УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ПІДКОВКА НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 612.112.94.015.11.014.23.014.333

регуляторна роль Са2+ у функціонуванні

Глутатіонової антиоксидантної системи

лімфоцитів крові

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Воробець Зіновій Дмитрович,

завідувач кафедри медичної біології та генетики

Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

завідувач відділу біохімії м`язів, заступник директора

з наукової роботи Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна

НАН України

доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

завідувач лабораторії обміну речовин

Інституту біології тварин УААН

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

кафедра біохімії

Захист відбудеться “_11_”____березня_____2003 р. о ____12.00_ годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН:

вул. Стуса, 38, м. Львів 79034).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН

за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.

Автореферат розісланий “_7_”___лютого______2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.І. ВіщурЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення регуляторних механізмів процесів пероксидної оксидації ліпідів та систем антиоксидантного захисту є одним з актуальних завдань сучасної біохімії та фізіології. Пероксидна оксидація ліпідів - універсальний механізм ушкодження клітинних мембран при різних патологіях (Владимиров Ю.А., 1989; Oltra A.M., 2001). За нормального функціонування організму постійно підтримується динамічна рівновага між анти- й прооксидною системами. Порушення цієї рівноваги в бік переважання генерації активних форм кисню та їхніх метаболітів, виснаження систем антиоксидантного захисту призводять до окиснювального стресу (Сологуб Л.І, 1989; Дубініна О.Ю., 2001; Chiaramonte R. et al., 2001). У знешкодженні вторинних продуктів пероксидаціі та інших окиснених речовин головну роль відіграє глутатіонова антипероксидна система (Ursini F., Bindoli A., 1987; Ishikawa T. et al., 1997). Завдяки каталітичній активності глутатіонпероксидази (ГП) у клітинах відбувається відновлення Н2О2 та гідропероксидів органічних молекул до відповідних гідроксисполук (Selman C. et al., 2002). Ця захисна система містить також глутатіонредуктазу (ГР), глутатіонтрансферазу (ГТ) та відновлений глутатіон (GSH) (Ballatory N., 1994).

Са2+, як відомо, є одним з основних внутрішньоклітинних месенджерів, який регулює десятки клітинних функцій, а також може бути ініціатором процесу пероксидації ліпідів (Carafoli E., 1991; Курский М.Д. та ін., 1987, 2000; Костерин С.А., 1994, 2000; Воробець 3.Д. та ін., 1998, 2000; Костюк П.Г., 2000; Матишевська О.П., 2002). Ймовірно, динаміка активності Са2+-транспортувальних систем, зокрема Ca2+,Mg2+-АТФази, в клітинному метаболізмі та підтриманні гомеостазу Са2+ повинна корелювати з активністю інших метаболічних систем, зокрема з комплексом глутатіонозалежних ферментів, які є основою антиоксидантної системи. Зважаючи на це, можна припустити, що Са2+ бере безпосередню чи опосередковану участь у регуляції активності глутатіонової антиоксидантної системи.

Здебільшого згадані системи вивчали на плазматичних мембранах клітин та на саркоплазматичному ретикулумі (Lichtman A.H., 1981; Воробець 3.Д. та ін., 1998, 2000; Костерин С.А., 1994, 2000), а не на цілих клітинах. Дослідження на цілих клітинах мають свої особливості та переваги для розуміння механізмів функціонування інтактної клітини, оскільки визначається сумарна активність того чи іншого ферменту в клітині, а не окремих ізоформ, що локалізовані в різних мембранах чи цитозолі. Такі експерименти дають змогу вивчити взаємозв`язки між окремими ферментними системами.

Оскільки внутрішньоклітинний метаболізм лімфоцитів грунтується на фізіологічно закріпленій здатності цих клітини швидко реагувати на будь-які зміни гомеостазу в організмі і модуляція активності ферментів у лімфоцитах настає значно раніше, ніж змінюються морфологічні та біохімічні показники (Oltra A.M et al., 2001; Луговський С. П., 2002), ці клітини можна вважати актуальною моделлю для досліджень.

З огліду на участь лімфоцитів у реакціях клітинного та гуморального імунітету, необхідність підтримання іонного гомеостазу для нормального перебігу життєво важливих процесів на рівні клітини та цілого організму, актуальними є дослідження механізмів функціонування систем антиоксидантного захисту даних клітин та ролі Са2+ у цих процесах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького в рамках теми “Роль кальцій-транспортувальних систем у регуляції скоротливості серця при індукції фосфатидилінозитидного циклу” (№ держреєстрації: 2. 28. 4. 9.).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи - виявити взаємозв‘язок між функціонуванням глутатіонозалежної антиоксидантної системи, пероксидною оксидацію ліпідів та іонізованим кальцієм, використовуючи як модель моноядерні лімфоцити периферичної крові людини.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Визначити оптимальні умови для визначення глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної та глутатіонтрансферазної активності лімфоцитів крові, використовуючи як пермеабілізуючий агент сапонін.

2. Дослідити інтенсивність накопичення малонового діальдегіду (МДА), Ca2+,Mg2+-АТФазну, Na+,K+-АТФазну активність і вплив Са2+ на ферменти глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів.

3. Дослідити вміст малонового діальдегіду, відновленого глутатіону, а також Ca2+,Mg2+-АТФазну активність та активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів за умов окиснювального стресу.

4. Вивчити вплив лікарських препаратів різної фізіологічної дії на процес пероксидної оксидації ліпідів, функціонування АТФаз та глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів крові.

Об’єкт дослідження – роль Са2+ у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів крові.

Предмет дослідження – глутатіонова антиоксидантна система, Ca2+,Mg2+-АТФазна і Na+,K+-АТФазна активності лімфоцитів, окиснювальний стрес, індукований адріаміцином та Са2+.

Матеріали і методи досліджень. метод виділення моноядерних лімфоцитів периферичної крові у градієнті густини фікол-урографин, пермеабілізації клітин сапоніном, визначення концентрації білка за Лоурі, визначення активності глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази та глутатіонтрансферази, оцінка стану ПОЛ за концентрацією МДА, визначення вмісту GSH, визначення активності Ca2+,Mg2+-АТФази, Na+,K+-АТФази, визначення вмісту неорганічного фосфату.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше вивчені в комплексі окремі ланки глутатіонової антиоксидантної, катіон-транспортувальних систем та їх чутливість до Са2+ в моноядерних лімфоцитах периферичної крові людини.

З`ясовано, що обробка лімфоцитів сапоніном виявляє латентну активність глутатіонозалежних ферментів – глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіонтрансферази та Na+,K+- і Ca2+,Mg2+-АТФаз, що дає змогу простежити функціональні взаємозвязки між цими ферментами.

Виявлена залежність глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної, Na+,K+- АТФазної та Ca2+,Mg2+-АТФазної активності від інтенсивності окиснювального стресу. Встановлені оптимальні умови (рН, час інкубації, співвідношення катіонів, концентрація сапоніну, АТФ, білка) для визначення Na+,K+-АТФазної та Ca2+,Mg2+-АТФазної активності, визначені ці показники для ферментів системи глутатіонового захисту.

Отримані нові дані стосовно впливу лікарських речовин, як-от, куриозину, квамателу та мідокалму, на активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи та АТФаз. Простежено дозозалежність впливу цих речовин.

Продемонстрована здатність Са2+ регулювати пероксидну оксидацію ліпідів та активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи.

Практичне значення одержаних результатів. Продемонстровано, що моноядерні лімфоцити периферичної крові людини можуть бути зручною моделлю для вивчення механізмів функціонування катіон-транспортувальних, глутатіонової антиоксидантної систем та виявлення взаємозв`язків між цими системами. Отримані дані можуть служити основою для розробки методів корекції патологічних змін клітинного гомеостазу. З огляду на це можна ставити питання про створення нових та добір наявних фармакологічних препаратів, які модулюють активність АТФаз та ферментів глутатіонової антиоксидантної системи.

Матеріали дослідження можуть бути використані в курсі лекцій з біохімії та нормальної фізіології у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно проаналізувала наукову літературу за темою дослідження, сформульовала та обгрунтувала основні положення дисертаційної роботи і налагодила методи досліджень. Експериментальні дослідження, результати яких викладені в дисертації, здобувач проводила особисто. Визначення завдань, аналіз та обговорення отриманих результатів здійснені спільно з науковим керівником і співавторами статей.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені у доповідях та обговорені на ІІ Українській конференції молодих учених, присв`яченій пам’яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2001), 5-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2001), Науковій конференції, присв`яченій пам’яті Я.П. Склярова (Львів, 2001), Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001), 1-й Львівській Міжнародній конференції студентів і молодих учених (Львів, 2001), 1-му та 2-му Міжнародному медичному саміті студентів і молодих учених (Загреб, 2001, 2002), Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Клінічна фармакологія метаболічних коректорів та взаємодія ліків в клінічній практиці” (Вінниця, 2002), Львівсько-Люблінській міжнародній науковій конференції “Нові наукові досягення в еспериментальній та клінічній біохімії” (Люблін, 2002), XІ конференції міжнародного товариства “Дослідження вільних радикалів” (SFRRJ) (Париж, 2002), 4-й Міжнародній Парнасівській конференції “Молекулярні механізми активації клітин: біологічні сигнали та їх ферменти-мішені” (Вроцлав, 2002), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), III З’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 8 статтях, 6 з яких опубліковані у наукових фахових виданнях, а також у 13 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, методів досліджень, розділів, що відображають результати власних досліджень, висновків та списку використаної наукової літератури, який містить 226 джерел. Роботу викладено на 118 сторінках машинопису, проілюстровано 25 рисунками та 2 таблицями.

ОСНОВНА ЧАСТИНА РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. У дослідах використовували моноядерні лімфоцити периферичної крові людини, які виділяли методом центрифугування в градієнті концентрації фікол-урографину (=1,077) за методом Boum А.А., (1968) з гепаринізованої свіжоотриманої крові клінічно здорових осіб віком 21-28 років, розведеної у співвідношенні 1:3 розчином Хенкса без Са2+ і Mg 2+. Підраховували клітини у камері Горяєва. Життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах складала не менше 95%, оцінювали за забарвленням трипановим синім.

Для вивчення ферментативної активності лімфоцитарну суміш центрифугували 30 хв при 800 g та відбирали надосадову рідину, а лімфоцити ресуспендували у співвідношенні 1:1 у 0,9% NaCl, що містив ЕДТА у кінцевій концентрації 0,1%.

Для виявлення глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної, глутатіонредуктазної та Na+,K+-АТФазної латентної активності до суспензії лімфоцитів додавали 0,2 % сапонін, а для визначення глутатіонпероксидазної та Ca2+,Mg 2+-АТФазної активності – 0,1% сапонін. Дана методика грунтується на роботах Орлова та співавторів, виконаних на еритроцитах (Орлов С.Н., 1985).

Вміст білка в суспензії лімфоцитів визначали за методом, описаним Lowry О. et al., (1951).

Глутатіонпероксидазну активність визначали за зменшенням вмісту GSH (Моин В.М., 1986), глутатіонредуктазну активність - за зменшенням вмісту NADPH (Mannervik B., 1991; Власова С.Н. и др., 1990), глутатіонтрансферазну активність - за зменшенням вмісту GSH (Власова С.Н. и др., 1990; Булавин Д.В., 1996), інтенсивність ПОЛ оцінювали за вмістом одного з кінцевих метаболітів - малонового діальдегіду (Тимирбулатов С.А., Селезнев Е.И., 1998). Вміст відновленого глутатіону визначали за методом Власова С.Н., (1990).

Для визначення АТФазної активності суспензію клітин вносили в інкубаційне середовище (кінцевий об’єм 1,0 мл), яке готували на трис-HCl буфері (рН 7,4). Інкубаційне середовище для визначення Ca2+,Mg 2+-АТФазної активності містило 20мМ трис-HCl (рН 7,4), 5мМ MgCl2, 5мкМ СаСl2, 5мМ Na2АТФ. Mg2+-АТФазну активність визначали у таких самих умовах, але за відсутності СaCl2 і з додаванням 1 мМ ЕГТА та 0,1 мМ оуабаїну [Орлов С.Н., 1977]. За активність Сa2+,Mg2+-АТФази приймали активність, що інгібувалась 1 мМ розчином ЕГТА. За Na+,K+-АТФазну активність приймали активність, що інгібувалась 0,1 мМ розчином оуабаїну. Вміст неорганічного фосфату визначали за методом Фіске-Субароу (Меньшиков В.В., 1987).

Отримані результати досліджень статистично опрацьовували на комп’ютері зразка IBM сучасними методами аналізу, з використанням пакета компьютерних програм Microsoft Excel. Для оцінки рівня вірогідності використовували критерій Стьюдента. Зміни показників вважали вірогідними при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Функціональні властивості глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів крові. Відомо, що активність очищених ферментів глутатіонової антиоксидантної системи (ГП, ГР, ГТ) не залежить від Са2+. Однак, невідомо, як вони функціонують in vivo.

З огляду на те, що ферменти, які ми вивчали, локалізовані з внутрішнього боку плазматичної мембрани (АТФази, ГП, ГТ), інші – в цитозольній фракції (ГР), для розкриття їх латентної активності доцільною є пермеабілізація клітинних мембран. Метою першого етапу роботи був добір оптимальних умов для визначення активності даних ферментів у лімфоцитах крові, з використанням такого пермеабілізуючого агента, як сапонін у діапазоні концентрацій: 0,02...0,3%.

Виявлено, що низькі концентрації сапоніну (0,02...0,04%) є недостатніми для розкриття латентної активності досліджуваних ферментів. Оскільки це здебільшого цитозольні ферменти, а ГР - виключно цитозольний, для їх активації необхідна більша кількість сапоніну - 0,1% для ГП та 0,2% для ГР та ГТ (рис.1).

Властивості АТФаз лімфоцитів крові. Оскільки функціонування будь-яких ферментів залежить від багатьох чинників, метою другого етапу роботи був добір оптимальних значень таких показників, як рН, концентрація сапоніну, білка, АТФ, співввідношення катіонів Na+ і K+, час інкубації для визначення Са2+,Mg2+-АТФазної та Na+,K+-АТФазної активності лімфоцитів крові.

При визначенні Са2+,Mg2+-АТФазної активності в діапазоні концентрацій 0,02...0,1% спостерігалось зростання показника до 7,9+1,3± мкмоль Фн/мг білка за 1 хв. Більші концентрації сапоніну пригнічували ферментативну активність.

Nа+,K+ -АТФазна активність зростала лінійно відповідно до збільшення кількості сапоніну в інкубаційному середовищі. Максимальна активність даного ферменту становила 10,6±0,6 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв за 0,2% концентрації сапоніну.

Виявлено, що оптимум рН для Са2+,Mg2+-АТФази становить 7,0, для Na+,K+-АТФази - 6,8, тоді як, у більшості робіт на інших клітинах чи препаратах клітинних мембран при визначенні активності даних ферментів використовують інкубаційні середовища з рН 7,4 (Костерін С.О., 2000; Кульчицький О.К., 2001).

У результаті вивчення процесу гідролізу АТФ Са2+,Mg2+-АТФазою лімфоцитів залежно від часу виявлено, що активність цього ферменту становить 2,00,1 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв, за 20 хв інкубації досягає максимального значення (4,50,3 мкмоль Фн/мг білка), а при збільшенні часу інкубації до 30 хв знижується до 1,30,1 мкмоль Фн/мг білка.

Аналіз залежності Na+,K+-АТФазної активності від співвідношення Na+:K+ в інкубаційному середовищі та часу інкубації поданий на рис.2. Отже, протягом усього часу найменша максимальна активність спостерігалась при співвідношенні Na+:К+=150:10 і становила 0,90,1 мкмоль Фн/мг білка за 10 хв. Найбільшого значення цей показник досягав при співвідношенні Na+:К+ =130:10 і становив 6,40,6 мкмоль Фн/мг білка за 10 хв. Оскільки Na+,K+-АТФазна активність лінійно зростала упродовж 10 хв інкубації, то подальші досліди проводили протягом цього проміжку часу.

Na+,K+-АТФазна активність при концентрації білка 0,15 мг/мл становила 6,30,5 мкмольФн/мг білка за 1 хв, а при збільшенні концентрації білка до 0,45 мг/мл знижувалась до 0,90,3 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв та характеризувалась відповідною залежністю. Са2+,Mg2+-АТФазна активність із збільшенням концентрації білка до 0,3 мг/мл лінійно зростала, а відтак практично не змінювалась, що може свідчити про інгібування активності кінцевим продуктом реакції .

Як відомо, Na+,K+-АТФаза та Са2+,Mg2+-АТФаза здійснюють спряження гідролізу АТФ із трансмембранним переміщенням іонів (Carafoli Е., 1994; Clapham D.E., 1995; Костерін С.О. та ін., 2000). Саме тому для здійснення транспорту катіонів даними ферментами середовище має містити джерело енергії - АТФ. Са2+,Mg2+-АТФазна активність виявилася найвищою за наявності у середовищі інкубації АТФ у концентрації 5 мМ і становила 3,90,3 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв.

Na+,K+-АТФазна активність у наших експериментах була максимальною за наявності у середовищі інкубації 0,05 мМ АТФ і становила 2,60,3 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв. При концентрації АТФ 0,5 мМ АТФ вона зменшувалась до 1,20,2 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв. Отже, досліджені ферментні системи, ймовірно, характеризуються різною інтенсивністю ферментативного гідролізу АТФ.

Вплив Ca2+ на стан ПОЛ, властивості глутатіонової антиоксидантної системи та АТФаз. Для визначення залежності Ca2+,Mg 2+-АТФазної, глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної та глутатіонтрансферазної активності від концентрації Са2+, його вносили у вигляді СаCl2 в інкубаційне середовище у концентраціях 0,01 мМ...2 мМ. Як контроль використовували проби без додавання Са2+.

Згідно з результами досліджень, вміст МДА зростав від 228,312,5 нмоль/мг білка в контрольних пробах до 365,218,1 нмоль/мг білка за наявності 0,5 мM Са2+ (рис. 3).

Глутатіонпероксидазна активність лінійно зростала зі збільшенням концентрації Са2+ до 0,01 мМ і сягала 340,118,5 нмоль GSH/мг білка за 1 хв (рис.4). Більші концентрації Са2+ (0,5 мМ) зумовлювали зниження ГП-активності до 12,01,0 нмоль GSH/мг білка за 1 хв. За наявності 0,1 мМ Са2+ у середовищі інкубації спостерігалось зростання ГП-активності до 114,510,4 нмоль GSH/мг білка за 1 хв. Більші концентрації Са2+ спричиняли інгібування даної ферментативної активності. Наявність додаткового максимуму ГП-активності в даному випадку можна пояснити існуванням двох фракцій глутатіонпероксидази (Mannervik В., 1991) – мембранної та цитозольної, які виявляють різну безпосередню чи опосередковану чутливість до Са2+.

Додавання Са2+ у середовище інкубації призводило до пригнічення глутатіонтрансферазної активності (рис. 4). Цей показник був найбільшим за відсутності Са2+, тобто у контрольних зразках він становив 117,1±10,1 нмоль GSH/мг білка за 1 хв. Концентрації Са2+ 0,1...2 мМ зумовлювали подальше зниження активності ферменту до 46,4±3,5 нмоль GSH/мг білка за 1 хв.

Глутатіонредуктазна активність при 0,01 мМ Са2+, порівняно з контролем (24,93,1 нмоль NADPH/мг білка за 1 хв), виявляла тенденцію до зниження і становила 20,01,6 нмоль NADPH/мг білка за 1 хв. Із збільшенням концентрації Са2+ до 0,1 мМ спостерігалось зростання ГР-активності до 60,65,2 нмоль NADPH/мг білка за 1 хв. Подальше збільшення вмісту Са2+ призводило до зниження ГР-активності .

Відомо, що оксидація системних та мембранних ліпідів та активація фосфоліпаз активними видами кисню спричинює зростання концентрації метаболітів арахідонової кислоти, пероксидів, альдегідів та оксистеролів (Сологуб Л.І., 1989, 2000). Ці процеси спричиняються до порушення структури мембран та входження Са2+ у клітину внаслідок втрати кальцієвого гомеостазу як критичного фактора для виживання клітин (Goel R., Khanduja K.L., 1998).

Продемонстрований нами вплив Ca2+ на перебіг процесів ПОЛ та функціонування ферментів глутатіонової системи, ймовірно, полягає у збільшенні проникності плазматичної мембрани для Ca2+ внаслідок модифікуючого впливу ПОЛ, індукованого мілімолярними концентраціями власне Ca2+. Підвищення вязкості клітинних мембран внаслідок ПОЛ призводить до погіршення роботи ферментних систем, що виводять Са2+ з клітин, а отже зростає концентрація Са2+ в клітині та розвивається окиснювальний стрес[Матишевська О.П., 2002; Катанаев В.Л., 2001; Рыбина В.В., 2001; Chiaramonte R. et al., 2001]. Ймовірно, в цьому процесі бере участь також фосфоліпаза А2, яка є Са2+-чутливою та гідролізує фосфоліпіди з утворенням арахідонової кислоти [Матишевська О.П. та ін., 1991]. Це в свою чергу теж призводить до зміни проникності мембран для Са2+ [Kramer R.M., 1993].

Отже, катіони Са2+ здатні регулювати процес ПОЛ та функціонування системи знешкодження наслідків його дії, здійснюючи не тільки стимулюючий вплив на глутатіонову антиоксидантну систему при низьких концентраціях (0,01 мМ...0,1 мМ), а й інгібувальний вплив при вищих концентраціях Са2+.

Взаємодія катіон-транспортувальних та глутатіонової антиоксидантної систем лімфоцитів крові при індукції окиснювального стресу. Для з?ясування характеру взаємодії пероксидації, катіон-транспортування та антиоксидантних процесів у пермеабілізованих лімфоцитах був використаний цито- та мебранотоксичний препарат адріаміцин (Давтян Т.К., Аванесян Л.А., 2001). Шляхом інкубації клітин з адріаміцином у концентраціях 0,01%...0,3% індукували окиснювальний стрес, інтенсивність якого оцінювали за вмістом кінцевого продукту ПОЛ - малонового діальдегіду. Концентрація МДА при 0,1% концентрації адріаміцину зростала від 61,0±4,4 до 82,3±6,1 мкмоль/мг білка, а відтак - до 132,1±8,0 зі збільшенням концентрації адріаміцину до 0,2%. Наявність 0,3% та 0,4% адріаміцину сприяла зниженню цього показника відповідно до 96,1±7,2 та 89,0±5,3 мкмоль/мг білка, що пояснюється активацією глутатіонпероксидази та глутатіонтрансферази.

Вміст GSH знижувався зі збільшенням концентрації антибіотика від 17,2±1,6 нмоль/мг білка у контрольних зразках до 8,1±0,7 нмоль/мг білка за наявності 0,3% адріаміцину. Лише за наявності 0,1% адріаміцину спостерігалось зростання концентрації GSH до 22,0±2,1 нмоль/мг білка.

Отже, не зважаючи на підвищену ГП-активність (196,0±11,5 нмоль GSH/мг білка за 1 хв), за даних умов відбувається не виснаження глутатіонової антиоксидантної системи, а її реактивація, оскільки виявлено, що ГР-активність зростала зі збільшенням концентрації адріаміцину до 0,1% і становила 85,1±6,2 нмоль NADPH/мг білка за 1 хв. Проте подальший розвиток процесів ПОЛ за вищих концентрацій адріаміцину пригнічував активність ферменту, що також підтверджується відповідним зниженням вмісту GSH.

Усі досліджені концентрації адріаміцину інгібували глутатіонтрансферазну активність, яка зменшувалась приблизно втричі.

Na+,K+- АТФазна активність знижувалась з 7,0±0,6 у контрольних пробах до 1,5±0,1 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв при концентрації адріаміцину 0,2%, наближуючись до нульових значень за більших концентрацій антибіотику, що може бути зумовлене модифікацією ліпідного оточення даного ферменту в плазматичній мембрані внаслідок розвитку окиснювального стресу.

Ca2+,Mg2+-АТФазна активність в зразках, у яких не індукували окиснювальний стрес, становила 1,6±0,2 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв. У всіх досліджуваних зразках наявність адріаміцину призводила до практично повного інгібування активності даного ферменту.

Вищенаведені дані підтверджені результатами, які ми отримали раніше, вивчаючи вплив Са2+ на глутатіонову антиоксидантну та Са2+-транспортувальну системи.

Зміни властивостей глутатіонової антиоксидантної системи, стану ПОЛ, АТФаз при дії лікарських речовин. Вивчення механізму дії лікарських препаратів різного типу, які широко впроваджуються в медичну практику, є одним з актуальних завдань біохімії, фізіології, фармакології та клінічної фармації.

Перспективним є вплив на глутатіонову антиоксидантну систему з метою підвищення або зниження концентрації глутатіону в тканинах, зміни його кількості чи активності ферментів його обміну. Для з`ясування універсальності ролі глутатіонової системи та Са2+ в підтриманні клітинного гомеостазу і опосередкування нею дії лікарських препаратів ми використовували різні за механізмом дії та фізіологічним ефектом препарати. Одним з таких препаратів є куриозин (гіалуронат цинку), який активує проліферацію клітин, передусім сполучної тканини і, таким чином, сприяє регенерації.

Продемонстровано, що при концентрації куриозину 10 мкг/мл глутатіонпероксидазна активність зростає порівняно з контролем в 1,5 разу, але при вищих концентраціях препарату активність ферменту знижується. Вплив даних концентрацій куриозину (5...500 мкг/мл) на глутатіонредуктазну активність був аналогічним.

У лікуванні захворювань травної системи широко використовується квамател (фамотидин) – один з найефективніших представників родини селективних блокаторів Н2-рецепторів 3-го покоління. Імовірно, що лімфоцити крові можуть бути моделлю для вивчення механізму дії Н2-антагоністів.

Виявлено, що низькі концентрації квамателу (10-6…10-5 М) практично не впливають на ГП-активність, тоді як при його вмісті 10-4 М, ферментативна активність зростає в 6 разів проти контролю від 25,0±1,1 до 150,6±12,5 нмоль GSH/мг білка за 1 хв. Більші концентрації препарату пригнічуюють ГП-активність.

Зміни глутатіонредуктазної активності полягали у її зростанні від 20,7±1,9 нмоль NADPH/мг білка за 1 хв за відсутності квамателу до 179,5±12,9 нмоль NADPH/мг білка за 1 хв при концентрації 10-5 М. При зростанні концентрації цієї сполуки до 10–3 М спостерігалось поступове зменшення показника до нульового значення. Отже, продемонстрована дозозалежна дія квамателу зі стимулювання ГП- та ГР-активності лімфоцитів крові людини.

При вивченні залежності Са2+,Mg2+-АТФазної активності лімфоцитів від концентрацій квамателу виявлено, що зі збільшенням концентрації квамателу в інкубаційному середовищі до 10-5 М, ферментативна активність зменшується в 10 разів проти контролю. Вищі концентрації квамателу цілковито пригнічували дану АТФазну активність. При цій же концентрації квамателу (10-5 М), Na+,K+-АТФазна активність також пригнічувалась цілковито. Нижча концентрація цього антагоніста (10-6 М) в 1,3 разу пригнічувала активність ферменту.

Мідокалм (толперизон) є одним з найчастіше застосовуваних у клінічній практиці міорелаксантів. Вплив цього препарату на фізіологічні функції загалом добре вивчений, але механізм його дії зясований недостатньо. Відомо, що дія мідокалму певним чином пов’язана з оксигенацією клітин та з роботою іонних помп. Є підстава припускати, що він впливає також і на низку інших життєво важливих систем клітини.

Са2+,Mg2+-АТФазна активність зростала зі збільшенням концентрації мідокалму до 10 мкг/мл і сягала 2,40,2 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв. Дана активність зростала в 3,5 разу проти контролю. Більші концентрації мідокалму призводили до зниження Са2+,Mg2+-АТФазної активності, а при його концентрації 50 мкг/мл ферментативна активність наближалась до нульових значень.

Na+,K+-АТФазна активність різко знижувалась при концентрації мідокалму 5 мкг/мл, з 2,10,1 до 0,50,04 мкмоль Фн/мг білка за 1 хв, а далі зі збільшенням концентрації препарату до 20 мкг/мл поступово зростала до 1,50,1 мкмоль Фн /мг білка за 1 хв. Концентрації мідокалму понад 20 мкг/мл інгібували дану АТФазну активність. Ці процеси, ймовірно, супроводжувались активізацією ПОЛ мембран, оскільки спостерігалось зростання вмісту МДА та інгібування ГП- і ГР- активності у всіх досліджених зразках після додавання препарату.

Отже, не дивлячись на різний фізіологічний ефект куриозину, квамателу та мідокалму, один із механізмів їх дії пов‘язаний з функціонуванням глутатіонової антиоксидантної та катіон-транспортувальної систем.

ВИСНОВКИ

У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань дослідження на пермеабілізованих лімфоцитах крові вперше отримано дані, що підверджують тісний взаємозв`язок між активністю глутатіонової антиоксидантної системи, концентрацією Са2+ та пероксидною оксидацією ліпідів, виявлена регуляторна роль Са2+ в забезпеченні функціонування глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази та глутатіонтрансферази. Цей взаємозв`язок між дослідженими системами засвідчують такі результати :

1. Обробка лімфоцитів сапоніном (0,1...0,2%) виявляє латентну активність глутатіонозалежних ферментів – глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіонтрансферази та Na+,K+- і Ca2+,Mg2+-АТФаз, що дає змогу простежити функціональні взаємозвязки між цими ферментами.

2. Катіони Са2+ регулюють процес пероксидної оксидації ліпідів і, відповідно функціонування системи знешкодження наслідків його дії (глутатіонпероксидазу, глутатіонредуктазу, глутатіонтрансферазу), здійснюючи не тільки стимулюючий вплив на глутатіонову антиоксидантну систему при низьких концентраціях, а й інгібуючий вплив при концентраціях, що перевищують 0,1 мМ.

3. Адріаміцин у концентрації до 0,2% індукує окиснювальний стрес у лімфоцитах крові, збільшуючи вміст малонового діальдегіду, що супроводжується зростанням глутатіонпероксидазної та глутатіонредуктазної активності. Вища концентрація адріаміцину призводить до подальшого зростання глутатіонпероксидазної активності та різкого зниження глутатіонредуктазної і глутатіонтрансферазної активності.

4. Розвиток пероксидної оксидації ліпідів та окиснювального стресу спричиняється до пригнічення Ca2+,Mg2+-АТФазної активності.

5. Виявлена залежність глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної, Na+,K+- АТФазної та Ca2+,Mg2+-АТФазної активності від інтенсивності окиснювального стресу, індукованого адріаміцином, що свідчить про тісний функціональний зв’язок досліджених систем in vivo.

6. Виявлено, що один зі шляхів реалізації фізіологічного ефекту різних за механізмом дії фармакологічних препаратів (куриозин, мідокалм, квамател) опосередковується глутатіоновою антиоксидантною системою. Вплив цих препаратів на ферментативну активність глутатіонової антиоксидантної та катіон-транспортувальних систем є дозозалежним.

7. Моноядерні лімфоцити периферичної крові людини є адекватною моделлю для вивчення механізмів функціонування катіон-транспортувальних та глутатіонової антиоксидантної систем. Їх можна використовувати як експериментальну модель для виявлення індивідуальної чутливості клітин до ліків, а також для дослідження біохімічних механізмів дії лікарських препаратів.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

АНОТАЦІЯ

Підковка Н.О. Регуляторна роль Са2+ у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи лімфоцитів крові. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. – Інститут біології тварин УААН. -Львів. – 2002.

У дисертації подані результати вивчення одної з актуальних проблем біохімії – механізмів функціонування систем антиоксидантного захисту лімфоцитів периферичної крові людини та ролі Са2+ у цих процесах.

Вперше вивчено в комплексі окремі ланки глутатіонової антиоксидантної та катіон-транспортувальних систем. З`ясовано, що обробка лімфоцитів сапоніном виявляє латентну активність глутатіонозалежних ферментів – глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіонтрансферази та Na+,K+- і Ca2+,Mg2+-АТФаз, що дає змогу простежити функціональний взаємозвязок між цими ферментами.

Продемонстрована здатність Са2+ до регуляції процесу пероксидної оксидації ліпідів, та функціонування системи знешкодження наслідків його дії за допомогою глутатіонозалежних ферментів.

Виявлена залежність глутатіонпероксидазної, глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної, Na+,K+- АТФазної та Ca2+,Mg2+-АТФазної активності від інтенсивності пероксидної оксидації ліпідів. Визначені оптимальні умови (рН, час інкубації, співвідношення катіонів, концентрація АТФ, білка, сапоніну) для визначення АТФазної активності та аналогічні показники для ферментів системи глутатіонового захисту.

Отримані нові дані стосовно впливу лікарських речовин, як от куриозину, квамателу та мідокалму, на активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи та АТФаз. Засвідчена дозозалежність цього впливу.

Продемонстровано, що моноядерні лімфоцити периферичної крові людини є адекватною моделлю для вивчення механізмів функціонування іон-транспортувальнх та глутатіонової антиоксидантної систем.

Ключові слова: лімфоцити, Са2+, Ca2+,Mg2+-АТФаза, Na+,K+- АТФаза, пероксидна оксидація ліпідів, глутатіон, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза, глутатіонтрансфераза.

АННОТАЦИЯ

Подковка Н.А. Регуляторная роль Са2+ в функционировании глутатионовой антиоксидантной системы лимфоцитов крови. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биологии животных УААН. -Львов. – 2002.

В диссертации приведены результаты изучения одной из актуальных проблем биохимии –механизмов функционирования глутатионовой антиоксидантной системы в лимфоцитах крови и роли Са2+- в этих процессах.

Впервые исследованы в комплексе отдельные звенья катион-транспортирующих и глутатионовой антиоксидантной систем.

Установлено, что обработка лимфоцитов сапонином раскрывает латентную активность глутатионзависимых ферментов – глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы, а также Na+,K+- і Ca2+,Mg2+-АТФаз, что дает возможность установить функциональную взаимосвязь между активностью этих ферментов. Определены оптимальные условия (рН, время инкубации, соотношение катионов, концентрация сапонина, АТФ, белка) для определения АТФазной активности и аналогичные показатели для ферментов системы глутатионовой защиты.

Продемонстрирована способность Са2+ к регуляции процесса пероксидной оксидации липидов и системы обезвреживания их действия с помощью глутатионовой антиоксидантной системы. Показана зависимость глутатионпероксидазной, глутатионредуктазной, Na+,K+- АТФазной и Ca2+,Mg2+-АТФазной активности от интенсивности пероксидной оксидации липидов, индуцированной адриамицином.

Получены новые данные о влиянии лекарственных препаратов (куриозин, квамател, мидокалм) на активность ферментов глутатионовой антиоксидантной системы и АТФаз. Показана дозозависимость этого влияния.

Таким образом, лимфоциты крови человека являются адекватной моделью для изучения механизмов функционирования катион-транспортирующих и глутатионовой антиоксидантной систем, а также могут использоваться в качестве експериментальной модели при определении индивидуальной чувствительности клеток к лекарствам и для исследования биохимических аспектов механизмов действия лекарственных препаратов.

Ключевые слова: лимфоциты, Са2+, Ca2+,Mg2+-АТФаза, Na+,K+- АТФаза, пероксидная оксидация липидов, глутатион, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глутатионтрансфераза.

SUMMARY

Podkovka N.A. Ca2+ regulating role in glutathione antioxidant system function in blood lymphocytes. – Manuscript.

Thesis is presented for a scientific degree of the Candidate of Biological Sciences on the specialty 03.00.04 - biochemistry. - Institute of the Animal Biology of the Academy of Agrarian Sciences of Ukraine. - Lviv. – 2002.

The relationship between the Ca2+-transporting and antioxidant systems function in human blood lymphocytes were investigated.

For the first time the separate links of glutathione antioxidant system and cation-transporting enzymatic system were studied in complex.

We revealed that saponin application uncovered the latent activities of the glutathione-dependent enzymes, such as glutathione peroxidase, glutathione reductase, glutathione transferase, and Na+,K+-ATPase, Ca2+,Mg2+-АТPase that gives the opportunity to define the functional relationships between the activities of these enzymes.

We have defined the optimal conditions (concentration of saponin, protein and ATP; pH, time of the incubation, cations correlation) for ATPases activity definition and the analogical indexes for the enzymes of glutathione protective system.

The Са2+ ability for the regulation of lipid peroxidation processes and, accordingly, the system of their detoxication with the help of glutathione antioxidant system was demonstrated. There was revealed the dependence of glutathione peroxidase, glutathione reductase and glutathione transferase activities from Ca2+ contents.

It was shown the dependence of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glutathione transferase and Na+,K+-ATPase, Ca2+,Mg2+-АТPase activity from the intensity of the oxidative stress, inducing by adriamycine.

The new data about drugs (Curiosin, Quamatel, Midokalm) influence on enzymatic activities of glutathione antioxidant system and ATPases were obtained.

We demonstrated that human peripheral blood lymphocytes are an adequate model for the investigation of the function mechanisms of cation-transporting and glutathione antioxidant systems.

Key words: lymphocytes, Са2+, Ca2+,Mg2+-АТPase, Na+,K+- АТPase, lipid peroxidation, glutathione, glutathione peroxidase, glutathione reductase, glutathione transferase.