НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

БОКШАН ОЛЬГА ЯРОСЛАВІВНА

УДК: 582.28+632:634.4

ВИЯВЛЕННЯ ТА ДІАГНОСТИКА КАРАНТИННИХ
БАКТЕРІОЗІВ: ОПІКУ ПЛОДОВИХ

ТА БУРОЇ ГНИЛІ КАРТОПЛІ

06.01.11 – фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИІВ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Закарпатському територіальному відділі карантину рослин Інституту захисту рослин Української академії аграрних наук

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор,

заслужений діяч науки і техніки України,

Гвоздяк Ростислав Ілліч,

Інститут мікробіології та вірусології НАН України,

завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, професор

Слюсаренко Олександр Миколайович,

Одеський національний університет ім. Мечнікова,

професор кафедри ботаніки

кандидат біологічних наук,

Шевченко Жанна Петрівна

Уманський державний аграрний університет,

завідувач кафедри захисту рослин

Провідна установа – Харківський національний аграрний університет ім. В.В.Докучаєва, кафедра фітопатології, Міністерства аграрної політики України,
м. Харків

Захист відбудеться „ 26” листопада 2004 року о 12 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус №3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, к.41

Автореферат розісланий „ 25” жовтня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мороз М.С

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливе значення в запобіганні збитків в сільському господарстві від шкідливих організмів мають карантинні заходи.

Для кожної країни спеціальними законодавчими актами затверджено перелік організмів, які мають карантинне значення.

Серед 11 видів карантинних для України бактеріальних хвороб найбільш економічно небезпечними є збудники бактеріального опіку плодових – Erwinia amylovora ( Burrill) Winslow et al та бурої гнилі картоплі – Ralstonia solanacearum (Smith), які є об’єктами зовнішнього карантину більшості країн світу. Плодові культури в нашій країні займають чільне місце в сільськогосподарському виробництві в різних регіонах, а картопля, як відомо, для українців є другим хлібом. Шкідливість цих хвороб надто значна, тому увага до них має бути постійною. Так, у 1976 році в штаті Каліфорнія втрати врожаю плодових культур внаслідок ураження опіком плодових оцінено в 4,7 млн. доларів, в штаті Мічиган (1991 р.) - 3,8 млн. доларів. У Єгипті втрати врожаю від опіку плодових в 1985 році досягали 95%. За підрахунками ФАО, світові втрати потенційно можливого урожаю картоплі від хвороб щорічно складають 88,9 млн. тонн, тобто 11,6% її валового збору, що в 2 рази перевищує втрати урожаю зернових культур, овочів і цукрового буряка. Ареал цих хвороб зростає з кожним роком. В той час як ефективних методів захисту від бактеріозів не існує.

Карантинні заходи, які спрямовані на попередження проникнення та локалізацію бактеріозів є надзвичайно важливими, а відтак методи виявлення та діагностики збудників цих хвороб повинні бути швидкими та високочутливими. При карантинній експертизі рослинного матеріалу висновок про його фітосанітарний стан необхідно давати в стислі строки (1-2 доби). Це потребує створення прискорених високочутливих методів ідентифікації. Значимість вирішення цієї проблеми і обумовила вибір теми дисертаційної роботи, її структуру та актуальність дослідження.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках робочих програм Закарпатського територіального відділу карантину рослин Інституту захисту рослин УААН за завданням 06.- „Удосконалити методи виявлення карантинних шкідників, хвороб та бур’янів, систему спостережень за ними, способи локалізації та знищення (номер державної реєстрації 01970012340) (1996-2000 рр.), за завданням 06.- “Удосконалити методи виявлення, локалізації та ліквідації вогнищ карантинних шкідників, хвороб і бур’янів” (номер державної реєстрації 0101V003711) ( 2000-2005 рр.).

Мета роботи: підібрати найбільш чутливі і раціональні методи виявлення та ідентифікації збудників опіку плодових та бурої гнилі картоплі з урахуванням технічного забезпечення карантинних лабораторій.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- провести моніторинг плодових насаджень на наявність бактеріального опіку в Закарпатській та Чернівецькій областях України;

- встановити найбільш оптимальні строки появи бактеріального опіку на плодових культурах;

- на основі вивчення існуючих методик ідентифікації E. аmylovora та власних досліджень підібрати найбільш раціональну схему діагностики бактеріального опіку плодових під час проведення карантинної експертизи;

- на базі існуючих в країнах з широким розповсюдженням опіку плодових моделей прогнозування ризику появи та розвитку цієї хвороби підібрати модель, яка б забезпечувала прогнозування ризику появи та розвитку його на території Закарпатської області;

- узагальнити існуючі методи діагностики R. solanacearum та підібрати раціональну схему діагностики бактеріальної бурої гнилі картоплі для карантинної експертизи.

Об’єкти дослідження. Збудники карантинних бактеріозів плодових культур та картоплі, бактерії Erwinia аmylovora 9057, Ralstonia solanacearum 9049, Erwinia carotovora 8982, Corynebacterium sepedonicum 7757, Pseudomonas fluorescens 8573.

Предмет дослідження. Виявлення, прогнозування появи та розвитку опіку плодових, методи прискореної діагностики Erwinia аmylovora та Ralstonia solanacearum.

Методи дослідження. При виконанні поставлених завдань використовували загальноприйняті мікробіологічні, біохімічні та серологічні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше в Закарпатській області (2003р.) виявлено та ідентифіковано збудника бактеріального опіку плодових E. аmylovora. Встановлено, що в цих умовах перебіг хвороби дещо відрізняється від класичного її опису, зокрема виділення молочно-білого ексудату не спостерігається. Найбільший ризик прояву хвороби припадає на період інтенсивного росту дерев.

Вперше підібрано адаптовану до умов Закарпатської області модель прогнозу ризику появи та розвитку бактеріального опіку плодових, яка передбачає визначення інфекційного дня, інкубаційного періоду та появи симптомів як на квітках, так і на інших частинах рослин, і забезпечує своєчасний хімічний контроль хвороби.

Модифіковано методику ідентифікації бактерій E. аmylovora без виділення збудника шляхом проведення реакції кільцепреципітації, яка забезпечує більш високу чутливість виявлення збудника опіку плодових.

Вперше підібрано параметри одержання еритроцитарного діагностикума для ідентифікації E. аmylovora з використанням методики непрямої гемаглютинації з чистою культурою та соком патологічного матеріалу, що забезпечує більш високу чутливість серодіагностики.

Запропонована схема попереднього діагностування збудника бурої гнилі картоплі R. solanacearum, яка дає змогу диференціювати збудників гнилей картоплі протягом доби.

Адаптована щодо фітопатогенних бактерій методика виявлення протеолітичної активності бактерій з використанням фотоплівки, яка забезпечує скорочення тривалості визначення цієї ознаки.

Для прискореної ензим-індикації фітопатогенних бактерій вперше розроблена методика приготування паперових індикаторних дисків (ПІД), використання яких забезпечує уніфікацію процесу, зменшення витрат на матеріали та часу отримання результатів.

Практичне значення одержаних результатів. Визначені критичні періоди появи та розвитку бактеріального опіку плодових можуть бути використані при проведенні моніторингу плодових культур службою карантину рослин України.

Підібрані моделі для прогнозування появи та розвитку опіку плодових можуть бути застосовані для визначення термінів превентивної обробки плодових культур хімічними засобами захисту рослин у вогнищах захворювання.

Підібрані схеми ідентифікації збудників опіку плодових та бурої гнилі картоплі забезпечують скорочення тривалості бактеріологічної експертизи і можуть бути використані в лабораторіях з карантину та захисту рослин.

Приготування імунної сироватки до E. аmylovora за підібраною схемою імунізації кролів забезпечує її високу специфічність і чутливість і може застосовуватись в лабораторіях з карантину рослин та інших установах.

Паперові індикаторні диски для ензим-індикації можуть бути використані при ідентифікації фітопатогенних бактерій.

На основі власних досліджень та даних літератури підготовлені тимчасові методичні вказівки „Виявлення, діагностика та локалізація бактеріального опіку плодових E. amylovora, які опубліковані в 2000 р. разом з Укрголовдержкарантином та передані для обласних інспекцій з карантину рослин та прикордонних пунктів.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів та їх узагальнення виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговоренні на наукових конференціях: “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва (Харків, Інститут рослинництва ім. В.Я.Юр’єва УААН, 1999), на міжнародному регіональному семінарі “Охорона довкілля: сучасні дослідження в екології і мікробіології” (Ужгород, 1997), міжнародному симпозіумі „Екологічні проблеми в захисті рослин і сучасному сільському господарстві” (Братислава, Словаччина, 1996); міжнародній науково-практичній конференції “Спільні агроеколого-економічні проблеми Карпатського регіону” (В.Бакта, 1999); міжнародному симпозіумі „Інтегрований захист плодових культур і винограду” (Ужгород, 2000); міжнародний симпозіум (Познань, Польща, 2001); міжнародний симпозіум (Чопак, Угорщина, 2002). В цілому дисертація заслухана і обговорена на розширеному засіданні Закарпатського територіального відділу карантину рослин ІЗР УААН, на засіданні відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології НАНУ, на засіданні вченої ради Інституту захисту рослин УААН в 2004 році.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 6 статтях у фахових наукових журналах, в 9 матеріалах та тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаної літератури, який містить 161 найменування першоджерел, в тому числі 100 іноземних.

Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинописного тексту. Робота містить 36 таблиць і 31 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури, який складається з 3-х підрозділів, висвітлено географію, цикл розвитку, симптоми, біологію та методи ідентифікації опіку плодових та бурої гнилі картоплі. Описано моделі прогнозу появи та розвитку опіку плодових. Приведені дані про ензим-індикацію та серологічні методи досліджень бактерій.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Моніторинг плодових насаджень на виявлення бактеріального опіку проводили в Закарпатській області (Ужгородський, Берегівський, Виноградівський, Іршавський райони) та Чернівецькій області (Придністровська науково - дослідна станція Інституту садівництва УААН, Сторожинецький, Кіцманський райони) згідно існуючих методик (Воронкова, 1974). Визначення ступеню ураження бактеріальним опіком різних сортів груші та яблуні в плодових насадженнях Придністровської науково-дослідної станції Інституту садівництва УААН та в приватних садах Закарпатської області проводили за загальноприйнятою методикою (Дементьева, 1970). Мікробіологічний аналіз зразків патологічного матеріалу, вивчення патогенних, фізіологічних та серологічних властивостей ізолятів проводили у відповідності із методами діагностики збудників бактеріозів (Гвоздяк, Матвеева та ін., 1987; Бельтюкова та ін., 1968; Кирай та ін., 1974). Як контроль при проведенні бактеріологічного аналізу, використовували колекційний штам E.amylovora 9057 отриманий з колекції живих культур відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології
НАНУ.

Імунні сироватки до E.amylovora, які використовували в серологічних реакціях, були отримані нами шляхом імунізації кролів бактеріями E.amylovora штам 9057 за різними схемами імунізації (Бельтюкова, 1968; Schroder, 1978; ). Абсорбцію родоспецифічних антитіл імунної до E.amylovora сироватки проводили шляхом додавання до неї однакового об’єму суміші культур E.carоtovora і P. agglomerans у фізіологічному розчині з наступним відділенням аглютинату шляхом центрифугування.

Для прогнозування появи та розвитку опіку плодових використовували моделі Maryblyt model, Cougarblight – версія 2000 (Celsius), Billing’s integrated system та Billing’s original system, дані метеорологічних умов Ужгородського та Берегівського районів за 2001-2003 рр., проводили спостереження за фенологічним станом дерев яблуні сортів Айдаред, Джонатан, Старкримсон, Голденспур.

Моніторинг гнилі картоплі в сховищах та на посадках проводили протягом 2000-2002 рр. в Закарпатській області в Ужгородському, Мукачівському, Перечинському та Воловецькому районах згідно існуючих методик. Ідентифікацію збудників проводили за методиками як це описано в роботах: Кирай та ін (1974); French (1995).

Вивчення характеристики збудників гнилей картоплі проводили на колекційних штамах R.solanacearum 9049, 9080, 9081, E.carotovora 8982, C.sepedonicum 7757, P.fluorescens 8573, які були отримані з відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. академіка Д.К.Заболотного НАНУ.

Вивчення культуральних властивостей R. solanacearum, E.carotovora, C.sepedonicum та P.fluorescens проводили на картопляному середовищі, середовищі Кельмана з 2,3,5 тетразолій хлоридом, середовищі Кінга В (Бельтюкова, 1968).

Вивчення спектру рослин, здатних уражуватись бактеріями R. solanacearum, проводили шляхом штучного інфікування листків та пагонів картоплі, томатів, перцю, тютюну, баклажанів бактеріальною суспензією 108 кл/мл методом ін’єкції та нанесенням суспензії на пошкоджені місця. Облік ураженості рослин проводили за шкалою, запропонованою Aley та ін. (1994).

Диференціацію бактеріозів картоплі без виділення збудника проводили на основі реакції з КОН та тестів на уреазу (Cowan, 1974) і оксидазу (Lloyd,1978). Вивчення протеолітичної активності бактерій за допомогою фотоплівки проводили за методикою, описаною Кузнєцовою (1989).

Для прискорення ензим-індикації фітопатогенних бактерій виготовляли з фільтрувального паперу індикаторні диски діаметром 0,5 мм, які насичували розчином цукрів та багатоатомних спиртів різних концентрацій (1%, 5% та 10%) і вносили в стерильні (0,4% та 0,04%) розчини індикатора при температурі 180С та 250С протягом 0,5, 1 та 24 годин. Оцінку біохімічної активності бактерій за допомогою паперових індикаторних дисків проводили мікрометодом. У пробірку з 0,3 мл стерильного фізіологічного розчину (рН 7,2-7,4) вносили петлю добової агарової культури мікроба, а потім додавали відповідний паперовий індикаторний диск. Облік проводили через 2, 3 та 24 години інкубації при температурі 280 С за характером зміни кольору індикатора. Контролем були диски, занурені в стерильний фізіологічний розчин без внесення бактерій та класичний метод вивчення біохімічної активності за допомогою кольорового ряду.

При вивченні способу засвоєння глюкози за допомогою паперових індикаторних дисків в дві пробірки з 0,3 мл фізіологічного розчину (рН 7,2) та петлею добової культури вносили диски і одну пробірку заливали стерильним вазеліновим маслом. Обліки проводили через 3-5 годин інкубації при температурі 280С. Контролем були аналогічні пробірки без внесення маси культури бактерій, а також пробірки з 1% агаром з глюкозою та індикатором і ідентичною культурою, одна з яких заливалась мінеральним маслом. Інкубацію проводили протягом 3 діб при температурі 280С.

Каталазну активність у бактерій визначали за методикою, запропонованою Варвашевич з співавторами (1989).

Постановку реакції кільцепреципітації без виділення бактерій в чисту культуру здійснювали за методикою Ізраїльського (1967), але кількість досліджуваного матеріалу було збільшено в 10 раз і додавали 0,5% сахарози в фізіологічному розчині, ставили в термостат на 3 год. при 280С.

Реакцію непрямої гемаглютинації здійснювали за методом Рицаря з виготовленим нами еритроцитарним діагностикумом (Бокшан, 2002).

Реакцію непрямої гемаглютинації без виділення збудника в чисту культуру здійснювали з екстрактом патологічного матеріалу, підготовленого так, як і для постановки реакції кільцепреципітації.

БАКТЕРІАЛЬНИЙ ОПІК ПЛОДОВИХ

Моніторинг плодових культур на виявлення бактеріального опіку в Закарпатській та Чернівецькій областях України. Протягом 8 років (1996-2003 рр.) проведено вибірковий моніторинг плодових садів на виявлення опіку плодових в 20 населених пунктах Закарпатської та 10 населених пунктах Чернівецької областей. Вперше в Чернівецькій області бактеріальний опік плодових був виявлений в 1997 році, а в Закарпатській області – в 2003 році. До цього часу на території України ця хвороба не реєструвалася.

Спостереження за симптомами хвороби показали відсутність характерного молочно-білого ексудату, але інші ознаки (гачкоподібний згин верхівок молодих пагонів, зміна кольору листя на груші до чорного, а на яблуні до коричневого, розтріскування кори з відшаруванням епідермісу, муміфікація плодів груші та яблуні) вказували на подібність захворювання до бактеріального опіку плодових. Хвороба на груші охоплювала всю верхівкову частину дерева і поступово спускалась на нижні гілки, а на деревах яблуні спостерігали лише часткове ураження окремих скелетних гілок.

В період цвітіння плодових культур симптомів прояву хвороби як в Чернівецькій так і в Закарпатській областях не спостерігали. Перші симптоми захворювання проявлялись на молодих пагонах. Спалах хвороби припадав на кінець червня - початок липня, коли відбувався інтенсивний ріст рослин (табл.1).

Таблиця 1 - Результати моніторингу плодових культур на наявність бактеріального опіку в Чернівецькій та Закарпатській областях в різні вегетаційні періоди

Область та роки моніторингу | Кількість випадків виявлення бактеріального опіку плодових в різні періоди вегетації

цвітіння | активного

росту | осіннього

сокоруху

Чернівецька | 1997 | 0 | 2 | 0

1998 | 0 | 10 | 2

1999 | 0 | 19 | 4

2000 | 0 | 8 | 1

2001 | 0 | 11 | 1

2002 | 0 | 10 | 2 | 2003 | 0 | 11 | 1 | Закарпатська | 1996-2002 | 0 | 0 | 0 | 2003 | 0 | 8 | 3 |

За період моніторингу в Чернівецькій області з 281 зразка було виділено 146 патогенних ізолятів, із яких E .amylovora складала 81 ізолят. В Закарпатській області було відібрано і проаналізовано 1144 зразків, з яких виділено 289 патогенних ізолятів, із них 79 ізолятів E .amylovora, які виявлені лише в 2003 році, інші патогенні ізоляти (210) ідентифіковані як P. syringae і виділялись щорічно (табл.2). При обстеженні насаджень яблуні та груші в Придністровській дослідній станції Інституту садівництва УААН спостерігали різну сортову чутливість рослин до збудника опіку плодових (табл.3).

Таблиця 2 - Результати бактеріологічного аналізу зразків патологічного матеріалу плодових

культур, відібраних за період 1996-2003 рр.у Закарпатській та Чернівецькій областях

Місце відбору зразків | Рік
відбору зразків | Проаналізовано зразків, шт. | Виділено ізолятів, шт. | Збудник
хвороби

всього | із них патогенні штами

Закарпатська
область | 1996 | 172 | 62 | 26 | P. syringae | 1997 | 195 | 58 | 49 | P. syringae

1998 | 90 | 67 | 52 | P. syringae

1999 | 141 | 66 | 11 | P. syringae

2000 | 123 | 52 | 24 | P. syringae

2001 | 138 | 54 | 22 | P. syringae

2002 | 93 | 52 | 14 | P. syringae

2003 | 192 | 110 | 79 | E. amylovora

12 | P. syringae

Всього: | 1144 | 521 | 289 | Чернівецька
область | 1997 | 18 | 17 | 2 | E. amylovora

13 | P. syringae

1998 | 40 | 36 | 12 | E. amylovora

18 | P. syringae

1999 | 96 | 54 | 23 | E. amylovora

12 | P. syringae

2000 | 25 | 21 | 9 | E. amylovora

5 | P. syringae

2001 | 36 | 23 | 12 | E. amylovora

8 | P. syringae

2002 | 42 | 29 | 12 | E. amylovora

5 | P. syringae

2003 | 24 | 19 | 11 | E. amylovora

4 | P. syringae

Всього: | 281 | 199 | 146 |

Таблиця 3 - Результати вивчення сортової чутливості сортів груші та яблуні

до збудника опіку плодових в 1997 році на Придністровській

науково-дослідній станції Інституту садівництва УААН

Культура | Середній ступінь ураження, бал | Груша, сорт | Яблуня, сорт | Киргизька зимова | Мелба, Слава Переможцям,
Боскопська красуня | 0 | Яблунівська, Дево, Гере-Жіффер, Варна | Спартан, Голден делішес,
Старкримсон | 0,5

Олів’є де Серр, Вільямс червоний, Бере Бенуа, Первомайська,
Юбілейна, Веснянка, Пасс Кроссон, Етюд, Маргарита Марілля, Чорнобривка, Сільва | Айдаред | 1 | Сувенір де Рівз, Ноябрська,
Виставочна | Джонатан | 1,5 | Крупноплідна, Жак Тел’є, Бере
рання, Моретінні, Вільямс, Кюре | Вагнера призове, Мантуанське, Ренет ландсберський | 2 | Буковина, Кучерянка, Трівенель, Реала Туринська | 2,5 | Тріумф Пекгама, Жанна Дарк, Чудо, Веснянка (Туза), Янтарна, Вікторія, Молдавська рання, Припрутська, Чернівчанка, Бере-Гарді, Конференція | 3 | Малевчанка, Старкримсон,
Мореттіні 64, Микола Тригер | 3,5

Кримські зорі, Оригінальна,
Ля Пестоле, Білка, Парижанка, Мелітопольська сочна | 4 |

Характеристика виділених патогенних штамів бактерій. За період дослідження в Закарпатській області із ураженого матеріалу було виділено 521 ізолят, а в Чернівецькій -199 ізолятів бактерій, тобто в загальній кількості 720 ізолятів.

За здатністю утворювати на середовищі Кінга В флуоресцентний пігмент всі бактерії розділили на 2 групи: нефлуоресціюючі - 335 ізолятів і 385 ізолятів, які здатні були утворювати цей пігмент. Особливу увагу приділяли групі бактерій, які нездатні дифундувати в середовище жовто-зелений пігмент, що характерно для збудника опіку плодових. При культивуванні цієї групи бактерій на середовищах Кадо і Гаскет (Д3) та Кроса і Гудмана виявили два типи колоній. Одна частина (160 ізолятів) на середовищі Кадо і Гаскет (Д3) через 3 доби утворювали червоно-оранжеві колонії, на середовищі Кроса і Гудмана колонії мали посередині кратероподібні заглибини при розгляді їх під малим збільшенням мікроскопу, а при культивуванні на поживному агарі з 5% сахарози утворювали так звані леван-колонії, які мали куполоподібний вигляд. Друга частина нефлуоресціюючих бактерії утворювала червоно-оранжевий пігмент на середовищі Д3 уже через 24 години, на середовищі Кроса і Гудмана колонії були без кратероподібних заглибин. При рості на середовищі Кінга через 48 годин спостерігали дисоціацію колоній на безпігменту та з жовтим пігментом, а з часом такого кольору набували всі колонії.

Патогенні властивості на незрілих плодах груші та реакція надчутливості на листках тютюну були виявлені лише у 160 ізолятів. Подальші вивчення непатогенних нефлуоресціюючих ізолятів показали їх належність до P. agglomerans. У флуоресціюючих бактерій патогенні властивості були виявлені лише у 210 із 385 ізолятів.

На основі даних літератури і встановлених культуральних, морфологічних, біохімічних та серологічних властивостей виділених патогенних штамів нефлуоресціюючі бактерії було ідентифіковано як E. amylovora, а флуоресціюючі – як P. syringae.

Для підтвердження належності виділених штамів до E. amylovora було проведено аналіз на молекулярному рівні шляхом постановки полімеразної ланцюгової реакції в Московській Центральній науково-дослідній лабораторії з карантину рослин.

Серологічні методи діагностики збудника опіку плодових Erwinia amylovora. Порівняно три схеми імунізації кролів антигенами E. amylovora.

Із 10 кролів, імунізацію яких проводили згідно схеми 1 (Бельтюкова), до кінця процедури вижило лише 2 кролі. При імунізації за схемою 2 (G.M.Schroder) також спостерігали загибель чотирьох із 10 тварин через 1 добу після третьої ін’єкції. При імунізації за схемою 3 (Бокшан, Садляк) загинув лише один кріль на 25 день від початку імунізації.

Найбільш чутливою в серологічних реакціях була імунна сироватка, одержана за схемою 3 (табл.4).

Таблиця 4 - Результати апробації сироваток в реакціях

аглютинації та кільцепреципітації

Сироватка одержана за схемою | Титр аглютинацїї | Навантаження вихідного матеріалу, кл/мл

кільцепреципітації | гемаглютинації

1 | 1:800 | 109 | 107

2 | 1:3200 | 108 | 106

3 | 1:12800 | 105 | 103

Для встановлення специфічності імунних до E. amylovora сироваток використовували штами бактерій E. amylovora, E.carotovora, P. agglomerans та P.syringae (табл. 5). Встановлено, що реакції аглютинації на склі та в пробірках виявилися менш специфічними в порівнянні з реакціями кільцепреципітації та гемаглютинації. При проведені реакції аглютинації на склі з клітинами E.carotovora та P.agglomerans спостерігали часткове їх склеювання. Позитивною була і реакція аглютинації в пробірці з клітинами бактерій E.carotovora та P.agglomerans в розведенні 1:50; 1:100. Проте в жодному випадку не спостерігали позитивних результатів при взаємодії з бактеріями P.syringae.

Для підвищення специфічності сироваток проводили абсорбцію імунної сироватки неспецифічних антитіл бактеріями E. carotovora та P. agglomerans. Абсорбована сироватка в реакціях аглютинації реагувала лише з бактеріями E. amylovora

(табл. 6).

Відмічено зниження титру сироватки при абсорбції двома видами бактерій в реакції аглютинації з бактеріями E. amylovora до 1:6400.

При порівнянні різних серологічних методів (аглютинація на склі, аглютинація в пробірках, реакція кільцепреципітації та реакція непрямої гемаглютинації) при різних навантаженнях бактерій E. amylovora було встановлено, що найбільш чутливою була реакція непрямої гемаглютинації (табл.7).

Таблиця 5 - Результати взаємодії імунної до E. amylovora сироватки з різними антигенами

Вид бактерій | Аглютинація | Преципітація

на склі | в пробірці, титр | непряма гемаглютинація | кільцепреципітація | в агарі

E. amylovora | ++++ | ++ 1:12800 | ++ ++ | + | не перетинались

E. carotovora | ++ | ++ 1:100 | - | - | перетиналась 1 лінія

P.agglomerans | ++ | ++ 1:100 | - | - | перетиналась 1 лінія

P. syringae | - | - | - | - | -

Таблиця 6 - Титри антитіл кролячої імунної до E.amylovora сироватки до і після
абсорбції бактеріальними клітинами E.carotovora та P.agglomerans

№ з/п | Імунна сироватка | Титри антитіл в реакціях з бактеріями

E .amylovora | E. carotovora | P. agglomerans

1. | Неабсорбована | 1:12800 ++ | 1:100 ++ | 1:100 ++

2. | Абсорбована E. carotovora | 1:12800 ++ | - | 1:100 +

3. | Абсорбована P. agglomerans | 1:12800 ++ | 1:100 ++ | -

4 | Абсорбована E.carotovora + P.agglomerans | 1:6400++ | - | -

Примітка: „+” - оцінка ступеню реакції; „-” – реакція відсутня

Таблиця 7 - Чутливість різних серологічних методів індикації E. amylovora

Серологічний метод | Навантаження бактерій, кл/мл

108 | 107 | 106 | 105 | 104 | 103 | 102

Аглютинація на склі | ++++* | - | - | - | - | - | -

аглютинація в пробірці | ++++ | +++ | +** | - | - | -

гемаглютинація | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | + | -

кільцепреципітація | + | + | + | + | - | - | -

Примітка: *Аглютинація на склі – розведення сироватки 1:1

**Аглютинація в пробірці – розведення сироватки 1:12800

Враховуючи високу чутливість реакції непрямої гемаглютинації, яка базується на феномені аглютинації еритроцитів, які несуть на своїй поверхні антитіла, нами підібрані параметри одержання антитільного еритроцитарного діагностикума для ідентифікації E. amylovora (табл. 8).

Таблиця 8 - Оптимальні параметри підготовки та сенсибілізації

еритроцитів антитілами імунної сироватки до E. amylovora

Концентрація еритроцитів, % | Спосіб

фіксації | Розведення таніну | Співвідношення об’єму еритроцитів і сироватки | рН середовища | Температура, 0С | Експозиція, хв.

3,5 | Фомалінізація за Чізмесом | 1:20000 | 1 : 4 | 6,4 | 37 | 20

Формалінізовані і танізовані еритроцити зберігались в холодильнику протягом 3-х тижнів. Сенсибілізацію еритроцитів необхідно здійснювати протягом 20 хв. при температурі 370С безпосередньо перед постановкою реакції непрямої гемаглютинації, використовуючи 1 об’єм еритроцитів і 4 об’єми сироватки при рН 6,4.

Моделювання прогнозу ризику появи та розвитку бактеріального опіку плодових. В країнах широкого розповсюдження опіку плодових розроблено ряд моделей по сигналізації появи захворювання, що дозволяє вчасно застосовувати пестициди як проти патогена, так і проти комах-поширювачів.

В Україні моделі по прогнозуванню появи та розвитку бактеріального опіку плодових в умовах наших регіонів відсутні. Ми проаналізували чотири моделі прогнозування ризику появи та розвитку бактеріального опіку плодових (Maryblyt model, Cougarblight – версія 2000 (Celsius), Billing’s integrated system та Billing’s original system), які базуються на біотичних та абіотичних факторах. Найбільш оптимальною для прогнозування ризику появи та розвитку опіку плодових була модель Maryblyt, яка передбачає інфекційний день, інкубаційний період та появу симптомів як на квітках, так і на інших частинах рослин. Проведені розрахунки за даною моделлю показали, що в період цвітіння 2001-2002 рр. не було відповідних умов для інфікування та розвитку хвороби (рис.1).

У Берегівському районі в 2001 році 110 градусо-годин >180С, які необхідні були для накопичення патогена, досягли 29.04, але на даний період проникнення інфекції лімітувалось недостатнім зволоженням квітів. В 2002 році відповідна сума градусо-годин >180С досягла 1 травня, але середньодобова температура складала лише 13,20С, в той час як для інфікування необхідно 15,60С. В 2003 році 110 градусо-годин >180С досягла 29 квітня, середньодобова температура складала 17,90С, напередодні випали опади 2,5 мм, отож цей день можна вважати сприятливим для проникнення інфекції. Для попередження захворювання в цей день необхідно було б провести хімічний захист рослин відповідними препаратами.

Згідно моделі Maryblyt для появи симптомів на квітках необхідно, щоб було 57 градусо-днів >12,70C, тобто це так званий інкубаційний період, за проведеними спостереженнями в 2003 році він наступив 6 травня, коли цвітіння закінчилося. Тому симптомів опіку квіток не спостерігали.

При розрахунку прогнозу появи симптомів на зелених пагонах (рис. 2) встановлено, що цей період в 2003 році припав на 25 травня. Фактично перші симптоми опіку плодових на яблуні в Берегівському районі було зафіксовано 28 травня, тобто прогнозовані розрахунки співпали з проявом хвороби.

БАКТЕРІАЛЬНІ ГНИЛІ КАРТОПЛІ

Вибіркове обстеження бульб картоплі в сховищах та посадок картоплі проводили в Закарпатській області в трьох агрокліматичних зонах (низинній, передгірній та гірській), зокрема в Ужгородському, Мукачівському, Перечинському та Воловецькому районах протягом 2001-2002 рр.

При аналізі бульб картоплі (238 зразків) бурої гнилі картоплі (Ralstonia solanacearum) не було виявлено, проте виявлено незначне ураження кільцевою та мокрою гниллю. Ураженість бульб картоплі збудником кільцевої гнилі після зимівлі в 2002 році була невисокою. Зокрема, у Воловецькому районі вона становила 2,1%, Перечинському – 1,9%, Мукачівському – 1,3%, Ужгородському – 0,9%.

Подібність симптомів проявлення хвороб картоплі при ураженні їх бактеріями R. solanacearum, C .sepedonicum, E. carotovora вимагають проведення детальної діагностики збудників. Вивчення характеристики росту бактерій на середовищах Кельмана, картопляному та Кінга В дозволяє визначити родову їх належність. Колонії P. fluorescens на середовищі Кельмана були такого ж забарвлення, як і колекційні культури R. solanacearum, але відрізнялись тим, що в них забарвлення було рівномірним, без утворення світлої облямівки і мали округлу форму. Бактерії C. sepedonicum утворювали на другу добу культивування світлі колонії і лише через 5 днів спостерігалось утворення світло-червоного пігменту. Колонії бактерій E. carotovora залишались безбарвними протягом періоду досліджень. Для розділення бактерій R. solanacearum і P. fluorescens, можна використовувати середовище Кінга В, на якому P. fluorescens утворює флуоресцентний пігмент.

При вивченні біохімічних властивостей різних збудників гнилей картоплі встановлено, що E.carotovora здатна використовувати ті ж самі вуглеводи (мальтоза, лактоза, целобіоза) та багатоатомні спирти (маніт, сорбіт), що і R.solanacearum біовар 3. Збудник кільцевої гнилі C.sepedonicum за своїми біохімічними властивостями відрізняється від R.solanacearum біовару 4 лише тим, що нездатний використовувати дульцит. В той же час біовари R.solanacearum за біохімічними ознаками значно відрізняються один від одного. Таким чином, при вивченні біохімічних властивостей патогенів, виділених з рослин картоплі, слід завжди пам’ятати про наявність різних біоварів і для ідентифікації до виду включати інші тести.

Встановлено, що перші етапи диференціювання бактеріальних гнилей картоплі в польових умовах та в умовах прикордонних пунктів карантину рослин можна проводити без виділення збудника в чисту культуру за наведеною на рисунку 3 .

При наявності Грам негативних та оксидазо- і уреазо- позитивних бактерій необхідно проводити виділення бактерій на напівселективному середовищі Кельмана та середовищі Кінга В з подальшим вивченням всіх характеристик (патогенність, біохімічні властивості та ін.).

КОН

Грам ( - ) Грам ( + )

Ralstonia solanacearum, Clavibacter

Erwinia carotovora sepedonicum

Тести на оксидазу і уреазу

Позитивні Негативні

Ralstonia solanacearum Clavibacter sepedonicum Erwinia carotovora

Рис. 3. Схема попередньої диференціації збудників бактеріозів картоплі
(без виділення їх в чисту культуру)

МЕТОДИКИ ПРИСКОРЕНОЇ ЕНЗИМ-ІНДИКАЦІЇ

ФІТОПАТОГЕННИХ БАКТЕРІЙ

Для вивчення біохімічних властивостей фітопатогенних бактерії нами підібрано набір відповідних вуглеводів та багатоатомних спиртів та умови імпрегнування ними паперових дисків.

Встановлено, що найбільш оптимальною була 10% концентрація вуглеводів та багатоатомних спиртів та термін просочування паперових дисків 30 хвилин.

На біохімічну активність бактерій при застосуванні паперових дисків впливає температура. Найбільш оптимальною була температура 280С. Зміни рН середовища спостерігали через 3-5 годин. Як контроль біохімічної активності бактерій використовували ряди Гіса з такими ж речовинами, де біохімічна активність спостерігалась лише через 24 і більше годин. Таким чином встановлено, що при застосуванні мікрометоду з використанням паперових дисків біохімічну активність бактерій можна встановити набагато швидше, ніж класичним методом.

Шляхом визначення типу утилізації бактеріями глюкози визначають їх родову належність. Зокрема бактерії роду Pseudomonas та Ralstonia здатні до кисневого використання глюкози, а бактерії роду Erwinia – до ферментативного. Тривалість класичного O/F- тесту складає не менше ніж 24 години. Постановка цього тесту за допомогою паперових індикаторних дисків дає змогу скоротити цей час до 3-х годин.

Встановлено, що використання засвіченої проявленої фотоплівки, яка вноситься в субстрат з мікроорганізмами, значно скорочує (більш ніж у 2 рази) час виявлення протеолітичної активності у фітопатогенних бактерій в порівнянні з класичним методом.

При вивченні каталазної активності бактерій за йод-крохмальним методом встановлена пряма залежність цієї ознаки від ступеня вірулентності штаму. За допомогою цієї методики каталазна активність була виявлена у всіх досліджуваних бактерій (E. amylovora, E.carоtovora, P.syringae, R.solanacearum). При вивченні каталазної активності у бактерій R. solanacearum було відмічено підвищення її у штамів, які декілька раз пасивувались на рослинах. Величина білих зон навколо внесених бактерій E.amylovora, виділених із патологічного матеріалу, була значно більшою, ніж навколо колекційного штаму цієї культури. Таким чином, даний метод є надійним і інформативним і дозволяє робити висновки про вірулентність досліджуваної культури.

Порівняльне вивчення прискорених методик виявлення E. amylovora показало, що найбільш чутливим є метод непрямої гемаглютинації (табл.9).

Таблиця 9 - Результати порівняльного вивчення виявлення E. amylovora

з ураженого матеріалу різними методами

Методика

досліджень | Виявлення збудника

в різних типах зразків, % | Затрати часу

З явними ознаками захворювання | Без видимих симптомів захворювання

Повний бактеріологічний аналіз | 100 | 100 | 24 доби

Реакція кільцепреципітації за методом Ізраїльського | 100 | 88 | 3,5-4 год.

Модифікована реакція кільцепреципітації | 100 | 98 | 4-4,5 год.

Реакція непрямої гемаглютинації | 100 | 100 | 2-12 год.

Модифікована нами реакція кільцепреципітації дає змогу підвищити ймовірність виявлення E. amylovora з 88 до 98 відсотків.

ВИСНОВКИ

1. Вперше в Закарпатській (2003 р.) області виявлено та ідентифіковано збудника бактеріального опіку плодових E. аmylovora. Встановлено, що в умовах Закарпатської та Чернівецької областей перебіг хвороби дещо відрізняється від класичного її опису, зокрема виділення молочно-білого ексудату не спостерігається. Характер утворення виразок на гілках залежить від чутливості сорту.

2. Встановлено, що із трьох критичних періодів чутливості плодових культур до опіку плодових (цвітіння, інтенсивного росту, осіннього сокоруху) найбільший ризик прояву захворювання в умовах Закарпатської та Чернівецької областей припадає на період інтенсивного росту дерев.

3. Вперше в Україні проведено оцінку чутливості сортів яблуні та груші, які культивуються в Чернівецькій та Закарпатській областях до збудника бактеріального опіку плодових в природних умовах. При спостереженні протягом 4 років за 9 сортами груші (Киргизька зимова, Яблунівська, Олів’є де Серр, Ноябрська, Жак Тел’є, Кучерянка, Конференція, Старкримсон, Парижанка) в Чернівецькій області стійкість до бактеріального опіку виявлена лише у сорту Киргизька зимова. Сорти Конференція, Старкримсон, Парижанка виявились найбільш чутливими. У яблуні стійкими до бактеріального опіку плодових були сорти Мелба, Слава переможцям, Боскопська красуня, найбільш чутливими – Вагнера призове, Мантуанське, Ренет ландсберський.

4. В Закарпатській області бактеріальний опік плодових виявлено на сортах груші Конференція, Кучерянка, Кюре, Парижанка, яблуні – Айдаред, Джонатан.

5. Різну сортову чутливість плодових культур до цієї хвороби необхідно враховувати при проведенні моніторингу на виявлення бактеріального опіку плодових та при закладанні нових садів.

6. Прогнозування появи та розвитку бактеріального опіку плодових в умовах Закарпатської області можна здійснювати на основі моделі Maryblyt, яка передбачає інфекційний день, інкубаційний період та появу симптомів як на квітках, так і на інших частинах рослин і забезпечує своєчасний хімічний контроль хвороби.

7. На основі вивчення існуючих методик ідентифікації E. amylovora та власних досліджень розроблено схему прискореної діагностики збудника бактеріального опіку плодових, яка включає тест на патогенність на незрілих плодах груші, серологічні реакції (кільцепреципітації та пасивної гемаглютинації) без виділення збудника, характер росту виділених бактерій на середовищах Кінга В, Кадо і Гаскет, Кроса та Гудмана, розташування джгутиків у бактеріальної клітини та спосіб утилізації глюкози.

8. Підібрано схему імунізації кролів антигенами E. amylovora, яка забезпечує одержання високоспецифічної антисироватки.

9. Вперше підібрано параметри одержання еритроцитарного діагностикума для ідентифікації E. аmylovora з використанням методики непрямої гемаглютинації з чистою культурою та соком патологічного матеріалу.

10. В результаті вибіркового моніторингу картоплесховищ та посадок картоплі в Закарпатській області карантинного захворювання бурої гнилі картоплі (Ralstonia solanacearum) не виявлено.

11. Узагальнено існуючі методи діагностики Ralstonia solanacearum та запропоновано схему розділення збудників гнилей картоплі на основі вивчення тинкторіальних, культуральних та біохімічних властивостей.

12. Розроблена методика приготування паперових індикаторних дисків та методика їх використання для прискореної ензим-індикації фітопатогенних бактерій, що дозволяє вияснити біохімічну активність бактерій протягом 3-8 годин.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. В опублікованих 2000 р. методичних вказівках “Виявлення, діагностика та локалізація бактеріального опіку плодових E.amylovora” та переданих для обласних інспекцій та прикордонних пунктів з карантину рослин рекомендовано обстеження плодових культур на виявлення опіку плодових проводити в три періоди: цвітіння, інтенсивного росту та період сокоруху. Попередню діагностику бактеріального опіку плодових проводити шляхом проведення реакції кільцепреципітації без виділення збудника з патологічного матеріалу.

2. Спеціалістам карантинних лабораторій пропонується скорочена схема ідентифікації E.amylovora, яка включає тест на патогенність на незрілих плодах груші, характер росту на середовищах Кінга В, Кадо і Гаскет, Кроса та Гудмана, розташування джгутиків в бактеріальній клітині, спосіб