ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

СИНЮК Юрій Володимирович

УДК 577.122:597.551.2

обмін амінокислот і фракційний СКлад білків

у організмі коропа за дії іонів

марганцю, цинку, міді та свинцю

03.00.04 – біохімія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільському державному педагогічному університеті

імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Грубінко Василь Васильович,

Тернопільський державний педагогічний

університет імені Володимира Гнатюка,

проректор з навчальної роботи,

завідувач кафедри загальної біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну речовин

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Коновець Ігор Миколайович,

Інститут гідробіології НАН України,

с.н.с. відділу екологічної фізіології

водних тварин та іхтіології

Провідна установа: Чернівецький національний університет

імені Юрія Федьковича, кафедра біохімії

Міністерства освіти і науки України, м. Чернівці

Захист відбудеться “_16__”__грудня___ 2003 р. о _1000__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин УААН за адресою: вул. В. Стуса, 38, м. Львів 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: вул. В. Стуса, 38, м. Львів 79034.

Автореферат розісланий “_14_”___листопада__ 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Забезпечення високої продуктивності рибництва останнім часом ускладнюється внаслідок антропогенної трансформації природного середовища, особливо забруднення водойм. Крім того, викиди у водне середовище окремих речовин викликають у гідробіонтів токсичний стрес. Серед таких забруднювачів важливе місце займають важкі метали. Їх іони прямо, шляхом дії на ферменти, чи опосередковано, шляхом утворення регуляторних сполук, здатні змінювати інтенсивність та спрямованість метаболізму у риб (Лукьяненко В.И., 1983; Евтушенко Н.Ю., 1985).

Зменшення продуктивності риб, вирощуваних у забрудненому середовищі, значною мірою обумовлені змінами метаболізму білків, які, як відомо, є одними з основних структурних і метаболічних чинників адаптацій. Основними інтермедіатами білкового обміну є амінокислоти. У риб амінокислоти є резервом для синтезу білків та нуклеїнових кислот, а також беруть участь у субстратному забезпеченні ліпогенезу та глюконеогенезу, зв’язуванні аміаку, виконують функції нейромедіаторів, використовуються як джерело енергії (Сидоров В.С., 1985; Яковенко Б.В., 1993; Грубінко В.В., 1995). Окремі з них беруть активну участь у детоксикації шкідливих для організму речовин (аміак, важкі метали, пестициди та інші) (Балезин С.Л., Грицук А.И., 1991; Грубінко В.В., Арсан О.М., 1991; Курант В.З., 2001). Однак, метаболізм білків і амінокислот у організмі риб за дії важких металів досліджений мало, що обумовлює актуальність розширення і поглиблення досліджень такого плану.

Якісний та кількісний склад білків сироватки крові відображає стан метаболізму в організмі риб. За дії токсикантів зміни метаболізму білків в організмі риб впливають на вміст білків у сироватці крові. Дослідження впливу важких металів на вміст білків у сироватці крові вибірково проводились на певних видах риб за дії окремих металів. Однак, відомі дані є недостатньою базою для повного розуміння фізіолого-біохімічних процесів, які відбуваються в організмі риб за інтоксикації важкими металами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослiдження проведені в межах виконання держбюджетної тематики Міністерства освіти і науки України: “Дослідження метаболічної ролі амінокислот в адаптаційно-компенсаторних процесах в організмі тварин при екологічних стресах” (1999-2000 рр., номер держреєстрації 0199U002522), у якій автор досліджував вміст вільних амінокислот у тканинах та включення мічених гліцину, аланіну та лейцину у білки печінки і м’язів коропа за дії важких металів; “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів та водних екосистем до іонів важких металів та їх регуляція” (2001-2003 рр., номер держреєстрації 0101U000303), у якій автор досліджував зміни вмісту і фракційного складу білків у сироватці крові коропа за інтоксикації важкими металами.

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було встановлення внеску амінокислот – гліцину, лейцину та аланіну у синтез білків тканин коропа, а також змін загального вмісту та фракціного складу білків сироватки крові при адаптації до підвищеного вмісту іонів важких металів у водному середовищі. Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні завдання:

- визначення вмісту марганцю, цинку, міді та свинцю у тканинах коропа при підвищенні концентрації цих іонів у воді;

- визначення вмісту вільних амінокислот (гліцину, лейцину і аланіну) у печінці та м’язах коропа в нормі та при інтоксикації цими металами;

- визначення ступеня використання гліцину, лейцину і аланіну в біосинтезі білків у м’язах та печінці коропа в нормі та при інтоксикації важкими металами;

- дослідження загального вмісту білків у сироватці крові коропа в нормі та при дії важких металів;

- дослідження фракційного складу білків сироватки крові за дії підвищених концентрацій іонів марганцю, цинку, міді та свинцю у водному середовищі.

Об’єкт дослідження. Обмін амінокислот і синтез білків у тканинах коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) за дії підвищених концентрацій іонів важких металів у воді.

Предмет дослідження. Зміни вмісту гліцину, аланіну, лейцину та використання їх у синтезі білків у печінці та скелетних м’язах, зміни загального вмісту та фракційного складу білків сироватки крові коропа при зростанні концентрації марганцю, цинку, міді та свинцю у воді.

Методи дослідження: спектрофотометричні (визначення вмісту металів у тканинах), радіоізотопні (визначення інтенсивності включення амінокислот у білки), електрофорез (встановлення фракційного складу білків сироватки крові), хроматографія (визначення вмісту амінокислот).

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених досліджень вперше встановлено кількісний внесок [U-14С]-гліцину, [1-14С]-аланіну та [1-14С]-лейцину в синтез білків м’язів та печінки коропа за дії 2 та 5 гранично допустимих концентрацій іонів марганцю, цинку, міді та свинцю у воді. Встановлено вміст іонів вказаних металів у цих тканинах за нормальних умов та при токсичному стресі, викликаному підвищеними рівнями токсикантів у воді.

Вперше за токсичного стресу у риб, викликаного іонами вказаних металів у наведених концентраціях, прослідковано зміни у білковій системі крові: динаміку загального вмісту білків, білковий коефіцієнт та відносні частки білкових фракцій крові.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть бути використані при оцінці токсичності водного середовища для організму риб; для оцінки якості рибної продукції.

Виявлені біохімічні ефекти можуть бути використані для розробки методик уточнення ГДК важких металів у водному середовищі.

Результати роботи можуть використовуватись при викладанні курсу “Біологічна хімія” в темах “Амінокислоти” та “Білки”, курсу “Екологія”, а також спецкурсу “Екологічна фізіологія і біохімія”.

Особистий внесок здобувача. Підбір та опрацювання лiтератури з теми дисертації, написання дисертаційної роботи, виконання експериментальної частини та статистичну обробку результатів було зроблено автором самостiйно. Аналiз та інтерпретацiю одержаних результатiв проведено разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на: І Всеукр. наук. конференції “Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Тернопіль, 1998); конференції, присвяченій 100-річчю з нагоди дня народження С.З. Гжицького (Львів, 2000); ІІІ з’їзді Гідроекологічного товариства України (Тернопіль, 2001); симпозіумі “Metals and Cell” (Кентербері, Великобританія, 2001); VІІІ з’їзді Укр. біохім. товариства (Чернівці, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць у вигляді статей у фахових виданнях та 4 тези конференцій.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел та додатку. Робота викладена на 141 сторінці друкованого тексту, містить 14 рисунків, 11 таблиць загальним обсягом 15 сторінок. Список використаних джерел включає 233 назви, з них 76 зарубіжних авторів.

основний зміст роботи

Огляд літератури. У розділі проаналізовано загальні особливості впливу важких металів на організм риб, зібрано наявні у літературі дані про участь амінокислот у синтезі білків тканин та роль білків сироватки крові при адаптації риб до важких металів. Зроблено висновок про те, що питання обміну амінокислот та синтезу білків у риб за інтоксикації важкими металами потребує подальшого вивчення, оскільки відомі дані є недостатньою базою для повного розуміння фізіолого-біохімічних процесів у їх організмі при підвищеній концентрації важких металів у воді.

Матеріали і методи досліджень. Для досліджень використовували дворічок коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) середньою масою 250-300 грам. Інтоксикацію моделювали внесенням у воду акваріумів, де знаходились дослідні групи риб, розчинених солей ZnSO4·7Н2О; MnCl2·2Н2О; CuSO4·5Н2О; Pb(NO3)2, до досягнення вмісту іонів досліджуваних металів, відповідних 2 і 5 ГДК: цинку 2 та 5 мг/л, марганцю 2,4 та 6 мг/л, міді 0,2 та 0,5 мг/л, свинцю 0,2 та 0,5 мг/л. За даними деяких авторів (Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А., 1985), гранично допустима концентрація іонів цинку – 1 мг/л, марганцю – 1,2 мг/л, міді та свинцю – 0,1 мг/л. Контрольна група утримувалась в аналогічних умовах, але без присутності вищевказаних металів.

Вміст кисню у воді акваріумів підтримували на рівні 7,0-8,0 мг/л, вуглекислого газу – 2,2-2,8 мг/л. Величина рН була близькою до 7,7-7,9. Температура води становила 12 ± 2оС. Воду акваріумів змінювали через кожні дві доби. Зі зміною води вносили вказані кількості солей.

Період акліматизації становив 14 діб, що вважається достатнім для формування адаптивних фізіолого-біохімічних захисних механізмів до дії вищевказаних токсикантів (Хлебович В.В., 1981).

У білих скелетних м’язах спини і в передній долі печінки досліджували такі показники: вміст марганцю, цинку, міді та свинцю; вміст вільних амінокислот; включення суміші [U-14С]-амінокислот у білки; включення [U-14С]-гліцину, [1-14С]-аланіну та [1-14С]-лейцину у білки; крім цього в крові визначали фракційний склад білків сироватки та їх загальну концентрацію, а також вміст досліджуваних мікроелементів.

Визначення вмісту важких металів. Тканини спалювали в концентрованій азотній кислоті в співвідношенні 1:5 (маса:об’єм). Концентрацію марганцю, цинку та міді визначали на атомно-адсорбційному спектрофотометрі С-115М (Україна), свинцю – S-600 (Україна) і виражали у мг/кг вологої маси м’зів та печінки та у мг/л крові.

Кров відбирали гепаринізованою голкою із серця риб. Після зсідання (1 год при 370С) центрифугували 15 хв при 3000 об/хв і відбирали сироватку (Остапець М.Г., Романська Н.М., 1974). Для досліджень білкових фракцій сироватки крові використовували “Діагностичний набір для електрофоретичного розділення білків сироватки крові на агарозі Cormаy gel protein 100” виробництва фірми Cormаy (Австрія).

Сумарну концентрацію білків сироватки крові визначали біуретовим методом за допомогою приладу “МЕФАН 8001” (Україна) при довжині хвилі 530 нм (Неменова Ю.М., 1976).

Визначення включення радіоактивної мітки 14С-амінокислот у білки тканин коропа. Після відбору тканини гомогенізували в розчині Рінгера для холоднокровних із рН 7,2 у скляному гомогенізаторі при температурі 4оС. 100 мг гомогенатів скелетних м’язів чи печінки інкубували в термостаті при 27 оС протягом 60 хв із 20 кБк [U-14С]-гліцину, [1-14С]-аланіну, [1-14С]-лейцину та суміші [U-14С]-амінокислот. Ферментативні процеси в бюксах після закінчення інкубації зупиняли додаванням до гомогенатів 2 мл 10% розчину трихлороцтової кислоти (Вовк С.И., Янович В.Г., 1988).

Після інкубації з гомогенатів видаляли ліпіди за допомогою розчину Фолча (Folch J., Lees M., 1957), глікоген, глюкозу та інші водорозчинні речовини за рекомендаціями (Прохорова М.И., 1982). Білки солюбілізували 5М КОН при 70оС протягом 4 год (Вовк С.И., Янович В.Г., 1988). Після охолодження, нейтралізації та висушування їх вносили в сцинтиляційну рідину ЖС – 9 (Вовк С.И., Янович В.Г., 1988) і визначали радіоактивність на сцинтиляційному лічильнику LKB (Швеція).

Визначення вмісту вільних амінокислот. Зразки скелетних м’язів та печінки (200 мг) гомогенізували в розчині Рінгера для холоднокровних із рН 7,2, після чого центрифугували протягом 15 хв. при 3000 об/хв при 4оС. Супернатант осаджували 2%-ним розчином сульфосаліцилової кислоти. Іонообмінну хроматографію вільних амінокислот проводили на приладі ААА-339 (Чехія) за рекомендаціями (Дэвени Т., Гергей Я., 1976).

Всі отримані цифрові дані обробляли методом варіаційної статистики (Лакин Г.Ф.,1990).

Результати досліджень та їх обговорення

Накопичення марганцю, цинку, міді та свинцю у печінці, м’язах та крові коропа за їх підвищених концентрацій у воді. Встановлено, що в нормі в печінці коропа із досліджуваних металів найменше міститься свинцю, дещо більше – марганцю, на порядок вищим є вміст міді, а найбільше є іонів цинку (табл. 1).

При підвищенні вмісту Zn2+ у воді рівень цих іонів у печінці залишається практично незмінним. При додаванні до води іонів інших металів вміст їх у печінці риб зростає. Найменше зростання відзначено стосовно свинцю, більше – марганцю і ще більше – міді. Якщо для марганцю виявлено вищий вміст при більшій концентрації у воді, то для свинцю та міді більше накопичення відбувається під дією не 5, а 2 ГДК їх іонів у воді.

У нормі у м’язах порівняно менше є марганцю, дещо більше міді, ще більше свинцю, а концентрація цинку, як і в печінці, є найвищою. У цій тканині виявлено зниження вмісту іонів марганцю при зростанні їх концентрації у воді та зростання кількості міді та цинку при інтоксикації, а за дії свинцю вміст цих іонів практично не змінювався. За дії досліджуваних металів при 2 і 5 ГДК рівень їх у крові збільшувався (за винятком міді).

Таблиця 1

Вміст металів у тканинах коропа під впливом їх підвищених концентрацій у воді

(мг/кг м’язів та печінки, мг/л крові, М±m, n=5)

Метал | Досліджуваний орган | Умови досліду

Контроль | 2 ГДК | 5 ГДК

Марганець | Печінка | 0,87±0,07 | 1,49±0,16** | 1,73±0,16**

М’язи | 0,46±0,04 | 0,29±0,03** | 0,25±0,03**

Кров | 0,10±0,01 | 0,20±0,02** | 0,12±0,01

Цинк | Печінка | 221,3±10,12 | 225,5±10,84 | 200,9±9,43

М’язи | 17,45±0,44 | 25,52±1,88** | 28,16±1,43***

Кров | 19,71±0,48 | 23,93±0,53*** | 22,14±0,84*

Мідь | Печінка | 7,06±1,50 | 16,19±1,31** | 13,90±1,09**

М’язи | 0,65±0,05 | 1,45±0,15*** | 0,69±0,06

Кров | 1,59±0,07 | 1,49±0,11 | 1,36±0,08

Свинець | Печінка | 0,52±0,04 | 0,76±0,08* | 0,62±0,07

М’язи | 1,07±0,08 | 0,94±0,12 | 1,02±0,11

Кров | 0,48±0,14 | 1,42±0,25* | 0,86±0,18

Примітка. Тут і у табл. 2, 3, рис 1 3: * – відмінності між показниками дослідної і контрольної груп є вірогідними (р < 0,05); ** (р 0,01), *** (р 0,001).

Отже, під впливом іонів марганцю, цинку, міді та свинцю зміни їх вмісту у тканинах коропа неоднакові. Причиною цього можуть бути як особливості хімічної природи досліджуваних металів, так і особливості їх взаємодії із мембранними структурами клітин та метаболітами.

Вміст вільних амінокислот у тканинах коропа за інтоксикації іонами важких металів. Встановлено, що в нормі у печінці та м’язах коропа із досліджуваних вільних амінокислот найбільше міститься вільного гліцину, меншим є вміст аланіну, і ще меншим – лейцину. За інтоксикації іонами важких металів відбуваються різнотипні зміни вмісту вільних амінокислот у тканинах (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст вільних амінокислот у тканинах коропа під впливом підвищених концентрацій металів у воді (мг/кг вологої тканини, М±m, n=5)

Метал | Тканина | Аміно-кислота | Умови досліду

Контроль | 2 ГДК | 5 ГДК

Марга-нець | Печінка | Гліцин | 1280,0±12,7 | 1190,0±12,3*** | 1390,0±19,7**

Аланін | 324,0±8,2 | 296,0±5,6* | 213,0±3,8***

Лейцин | 151,0±7,2 | 86,0±3,2*** | 84,0±3,7***

М’язи | Гліцин | 2270,0±25,5 | 1590,0±22,7*** | 1340,0±21,8***

Аланін | 797,0±18,7 | 929,0±17,5** | 473,0±15,5***

Лейцин | 617,0±10,5 | 716,0±17,3** | 685,0±20,7*

Цинк | Печінка | Гліцин | 1368,0±30,1 | 1306,0±23,1 | 1305,0±18,9

Аланін | 217,0±5,8 | 230,0±7,3 | 235,0±6,7

Лейцин | 172,0±8,3 | 124,0±8,4** | 94,0±6,8***

М’язи | Гліцин | 2028,0±23,8 | 1656,0±20,6*** | 1327,0±16,2***

Аланін | 879,0±16,4 | 757,0±16,8*** | 576,0±15,7***

Лейцин | 517,0±9,8 | 578,0±12,4** | 467,0±12,3*

Мідь | Печінка | Гліцин | 1208,0±16,6 | 1255,0±18,1 | 1309,0±18,9**

Аланін | 326,0±4,2 | 275,0±14,3** | 308,0±17,6

Лейцин | 162,0±3,1 | 150,0±3,2* | 201,0±4,2***

М’язи | Гліцин | 1810,0±22,1 | 1730,0±18,6* | 1330,0±16,2***

Аланін | 982,0±18,6 | 622,0±14,3*** | 619,0±16,0***

Лейцин | 427,0±10,2 | 448,0±11,2 | 268,0±6,7***

Сви-нець | Печінка | Гліцин | 1512,0±23,4 | 1973,0±12,4*** | 1328,0±19,5***

Аланін | 425,0±5,2 | 361,0±3,2*** | 565,0±12,5***

Лейцин | 192,0±3,5 | 126,0±2,5*** | 81,0±2,2***

М’язи | Гліцин | 1970,0±8,5 | 2020,0±7,7*** | 1630,0±6,5***

Аланін | 826,0±22,1 | 928,0±25,2* | 721,0±26,5*

Лейцин | 312,0±11,4 | 924,0±37,4*** | 820,0±10,4***

Одержані результати свідчать про активацію метаболізму гліцину в тканинах коропа при інтоксикації іонами важких металів у водному середовищі. Основними шляхами використання гліцину при інтоксикації є його участь у синтезі білків та у вивільненні енергії. При цьому досліджувані метали по-різному впливають на ці процеси у зв’язку з відмінностями в їх хімічній природі і біологічних ефектах, а також із фізіологічними особливостями досліджуваних тканин.

За дії важких металів вміст аланіну у тканинах переважно знижується, що вказує на посилене використання цієї амінокислоти за інтоксикації, зокрема, у глюкозо-аланіновому циклі.

Особливо знижується в печінці концентрація вільного лейцину (майже у 2 рази) за дії марганцю, цинку та свинцю, а у м’язах, навпаки, зростає. Оскільки лейцин є маркерною амінокислотою синтезу білків, то отримані дані вказують на зниження інтенсивності синтезу білків у м’язах та зростання цього процесу у печінці.

Зі зростанням концентрації іонів Мn2+ та Zn2+ зменшується пул вільних амінокислот у досліджуваних тканинах. Механізм цього впливу, очевидно, пов’язаний із стимулюванням біосинтетичних процесів, зокрема, синтезу адаптивних білкових структур клітин.

Виявлені зміни вмісту вільних амінокислот при підвищених концентраціях іонів міді у воді свідчать про посилення катаболізму білків м’язів риб. Зростання їх рівня у печінці вказує на розвиток стрес-катаболічного синдрому, порушення гомеостазу організму.

Зміни вмісту досліджуваних вільних амінокислот, що виникли за інтоксикації риб іонами свинцю, були якісно і кількісно відмінні від змін, які виявлено за дії інших металів, що пояснюється небіогенною природою свинцю.

В цілому виявлені зміни свідчать про посилення катаболізму білків та повну мобілізацію амінокислот в адаптивні процеси за інтоксикації.

Особливості використання амінокислот у синтезі білків у тканинах коропа за інтоксикації важкими металами. При застосуванні суміші [U-14C]- амінокислот показано, що використання їх у синтезі білків як печінки, так і м’язів за інтоксикації іонами важких металів значно знижується в порівнянні з контрольними величинами у ряді: марганець > цинк > мідь > свинець (табл. 3).

Таблиця 3

Радіоактивність білків печінки і м’язів коропа при їх інкубації з сумішшю

[U-14С]-амінокислот за дії іонів важких металів в концентрації 2 ГДК

(М±m, n=5), тис. імп. /хв

Орган | Умови досліду

Контроль | Марганець | Цинк | Мідь | Свинець

Печінка | 5,13±0,04 | 4,23±0,08* | 3,81±0,01* | 3,56±0,02* | 3,25±0,05*

М’язи | 3,08±0,05 | 2,17±0,05* | 2,05±0,03* | 1,84±0,01* | 1,83±0,02*

Прийнявши умовно суму мічених гліцину, аланіну та лейцину за 100 %, ми встановили відносний внесок кожної з них у цей процес. Виразивши їх співвідношення за нормальних гідрохімічних умов та за умов токсичного впливу, що досліджувався, отримаємо таку гістограму (рис.1).

Як в нормі, так і при інтоксикації у білки досліджуваних тканин риб найбільшою мірою включається лейцин. Значно менше використовується в цьому процесі гліцин, ще менше – аланін.

Як бачимо з рис. 1, відносне включення у білки печінки і м’язів досліджуваних 14С-амінокислот за різних гідрохімічних умов змінюється в межах 15%.

Рис.1. Співвідношення використання [U-14C]-гліцину, [1-14С]-аланіну та

[1-14С]-лейцину в синтезі білків у печінці та м’язах коропа під дією іонів важких металів, %

Примітка. Тут і на рис. 2, 3: к. – контроль, Mn – марганець, Zn – цинк, Cu – мідь, Pb – свинець.

Відносна участь гліцину у синтезі білків знижується, як у м’язах, так і в печінці за дії всіх досліджуваних металів у концентраціях 2 ГДК (за винятком дії цинку в печінці). Під впливом іонів важких металів у концентраціях 5 ГДК, цей показник зростає, за винятком дії міді у печінці. Із даних, поданих на рис. 1, видно, що незважаючи на те, що частка вільного гліцину в тканинах коропа є найбільшою, використання його в синтезі білків є нижчим, ніж лейцину.

Згідно рис. 1 частка гліцину у загальній сумі амінокислот може змінюватися в межах 13 %, аланіну – в межах 7 %, лейцину – в межах 14 %. Якщо найбільшу роль у адаптивних реакціях надавати тій амінокислоті, частка якої у сумі амінокислот змінюється найбільшою мірою, то можна стверджувати, що серед досліджуваних амінокислот лейцин та гліцин активніше, ніж аланін, беруть участь у формуванні відповіді організму риб на стрес, викликаний підвищенням вмісту важких металів у воді.

Склад білків сироватки крові коропа за дії підвищених концентрацій іонів важких металів. Аналіз динаміки змін білків сироватки крові коропа при інтоксикації іонами важких металів показав, що білковий склад крові є дуже чутливим до змін іонного складу водного середовища. Зокрема, виявлено, що сумарна концентрація білків сироватки крові коропа зростає із збільшенням концентрації у воді іонів марганцю, цинку, свинцю, і, особливо міді (рис. 2).

Рис.2. Фракційний розподіл білків сироватки крові коропа ( % від сумарної кількості білків контрольної групи)

Якщо порівняти фракційний розподіл білків сироватки крові, виражений у відсотках від загальної кількості білків контрольної групи (дані рис. 2) із їх відносним розподілом, вираженим у відсотках до загальної кількості білків кожної конкретної групи, наведеним на рис. 3, то бачимо, що частка білків у фракції альбумінів у першому випадку за дії досліджуваних металів, крім дії свинцю при 2 ГДК, є вищою, ніж у другому випадку.

Рис. 3. Відносний вміст білків сироватки крові коропа в нормі та при інтоксикації (% від сумарної кількості білків у кожній групі)

Якщо аналізувати зміни, викликані іонами досліджуваних металів у фракції 1-глобулінів, то виявляється, що зміни їх частки в % до суми білків контрольної групи мають більш виражений характер. Якщо у випадку дії 5 ГДК міді частка 1-глобулінів відносно загальної кількості білків даної дослідної групи знижується, то щодо суми білків контрольної групи частка білків цієї фракції значно зростає і є найбільшою серед досліджуваних металів за рахунок значного зростання загального вмісту білків, як у цьому варіанті досліду, так і за дії 2 ГДК.

Зміни у фракції 2-глобулінів є аналогічними. При цьому відзначено, що зниження вмісту білків цієї фракції за дії цинку та марганцю не є таким значним у відсотковому відношенні до суми білків контрольної групи, як це описано для частки їх відносно суми білків сироватки крові в риб конкретної дослідної групи. Крім того, при 5 ГДК марганцю у цій фракції міститься більше білків, ніж у нормі.

Частка ?-глобулінів у загальному вмісті білків сироватки крові піддослідних риб зростає за дії марганцю, цинку та свинцю при 2 ГДК, а в решті випадків – знижується. Особливо значне відносне зниження білків цієї фракції описано за дії міді у обох концентраціях. Частка ?-глобулінів, виражена у відсотках до суми білків сироватки крові контрольної групи, зростає за дії усіх металів при 2 ГДК та 5 ГДК (крім випадку дії свинцю при 5 ГДК).

Зміни частки білків фракції ?-глобулінів у обох вираженнях мають однакову спрямованість, переважно зростають, особливо при 5 ГДК, однак, за даними рис. 2 є дещо вищими. Крім того, якщо частка цих білків від суми білків даної проби за дії 2 ГДК міді є найнижчою, то за використання вираження у відсотках до суми білків контрольної групи вона вища, ніж за дії цинку, а у випадку 5 ГДК є найвищою серед досліджуваних груп риб.

Із вищенаведеного випливає, що загальноприйнятий метод оцінки реакції організму у вигляді змін у розподілі білкових фракцій без врахування змін кількості білків у нашому дослідженні дає дещо занижені результати. Отже, щоб адекватно оцінити участь білків сироватки крові риб у захисних процесах при інтоксикації важкими металами слід застосовувати порівняння вмісту білків певної фракції сироватки крові дослідних риб із сумарним вмістом білків у сироватці крові риб контрольної групи.

Результати проведених досліджень вказують на існування адаптивних змін метаболізму амінокислот і білків у організмі коропа за інтоксикації іонами важких металів при різних їх концентраціях у воді. Доведено, що за токсичного впливу важких металів у організмі досліджуваних риб відбуваються зміни вмісту таких вільних амінокислот, як гліцин, аланін та лейцин та активно змінюється використання цих амінокислот у синтезі білків.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає у вивченні дії підвищених концентрацій Mn2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+ у воді на обмін амінокислот та синтез білків у організмі коропа.

1. За підвищення у водному середовищі концентрації іонів марганцю, цинку, міді та свинцю до 2 та 5 ГДК у тканинах коропа прямого зв’язку між концентрацією металу у воді і його вмістом у тканинах не виявлено. Марганець, мідь та свинець при інтоксикації нагромаджуються переважно в печінці, цинк – у м’язах риб.

2. Встановлено, що підвищені концентрації Mn2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+ (2 і 5 ГДК) у воді викликають зміни вмісту вільних амінокислот у печінці та м’язах. Вміст гліцину та аланіну у м’язах при цьому переважно знижується, особливо за дії Mn2+ та Zn2+ при 5 ГДК (відповідно для гліцину 40,97 % (р<0,001) і 34,57 % (р<0,001) та для аланіну 40,65 % (р<0,001) і 34,47 % (р<0,001); у печінці зміни вмісту цих амінокислот для кожної концентрації іонів окремого металу є різними. Вміст лейцину у печінці за інтоксикації важкими металами переважно знижується, особливо за дії свинцю (на 34,38 % (р<0,001) при 2 ГДК і на 57,81 % (р<0,001) при 5 ГДК), а у м’язах зростає, також у найбільшій мірі за дії свинцю (у три рази при 2 ГДК та в 2,6 раз при 5 ГДК (р<0,001)). В переважній більшості випадків концентрація вільних гліцину, аланіну та лейцину за дії 2 ГДК досліджуваних металів є вищою, ніж при 5 ГДК.

3. Використання суміші [U-14C]-амінокислот у синтезі білків за дії важких металів знижується проти норми у ряду Mn2+> Zn2+> Cu2+> Pb2+ як у м’язах, так і у печінці риб.

4. Виявлено залежність включення [U-14С]-гліцину та [1-14С]-аланіну у білки досліджуваних тканин від металу та його концентрації. У м’язовій тканині при інтоксикації Mn2+, Zn2+ та Cu2+ включення [U-14С]-гліцину в білки зростає, особливо при 5 ГДК (на 23,08 %, 31,71 % (р0,05), 9,57 % відповідно); у печінці такий вплив спостерігається лише за дії Zn2+ (на 39,06 % при 2 ГДК, та 26,95 % при 5 ГДК). Підвищені концентрації іонів досліджуваних металів приводять до зниження включення [1-14С]-аланіну в білки тканин, за винятком марганцю, дія якого стимулює цей процес в печінці при 5 ГДК (на 45,88 % (р0,05)) , а в м’язах – при 2 ГДК (на 38,27 % (р0,05)).

5. Використання [1-14С]-лейцину, на відміну від гліцину та аланіну, у синтезі білків у тканинах коропа є більш залежне від концентрації токсиканту у воді. За дії досліджуваних іонів у концентрації 2 ГДК виявлено зростання використання цієї міченої амінокислоти у синтезі білків печінки, особливо за дії марганцю та свинцю (64 % (р<0,01) та 57 % (р<0,05) відповідно), а також м’язів (за дії Mn2+ на 69,53 % (р<0,001), Zn2+ – на 53,62 % (р<0,001), Cu2+ – на 49,95 % (р<0,01), Pb2+ – на 8,29 %). При 5 ГДК виявлено зниження участі [1-14С]-лейцину у синтезі білків, особливо за дії Mn2+ та Pb2+ у печінці (на 40,72 % (р<0,001) та на 43,25 % (р<0,001) відповідно). У м’язах мідь та свинець при 5 ГДК знижують досліджуваний показник майже однаково – на 30,96 % (р<0,001) та 33,88 % (р<0,001), марганець на 40,65 % (р<0,001)

6. При інтоксикації іонами досліджуваних металів загальний вміст білків у сироватці крові зростає, що обумовлено в першу чергу зміною кількості альбумінів. Найбільші відхилення від нормальних значень виявлено за дії іонів міді (при 2 ГДК на 17,15 % (р<0,001), при 5 ГДК – на 39,61 % (р<0,001)).

7. При дослідженні співвідношення білкових фракцій сироватки крові виявлено, що на дію Mn2+, Zn2+, Cu2+ в першу чергу реагують ті фракції, у яких містяться специфічні до цих металів білки. У більшості випадків відмічено зростання вмісту альбуміну. Свинець, як небіогенний елемент, проявляє певні відмінності порівняно з ефектами біогенних елементів.

8. Не виявлено кореляції між вмістом важких металів у тканинах та вмістом у них вільних гліцину, аланіну та лейцину, включенням радіоактивно мічених амінокислот у білки тканин, і зміною загальної кількості та фракційного складу білків сироватки крові коропа.

9. Розраховано рівень метаболічної активності амінокислот в тканинах риб при дії важких металів на основі визначення частки використання кожної амінокислоти в біосинтезі білків. Показано, що лейцин та гліцин більш активно, ніж аланін, беруть участь у синтезі білків за дії на риб підвищених концентрацій іонів важких металів (частка гліцину у загальній сумі амінокислот може змінюватися в межах 13 %, аланіну – в межах 7 %, лейцину – в межах 14 %).

Практичні рекомендації

1. Запропоновано використовувати для оцінки токсиконебезпечності важких металів водного середовища для риб методи, що грунтуються на основі:

а) виявлення та інтеграції показників сумарного вмісту і фракційного складу білків сироватки крові;

б) виявлення змін концентрації вільних амінокислот у тканинах та включення [14С] - амінокислот у білки.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Синюк Ю.В. Особливості метаболізму амінокислот в організмі риб за інтоксикації йонами цинку // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: біологія. –Тернопіль. – 2001. – №3 (14). – С. 226 - 228.

2. Особливості метаболізму гліцину в печінці і скелетних м'язах коропа при інтоксикації іонами свинцю / В.3. Курант, С.В. Бродін, Ю.В. Синюк, В.В. Грубінко, А.М. Бучко // Біологія тварин. – 1999.–Т.1, № 2. – С.73–76. Дисертант визначив включення [U-14C] гліцину в білки тканин, здійснив статистичну обробку та аналіз даних, підготував статтю до друку.

3. Особливості метаболізму амінокислот в організмі риб за умов інтоксикації іонами міді / В.3. Курант, С.В. Бродін, Ю.В. Синюк, А.М. Бучко, В.В. Грубінко // Біологія тварин. – 2000. – Т. 2, № 2. – С. 86-90. Дисертант визначив вміст амінокислот у печінці та м’язах, здійснив підбір літератури, статистичну обробку даних, підготував статтю до друку.

4. Вплив іонів важких металів на метаболізм [U-14C] амінокислот у тканинах коропа за умов in vitro / В.З. Курант, С.В. Бродін, Ю.В. Синюк, В.В. Грубінко // Біологія тварин. – 2001. – Т.3, № 1. – С. 101 – 104. Дисертант визначив включення [U-14C] амінокислот в білки м’язів та печінки, здійснив підбір літератури, статистичну обробку даних, підготував статтю до друку.

5. Курант В.З., Синюк Ю.В., Грубінко В.В. Метаболізм лейцину в організмі коропа при дії іонів важких металів // Науково–технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН. – 2001. – Вип. 1-2. – С. 122–125. Дисертант визначив включення [1-14C] лейцину в білки м’язів та печінки, здійснив підбір літератури, статистичну обробку та аналіз даних, підготував статтю до друку.

6. Курант В.З., Бродін С.В., Синюк Ю.В. Вплив іонів важких металів на метаболізм гліцину в умовах in vivo // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: біологія. – 2001. – №2 (13). – С. 37 - 40.

Дисертант визначив включення [U-14C] гліцину в білки м’язів та печінки, виконав статистичну обробку даних, підготував статтю до друку.

7. Динаміка вмісту вільних амінокислот у тканинах коропа за дії іонів важких металів / В.3. Курант, Ю.В.Синюк, Р.Б. Балабан, В.В. Грубінко // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: біологія. – 2002. – № 1 (16). – С. 105–111.

Дисертант визначив вміст амінокислот у печінці та м’язах, здійснив підбір літератури, статистичну обробку та аналіз даних, підготував статтю до друку.

8. Особливості білкового складу сироватки крові коропа при дії іонів важких металів / В.З. Курант, Ю.В. Синюк, В.О. Арсан, В.В. Грубінко // Доповіді НАН України. – 2002. - №11. – С.159-163.

Дисертант провів електрофорез та денситометрію, здійснив підбір літератури, статистичну обробку та аналіз даних, підготував статтю до друку.

9. Вміст вільних амінокислот у тканинах коропа при дії іонів свинцю / Ю.В. Синюк, С.В. Бродін, В.З. Курант, В.Г. Янович // І Всеукр. наук. конф. “Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах”._Тернопіль: ТДПУ. – 1998. _С. 62 – 63.

10. Kurant V.Z., Brodin S.V., Syniuk Y.V. The influence of heavy metals on glycine metabolism in tissues of carp (Cyprinus carpio L.) // Metals and Cells Symposium Canterbury. – University of Kent at Canterbury. – 2001. – P. 45.

11. Курант В.З., Синюк Ю.В., Грубінко В.В. Особливості метаболізму гліцину, аланіну та лейцину в організмі коропа за дії іонів важких металів // Укр. біохім. журн. – VIII Укр. біохім. з’їзд. Чернівці, 2002. Т.74, № 4б (додаток 2). – С. 94-95.

12. Грубинко В.В., Синюк Ю.В., Курант В.З. Состояние белков сыворотки крови карпа при воздействии ионов тяжелых металлов // Всероссийская конференция “Современные проблемы водной токсикологии”. – Борок, 2002. – С. 35-36.

AНОТАЦІЇ

Синюк Ю.В. Обмін амінокислот і фракційний склад білків у організмі коропа за дії іонів марганцю, цинку, міді та свинцю.- Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.04. - бiохiмiя. - Інститут біології тварин УААН, Львів, 2003.

Робота присвячена дослідженню дії іонів марганцю, цинку, міді і свинцю на обмін амінокислот і синтез білків в організмі коропа. Встановлено зміни вмісту вільних амінокислот (гліцину, лейцину і аланіну) в м'язах і печінці коропа при дії підвищених концентрацій вказаних металів. Показана участь цих амінокислот в біосинтезі білків у м'язах і печінці коропа в нормі і при інтоксикації важкими металами. Запропоновано спосіб оцінки рівня метаболічної активності амінокислот в тканинах риб при дії важких металів на основі встановлення частки участі окремої амінокислоти в біосинтезі білків.

Показана роль білків сироватки крові в адаптаціях до дії підвищених концентрацій іонів важких металів. Запропоновано використовувати для оцінки токсиконебезпечності важких металів водного середовища виявлення змін білкових фракцій сироватки крові і інтегральних показників динаміки сумарного вмісту і фракційного складу білків сироватки крові.

Ключові слова: короп, амінокислоти, білки, марганець, цинк, мідь, свинець.

Синюк Ю.В. Обмен аминокислот и фракционный состав белков в организме карпа при действии ионов марганца, цинка, меди и свинца. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. - Институт биологии животных УААН, Львов, 2003.

Работа посвящена изучению особенностей метаболизма аминокислот и синтеза белков в тканях карпа при действии повышенных концентраций ионов марганца, цинка, меди и свинца в водной среде.

Исследовано влияние токсикантов (Mn2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+) в концентрациях, соответствующих 2 и 5 ГДК на накопление тяжелых металлов в тканях, содержание свободных глицина, аланина и лейцина в тканях; включения [U-14С]-глицина, [1-14С]-аланина и [1-14С]-лейцина, а также смеси [U-14С]-аминокислот в белки мышц и печени. Определены такие общие показатели белкового обмена, как фракционный состав белков сыворотки крови, белковый коэффициент и суммарное содержание белков сыворотки крови.

Показано, что в печени, мышцах и крови из всех исследуемых элементов содержание марганца наиболее низкое. Поскольку свинец не является биогенным элементом, то его наличие в тканях зависит от содержания в природной водной среде. Содержание меди в мышцах несколько выше, чем марганца, а в печени и крови ее на порядок больше. Среди исследуемых металлов больше всего обнаружено цинка, причем в печени его уровень на порядок выше, чем в мышцах и крови.

Не обнаружено зависимости между содержанием тяжелых металлов в воде и в тканях, что связывается с функционированием процессов поддержки ионного гомеостаза. Кроме того, полученные результаты указывают на перераспределение металлов из мышечной ткани в печень и другие органы, где происходит их аккумуляция и выведение из организма.

Установлено, что повышенные концентрации Mn2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+ (2 и 5 ГДК) в воде вызывают изменения содержания свободных аминокислот в исследуемых тканях. Концентрация глицина и аланина в мышцах преимущественно снижается, а в печени изменяется в зависимости от концентрации металлов в воде. Содержание лейцина в печени при интоксикации тяжелыми металлами преимущественно снижается, а в мышцах увеличивается. В подавляющем большинстве