровий діабет 2-го типу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної теми відділення профілактичної діабетології Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України “Вивчити особливості метаболізму мозкової та печінкової тканини у осіб похилого віку хворих на цукровий діабет за допомогою магнітно-резонансної спектроскопії” (номер Державної реєстрації 0101U002549).

Мета дослідження: охарактеризувати показники функціонального стану ендотелію у хворих на цукровий діабет 2-го типу з різною масою тіла.

Завдання дослідження.

1. Вивчити вміст метаболітів оксиду азоту в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу з різною масою тіла.

2. Дослідити співвідношення між метаболітами оксиду азоту у хворих на цукровий діабет з ожирінням та нормальної масою тіла.

3. Вивчити активність індуцибельної NO-синтази в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу з різною масою тіла.

4. Визначити вміст ендотеліну-1 в сироватці крові при цукровому діабеті, що розвився на фоні ожиріння або нормальної маси тіла.

5. Дослідити механізми впливу бета-адреноблокатору небівололу на вміст метаболітів оксиду азоту, активність різних ізоформ NO-синтази, рівень ендотеліну-1 в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу та артеріальну гіпертензію.

6. Виявити зв’язок між рівнем глікемії, масою тіла та вмістом у крові ендотеліальних вазоактивних факторів.

Об'єкт дослідження – цукровий діабет 2-го типу, ожиріння, артеріальна гіпертензія.

Предмет дослідження – ендотеліальні вазоактивні фактори, небіволол.

Наукова новизна одержаних результатів:

На основі вивчення показників функціонального стану ендотелію були розширені уявлення про механізми ендотеліальної дисфункції, роль гіперглікемії та ожиріння у розвитку цього патологічного феномену при цукровому діабеті 2-го типу .

1. Вперше виявлено, що підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту в сироватці крові при цукровому діабеті 2-го типу пов’язано з рівнем гіперглікемії і не залежить від маси тіла.

2. Вивчені співвідношення між сироватковими рівнями різних метаболітів оксиду азоту. У хворих на цукровий діабет 2-го типу знайдено підвищення сумарного вмісту метаболітів оксиду азоту, зниження відносного вмісту нітрит-аніону та підвищення відносного вмісту нітрат-аніону від загальної суми метаболітів оксиду азоту, незалежно від маси тіла, а також підвищення сумарного вмісту метаболітів оксиду азоту у осіб з ожирінням, що не страждають від цукрового діабету.

3. Вперше встановлено, що підвищення активності індуцибельної NO-синтази в сироватці крові при цукровому діабеті 2-го типу пов’язано з рівнем гіперглікемії і не залежить від маси тіла. Підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту відбувається за рахунок активації індуцибельної ізоформи NO-синтази.

4. Знайдено підвищення рівня ендотеліну-1 у хворих на цукровий діабет 2-го типу, що корелює із рівнем глікемії. Ожиріння самостійно також викликає підвищення рівня ендотеліну-1 як у поєднанні з цукровим діабетом, так і без діабету. Рівень ендотеліну-1 зворотно пов’язаний з рівнем метаболітів оксиду азоту та активністю індуцибельної NO-синтази.

5. Призначення бета-адреноблокатору небівололу викликає зниження рівня ендотеліну-1, підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту за рахунок активації індуцибельної NO-синтази у хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією.

Проведені дослідження розширюють знання про функціональний стан ендотелію та механізми розвитку ендотеліальної дисфункції у хворих на цукровий діабет 2-го типу з різною масою тіла та у осіб із ожирінням, що не страждають від цукрового діабету.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати свідчать про порушення функціонального стану ендотелію у хворих на цукровий діабет 2-го типу та значний вплив глікемії на розвиток цих патологічних змін. Це може вказувати на можливість попередження розвитку виявлених порушень за умов досягнення стійкої нормоглікемії у хворих на цукровий діабет з метою профілактики та корекції ендотеліальної дисфункції.

Зміни вмісту ендотеліальних вазоактивних факторів у осіб з ожирінням, які не страждають від цукрового діабету, свідчать про необхідність лікування ожиріння з метою профілактики подальшого прогресування ендотеліальної дисфункції та розвитку патологічних станів, пов’язаних із нею.

Доведений позитивний вплив бета-адреноблокатору небівололу на вміст ендотеліальних вазоактивних факторів дозволяє рекомендувати даний препарат для лікування артеріальної гіпертензії та корекції ендотеліальної дисфункції у хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проводилось клінічне та антропометричне обстеження осіб, що були залучені до дослідження, розрахунок кореляційних зв’язків, статистична обробка отриманих результатів, розрахунок коефіцієнтів співвідношення між метаболітами оксиду азоту. Автор брала безпосередню участь у визначенні вмісту метаболітів оксиду азоту, активності NO-синтази, рівня ендотеліну-1. Автором самостійно викладені результати досліджень та написана дисертаційна робота і автореферат.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на 18-му конгресі Міжнародної Діабетологічної Федерації (м. Париж, Франція, 2003); на 2-му міжнародному симпозіумі з інсулінорезистентності (м. Сан-Дієго, США, 2002); на 37-му конгресі Європейської асоціації по вивченню цукрового діабету (м. Глазго, Шотландія, 2001); на 3-му міжнародному симпозіумі з інсулінорезистентності (м. Нью-Орлеан, США, 2003); на Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Нові напрямки в діагностиці, лікуванні і профілактиці артеріальної гіпертензії та її ускладнень” (м. Харків, 2002); на 4-ій республіканській науково-практичній конференції “Нове в клінічній фармакології та фармакотерапії захворювань внутрішніх органів” (м. Харків, 2002); на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Проблеми діагностики та лікування ендокринопатій” (м. Вінниця, 2003); на 1-ій науково-практичній конференції молодих вчених, присвяченій ювілею з дня народження В.П. Комісаренка (м. Київ, 2002); на IV Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам’яті академіка В.В.Фролькіса (м. Київ, 2003); на засіданні апробаційної комісії з клінічної ендокринології Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (2002); на засіданні сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (м. Київ, 2003).

Публікації результатів дослідження. По темі дисертації опубліковано 13 друкованих робіт, із них 4 статті у спеціалізованих наукових журналах та 9 тезів конгресів, симпозіумів та науково-практичних конференцій (4 з них закордонних).

Об`єм та структура дисертації. Дисертація викладена на 151 сторінках машинописного тексту. Складається з вступу, огляду літератури, п’яти розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків, практичних рекомендацій на 125 сторінках, списку використаної літератури на 26 сторінках, що включає 218 літературних джерел (42 вітчизняних та 176 іноземних). Дисертація ілюстрована 20 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Робота виконана у відділені профілактичної діабетології Інституту ендокринології та обміну речовин В.П.Комісаренка АМН України (планування та апробація роботи), у Хмельницькій обласній клінічній лікарні (клінічне обстеження хворих та збір матеріалу), у відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В.Паладіна НАН України (визначення вмісту метаболітів оксиду азоту та активності NO-синтаз за консультативною допомогою ст.н.сп., к.б.н. Коцюруби А.В.), на базі Західно-Українського регіонального центру клінічної імунології та алергології, у лабораторно-діагностичному відділі лабораторії імуноферментного аналізу (визначення рівня ендотеліну-1).

Матеріали та методи дослідження. Обстежено 108 чоловік, з них - 64 хворих на цукровий діабет 2-го типу, котрі були розподілені на такі групи: 32 хворих з ожирінням та 32 - з нормальною масою тіла, та 44 особи, які не страждають від цукрового діабету, серед них - 22 особи з нормальною масою тіла та 22 особи з ожирінням. Серед обстежених було 58 жінок (54%) і 50 чоловіків (46%). Вік обстежених склав (дані наведені як середнє стандартна похибка) 54,61,39 років в групі хворих на цукровий діабет із ожирінням та 52,11,65 - в групі хворих на цукровий діабет із нормальною масою тіла. В групі осіб, що не страждають від діабету, вік осіб з ожирінням склав 52,82,1, з нормальною масою тіла - 481,37 років. Вік хворих в усіх групах вірогідно не відрізнявся, р>0,05. Діагноз цукрового діабету 2-го типу встановлювали згідно з критеріями ВООЗ (1999). При обстеженні осіб з ожирінням з метою виключення цукрового діабету та порушення толерантності до глюкози проводили стандартний тест толерантності до глюкози. Для встановлення діагнозу ожиріння визначали індекс маси тіла (ІМТ). Ожиріння діагностувалось при ІМТ>30 кг/м2. ІМТ в групі хворих на цукровий діабет 2-го типу з ожирінням склав 35,280,83 кг/м2, в групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла – 24,20,75 кг/м2, в групі осіб з ожирінням без діабету - 33,930,6 кг/м2, в групі без діабету з нормальною масою тіла – 24,030,61 кг/м2, р<0,05 при порівнянні цього показника між групами з ожирінням та нормальною масою тіла, як у осіб, що хворіють та не хворіють на діабет. Показник ІМТ не відрізнявся в групах осіб з ожирінням, які хворіють або не хворіють на діабет. Рівень глікемії визначався натще безпосередньо в тих зразках венозної крові, що використовувались для подальших досліджень, і складав в групі хворих на цукровий діабет з ожирінням 11,70,9 ммоль/л, в групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла – 13,91,02 ммоль/л, в групі з ожирінням без діабету – 4,90,29 ммоль/л, в контрольній групі з нормальною масою тіла – 4,50,2 ммоль/л. Серед хворих на цукровий діабет із ожирінням артеріальну гіпертензію (АГ) діагностовано у 27 (84,4%) осіб, в групі пацієнтів з діабетом та нормальною масою тіла АГ була відмічена у 14 (43,75%) осіб. У осіб без діабету АГ була виявлена у 18 (81,8%) осіб з ожирінням, і у 9 (40,9%) осіб з нормальною масою тіла. В дослідження не були включені особи, які отримують препарати, що потенційно здатні впливати на функціональний стан ендотелію, а саме: гіполіпідемічні засоби, інгібітори ангіотензинперетворюючого ферменту, блокатори кальцієвих каналів, нітрати, гормональні контрацептивні засоби та препарати замісної гормональної терапії. За 3 дні до забору крові для досліджень із харчового раціону вилучались продукти, що можуть містити сполуки азоту (копченості).

Вміст нітрит-аніону визначали спектрофотометричним методом Гріна з використанням реактиву Гріса (Green L.C. et al., 1982) у сучасній модифікації (Коцюруба А.В. та співав., 2000), вміст нітрат-аніону визначали спектрофотометричним методом за допомогою бруцинового реактиву (Isukahara H. et al., 1996). Для визначення активності NO-синтази: сумарної та індуцибельної (Са2+-залежної та Са2+-незалежної) використовували комбінацію класичного методу (Salter M. et al., 1991) з сучасною його модифікацією (Сhin S.Y., et al., 1999; Сагач В.Ф. та співав., 2003), пристосовану для спектрофотометричного вимірювання одного з продуктів реакції – нітрит-аніона (Vodovotz Y., et al. 1994). Активність конституційної NO-синтази визначали, як різницю між активністю сумарної та індуцибельної NO-синтази. Визначення рівня ендотеліну-1 проводились імуноферментним методом із використанням сорбційних колонок “Аmprer” (Amersham Lifesilence) та тест-систем “Amersham pharmacia biotech” (England). Дослідження проводилися на плошковому ELISA-аналізаторі “Stat Fax-303 Plus” (USA). Статистичну обробку даних проводили методами варіаційної та описової статистики за допомогою стандартного пакета статистичного розрахунку даних програми Microsoft Excel на персональном компьютере Сеleron 600. Достовірність відмінностей середніх величин визначали за критерієм t-Стьюдента. Відмінність вважалась достовірною при величині показника р<0,05. Кореляційний аналіз між рядами показників розраховували за коефіцієнтом Пірсона (Лапач С.Н. та співав., 2000).

Результати дослідження та їх обговорення.

Вміст метаболітів оксиду азоту в сироватці крові при цукровому діабеті. Нами виявлено статистично достовірне підвищення вмісту нітрит-аніону (NO2- ) у хворих на цукровий діабет 2-го типу з ожирінням, в порівнянні з групою осіб з ожирінням, що не страждають від цукрового діабету (табл.1). В групі хворих на цукровий діабет 2-го типу з нормальною масою тіла рівень NO2- був також достовірно вищий, ніж в контрольній групі осіб з нормальною масою тіла. Виявлено статистично достовірне підвищення вмісту нітрат-аніону (NO3-) в групі хворих на цукровий діабет 2-го типу з ожирінням, в порівнянні з цим показником в групі осіб з ожирінням, що не страждають від цукрового діабету. Рівень NO3- в групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла був достовірно вищий, ніж у таких осіб, що не страждають від цукрового діабету (див. табл. 1)

Таблиця 1. Вміст метаболітів оксиду азоту, їх співвідношення та активність індуцибельної NO-синтази в сироватці крові у хворих на цукровий діабет 2-го типу та осіб без діабету з різною масою тіла

Групи

Показник | Особи з ожирінням | Особи з нормальною масою тіла

Хворі на цукровий діабет | Особи, що не хворіють на цукровий діабет | Хворі на цукровий діабет | Особи, що не хворіють на цукровий діабет

Нітрит-аніон, нмоль/мг білка | 0,1040,02* | 0,0340,015 | 0,090,018** | 0,0380,01

Нітрат-аніон, нмоль/мг білка | 7,830,82* | 4,770,55 | 8,150,59** | 4,290,43

Сумарний вміст метаболітів оксиду азоту, нмоль/мг білка | 7,940,83* | 5,320,13# | 8,672,25** | 3,980,46

Відносний вміст нітрит-аніону від загального вмісту метаболітів оксиду азоту, % | 1,260,2* | 2,00,05 | 0,920,13** | 2,090,07

Відносний вміст нітрат-аніону від загального вмісту метаболітів оксиду азоту, % | 98,730,2* | 97,990,05 | 99,070,13** | 97,90,07

Активність індуцибельної NO-синтази, пмоль за хв./мг білка | 23,183,35* | 11,351,96 | 19,621,07 ** | 11,040,61

Примітки:

* р<0,05 - між групою хворих на цукровий діабет з ожирінням та особами з ожирінням, що не хворіють на цукровий діабет;

**р<0,05 - між групою хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла та особами з нормальною масою тіла, що не хворіють на цукровий діабет;

# р<0,05 – між групою осіб, що не хворіють на цукровий діабет, з ожирінням та нормальною масою тіла.

Таким чином, в результаті нашого дослідження був виявлений підвищений рівень метаболітів оксиду азоту – нітрит - та нітрат-аніонів, в групах хворих на цукровий діабет, як на фоні ожиріння, так і у пацієнтів з нормальною масою тіла в порівнянні з відповідними групами осіб, що не хворіють на цукровий діабет. Причому достовірної різниці між вмістом метаболітів оксиду азоту в групах хворих на цукровий діабет з ожирінням та нормальною масою тіла не виявлено. Це може вказувати на те, що різниця в масі тіла у хворих на цукровий діабет не має суттєвого впливу на зміну рівня метаболітів оксиду азоту, тобто саме цукровий діабет та порушення обміну речовин, які він спричиняє (перш за все – гіперглікемія), а не ожиріння, є найбільш вагомою причиною розвитку знайдених порушень. Дані літератури також вказують на те, що гіперглікемія – це основна причина ендотеліальної дисфункції при цукровому діабеті (Cohen R.A., 1993; Luscher T.F., Barton M., 1997).

Припущення про патогенетичне значення гіперглікемії підтверджується також результатами проведеного кореляційного аналізу, який виявив статистично достовірний прямий кореляційний зв’язок між рівнем глікемії на момент обстеження та вмістом NO2- в сироватці крові. В групі хворих на цукровий діабет з ожирінням коефіцієнт кореляції r склав 0,49 (р<0,05), а серед хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла коефіцієнт кореляції становив 0,64 (р<0,05). Статистично достовірний прямий кореляційний зв’язок виявлено також між вмістом NO3- та рівнем глікемії на момент обстеження. В групі хворих на цукровий діабет з ожирінням коефіцієнт кореляції склав 0,71 (р<0,05), а в групі пацієнтів з діабетом без ожиріння 0,53 (р<0,05).

Отриманні дані вказують на посилену продукцію оксиду азоту при цукровому діабеті, що, в свою чергу, може бути компенсаторною реакцією, яка розвивається у відповідь на порушення чутливості гладком’язових клітин судин до дії оксиду азоту (Tooke J.E., 2000) та/або відповіддю на посилене руйнування оксиду азоту, що продукується, за рахунок підвищення вмісту продуктів неензиматичного глікозування білків, накопичення сорбитолу у наслідок активації поліолового шляху обміну глюкози, оксидативного стресу та підвищення вмісту вільних радикалів, посилення продукції ендотеліальних вазоконстрикторних речовин, що протидіють судинним ефектам NO, та інших можливих механізмів (Pricci F. et al. 2003). З іншого боку, за даними Pieper G.M. (1999), існує три фази ендотелій-залежної NO-опосередкованої релаксації, що послідовно змінюють одна одну протягом розвитку цукрового діабету: фаза посиленої, незміненої та ослабленої релаксації. Можливо, саме підвищений вміст оксиду азоту викликає посилену ендотелій-залежну релаксацію на початку розвитку цукрового діабету, коли чутливість тканин та трансдукція сигналу не порушені, а також підтримує її в подальшому на нормальному рівні при незначному зниженні чутливості до оксиду азоту. На фоні прогресування захворювання саме підвищені концентрації оксиду азоту дозволяють у деякій мірі компенсувати суттєве зниження чутливості гладких м’язів судин, що розвиваються при цьому.

Співвідношення між нітрит - та нітрат-аніонами у хворих на цукровий діабет 2-го типу. Нітрит-аніон утворюється за фізіологічних умов при взаємодії молекули оксиду азоту (NO) з молекулою кисню, а нітрат-аніон - при взаємодії NO з оксигенованим гемоглобіном в еритроцитах або ж при взаємодії з вільним радикалом кисню в присутності супероксиддисмутази (Violi F. et al., 1999). Нами були підраховані коефіцієнти, що відображають співвідношення між метаболітами оксиду азоту - NO2- та NO3-, в різних групах обстежених хворих (див. табл. 1).

При цьому знайдено статистично достовірне підвищення сумарного вмісту метаболітів оксиду азоту (NOx) в групі хворих на цукровий діабет з ожирінням, в порівнянні з групою осіб з ожирінням, що не страждають від цукрового діабету, та в групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла, в порівнянні з контрольною групою обстежених з нормальною масою тіла. Статистично достовірне підвищення NOx виявлено також в групі осіб з ожирінням, котрі не страждають від цукрового діабету, в порівнянні з групою осіб без діабету з нормальною масою тіла. Встановлено статистично достовірне зниження відносного вмісту нітрит-аніону від сумарного вмісту метаболітів оксиду азоту в групі хворих на цукровий діабет з ожирінням, в порівнянні з групою осіб з ожирінням, що не хворіють на діабет, а також в групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла в порівнянні з особами без діабету з нормальною масою тіла. Також виявлено статистично достовірне підвищення відносного вмісту нітрат-аніону від NOx у хворих на цукровий діабет у порівнянні з показниками осіб без діабету, як в групі з ожирінням, так і з нормальною масою тіла. Підвищення відносного рівня нітрат-аніону та зниження відносного рівня нітрит-аніону від сумарного вмісту метаболітів оксиду азоту у хворих на цукровий діабет може свідчити про активацію індуцибельного шляху біосинтезу оксиду азоту, що спричиняє дифузію NO в кровотік із ендотелію, де він захоплюється еритроцитами та перетворюється в нітрат-аніон. З іншого боку, підвищення вмісту нітрат-аніону свідчить про надлишковий синтез пероксинітриту (ONOO-) - вільного радикалу, що має потужні прооксидантні властивості та є одним із факторів оксидативного стресу в організмі (Violi F. et al., 1999). Таким чином, ми можемо припустити, що надлишкова продукція оксиду азоту та нітрат-аніону являє собою один із проявів формування оксидативного стресу, якому надається велика роль у патогенезі розвитку ускладнень цукрового діабету.

Активність індуцибельної NO-синтази в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу з різною масою тіла. Синтез оксиду азоту з L-аргініну здійснюють три основні ізоформи NO-синтази: ендотеліальна, невральна та індуцибельна. Індуцибельна NO-синтаза продукує більшу кількість оксиду азоту, ніж інші ізоформи (Monti L.D. et al. 2003). Нами виявлено статистично достовірне підвищення активності індуцибельної NO-синтази в групі хворих на цукровий діабет з ожирінням в порівнянні з активністю цього ферменту у осіб з ожирінням, що не страждають від цукрового діабету (див. табл.1). Активність індуцибельної NO-синтази також була достовірно вища в групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла в порівнянні з контрольною групою з нормальною масою тіла. Це може свідчити про те, що цукровий діабет 2-го типу супроводжується підвищенням активності індуцибельної NO-синтази, як в поєднанні з ожирінням так і з нормальною масою тіла. При цьому, різниця в масі тіла не має суттєвого впливу на цей показник. Підвищення активності індуцибельної NO-синтази ймовірно обумовлює посилену продукцію оксиду азоту у цих хворих, що була відмічена в нашому дослідженні.

При проведенні кореляційного аналізу нами виявлено статистично достовірний прямий кореляційний зв’язок між рівнем глікемії на момент обстеження та активністю індуцибельної NO-синтази в сироватці крові. Серед осіб, хворих на цукровий діабет з ожирінням, коефіцієнт кореляції склав 0,4 (р<0,05). В групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла коефіцієнт кореляції між цими показниками склав 0,9 (р<0,05). Це може вказувати на провідну роль гіперглікемії як фактора, що здатний підвищувати активність індуцибельної NO-синтази. Це припущення збігається з даними деяких авторів, які відзначають, що при тривалій експозиції людських аортальних ендотеліальних клітин у присутності високих концентрацій глюкози підвищується експресія NO-синтази (Cosentino F., et al., 1997).

При проведенні кореляційного аналізу виявлено статистично достовірний прямий кореляційний зв’язок між вмістом NO2- та активністю індуцибельної NO-синтази в групі хворих на цукровий діабет з ожирінням (r=0,46, р<0,05) та з нормальною масою тіла (r=0,82, р<0,05). Нами виявлено також тісний достовірний прямий кореляційний зв’язок між вмістом NO3- та активністю індуцибельної NO-синтази в сироватці крові в групі хворих на цукровий діабет – як з ожирінням (r=0,74, р<0,05), так і з нормальною масою тіла (r=0,7, р<0,05). Отже, підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту, яке спостерігається при цукровому діабеті, обумовлене активацією індуцибельної NO-синтази, що, у свою чергу, обумовлено впливом гіперглікемії.

Вміст ендотеліну-1 в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу з ожирінням та нормальною масою тіла. Ендотелій регулює судинний тонус та проліферацію гладком’язових клітин за рахунок підтримання співвідношення між рівнем вазоконстрикторних та вазодилятаторних факторів. Ендотелін-1 – це найпотужніший з усіх відомих вазоконстрикторів (Сагач В.Ф., 1998). Нами виявлено статистично достовірне підвищення вмісту ендотеліну-1 у сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу – як у осіб з ожирінням, так і з нормальною масою тіла, у порівнянні з цим показником у осіб, що не страждають від цукрового діабету з відповідною масою тіла (рис.1). Також було відмічено достовірне підвищення вмісту ендотеліну-1 у сироватці крові у осіб з ожирінням у порівнянні з обстеженими особами з нормальною масою тіла, як в групах з цукровим діабетом, так і без цього захворювання. Найвищий рівень ендотеліну-1 при цьому спостерігався в групі хворих на цукровий діабет 2-го типу з ожирінням, а найнижчий – в групі осіб без діабету з нормальною масою тіла.

При проведенні кореляційного аналізу нами виявлено статистично достовірний прямий кореляційний зв’язок між вмістом ендотеліну-1 та індексом маси тіла. В групі хворих на цукровий діабет з ожирінням коефіцієнт кореляції склав r=0,54, р<0,05, а в групі осіб з ожирінням, що не страждають на цукровий діабет, r=0,68, р<0,05. Також спостерігався достовірний прямий кореляційний зв’язок між рівнем ендотеліну-1 в сироватці крові та глікемією. В групі хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла коефіцієнт кореляції склав 0,5 (р<0,05), а у хворих на діабет і ожиріння він був r=0,31, (р<0,05).

Рис.1. Вміст ендотеліну-1 в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу та осіб, що не страждають від цукрового діабету з різною масою тіла, пмоль/л.

* р<0,05 - між групою хворих на цукровий діабет з ожирінням та групою з ожирінням без діабету;

** р<0,05 - між групою хворих на цукровий діабет з нормальною масою тіла та групою з нормальною масою тіла без діабету;

*** р<0,05 - між групами без діабету з ожирінням та нормальною масою тіла;

# р<0,05 - між групами хворих на цукровий діабет з ожирінням та нормальною масою тіла.

Показано, що зміна плазмової концентрації ендотеліну-1 та судинна відповідь на ендотелін-1 залежить від тривалості захворювання та є маркером ушкодження ендотелію (Hopfner R.L., et al., 1999). Тобто ми можемо припустити, що підвищення рівня ендотеліну-1 у сироватці крови може грати роль у розвитку ендотеліальної дисфункції при цукровому діабеті, яка найбільш виражена у хворих з ожирінням. Ожиріння, незалежно від наявності цукрового діабету, теж грає деяку самостійну роль у розвитку порушень функції ендотелію, що проявляється підвищенням вмісту ендотеліну-1 у цих хворих. Це підтверджує також і виявлений нами кореляційний зв’язок між рівнем ендотеліну-1 та індексом маси тіла. Раніш в експериментальних дослідженнях було показано, що гіперглікемія може викликати підвищення, зниження або ж не впливати на вивільнення ендотеліну-1 з ендотеліальних клітин в культурі (Baumgartner-Parzer S. et al., 1996). В ряді робіт доведено, що інсулін також діє як модулятор біологічної дії ендотеліну-1, ЕТ-рецепторів, ЕТ-1-опосередкованої відповіді судин (Nava P. et al., 1997). Як відомо, ожиріння та інсулінорезистентність, що його супроводжує, приводять до розвитку компенсаторної гіперінсулінемії (Лысенко В.А., Маньковский Б.Н., 2000). Індукована гіперінсулінемія підвищує концентрацію ЕТ-1 у сироватці крові людей і тварин (Ferri C. et al.,1995, Piatti P.M. еt al., 1996) Встановлене нами достовірне підвищення вмісту ендотеліну-1 в групах хворих на цукровий діабет з ожирінням та у людей з ожирінням, які не страждають від цукрового діабету, може бути зумовлено, таким чином, також й впливом підвищеного рівня інсуліну в крові. З іншого боку, підвищення рівня ендотеліну-1 може бути компенсаторною реакцією організму у відповідь на знижену чутливість тканин до ендотеліну-1. Разом із тим, деякі дослідження вказують на те, що ендотелін-1 стимулює секрецію інсуліну методом прямого впливу на острівці Лангерганса (Gregersen S. et al., 1996), тобто гіперпродукція ендотеліну-1, що була знайдена нами, може являти собою компенсаторну реакцію, що має за мету підтримання адекватної продукції інсуліну в умовах інсулінорезистентності, яка є типовим етіопатогенетичним фактором розвитку цукрового діабету 2-го типу.

Проводячи кореляційний аналіз, нами виявлено достовірний зворотній кореляційний зв’язок між вмістом ендотеліну-1 в сироватці крові та вмістом NO2- та NO3-. У хворих на цукровий діабет з ожирінням коефіцієнт кореляції між вмістом ендотеліну-1 та NO2- становив r=-0,47, р<0,05, а між вмістом ендотеліну-1 та NO3- r=-0,34, р<0,05. У пацієнтів з нормальною масою тіла цей коефіцієнт кореляції був r=-0,61, (р<0,05) та r=-0,4 (р<0,05), відповідно для NO2- та NO3-. У хворих на цукровий діабет також був знайдений достовірний зворотній зв’язок між активністю індуцибельної NO-синтази та вмістом ендотеліну-1 в сироватці крові - r=-0,56, (р<0,05) та r=-0,42 (р<0,05) у пацієнтів з ожирінням та нормальною масою тіла, відповідно. Тобто підвищення вмісту ендотеліну-1 супроводжується зниженням продукції оксиду азоту та активності індуцибельної NO-синтази. Однак причинно-наслідковий зв’язок між цими змінами потребує подальшого вивчення.

Показано, що при цукровому діабеті вивільнення та дія ЕТ-1 змінюються паралельно зі змінами продукції та біологічної дії оксиду азоту та функції ендотелію (DeMattia G. et al., 1998). Оксид азоту не тільки здатний модулювати вазопресорні ефекти ендотеліну-1, але й за механізмом негативного зворотного зв’язку за рахунок збільшення вмісту внутрішньоклітинного цГМФ може пригнічувати біосинтез ЕТ-1 (Bloomgarden Z.T., 1998). Тому логічно припустити, що підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту, що було виявлено нами у хворих на цукровий діабет, може бути біологічною відповіддю на підвищення вмісту ендотеліну-1 для його пригнічення.

Вплив бета-адреноблокатору небівололу на вміст метаболітів оксиду азоту, різних ізоформ NO-синтази, ендотеліну-1 в сироватці крові при цукровому діабеті 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією. Небіволол – високо селективний бета1-блокатор, що справляє залежну від ендотелію судиннорозширювальну дію, яка опосередковується перетворенням L-аргініну в оксид азоту в судинному руслі через вплив на NO-синтазу (McNeely W., Goa K.L, 1999). Ми вивчали вплив небівололу на рівень ендотеліальних вазоактивних факторів в сироватці крові у хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією.

Під спостереженням знаходилось 15 осіб хворих на цукровий діабет 2-го типу, що супроводжувався артеріальною гіпертензією, віком 56,82,2 років. Хворим проводилась антигіпертензивна терапія препаратом “Небілет” (“Berlin-Chemie” Menarini Group) в дозі 5-10 мг на добу протягом 2 місяців у режимі антигіпертензівної монотерапії. Монотерапія небівололом призвела до зниження артеріального тиску на 15% від початкового рівня. В результаті 2-х місячного застосування небівололу спостерігалось статистично достовірне підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту - NO2- та NO3- в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією (табл.2.).

Таблиця 2. Вміст метаболітів оксиду азоту, активність різних ізоформ NO-синтази, рівень ендотеліну-1 в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією під впливом лікування небіволом. |

До прийому небівололу | Після прийому небівололу

Вміст нітрит-аніон, нмоль на мг білка | 0,290,02* | 3,730,23

Вміст нітрат-аніон, нмоль на мг білка | 4,130,28* | 7,340,3

Активність сумарної NO-синтази, пмоль за хв./мг білка | 71,451,08* | 86,592,74

Активність індуцибельної NO-синтази, пмоль за хв./мг білка | 20,833,76* | 37,466,82

Активність конституційної NO-синтази, пмоль за хв./мг білка | 49,041,03 | 50,621,32

Вміст ендотеліну-1, пмоль/л | 10,1±0,58* | 6,40,67

Примітки:

*р<0,05 - між показниками до та після прийому небівололу.

Виявлено також статистично достовірне підвищення активності сумарної та індуцибельної NO-синтази в сироватці крові хворих, що одержували лікування. Активність конституційної NO-синтази під впливом лікування достовірно не змінювалась. Це співпадає з даними Greven J. та співавторів (2000), що вказують на стимуляцію утворення NO-синтази, а саме індуцибельної її ізоформи, в нирках під впливом небівололу. Таким чином, небіволол, підвищуючи активність індуцибельної NO-синтази та вміст метаболітів оксиду азоту, здатний позитивно впливати на функціональний стан ендотелію у хворих на цукровий діабет в поєднанні з артеріальною гіпертензією.

Вміст ендотеліну-1 в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією в результаті прийому небівололу достовірно знизився (табл.2.). Це співпадає з літературними даними про те, що небіволол здатний зменшувати рівень мРНК препроендотеліну-1, тим самим, пригнічувати утворення ендотеліну-1 (Brehm B.R. et al., 2000). З іншого боку, оскільки існує певний взаємозв’язок між вмістом таких вазоактивних ендотеліальних факторів, як оксид азоту та ендотелін-1, то зменшення вмісту ендотеліну-1 в сироватці крові під впливом небівололу можна пояснити таким чином, що небіволол підвищує синтез оксиду азоту, який, у свою чергу, пригнічує виділення ендотеліну-1. Тобто, зниження вмісту ендотеліну-1 під впливом небівололу є не прямим його ефектом, а наслідком підвищення вмісту оксиду азоту. Не можна виключити й самостійного значення нормалізації артеріального тиску під впливом лікування на стан ендотелію у хворих на цукровий діабет. Таким чином, застосування бета-адреноблокатору небіволол викликало нормалізацію артеріального тиску та призводило до підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту та зниження рівня ендотеліну-1 у сироватці крові, що може свідчити про позитивний вплив лікування на стан ендотеліальної функції у хворих на цукровий діабет.

Висновки

1. В роботі отримані нові дані щодо показників функціонального стану ендотелію (вміст метаболітів оксиду азоту, ендотеліну-1, активність NO-синтази в сироватці крові) у хворих на цукровий діабет 2-го типу з різною масою тіла. Виявлені порушення можуть приймати участь у формуванні ендотеліальної дисфункції у хворих на цукровий діабет 2-го типу.

2. Цукровий діабет 2-го типу, як у поєднанні з ожирінням так і з нормальною масою тіла, супроводжується підвищенням вмісту метаболітів оксиду азоту – нітрит- та нітрат-аніону, що може свідчити про посилену продукцію оксиду азоту.

3. Підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту - нітрит- та нітрат-аніону у хворих на цукровий діабет відбувається за рахунок активації індуцибельної NO-синтази, рівень активності якої корелює з рівнем гіперглікемії.

4. Прямий кореляційний зв’язок між вмістом метаболітів оксиду азоту та активністю індуцибельної NO-синтази з одного боку, та рівнем глікемії, з іншого боку, свідчить про патогенетичну роль гіперглікемії в посиленні продукції оксиду азоту у хворих на цукровий діабет 2-го типу.

5. Збільшення відносного вмісту нітрат-аніону від сумарного вмісту метаболітів оксиду азоту в сироватці крові може бути одним з механізмів розвитку оксидативного стресу у цих пацієнтів.

6. Цукровий діабет 2-го типу супроводжується підвищенням вмісту ендотеліну-1 в сироватці крові, що пов’язане з гіперглікемією.

7. Вміст метаболітів оксиду азоту та активність індуцибельної NO-синтази в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу зворотно пов’язані з рівнем ендотеліну-1.

8. Лікування бета-адреноблокатором небівололом призводить до підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією, що супроводжується підвищенням активності сумарної та індуцибельної ізоформ NO-синтази та зниженням рівня ендотеліну-1, що вказує на позитивний вплив цього препарату на функціональний стан ендотелію.

Практичні рекомендації:

1. На підставі отриманих даних можна рекомендувати застосування бета-адреноблокатора небіволол у комплексному лікуванні хворих на цукровий діабет 2-го типу в поєднанні з артеріальною гіпертензією. Застосування цього препарату веде до підвищення продукції судиннорозширюючого фактору - оксиду азоту та зменшення продукції ендотеліну-1, тобто сприяє поліпшенню функціонального стану ендотелію у хворих на діабет.

2. Визначення вмісту нітрит- та нітрат-аніону в сироватці крові дає можливість оцінити стан продукції оксиду азоту у хворих на цукровий діабет.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Могильницька Л.А., Маньковський Б.М. Вміст метаболітів оксиду азоту – NO2-, NO3- в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2 типу з різною масою тіла//Буковинський медичний вісник. – 2001. – Т.5, № 4. – С. 88-91.

Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, підбір та обстеження хворих, ведення документації, статистична обробка та узагальнення результатів. Дольова участь Могильницької Л.А. 80%.

2. Могильницька Л.А., Маньковський Б.М. Вміст індуцибельної NO-синтази в сироватці крові хворих на цукровий діабет 2 типу з різною масою тіла// Імунологія та