НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

осташ Богдан Омелянович

УДК 575.224+577.21

генетичний контроль окремих етапів біосинтезу ландоміцину Е в streptomyces globisporus 1912

03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Федоренко Віктор Олександрович,

Львівський національний університет імені Івана Франка,

завідувач кафедри генетики та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Мацелюх Богдан Павлович

Інститут мікробіології та вірусології НАН України,

завідувач відділу генетики мікроорганізмів

кандидат біологічних наук

Карпова Ірина Сергіївна

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

старший науковий співробітник

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики, Міністерство освіти і науки України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться “25вересня 2003 р. о 10 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01. Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ.

Електронна адреса здобувача: boast0@yahoo.com

Автореферат розісланий “18 серпня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук ________________ О.А.Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ландоміцини – родина ангуциклічних полікетидних антибіотків, що володіють протипухлинною активністю. Загалом ландоміцини є активнішими проти ракових клітин порівняно з такими відомими хіміотерапевтичними агентами, як блеоміцин, цисплатин, мітоміцин С, доксорубіцин, водночас вони є токсичними по відношенню до нормальних клітин [Depenbrock et al., 1997]. Це перешкоджає безпосередньому використанню цих сполук у медичній практиці і стимулює пошук підходів до отримання нових ландоміцинів – із зниженою цитотоксичністю чи зміненим спектром дії.

Вивчення біосинтезу ландоміцинів дозволить з’ясувати, як регулюється продукція цих сполук, шляхи еволюції генів полікетидсинтаз, яким чином контролюються згортання лінійних попередників ангуциклінів, їхнє окиснення, відновлення та глікозилювання. За умов зростання числа онкологічних захворювань на Україні, поширення множинної резистентності ракових клітин до антибіотиків, та постійної потреби у нових ефективних ліках, вивчення біосинтезу нових сполук, яким властива сильна протипухлинна дія, та розробка підходів до їхнього генно-інженерного конструювання є надзвичайно актуальним завданням. Такі дослідження становлять основу для розвитку біотехнологічного виробництва нових антибіотиків. Розвиток в Україні виробництва протипухлинних антибіотиків є доцільним з огляду на його малотоннажність та високу прибутковість.

Зв’язок роботи з науковими програмами організації, де виконувалась дисертація. Вивчення біосинтезу ландоміцину Е виконувалось у межах держбюджетних науково-дослідних тем Бг-12б “Розробка методів генетичного та генно-інженерного конструювання штамів-продуцентів протиракових антибіотиків” (2000-2002, номер держреєстрації – 0197U018080), Бг-117б „Генетичний контроль біосинтезу протипухлинних антибіотиків ландоміцинової групи”(2003-2005, номер держреєстрації - 0197U011132). Ці дослідження також були підтримані міжнародним грантом INTAS-Україна 95-20 “Біотехнологічне вдосконалення продуцента нового потенційного протипухлинного антибіотика” (1997-2000), ВМВF 0311308 „Резистентність до власних антибіотиків у продуцентів антибіотиків” (1996-1998) та індивідуальним грантом INTAS-YSF 00-208 (2001-2003 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою цієї роботи є встановлення особливостей генетичного контролю окремих етапів біосинтезу ландоміцину Е. Були досліджені гени циклаз lndF, lndL, оксигеназ lndM, lndZ4lndZ5, глікозилтрансферази lndGT4. Це гени, роль яких у біосинтезі ландоміцину Е є найменш зрозумілою, і які можуть бути далі використані для генно-інженерного конструювання продуцентів нових антибіотиків. Завдання роботи:

- локалізувати усі гени біосинтезу ландоміцину Е за допомогою гібридизаційного скринінгу бібліотеки генів Streрtomyces globisporus 1912 та секвенувати виявлені гени;

- проаналізувати мутанти із порушеннями різних етапів біосинтезу ландоміцину Е, та виявити зміни в спектрі синтезованих мутантами ландоміцинів;

- здійснити експресію генів біосинтезу ландоміцину Е в гетерологічних умовах для виявлення специфічності їхнього функціонування.

Об’єкт дослідження: штам Streрtomyces globisporus.

Предмет дослідження: гени біосинтезу ландоміцину Е (lnd-гени).

Методи дослідження: генетичні, мікробіологічні, молекулярно-біологічні, хімічні.

Наукова новизна отриманих результатів. У результаті виконаної роботи ідентифіковано гени біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер). Вперше секвеновано 25 lnd-генів та отримано докази, що вони контролюють біосинтез ландоміцину Е. Схарактеризовано гени lndF та lndL, що контролюють згортання та циклізацію лінійного полікетонового інтермедіату ландоміцину Е. У результаті вивчення генів оксигеназ lndM та lndZ5 вперше запропонована схема окиснення попередників ландоміцинів. За допомогою “генного нокауту” вперше показано, що ген lndGT4 контролює приєднання третього залишку цукру L-родинози під час синтезу ландоміцину Е. В ході вивчення lndGT4 отримано нові ландоміцини F, G та Н. Це перші ландоміцини із зміненою структурою полікетидної частини. Вперше отримано штами актиноміцетів-продуцентів урдаміцину А (S.fradiae Tu2717), аклациноміцину (S.galilaeus HKI0022) та доксорубіцину (S.peucetius subsp.caesius ATCC27952), що містять клоновані макрофрагменти lnd-кластеру та показана залежність експресії структурних lnd-генів від наявності регуляторного гену lndI .

Практичне значення отриманих результатів полягає в можливості використання вивчених генів та рекомбінантних штамів бактерій у експериментах з комбінаторного біосинтезу нових полікетидних антибіотиків. Розроблена та випробувана система для спрямованих змін структури ландоміцинів. Подальше дослідження нових ландоміцинів сконструйованих у цій роботі дозволить виявити взаємозв’язки між структурою ангуциклінів та характером їхньої біологічної дії. Отримані у роботі штами мікроорганізмів, плазміди, що містять субклони lnd-кластеру, депоновані у колекції мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків при Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень. Для виявлення lnd-кластеру була використана бібліотека генів S.globisporus 1912, створена співробітником кафедри генетики Ю.Демидчук та дані часткового секвенування генів lndI, lndA, lndP, lndS, lndT, виконане аспіранткою кафедри генетики К.Панькевич. В роботі з аналізу індукованих мутантів S.globisporus 1912 із зміненим біосинтезом ландоміцину Е була використана колекція штамів, отримана Л.Басілією та О.Громиком. Для спрямованого мутагенезу lnd-генів використано метод кон’югації E.coli-Streptomyces, розроблений А.Лужецьким. Секвенування lnd-генів та структурний аналіз нових ландоміцинів виконувались у співпраці з науковцями відділу функціональної біології, ун-т м. Ов’єдо, Іспанія (Х.А.Салас) та Ін-ту дослідження природніх сполук, Йєна, ФРН (Г. Крюгель).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, оприлюднені на конференціях німецького мікробіологічного товариства (VAAM) “Біологія актиноміцетів” (Йєна, Німеччина, 26-28 вересня, 1999), “Біологія природніх продуктів бактерійного походження” (Фрайбург, Німеччина, 29 жовтня 2002 ), ІІ З’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000), Міжнародній конференції з молекулярної біології та генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченій 100-річчю генетики (Львів, 20-22 квітня, 2000), 2 Міжнародній медичній конференції для студентів та молодих вчених (Гданськ, Польща, 2000), Конференції з молекулярної біології та генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених (Київ, 20-22 жовтня, 2001), Всепольському мікробіологічному симпозіумі (Краків, 6-8 вересня, 2001) , 12 Міжнародному симпозіумі з біології актиноміцетів (Ванкувер, Канада, 5-9 серпня, 2001), З’їзді Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002), Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 23-26 квітня, 2002), 6 та 7 Конференції молодих вчених “Біологія – наука XXI століття” (Пущино, 20-24 травня, 2002 та 12 квітня 2003), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Освіта. Наука”(Киів, 10-11 лютого, 2003), на звітних наукових конференціях ЛНУ імені Івана Франка (2001-2003).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у профільних наукових журналах, 1 статтю у збірнику наукових праць, 17 тез доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (Матеріалів та методів досліджень, результатів та їхнього обговорення), висновків, списку використаних джерел, що охоплює 168 найменувань та двох Додатків. Роботу викладено на 200 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 44 рисунками та 9 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Штами бактерій та плазміди. У роботі використані штами S.globisporus 1912 та W1 (отримані від проф. Б.П. Мацелюха, Інститут мікробіології та вірусології НАНУ, м. Київ) їхні УФ-індуковані lnd-мутанти (О.Громико, Л.Басілія, ЛНУ ім.. І.Франка) та мутанти, отримані автором у цій роботі, S.fradiae Tu2717 (А.Бехтольд, ун-т м. Фрайбурга, ФРН) , S.coelicolor CH999, E.coli DH5б, E.coli ET12567 (pUB307), E.coli KW251 (Х.А. Салас, університет м. Ов’єдо, Іспанія), S.galileus HKI0022, S.peucetius subsp. caesius ATCC27952 (Г.Крюгель, Інститут дослідження природніх сполук, Йєна, ФРН). В експериментах з клонування генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-гени) використали векторні молекули ДНК pUC18/19, pBluescriptIIKS- [Sambrook et al., 1989], для спрямованого руйнування lnd-генів – pTNK, для експресії lnd-генів – плазміди pKC1218E, pSET152 [Bierman et al., 1992].

Середовища. Для отримання спор актиноміцетів та виконання схрещувань E.coli - Strteptomyces використовували вівсяне та кукурудзяне агаризовані середовища [Лужецький та ін., 2001], для регенерації протопластів - R2YE, рідкі середовища YEME, TSB, SG використовували для продукції антибіотиків, отримання біомаси штамів та протопластів [Kieser et al., 2000].

Кон’югацію E.coli-Streptomyces, інфекцію E.coli, визначення стійкості штамів до антибіотиків виконували як в [Лужецький та ін.,2001, Kieser et al., 2000].

Тонкошарову та високофективну рідинну хроматографію метаболітів (ТШХ та ВЕРХ, відповідно), спектральний аналіз ландоміцинів виконували згідно [Мацелюх Б.П. та ін., 1999; Henkel T. et al., 1990].

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення ДНК, секвенування, конструювання та аналіз рекомбінантних молекул ДНК, ПЛР, ДНК-ДНК гібридизація) виконували згідно методик [Kieser et al., 2000, Sambrook et. al, 1989].

Аналіз нуклеотидних та імовірних амінокислотних послідовностей виконували за допомогою програм REFLECTION, BLAST 2.0, BOXSHADE, DNASIS, CLUSTAL W [Altschul, S. F. et. al, 1997, GC-Group, Wisconsin, USA].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

Біосинтез ландоміцинів вивчений слабо. З огляду на потенційну терапевтичну цінність ландоміцинів та можливість використання генів їхнього біосинтезу для створення нових біологічно активних сполук, вивчення генетичного контролю формування молекули ландоміцину Е (LaE) є актуальним завданням. Ідентифікація генів, що контролюють циклізацію лінійного полікетидного попередника LaE, його окиснення та глікозилювання, становить особливий науково-практичний інтерес, бо ці реакції забезпечують структурну унікальність LaE та характер його дії.

Об’єктом роботи був штам S.globisporus 1912, продуцент LaE. Предметом дослідження були гени біосинтезу LaE (lnd-гени), зокрема гени циклаз lndF та lndL, ген глікозилтрансферази lndGT4, та ген оксигенази lndM. Було виконане секвенування lnd-кластеру, та проаналізовано функції вищеперелічених lnd-генів за допомогою їхнього спрямованого мутагенезу та гетерологічної експресії в продуцентах інших протипухлинних антибіотиків – доксорубіцину (S.peucetius subsp. caesius ATCC27952), урдаміцину А (S.fradiae Tu2717), аклациноміцину А (S.galileus HKI0022). Був виконаний хімічний аналіз метаболітів з шляху біосинтезу LaE, що їх продукують мутантні штами S.globisporus, та зміни в спектрі синтезованих антибіотиків рекомбінантними штамами S.peucetius subsp. сaesius, S.fradiae та S.galileus.

1. Секвенування кластеру генів біосинтезу ландоміцину Е S.globisporus 1912. За допомогою скринінгу фагової бібліотеки генів S.globisporus 1912 вдалося виявити ділянку хромосоми завдовжки 38 т.п.н., що гібридизується із генами кетосинтази urdA, гексосозосинтази urdG [Pankevych et al., 1999], які задіяні у біосинтезі спорідненого ангуцикліна урдаміцина А [Decker H. et al., 1995]. Подальше секвенування виявленої ділянки методом “shot-gun” призвело до ідентифікації 30 генів, продукти трансляції яких виявляють високий ступінь подібності (50-90%) до білків, задіяних у біосинтезі полікетидних антибіотиків. Ці гени формують кластер (позначений як “lnd”), що обмежений відкритими рамками зчитування, які кодують імовірні білки з шляхів первинного метаболізму (рис.1). За своєю загальною організацією, нуклеотидними та ймовірними амінокислотними послідовностями lnd-кластер подібний до кластерів генів біосинтезу інших ангуциклінів - ландоміцину А та урдаміцину А. Виходячи з даних множинного порівняння нуклеотидних послідовностей, ми

Рис.1. Організація lnd-кластеру S.globisporus 1912. Напрям стрілок вказує напрям транскрипції lnd-генів. Гени, що контролюють синтез полікетидної частини LaE (ландоміцинону) зображені у вигляді чорних стрілок; синтез та приєднання до ландоміцинону дезоксицукрів – білі стрілки, регуляція синтезу LaE – стрілки, що замальовані вертикальним штрихом, стійкість до LaE - косим штрихом, функція невідома або не пов’язана із синтезом LaE - горизонтальним (див.також текст). В - BamHI-сайти у межах lnd-кластеру. Знизу зображені BamHI-фрагменти lnd-кластеру, що використали у експериментах зі спрямованого мутагенезу та експресії lnd-генів. Праворуч від lnd-кластеру показані структурні формули LaE (зверху) та його дисахаридного попередника – ландоміцину D (знизу; на ньому позначені С11 та С15 гідроксильні групи ландоміцинону).

припустили, що гени мінімальної полікетидсинтази (ПКС) lndAlndBlndC та ген голо-АПБ-синтази lndZ6 контролюють синтез лінійного полікетидного ланцюга. Гени lndF, lndL кодуть циклази, що забезпечують згортання та циклізацію полікетиду. Гени редуктаз lndD, lndNlndO, lndV, lndZ4 контролюють відновлення ландоміцинону, однак залишається невідомим, на яких етапах біосинтезу це відбувається. Гени оксигеназ lndE, lndM, lndZ5 контролюють окиснення циклізованого попередника ландоміцинону, а гени lndGlndHlndQlndRlndSlndT, lndZ1, lndZ3 кодують білки біосинтезу дезоксицукрів. Приєднання цукрів до ландоміцинону контролюється генами lndGT1, lndGT2, lndGT4. Ген lndJ кодує ймовірний транспортер, а lndI – транскрипційний активатор lnd-генів. Ген lndP кодує імовірну декарбоксилазу, що може бути задіяна у декарбоксилювання залишків малоніл-КоА. Роль генів lndU, lndХ у біосинтезі LaE незрозуміла. Гени tmk1, prx1, stk1, імовірно, не належать до lnd-кластеру, і кодують білки первинного метаболізму. У виявленому кластері містяться усі структурні гени, теоретично необхідні для синтезу молекули LaE. Це, а також висока подібність lnd-генів до генів біосинтезу інших ангуциклінів, свідчить, що вони контролюють синтез LaE

2. Властивості мутантів S. globisporus 1912 із зміненим біосинтезом ландоміцину Е. Була досліджена колекція з 50 індукованих ультрафіолетовим опроміненням або нітрозогуанідином мутантів S.globisporus 1912 із зміненим біосинтезом LaЕ (lnd-мутанти). Ми перевірили, які саме зміни відбулися в біосинтезі LaE у lnd-мутантів і чи пов’язані вони зі змінами в lnd-генах.

Після трьох пасажів серед 50 lnd-мутантів було відібрано 9 стабільних штамів. ТШХ та Верх показали, що 2 з 9 штамів продукують слідові кількості LaЕ. Низький рівень синтезу LaЕ може бути наслідком нагромадження Lnd+-ревертантів, leaky-мутаціями в генах біосинтезу LaЕ, порушеннями регуляції біосинтезу антибіотика. У 5 lnd-мутантів не виявлено продукції ні LaЕ, ні його циклізованих попередників. Це свідчить про порушення функціонування структурних генів, що контролюють перші етапи синтезу LaЕ, або регуляторних генів lnd-кластеру. Три штами нагромаджують нові блідо-жовті сполуки. В екстрактах штаму LND317 виявлено речовини з максимумами поглинання при 370 і 400 нм, LND801 – 400 нм, LND900 – 325 нм. Сполуки з подібними спектральними характеристиками не виявляються в екстрактах вихідного штаму 1912. За допомогою ВЕРХ показано, що ці сполуки мають ідентичні з LaЕ та ландоміциноном максимуми поглинання в УФ-зоні спектру. Відомо, що поглинання світла у видимій області спектру забезпечує хінон-подібна структура полікетидної частини ангуциклінів, в УФ-області – система спряжених подвійних зв’язків ароматичних кілець [Rohr et al., 1992]. Отримані результати дозволяють нам стверджувати, що в цих штамів мутації не зачіпають генів, які контролюють формування полікетидного каркасу LaЕ. Імовірно, в них порушена експресія генів синтезу цукрів та модифікації полікетидної частини LaЕ.

Ми виконали ДНК-ДНК гібридизацію рестриктів сумарної ДНК досліджуваних мутантів із DIG-міченими фрагментами lnd-кластеру, що містять: а) регуляторний ген lndI („М”- зонд) б) гени мінімальної ПКС lndElndFlndAlndBlndClndD (“N”- зонд) та в) гени біосинтезу дезоксицукрів lndGlndHlndQlndRlndSlndT ( “J”- зонд). Показано, що у чотирьох з 5 lnd-мутантів з повним блоком синтезу LaЕ є делеції окремих ділянок lnd-кластеру. Так, сумарна ДНК контрольного Lnd- - мутанта W1 (наданий проф. Мацелюхом Б.П.) не гібридизується із жодним з використаних зондів. Не виявлено також позитивних сигналів гібридизації сумарної ДНК мутанта LND23 із М- та N-зондами, у мутантів LND900, LND901 - із М-зондом. У вихідного штаму 1912 та 6 lnd-мутантів (LND29, LND81, LND317, LND602, LND801, LND804) рестрикти сумарної ДНК, що гібридизуються з М-, N-, J-зондами, співпадають за розмірами. Отримані результати свідчать, що клоновані lnd-гени контролюють синтез LaЕ. Наші дані також дозволяють висловити припущення про важливу регуляторну роль гену lndІ в біосинтезі LaЕ, оскільки його делеція блокує біосинтез LaЕ.

3. Спрямований мутагенез lnd-генів у Streptomyces globisporus 1912. Показано, що кон’югація в системі E.coli – Streptomyces є ефективним методом введення ДНК у S.globisporus [Лужецький та ін., 2000]. Інтеграція кон’югативних нереплікативних векторів, що містять невеликі (1,5 т.п.н.) ділянки lnd-кластеру в геном S.globisporus відбувається за рахунок рекомбінації між гомологічними ділянками в хромосомі та плазміді. Плазміди для спрямованого мутагенезу lnd-генів конструювалися на основі вектора pTNK [Лужецкий и др., 2001], що містить ген апраміцин-стійкості aac(3)IV, ділянку ініціації реплікації плазміди pUC19 та ділянку ініціації кон’югаційного перенесення ДНК плазміди RK2.

3.1. Спрямований мутагенез генів lndF та lndL, що контролюють циклізацію попередника ландоміцину Е. Секвенування lnd-кластеру виявило два гени циклаз - lndF (309 п.н.) та lndL (960 п.н.), що імовірно контролюють формування 3/4, і 1/2 кілець ландоміцинону, відповідно. Механізм функціонування цих білків невідомий, тому ми отримали штами S.globisporus, в яких ці гени зруйновані, та дослідили зміни у спектрі синтезованих ними полікетидів.

Сконструйовано плазміду pTF1, що містить зруйнований алель гену lndF за рахунок інсерції в його кодуючу частину генної касети стійкості до канаміцину km з плазміди pKAPA [Лужецкий и др., 2001](lndF:: km; рис.2). Плазміду pTF1 перенесли шляхом кон’югації в S.globisporus. Були відібрані канаміцин-стійкі та апраміцин-чутливі екскон’юганти S.globisporus, які виникли у результаті подвійного кросинговеру між гомологічними ділянками в хромосомі S.globisporus та плазміді pTF1 (рис.2). Один з таких клонів, позначений як F133, був відібраний для подальшого аналізу. Факт заміщення гену lndF в геномі S.globisporus F133 на зруйнований алель lndF:: km був доведений за допомогою ПЛР-аналізу сумарної ДНК із використанням праймерів до кінців гену lndF. Використовуючи такий самий підхід, був отриманий мутант S.globisporus L16 з інактивованим геном lndL.

Ми проаналізували спектр полікетидних сполук, що синтезуються штамами F133 та L16. В екстрактах дикого типу виявлено кілька мажорних піків, що відповідають LaE та його інтермедіатам. В екстрактах штаму F133 не виявлено продукції повністю циклізованих ландоміцинонів, натомість мутант продукує 2 нові сполуки. В штамі L16 не виявлено LaE чи його циклізованих інтермедіатів.

Аналіз метаболітів штаму F133 із зруйнованим геном lndF свідчить, що саме цей ген контролює унікальне ангулярне згортання полікетиду і формування ландоміцинону. Результати філогенетичного аналізу LndF вказують на можливе походження генів біосинтезу ангуциклінів з кластерів генів біосинтезу спорових пігментів актиноміцетів. Високий рівень гомології генів циклаз 3-4-го кілець ангуциклінів дозволяє використовувати їх як зонди для ПЛР-скринінгу продуцентів нових ангуциклічних антибіотиків.

З результатів ВЕРХ можна зробити висновок, що мутантний штам L16 не тільки нездатний синтезувати коректно циклізований інтермедіат LaE, але нездатний також продукувати нормальні за розміром полікетидні ланцюги (декакетиди). Це свідчить про існування певних невивчених закономірностей у генетичному контролі перших кроків полікетидного синтезу. Не виключено, що утворення 1-го кільця ландоміцинону відбувається не після формування “повнорозмірного” декакетиду, а після перших п’яти циклів конденсації залишків малоніл-КоА. Тоді відсутність функціональної циклази робить неможливим подальше нарощування ланцюга. Наші дослідження дозволяють побудувати завершену схему синтезу тетрациклічного попередника ландоміцинону, де ген lndL контролює перші дві циклізації, а ген lndF – 3-ю та 4-у (рис.3). Імовірно, ген циклази lndL є важливим не тільки для циклізації полікетиду, але і для визначення його довжини.

3.2. Спрямований мутагенез гену lndM, що контролює окиснення попередника ландоміцину Е. Ген оксигенази lndM (1512 п.н.), що лежить у 3’-напрямі від гену lndL, був повністю секвенований та зруйнований шляхом заміщення на мутантний алель lndM::hyg (hyg – ген стійкості до гігроміцину з плазміди pHYG1). Генне заміщення у штамі М12 було підтверджене методом ПЛР-аналізу, як і у випадку руйнування гену lndF. Мутант S.globisporus М12 із зруйнованим геном lndM, поряд з продукцією ряду нових сполук, продовжує синтезувати LaE. Згідно результатів множинного порівняння оксигеназ, LndM каталізує гідроксилювання третього кільця (карбон С15) попередника ландоміцинону. В цій позиції розташована карбонільна група “ацетатного” походження, яка відновлюється, а потім вводиться de novo спеціальною оксигеназою [Weber S. et al., 1994]. Ген lndM своїм “стоп”-кодоном перекривається із “старт”-кодоном гену редуктази lndN (рис.1). Можна припустити, що редуктаза LndN відновлює карбонільну групу на третьому кільці, а оксигеназа LndM гідроксилює карбон С15 de novo. Інактивація гену lndM в мутанті М12 може мати полярний ефект на спряжений ген lndN, що буде вести до припинення його експресії. Тоді штам М12 далі продукуватиме LaE, оскільки не відбувається також відновлення карбонільної групи “ацетатного” походження (рис.4). Таким чином, враховуючи результати руйнування lndM та дані аналізу його нуклеотидної послідовності, ми стверджуємо, що lndM кодує оксигеназу третього кільця LaE. Порушення експресії генів оксигенази lndM та редуктази lndN зумовлює те, що мутантний штам М12 продукує як нові сполуки, так і LaE. Імовірно, після того, як проміжний продукт з відновленим третім кільцем зазнав певних модифікацій (гідроксилювання першого і/або другого кілець) відбувається його гідроксилювання за допомогою LndM. Відсутність відповідних редуктазної та оксигеназної активностей в М12 не припиняє біосинтез LaE, але робить його менш ефективним, оскільки невідновлений інтермедіат, порівняно з відновленим, є гіршим субстратом для інших ферментів. Тому частина проміжного продукту перетворюється в нові сполуки. Згідно даних мас-спектрального аналізу, ці сполуки є неглікозильованими похідними LaE (m/z --328 а.о.м.) . Наші результати демонструють, що штами S.globisporus з нокаутами окремих lnd-генів можуть бути джерелом нових ландоміцинів, що становить значний теоретичний та практичний інтерес.

3.3. Спрямований мутагенез гену глікозилтрансферази lndGT4 S.globisporus 1912. Для з’ясування особливостей генетичного контролю глікозилювання ландоміцинів, ми секвенували та зруйнували ген lndGT4 (1251 п.н.), що кодує імовірну родинозилтрансферазу – фермент, який каталізує приєднання залишку L-родинози під час синтезу LaE. У сконструйованого мутанта S.globisporus GT4.1 ген lndGT4 замістили на зруйнований алель lndGT4::aadA (aadA – ген стійкості до спектиноміцину з pHP45omega, [Blondelet-Rouyalt M. et al., 1997]). Згідно наших припущень, штам GT4.1 повинен нагромаджувати попередники LaE – дисахаридний інтермедіат ландоміцин D (LaD) та моноглікозильований ландоміцинон (ML). Однак ВЕРХ екстрактів показав, що мутант GT4.1 продукує дві нові сполуки (позначені як ландоміцини F та H; LaF, H), що за своєю хроматографічною рухливістю подібні до LaD та ML, але мають інші максимуми поглинання світла у видимій частині спектру.

Ми здійснили комплементацію порушень у мутанті GT4.1. Для цього lnd/lan-гени клонували під промотор гену еритроміцин-стійкості (ErmEp*) у вектори pKC1218E і pSET152. Експресія гену lndGT4 чи lаnGT4 у мутанті GT4.1 призвела до продукції утвореним штамом нової сполуки (LaG), хроматографічна рухливість якої близька до такої LaE, і має відмінні від LaE масу (LaE – 712, LaG - 695), спектральні характеристики.

Це означає, що нокаут гену lndGT4 шляхом інсерції в нього гену aadA має полярний ефект на інші lnd-гени. Імовірно, термінатори траскрипції і трансляції фага Т4, які ген aadA містить на своїх кінцях, перешкоджають експресії lnd-генів локалізованих у 3-напрямі.

Згідно даних секвенування, у 3-напрямі від lndGT4 розташовані гени редуктази lndZ4, гідроксилази lndZ5, голо-АПБ-синтази lndZ6. Ми зясували, що експресія генів lndGT4lnd Z4lndZ5 є достатньою, щоби відновити у мутанті GT4.1 продукцію LaE (рис.1). Експресія генів lndZ4lndZ5 у GT4.1 відновлює синтез LaD (рис.1). Експресія lndZ5 чи lanZ5 у GT4.1 не змінює спектру синтезованих ним сполук. Отже, у мутанті GT4.1 пошкоджена експресія трьох lnd-генів – lndGT4, lndZ4, lndZ5. Імовірно, нові ландоміцини не містять гідроксильної групи у своїй структурі.

Нові ландоміцини були очищені у препаративних кількостях і їхня хімічна структура була визначена за допомогою спектральних методів (ВЕРХ-МС, ІЧ-, UV-VIS-спектроскопія, МС, ядерномагнітний резонанс). Виявилось, що LaF є 11-дезоксиландоміцином D (m/z – 582) , LaH – моноглікозильованим 11-дезоксиландоміциноном (m/z – 451) , LaG - 11-дезоксиландоміцином Е (m/z – 695). У нових ландоміцинах відсутня гідроксильна група у позиції С11, що характерна для всіх досі описаних ландоміцинів А-Е [Krohn C. et. al., 1997]. Отже, LaF-H є першими ландоміцинами із зміненим агліконом.

З результатів секвенування генів lndGT4lndZ4lndZ5, комплементаційних експериментів та даних структурного аналізу ландоміцинів F-H ми зробили висновок, що ген lndGT4 контролює приєднання залишку L-родинози, а гени lndZ4lndZ5 контролюють гідроксилювання першого кільця під час синтезу LaЕ. Гени lndGT4lndZ4lndZ5 знаходяться у межах однієї транскрипційної одиниці. Наразі незрозуміло, яка роль редуктази LndZ4 у С11-гідроксилюванні. Однак перекриття генів lndZ4 і lndZ5 та нездатність lndZ5 відновити у мутанті GT4.1 продукцію С11-гідроксильованих ландоміцинів свідчить про те, що обидва білки – LndZ4 і LndZ5 - є важливими для каталізу реакції С11-гідроксилювання. Це питання заслуговує на окреме дослідження, оскільки окиснення першого кільця попередників ландоміцинів є унікальною реакцією серед ангуциклінів [Henkel T. et al., 1990], і фенілглікозидна структура, що при цьому формується, зустрічається вкрай рідко серед метаболітів бактерійного походження. Використання C11-гідроксилази для створення нових біоактивних сполук є перспективним завданням.

Із структур нових ландоміцинів можна зробити висновок, що усі глікозилтрансферази, задіяні у біосинтезі LaE, здатні використовувати 11-дезкосиландоміцинон як акцепторний субстрат для глікозилтрансферазних реакцій. Це свідчить про існування в них певного ступеню субстратної гнучкості – властивість, що робить ці ферменти цінним знаряддям у комбінаторному синтезі нових антибіотиків. Виявлення та недвозначне визначення структури моноглікозильованого ландоміцину LaH вказує на те, що дезоксицукри під час синтезу LaE та ландоміцину А приєднуються як моносахаридні активовані попередники, а не “блоками” (спочатку – дисахаридний оливозил-оливозильний залишок, потім – залишок L-родинози), як це припускали[Kirsching A et al., 1997].

Досі біологічні властивості ландоміцинів повязувались лише із відмінностями у будові сахаридної частини [Rohr J. et al., 1997], оскільки ландоміцинів із модифікаціями аглікону не існувало. Генерування ландоміцинів F-H відкриває можливість оцінити, як впливають зміни у будові полікетидного каркасу на протипухлинну активність цих сполук. Отримані дані дозволять раціональніше підходити до генно-інженерного конструювання продуцентів нових біологічно активних сполук із заздалегідь заданим типом біологічної дії.

4. Гетерологічна експресія lnd-генів у актиноміцетах. Цікавим у практичному і теоретичному відношеннях завданням є гетерологічна експресія lnd-генів. Отримані результати дозволяють оцінити їхній потенціал для конструювання нових антибіотиків, залежність експресії від регуляторних елементів господаря, ступінь субстратної специфічності білків, що кодуються lnd-генами.

Оскільки точна транскрипційна організація lnd-генів (промоторні-термінаторні ділянки, сайти зв’язування регуляторних білків тощо) невідома, ми сконструювали на основі вектора pSET152 плазміди pSN6 та pSXL62 для експресії макрофрагментів lnd-кластеру. pSN6 містить гени полікетидсинтази lndFlndAlndBlndClndD та ген оксигенази lndE. pSXL62 містить гени циклази lndL, оксигенази lndM, редуктаз lndNlndO декарбоксилази lndP та біосинтезу цукрів lndGlndHlndQlndRlndSlndT під промотором гену апраміцин-стійкості aac(3)IV. Ми перевірили, чи експресія генів мінімальної ПКС у гетерологічному господарі S.coelicolor CH999 [McDaniel et al., 1993] залежить від наявності регуляторного гену lndI. Ген lndI клонували у векторі pKC1218E під контролем промотору ErmEp*. Коекспресія гену lndI та плазміди pSN6 в штамі CH999 призводила до синтезу нових сполук. Ці сполуки за своїми спектральними характеристиками (максимуми поглинання світла при 280 та 410 нм) були подібні до описаних продуктів експресії мінімальних ПКС з інших кластерів генів біосинтезу полікетидів [Rawlings, 1999]. СН999, в якому експресували лише pSN6, за спектром синтезованих полікетидів не відрізнявся від вихідного штаму. Отже, ген lndI є важливим для активації структурних lnd-генів, і їхня експресія у гетерологічних умовах може відбуватися тільки з чужорідного конститутивного промотора. Тому для подальших дослідів ми вибрали плазміду pSXL62, в якій lnd-гени можуть експресуватися з промотора гену aac(3)IV.

pSXL62 була введена у штами-продуценти протипухлинних антибіотиків S.galilaeus HKI 0022 (продуцент аклациноміцину), S.fradiae Tu2717 (урдаміцину А), S.peucetius subsp.caesius ATCC27952 (доксорубіцину). ВЕРХ екстрактів рекомбінантних штамів, S.galilaeus SXL1, S.peucetius subsp.caesius SXL2 не виявила продукції нових сполук. Отже, антрациклічні антибіотики, які продукують ці штами, не можуть слугувати як субстрат для Lnd-білків. ВЕРХ екстрактів з штаму S.fradiae XL5 виявила, що він продукує нову сполуку, яка за своїми фізико-хімічними властивостями дуже подібна, але не ідентична з урдаміцином А.

Враховуючи структурну подібність молекул ландоміцину Е та урдаміцину А в ділянці ангулярного зчленування кілець, можна припустити, що експресія lnd-генів у рекомбінантному штамі веде до модифікації молекули урдаміцину А, а саме окиснення 3-го кільця. Експресія генів lndNlndO, що кодують редуктази, також можуть вести до певних модифікацій урдаміцинів. Подальший структурний аналіз нової сполуки дозволить недвозначно з’ясувати, які саме lnd-гени відповідають за модифікацію урдаміцину А.

ВИСНОВКИ

В результаті виконаної роботи виявлено і секвеновано кластер генів біосинтезу протипухлинного антибіотика ландоміцину Е (lnd-кластер) Streptomyces globisporus 1912. З’ясовано функції шести структурних lnd-генів і регуляторну функцію гену lndI. Вперше отримано нові ландоміцини із зміненою структурою аглікону.

1. Кластер генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер) знаходиться у ділянці хромосоми S.globisporus 1912 розміром 36 т.п.н. Виявлено 30 генів, що контролюють біосинтез ландоміцину Е. Гени lndZ6lndAlndBlndClndDlndLlndF lndElndMlndZ4lndZ5lndNlndOlndVlndP контролюють синтез полікетидної частини ландоміцину Е, lndGlndHlndQlndRlndSlndTlndZ1lndZ3 – синтез дезоксицукрів, lndGT2lndGT1lndGT4 – їхнє приєднання до аглікону, ген lndJ кодує імовірний детермінант стійкості до ландоміцину Е, lndI – позитивний регулятор структурних lnd-генів. Роль генів lndX та lndU у біосинтезі LaE невідома.

2. В трьох із дев’яти Lnd- - мутантів S.globisporus 1912 виявлені делеції які призводять до повного припинення біосинтезу ландоміцину Е. Ці делеції охоплюють райони клонованого lnd-кластеру, що містять регуляторний ген lndI та гени мінімальної полікетидсинтази lndA, lndB, lndC.

3. Гени lndL та lndF кодують циклазу-ароматазу першого кільця і циклазу третього-четвертого кілець ландоміцинону, відповідно. Ген lndM кодує оксигеназу третього кільця, lndGT4 кодує родинозилтрансферазу, що приєднує залишок L-родинози під час синтезу ландоміцину Е.

4. Інактивація гену lndGT4 призводить до продукції рекомбінантним штамом GT4.1 нових ландоміцинів F та Н, а комплементація генетичних порушень у цьому штамі геном lndGT4 – до продукції ландоміцину G. Усі три нові ландоміцини не містять гідроксильної групи у позиції С11. Ландоміцини Н та F містять у своїй структурі моно- та дисахаридний залишки, відповідно, ландоміцин G – трисахаридний залишок.

5. В гетерологічних господарях S.coelicolor CH999 та S.fradiae Tu2717 lnd-гени експресуються за наявності специфічного регуляторного гену lndI, або під контролем сильного конститутивного промотора.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ostash B.O., Luzhetskiy A.M., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Transfer of plasmids from Escherichia coli to mutant strain S. globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Наук. Вісн. Ужгород. Нац. Ун-ту, Сер. Біол. –2001.-Т.10.-С.147-149.

2. B. Ostash, L. Basiliya, O. Gromyko, Yu. Rebets, V. Fedorenko. Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin E biosynthesis // Вісник Львів. ун-ту, сер. біол. – 2001. -Т.27.-С.106-112.

3. А.Н.Лужецкий, Б.Е.Осташ, В.А. Федоренко. Межродовая конъюгация Еscherichia coli - Streptomyces globisporus 1912 с использованием интегративной плазмиды pSET152 и ее производных // Генетика. –2001.-Т.37, №10.-С.1340-1347.

4. Y. Rebets, B.Ostash, A. Luzhetskyy, D.Hoffmeister, A. Braтa, C.Mendez, J.A. Salas, A. Bechthold, V. Fedorenko. Production of landomycins in strains Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Lett.-2003.-V.222(1).-P.149-153.

5. В.О.Федоренко, Л.І.Басілія, К.О.Панькевич, Л.П.Дубицька, Б.О.Осташ, А.М.Лужецький, О.М.Громико, Г.Крюгель Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків-полікетидів // Бюлетень ін-ту сільськогосп. мікробіології . – 2000. – Т.2.-С.27-31.

6. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В., Настасяк І.М., Демидчук Ю.О., Дубицька Л.П., Мазепа А.Й., Мар’їна О.В., Панькевич К.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Самбір М.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів. „Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть”. K.: Логос.-2002.- Т.1. – С.469-476.

7. K. Pankevych, J. Demydchuk, A. Luzhetskiy, B. Ostash, L. Basiliya, K.Weber, V. Fedorenko, H. Saluz and H. Krugel. Pathway alignment and analysis of the landomycin E biosynthetic gene cluster from Streptomyces globisporus 1912. Dresden, VAAM-Workshop " Biologie der Actinomyceten" – Theses. – 1999.-26-28 September. -P. V18.

8. M.V. Sambir, O.M. Gromyko, B.O. Ostash. Molecular analysis of Streptomyces globisporus 1912 mutants deficient in production of putative anticancer polyketide Landomycin E. 2nd international medical conference for students and young doctors-Gdansk-April 28-30, 2000.-Theses-P.134.

9. Ostash B.O. Genetic approaches to studying the landomycin E biosynthesis in Streptomyces globisporus 1912 // Conference on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted to 100th anniversary of genetics: Proc. (L'viv, Ukr., 20 -22 April 2000). - Львів, 2000. - С. 69.

10. Ostash B.O., Pankevych K.O., Luzhetskiy A.M., Basiliya L.I., Gromyko O.M., Kruegel H., Fedorenko V.O. Studying of genes involved in landomycin E biosynthesis by S. globisporus 1912 // 12th Int. Symp. on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Abs.-P.133.

11. Luzhetskiy A.M., Ostash B.O., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Conjugative transfer of plasmid DNA into Streptomyces – producers of antitumor antibiotics //12th Int. Symp. on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Theses.-P.80.

12. V.O.Fedorenko, B.O.Ostash, A. M.Luzhetskiy, L.I. Basiliya, K.O. Pankevych, O.M.Gromyko, Yu. V.Rebets, H. Kruegel. Genetic control of antitumor landomycin E biosynthesis in S. globisporus 1912 // Mat. Ogolnopol. Symp. Mikrobiol. Krakow, Poland, 6-8 Wrzesien 2001. Abs.-P.17-18.

13. Yu. Rebets, B. Ostash. Using of different vector systems for heterologous expression of genes for angucycline antibiotic landomycin E biosynthesis // Conf. for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstract. P.119.

14. V. Yuskevych, B. Ostash. Characterization of recombinant strain Streptomyces fradiae Tu 2717 carrying plasmid pSET152 and its derivatives // Сonf. for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstracts book. P.129.

15. Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Юськевич В.Ю., Федоренко В.О. Гени Streptomyces globisporus 1912, які контролюють процеси циклізаціїї полікетидного ланцюга ландоміцину Е // Укр.біохім.журн. – 2002. – Т.74, № 46. – С.52-53.

16. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Bechthold A., Fedorenko V. Pathway-specific regulatory genes for landomycins E and A biosynthesis of Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136, a new member of SARP family// VAAM – Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduczenten” 29.Sept.-1 Okt.2002, Freiburg. – P.28.

17. Rebets Yu., Ostash B. Heterologous expression of landomicyn E biosynthesis genes in model strains of streptomycetes//6-th School-Conf. of young scientists “Biology – science of XXI century” : Proc. (Puschino, Russia, 20-24 May 2002). – Theses.- V.1.-P.308.

18. Юськевич В., Осташ Б. Гетерологічна експресія генів біосинтезу ландоміцину Е в штамі-продуценті урдаміцинів S.fradiae Tu 2717 // Мат. ІІ-ої Всеукр. Конф. студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”(Київ, 23-26 квітня 2002р.). Тези.- C. 46-47.

19. Юськевич В., Осташ Б, Федоренко В. Використання генів оксигеназ, що задіяні у біосинтезі ангуциклічних полікетидів, для конструювання продуцентів нових антибіотиків // Тези доповідей учасників І-ої Всеукр. Наук.-практ. Конф. студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 137-138.

20. Лужецький А., Грек М., Федоришин М., Осташ Б., Басілія Л., Бехтольд А., Федоренко В. Використання кон’югації для створення рекомбінантних штамів Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 127-128.

21. Ребець Ю., Осташ Б., Лужецький А., Хофмейстер Д., Брана А., Мендез К., Салас Х.А., Бехтольд А., Федоренко В. Гени, що контролюють біосинтез ландоміцинів у Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукр. наук.-практ. конф. студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 135-136.

22. Ребець Ю., Мік У., Дутко Л.О., Осташ Б., Басілія Л., Федоренко В. Клонування та вивчення генів lndJ та lndW Streptomyces globisporus 1912, що кодують білки транспортери // Тези доповідей учасників І-ої Всеукр. Наук.-практ. конф. студентів, аспірантів та мол. учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ).С.133-134.

23. Осташ Б., Лужецький А., Громико О., Ф. Ломбо, Салас Х.А., Федоренко В. Генетичний контроль глікозилювання протипухлинного антибіотика ландоміцину Е: вивчення гену lndGT4 Streptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 130-131.

АНОТАЦІЇ

Осташ Б.О. Генетичний контроль