АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

КУКОВСЬКА Ірина Любомирівна

УДК 615.243

РЕНАЛЬНІ ЕФЕКТИ ДАЛАРГІНУ

(експериментальне дослідження)

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фармакології і фармації Буковинської державної медичної академії МОЗ України, м. Чернівці

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Косуба Раїса Борисівна, Буковинська державна медична академія МОЗ України, професор кафедри фармакології та фармації

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Громов Леонід Олександрович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу нейрофармакології;

доктор медичних наук, професор Горчакова Надія Олександрівна, Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця (м.Київ), професор кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології та медичної рецептури

Захист дисертації відбудеться “18_” _лютого__ 2004 р. о _15_ годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України

(03057, м.Київ, вул Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м.Київ, вул.Ежена Потьє, 14.

Автореферат розісланий “16 ” ___січня_________ 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01

кандидат біологічних наук І.В.Данова

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Пріоритетним завданням сучасної фармакології є створення нових та більш досконале вивчення вже відомих лікарських препаратів. Все частіше для отримання ефективних та безпечних лікарських засобів використовують біологічно активні речовини ендогенного походження. Створений на основі опіоїдних пептидів синтетичний аналог лейцин-енкефаліну даларгін має широкий спектр фармакологічної активності, притаманний цим нейропептидам (М.В.Боднарь, 1997; Т.В.Масюк, 1998). Препарат з успіхом використовують при лікуванні ряду захворювань органів травлення (В.Ф.Булычев, Л.М.Вахрушев, 2000; В.М.Демидов, 2000; Н.В.Буглак и соавт., 2003; А.О.Лобенко та ін., 2003), в анестезіології та інтенсивній терапії (В.Д.Слепушкин, 1996; И.Б.Заболотских и соавт., 2002; А.В.Николаев, В.Е.Войцицкий, 2002), при патології серцево-судинної системи (В.В.Ежов, 1995; Н.Н.Петрищев и соавт., 2001; Н.В.Нарыжная и соавт., 2002; А.В.Курята, 2003) та ін. Таку поширеність клінічного застосування дослідники обґрунтовують метаболітними властивостями препарату, зокрема, його антиоксидантною дією (А.І.Лучков, 2000; С.Львова и соавт., 2002; О.А.Лебедько, С.С.Тимошина, 2002; С.С.Ткачук, 2002; В.М.Демидов, М.М.Коробка, 2003; А.І.Ковтун та ін., 2003). У літературі є повідомлення, що даларгін здатний впливати на функціональний стан нирок, що може мати певне значення для клінічної практики. Так, встановлено, що цей препарат може посилювати сечовиділення (Р.И.Айзман и соавт., 1993; В.Д.Слепушкин и соавт., 1993; Н.Н.Михайлова и соавт., 1994), однак є дані щодо пригнічення цієї функції нирок (Ю.Б.Лишманов и соавт., 1983; Ю.Б.Лишманов и соавт., 1986). Ці суперечливі свідчення не дають змоги зробити остаточний висновок щодо характеру ренальних ефектів даларгіну. Залишаються недослідженими залежність дії препарату від уведеної дози, тривалості застосування, ступеню гідратації організму. Не розкрито механізми реалізації ренальних ефектів даларгіну як на органному, так і системному рівнях, участь у цьому процесі натрійуретичних чинників, мінералокортикоїдів, ренін-ангіотензин-альдостеронової системи, ейкозаноїдів та ін. Нез'ясованість впливу даларгіну на функцію нирок та водно-сольовий гомеостаз обмежує його застосування при патологічних станах, які супроводжуються затримкою води і солей в організмі. Зважаючи на відомі циркадіанні коливання рівня ендогенних опіоїдів (E.Bailey et al., 1996; Asai M. et al., 1998; A.Xochimilco, 1998), невиправдано поза увагою дослідників залишилися питання особливостей хронофармакологічного впливу даларгіну на організм і діяльність нирок зокрема.

З огляду на те, що даларгін широко застосовується в клінічній практиці, а вплив препарату на функцію нирок достатньо не з’ясований, актуальним напрямком досліджень є встановлення його ренальних ефектів.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи кафедри фармакології та фармації Буковинської державної медичної академії: “Вивчення впливу вазоактивних лікарських засобів (диметилксантини, антагоністи кальцієвих каналів, тіотріазолін, даларгін та інші) на показники функції нирок та водно-сольовий обмін” (номер держреєстрації – 01.99.V.001761).

Мета дослідження. Зясувати характер та механізми ренальних ефектів даларгіну за різних умов експерименту задля обґрунтування доцільності його застосування при порушеннях функції нирок.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Обєкт дослідження – білі щурі, йонорегулювальна, екскреторна, волюморегулювальна функції нирок, показники водно-сольового гомеостазу та систем тканинного фібринолізу і протеолізу за умов дії синтетичного опіоїдного пептиду – даларгіну.

Предмет дослідження – зміни функціонального стану нирок у щурів під впливом даларгіну за різних умов експерименту.

Методи дослідження – фармакологічні, функціональні, біохімічні, хронобіологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведено, що зміни функціональної діяльності нирок під впливом даларгіну залежать від дози препарату, тривалості застосування, ступеню гідратації організму, а також часу введення впродовж доби. Найбільш помітна діуретична дія даларгіну виявлена при введенні його в оптимально ефективній дозі – 0,5 мг/кг та за умов збільшення рідини в організмі.

Уперше проведено хронофармакологічні дослідження впливу даларгіну на функціональний стан нирок. Доведено, що даларгін не порушує фізіологічну структуру біоритмів діяльності нирок, і найбільш виразно підвищує екскреторну функцію нирок у нічний період (2000 – 0400).

Уперше з'ясовано ренальні механізми впливу даларгіну на екскреторну функцію нирок, помірна сечогінна дія препарату переважно обумовлена збільшенням швидкості клубочкової фільтрації.

Доведено залежність ренальних ефектів даларгіну від стану основних регуляторів водно-сольового гомеостазу. Зміни функціонального стану нирок в більшій мірі проявляються при пригніченні активності мінералокортикоїдів, ренін-ангіотензин-альдостеронової системи, зменшенні рівня ейкозаноїдів та збільшенні натрійуретичного гормону (фактора) в організмі.

Уперше виявлено посилення тканинної протеолітичної активності в печінці, нирках, плазмі крові, сечі та фібринолітичної активності кіркової речовини нирок, печінки, сечі за умов дії препарату. Встановлено кореляційний зв'язок між зростанням швидкості клубочкової фільтрації та посиленням сумарної фібринолітичної активності кіркової речовини нирок під впливом даларгіну.

Уперше доведено ефективність даларгіну як профілактичного та лікувального засобу при експериментальній гострій нирковій недостатності.

Практичне значення одержаних результатів. Проведене дослідження розкриває нові, раніше невідомі механізми впливу даларгіну на нирки, залежність його ренальних ефектів від стану регуляторів водно-сольової рівноваги. М’яка сечогінна дія даларгіну посилюється при зменшенні активності мінералокортикоїдів (введення спіронолактону), ренін-ангіотензин-альдостеронової системи (введення еналаприлу), зменшенні рівня ейкозаноїдів (введення індометацину), при збільшенні об’єму рідини в організмі, при повторних введеннях препарату. Даларгін підвищує фібринолітичну та протеолітичну активність тканин нирок, плазми крові та сечі, нормалізує функціональний стан нирок при експериментальній гострій нирковій недостатності. Отримані дані поглиблюють фармакодинаміку даларгіну і можуть бути використані як експериментальне обґрунтування клінічного застосування препарату, зокрема для фармакотерапії порушень функції нирок і водно-сольового обміну.

За матеріалами досліджень отримано деклараційний патент на винахід № А від 17.03.2003 р. "Куковська І.Л., Косуба Р.Б., Роговий Ю.Є. Засіб для лікування гострої ниркової недостатності", а також посвідчення на раціоналізаторську пропозицію "Куковська І.Л., Косуба Р.Б., Роговий Ю.Є. Застосування даларгіну для лікування гострої ниркової недостатності в експерименті", видане БДМА за № 10/02 від 9 січня 2002 р. Окремі положення наукового дослідження впроваджено в лікувальних закладах Чернівецької області (Вижницькій ЦРЛ, лікарні швидкої медичної допомоги м. Чернівців).

Матеріали дисертації впроваджено у навчальний процес і використовуються у лекційному курсі для студентів та при проведенні практичних занять на кафедрі фармакології та фармації Буковинської державної медичної академії, кафедрі фармакології Івано-Франківської державної медичної академії (акт впровадження від 7.06.2001 р.), кафедрі фармакології з курсом клінічної фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова (акт впровадження від 6.06.2001 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконані всі фрагменти експериментальних досліджень, проведені функціональні, біохімічні та хронобіологічні дослідження, статистичний аналіз і узагальнення результатів дослідження з встановленням кореляційних зв’язків, підготовлені наукові роботи до друку, написана та оформлена дисертація, сформульовані висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та висновки дисертаційної роботи оприлюднені та обговорювались на 5-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Катовіце, Польща, 2000), 2-ій Міжнародній медичній конференції студентів та молодих вчених та 9-му Міжнародному науковому симпозіумі (Люблін, Польща, 2000), науково-практичній конференції “Нове в етіології, патогенезі і терапії кардіоміопатії (дилятаційної та гіпертрофічної)” (Харків, 2000), II Національному зїзді фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок у майбутнє” (Дніпропетровськ, 2001), VI зїзді Всеукраїнського лікарського товариства (Чернівці, 2001), науково-практичній конференції “Актуальні питання клініко-лабораторної діагностики захворювань людини” (Чернівці, 2001), науково-практичній конференції з міжнародною участю "Сучасні аспекти хронобіології та хрономедицини" (Чернівці, 2002), науково-практичній конференції "Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків" (Чернівці, 2002), 70-ій студентській науковій конференції, присвяченій 10 річниці незалежності України (Івано-Франківськ, 2001), на розширеному засіданні Чернівецького відділення асоціації фармакологів України (Чернівці, 2002), підсумкових наукових конференціях співробітників Буковинської державної медичної академії 1999–2002 рр.

Публікації. За матеріалами дослідження опубліковано 17 наукових робіт, із них 4 статті у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, та 12 робіт у матеріалах зїздів, конференцій, отримано 1 патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 173 сторінках машинопису та включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів дослідження, 4 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих результатів, висновки, науково-практичні рекомендації, список посилань, який містить 366 джерел, в тому числі 262 вітчизняних, 104 зарубіжних. Робота ілюстрована 21 рисунком, 26 таблицями.

основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 510 білих статевозрілих нелінійних щурах масою 120 – 180 г. Тварин утримували в умовах віварію на постійному режимі харчування без обмежень у споживанні води та їжі.

Для виконання дослідів тваринам внутрішньоочеревинно одноразово або повторно протягом 7 діб вводили даларгін (ЗАТ “БИОЛЕК”, Україна) у діапазоні доз від 0,01 мг/кг до 1 мг/кг у об'ємі 0,5 мл розчинника на 100 г маси тіла тварин.

Показники діяльності нирок досліджували за умов спонтанного діурезу та модельованої гіпергідратації організму шляхом уведення тваринам у шлунок через зонд питної води, гіпотонічного (0,45%) розчину натрію хлориду, а також внутрішньовенного введення ізотонічного розчину натрію хлориду в об'ємі 3–5% від маси тіла.

Після об'ємної (волюмо) стимуляції тварин поміщали на 2 год в індивідуальні клітки для збирання сечі, в якій визначали концентрацію креатиніну, білку, йонів натрію та калію. Для визначення аналогічних показників у плазмі крові проводили евтаназію тварин під ефірною анестезією, кров забирали гепаринізованим шприцем і центрифугували при 3000 об./хв протягом 10 хв.

Концентрацію йонів натрію і калію в плазмі крові та сечі визначали методом фотометрії полум'я на ФПЛ–1. Концентрацію креатиніну у сечі – за методом Фоліна, у плазмі крові – за методом Поппера із наступним колориметруванням зразків на спектрофотометрі КФК–2, концентрацію білка в сечі – за методом А.П Міхєєвої., І.А.Богодарової (В.М.Магаляс та співавт., 2001).

Для оцінки змін осмо- та волюморегулювальної функцій нирок під впливом даларгіну, проводили розрахунки швидкості клубочкової фільтрації, канальцевої реабсорбції та інших показників (О.Шюк, 1981; С.И.Рябов, Ю.В.Наточин, 1997).

В окремих серіях дослідів вивчали вплив даларгіну на структуру хроноритмів екскреторної та йонорегулювальної функцій нирок. Для цього тваринам через кожні 4 години (800, 1200, 1600, 2000, 2400, 0400) внутрішньоочеревинно вводили даларгін, контрольним тваринам – розчинник (воду очищену). Індукували діурез 5% водним навантаженням. Збір сечі та забір крові здійснювали з 4-годинним інтервалом впродовж доби. Статистичну обробку результатів досліджень проводили методом “Косинор-аналізу”. При цьому визначали та аналізували зміни характеристик мезору, амплітуди, акрофази та форми кривої циркадіанного ритму (И.П.Емельянов, 1988).

Для дослідження впливу даларгіну на показники діяльності нирок за різної мінералокортикоїдної активності створювали моделі гіперальдостеронізму шляхом підшкірного введення протягом 4 днів 0,5% олійного розчину дезоксикортикостерону ацетату – ДОКСА (АТ “Фармадон”, Росія) в дозі 10 мг/кг та блокади альдостеронових рецепторів шляхом 4-денного ентерального введення спіронолактону (“Гедеон Ріхтер”, Угорщина) у дозі 20 мг/кг на 1% зависі крохмалю.

Можливу причетність ейкозаноїдів до реалізації ниркових ефектів даларгіну вивчали після 4-денного введення в шлунок інгібітора синтезу простагландинів індометацину в дозі 5 мг/кг (А.А.Некрасова та співавт., 1977).

Для вивчення змін діяльності нирок під впливом даларгіну за умов зниженої активності ренін-ангіотензинової системи дослідження проводились після багаторазового введення препарату. Інгібітор ангіотензин-перетворювального ферменту еналаприл (ТОВ „Фармацевтична компанія „Здоров’я”, Україна) вводили тваринам у шлунок через зонд в дозі 10 мг/кг на 1% зависі крохмалю протягом 4 днів до проведення експерименту.

Натрійуретичну активність плазми крові щурів вивчали методом біологічного тестування на щурах (Ю.И.Иванов, 1980) і оцінювали по екскреції йонів натрію як у контрольних тварин, так і на тлі введення препарату при збільшенні об'єму позаклітинної рідини внутрішньовенним уведенням 0,9% розчину натрію хлориду в об'ємі 3% від маси тіла. Активність натрійуретичного гормону (НУГ) виражали в ум.од./мл. За одну умовну одиницю НУГ приймали таку його кількість, яка здатна в 2 рази збільшити натрійурез порівняно з контрольними дослідами (Р.Б.Косуба, 1990).

Об'єм внутрішньосудинної рідини у щурів визначали за допомогою синього Евансу (Т-1824), об'єм позаклітинної рідини – по тіоціанату натрію (Е.Б.Берхин, Ю.И.Иванов, 1972). Об'єм інтерстиційного сектору розраховували за різницею позаклітинного та внутрішньосудинного просторів.

Для визначення вмісту електролітів (Na+, K+) і води в тканинах органів проводили евтаназію тварин під ефірною анестезією шляхом декапітації, брали наважки внутрішніх органів (серце, печінка, нирки, тонка, товста кишка, скелетний м'яз), які висушували до постійної маси в сушильній шафі при температурі 80о С протягом 3 днів (Е.Б.Берхин, Ю.И.Иванов, 1972). Вміст натрію і калію в тканинах органів визначали згідно Martorano J. (1958). Загальну воду вираховували по різниці початкової та після висушування маси тканини органів.

Фібринолітичну активність плазми крові та сечі, а також тканинну фібринолітичну активність печінки, кіркового, мозкового та сосочкового шарів нирок визначали по лізису азофібрину з оцінкою сумарної і неферментативної (інкубація проб у присутності блокатора ферментативного фібринолізу ?_амінокапронової кислоти) з розрахунком ферментативної фібринолітичної активності. Стан необмеженого протеолізу плазми крові, сечі і тканин органів (печінка, нирки) під впливом даларгіну оцінювали за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу (В.М.Магаляс та співавт., 2001).

Для вивчення впливу даларгіну на діяльність нирок на моделі гострої ниркової недостатності, викликаної одноразовим введенням дихлориду ртуті у дозі 5 мг/кг (сулемова нефропатія), препарат вводили через 24 год після введення сулеми, або з профілактичною метою – за 3 дні до її введення.

Результати експериментів статистично оброблені з використанням програми "Statgrafics", "Nefr". Обчислювали середні арифметичні величини (х), їх стандартні похибки (Sx). Достовірність отриманих змін (р) оцінювали за t-критерієм Ст'юдента. При необхідності встановлювали наявність чи відсутність зв'язку між досліджуваними показниками. Для цього проводили кореляційний аналіз і визначали коефіцієнт лінійного (г) кореляційного зв'язку. Достовірність кореляційного зв'язку визначали за показником достовірності коефіцієнту кореляції.

Результати дослідження та їх обговорення

1.

Проведені дослідження показали, що за одноразового введення даларгіну в діапазоні доз від 0,01 мг/кг до 1 мг/кг на тлі збільшеного об?єму рідини в організмі оптимально ефективною виявилася доза 0,5 мг/кг, при якій діурез зростав у 1,2 раза (р<0,05) порівняно з контролем, екскреція креатиніну, як показника швидкості клубочкової фільтрації, збільшувалася у 2,5 раза (р<0,05).

Рис. 1. Вплив одноразового введення даларгіну в різних дозах на діурез (мл/2 год) та екскрецію креатиніну (мкмоль/2 год) нирками у щурів за умов збільшення об’єму рідини в організмі.

Після багаторазового (7днів) введення даларгіну в оптимально діючій дозі (0,5 мг/кг) спостерігалося аналогічне як і після одноразового введення збільшення сечовиділення – в 1,2 раза (р<0,02). Швидкість клубочкової фільтрації при цьому зростала у 2,4 раза (р<0,002). Мало місце суттєве (у 1,7 раза, р<0,001) зниження концентрації креатиніну в плазмі крові. Виявлено негативний кореляційний зв?язок між швидкістю клубочкової фільтрації та концентрацією креатиніну в плазмі крові (r=0,7524, р<0,05), що підкреслює взаємозалежність цих показників за умов курсового застосування препарату.

Таблиця 1.

Вплив багаторазового (7 днів) введення даларгіну (0,5 мг/кг)

на екскреторну та йонорегулювальну функції нирок у щурів

за умов гіпергідратації (хSx)

Показники | Контроль

(n=10) | Даларгін

(n=10) | р

Діурез, мл/2 год/100 г | 3,260,15 | 4,040,22 | < 0,02

Клубочкова фільтрація, мкл/хв/100 г | 315,9726,62 | 745,2579,35 | < 0,002

Концентрація креатиніну в плазмі крові, мкмоль/л | 75,007,21 | 43,904,34 | < 0,001

Реабсорбція води, % | 90,500,81 | 95,020,58 | < 0,002

Концентрація К+ в сечі, ммоль/л | 6,640,97 | 6,650,56 | > 0,05

Екскреція К+, мкмоль/2 год/100 г | 21,613,17 | 27,593,43 | > 0,05

Концентрація білка в сечі, мг/л | 0,090,01 | 0,020,002 | < 0,001

Екскреція білка, мг/2 год/100 г | 0,290,02 | 0,070,01 | < 0,001

Екскреція білка, мг/100 мкл клубочкового фільтрату | 0,100,01 | 0,010,001 | < 0,001

Екскреція Na+, мкмоль/2 год/100 г | 2,160,43 | 2,650,20 | > 0,05

Фільтрована фракція Na+, мкмоль/хв | 44,133,74 | 110,5416,67 | < 0,002

Екскретована фракція Na+, мкмоль/хв | 0,0180,004 | 0,020,002 | > 0,05

Реабсорбована фракція Na+, мкмоль/хв | 44,113,74 | 110,5216,67 | < 0,002

Дистальний транспорт Na+, мкмоль/2 год | 453,7621,70 | 592,5035,59 | < 0,02

Проксимальний транспорт Na+, мкмоль/2 год | 4,840,45 | 12,671,51 | < 0,002

Екскреція Na+ ,

мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату | 0,720,12 | 0,400,05 | < 0,05

Проксимальний транспорт Na+,

мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату | 12,640,11 | 4,000,36 | < 0,01

Дистальний транспорт Na+,

мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату | 1,320,11 | 0,720,08 | < 0,01

Примітка: р – показник вірогідності відносно контролю.

Нирковий транспорт йонів натрію за умов гіпергідратації характеризувався зростанням його фільтрованої фракції (у 2,5 раза), що зумовлено збільшенням швидкості клубочкової фільтрації і підтверджується прямим кореляційним зв?язком між цими показниками (r=0,885, р<0,001). Одночасно спостерігалася інтенсифікація процесів транспорту йонів натрію як на рівні проксимального (у 2,6 раза, р<0,002), так і дистального (у 1,3 раза, р<0,02) відділів нефрону. Стандартизований показник екскреції йонів натрію на 100 мкл клубочкового фільтрату зменшувався у 1,8 раза. Проведений кореляційний аналіз вказує на вірогідну кореляційну залежність між реабсорбованою фракцією йонів натрію та його проксимальним транспортом (r=0,888, р<0,001).

Дослідження, проведені за умов спонтанного діурезу показали, що даларгін у дозі 0,5 мг/кг при одноразовому застосуванні не викликає помітних змін у діяльності нирок.

При щоденному багаторазовому застосуванні виявлено поступове посилення сечовиділення з максимальним значенням діурезу на 5 добу введення (в 1,7 раза). Середньодобові значення об’єму виділеної сечі після тривалого введення даларгіну в 1,4 раза (р<0,05) перевищували показники контролю. Розрахунки відносного діурезу (відсоткове відношення добового діурезу до кількості випитої води) показали, що збільшення діурезу під впливом препарату не обумовлено змінами питної збудливості у тварин. Даларгін за даних умов експерименту виявляв також салуретичну дію, натрійурез перевищував середньодобові показники контролю в 1,7 раза (р<0,05), калійурез – у 2,5 раза (р<0,05). Вказані зміни досліджуваних показників зберігалися ще впродовж першої доби після відміни препарату, після чого поверталися до вихідного рівня. Останнє свідчить про відсутність у препарату кумулятивних властивостей.

При дослідженні впливу даларгіну на хроноритмологічну організацію діяльності нирок встановлено, що структура біоритмів їх функціонування суттєво не відрізняється від ритму діяльності нирок у контрольних тварин. Амплітуда ритму діурезу становила 12% від мезору як у контрольних так і у дослідних тварин. Середньодобовий рівень сечовиділення зростав у 1,2 раза (р<0,05).

Максимальне посилення діурезу під впливом даларгіну спостерігалося в другій половині доби (у нічний період) – у 1,3 раза (р<0,05) порівняно з контролем, хоча акрофаза діурезу в обох серіях досліду припадала на 1200год. Зміни діурезу при застосуванні даларгіну за своєю структурою подібні ритмам, що мали місце у контрольній групі тварин (рис. 2).

Середньодобовий рівень клубочкової фільтрації у групі дослідних тварин перевищував на 20 % аналогічний показник у контролі.

Рис. 2. Вплив даларгіну (0,5 мг/кг) на хроноритми діяльності нирок у щурів.

Амплітуда ритму клубочкової фільтрації під впливом препарату була вищою і становила 21% від мезору, що на 10% вище значень контрольної групи тварин. Максимальні значення швидкості клубочкової фільтрації при застосуванні даларгіну зареєстровані також у нічний час – о 2400–400 год, коли мало місце її зростання в 1,3 – 1,4 раза (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин.

Середньодобовий рівень екскреції йонів натрію з сечею (рис.2) перевищував контрольні дані у 2 рази за рахунок вищих показників та високої амплітуди значень. Причому, в першій половині доби спостерігалися близькі до контролю дані, а суттєве їх зростання ( в 2,6–3,8 раза, р<0,05) виявлено в другій половині доби. Акрофаза екскреції йонів натрію співпадала з максимальними значеннями клубочкової фільтрації о 2400 год.

Середньодобові значення екскреції йонів калію були вищими значень контролю в 1,2 раза. Ритм калійурезу при застосуванні даларгіну зберігав синфазну структуру із ритмом у контрольній групі тварин, із акрофазою в 800–1200 год, та батифазою о 2400–400 год.

2.

Діяльність нирок підпорядковується регулюючим впливам багатьох нейро-гуморальних чинників організму, що зумовило дослідження можливих механізмів ренальних ефектів даларгіну.

Для з?ясування причетності натрійуретичного гормону (фактору) до ренальних ефектів даларгіну проведено експерименти, де спостерігали за змінами діяльності нирок до та після проведення об?ємної стимуляції шляхом внутрішньовенного введення 0,9% розчину натрію хлориду в об?ємі 3% від маси тіла.

Рис.3. Вплив даларгіну на натрійуретичну активність плазми крові у щурів (ум/од/хв).

* – р<0,05 по відношенню до відповідного контролю.

Виявлено, що після багаторазового застосування даларгіну має місце зростання натрійуретичної активності плазми крові тварин як до об?ємної стимуляції (у 1,5 раза, р<0,05), так і, більшою мірою, після збільшення об’єму позаклітинної рідини (у 2,2 раза, р<0,05) при гіпергідратації. Збільшення натрійуретичної активності плазми крові узгоджується із змінами ниркової екскреції йонів натрію під впливом препарату.

Отже, даларгін підсилює натрійуретичну активність плазми крові і сприяє продукції (чи активації) натрійуретичного гормону (фактору).

На тлі підвищеного рівня мінералокортикоїдів (модель гіперальдостеронізму) мало місце нівелювання діуретичного та натрійуретичного ефектів даларгіну – зниження у 1,8 раза (р<0,01) об?єму виділеної сечі , та у 12,9 раза (р<0,01) екскреції йонів натрію при порівнянні з контролем.

На тлі блокади дії мінералокортикоїдів спіронолактоном діурез під впливом препарату зростав – у 1,5 раза (р<0,002) вище контрольних значень і був у 1,2 раза вищим порівняно із дією спіронолактону (р<0,01). Екскреція йонів натрію перевищувала дані контрольної групи в 2,1 раза (р<0,01).

Дослідження ренальних ефектів даларгіну на тлі пригнічення активності ренін-ангіотензин-альдостеронової системи еналаприлом виявило властиве препарату зростання сечовиділення в 1,2 раза (р<0,05) із збільшенням швидкості клубочкової фільтрації в 1,4 раза (р<0,05). Посилення натрійурезу більш ніж у 2 рази (р<0,05) відбувалося за рахунок пригнічення як дистального (у 2,6 раза, р<0,001), так і проксимального (у ,9 раза, р<0,01) транспорту йонів натрію.

Блокада синтезу простагландинів індометацином не перешкоджала діуретичному та натрійуретичному ефектам препарату. Об?єм виділеної сечі перевищував показники контролю в 1,4 раза (р<0,02), екскреція йонів натрію була вище контрольних значень у 3,1 раза (р<0,05).

При дослідженні розподілу води у водних секторах організму після повторних (7 днів) введень даларгіну відмічено зниження об?єму загальної позаклітинної рідини за рахунок зниження у 1,2 раза об?єму інтерстиційного простору, що призвело до відповідного зростання (у 1,2 раза) об?єму внутрішньосудинного русла. Подразнення волюморецепторів при цьому збільшувало натрійуретичну активність плазми крові і, як наслідок, викликало посилення натрійурезу.

Даларгін зменшував депонування йонів натрію в тканинах печінки, серця, кишечника. Вміст йонів калію в цих органах, навпаки, дещо зростав. Гідратація органів суттєво не змінювалася, за винятком деякого збільшення вмісту води в стінці тонкої кишки.

Функціональний стан нирок тісно пов?язаний із системою фібринолізу. Дослідження впливу даларгіну на процеси тканинного фібринолізу показали (табл. 2), що препарат збільшував фібринолітичну активність сечі у 1,5 раза (р<0,001), за рахунок зростання ферментативного та неферментативного лізису фібрину. Сумарна фібринолітична активність зростала в печінці (у 1,7 раза, р<0,001) та нирках (переважно в кірковій речовині).

Таблиця 2.

Вплив даларгіну (0,5 мг/кг) на тканинну фібринолітичну активність
печінки, нирок та сечі у щурів (х±Sx, n=10)

Фібринолітична активність (Е440/мг/год) | Контроль | Даларгін | р

Печінка

Сумарна | 9,230,326 | 15,791,06 | 0,001

Неферментативна | 5,240,287 | 9,070,67 | 0,002

Ферментативна | 3,990,358 | 6,720,47 | 0,01

Кіркова речовина нирок

Сумарна | 8,320,233 | 9,71 0,48 | 0,05

Неферментативна | 4,200,197 | 5,020,28 | 0,05

Ферментативна | 4,120,111 | 4,660,29 | 0,05

Мозкова речовина нирок

Сумарна | 5,270,259 | 3,230,28 | р0,002

Неферментативна | 2,530,104 | 1,350,07 | р0,001

Ферментативна | 2,740,19 | 1,870,22 | р0,05

Сосочковий шар нирок

Сумарна | 5,560,302 | 6,460,61 | р0,05

Неферментативна | 2,900,144 | 3,100,41 | р0,05

Ферментативна | 2,660,246 | 3,360,47 | р0,05

Сеча

Сумарна | 0,1700,011 | 0,2610,017 | 0,01

Неферментативна | 0,0940,006 | 0,1380,012 | 0,02

Ферментативна | 0,0770,005 | 0,1210,084 | 0,001

Примітка: р – вірогідність показників відносно контролю.

Виявлено позитивну кореляційну залежність між збільшенням швидкості клубочкової фільтрації та зростанням сумарної фібринолітичної активності кіркової речовини нирок (r=0,8077, р<0,05), що свідчить про взаємозумовленість цих процесів.

Даларгін активує також протеолітичну активність плазми крові та сечі. Показники ферментативної деградації азоальбуміну та азоколагену плазми крові зростали у 1,3 рази (р0,02), азоказеїну – у 2,25 рази (р0,001) у порівнянні з контрольною групою тварин. Лізис азоальбуміну сечі підсилювався у 1,7 разів (р<0,001). Розпад азоальбуміну в печінці під впливом даларгіну зростав у 2,4 рази (р0,001), в кірковій речовині нирок – у 2,2 раза (р0,001), лізис азоказеїну в кірковій речовині нирок – в 1,75 разів (р0,01) перевищував показники контролю.

3. Ренальні ефекти даларгіну при гострій нирковій недостатності

Експериментальні дослідження проведено на моделі сулемової нефропатії в період олігуричної стадії гострої ниркової недостатності, яка характеризувалася значним зниженням діурезу, зростанням рівню креатиніну в плазмі крові та сечі, суттєвим зниженням клубочкової фільтрації, посиленням протеїнурії та втратами йонів натрію (табл. 3).

При використанні даларгіну як профілактичного засобу в оптимально ефективній дозі (0,5 мг/кг) за три доби до введення сулеми спостерігали зростання діурезу (в 1,6 раза, р<0,01) порівняно з аналогічним показником у тварин з нефропатією. Препарат попереджав різке зниження швидкості клубочкової фільтрації, яке мало місце при сулемовій інтоксикації. Рівень клубочкової фільтрації був у 1,4 раза (р<0,02) вищим показників при гострій нирковій недостатності. Даларгін запобігав зростанню концентрації креатиніну в плазмі крові, показники наближались до даних контролю. Попереднє введення даларгіну запобігало також надмірній протеїнурії, концентрація та екскреція білка із сечею знижувалися відповідно в 3,9p<0,001) та 2,5 раза (p<0,001) порівняно з сулемовою нефропатією. За даних умов зменшувалися також значні втрати йонів натрію з сечею. Концентрація йонів натрію в сечі знижувалась у 12,8 раза (p<0,001), натрійурез – у 8,3 раза (p<0,001) у порівнянні з відповідними показниками при сулемовій нефропатії.

Використання даларгіну з лікувальною метою, через 24 год після введення сулеми, на тлі гострої ниркової недостатності призвело до зниження концентрації креатиніну в плазмі крові (в 1,5 раза проти сулемової нефропатії, p<0,001). Даларгін стримував характерну для гострої ниркової недостатності протеїнурію – концентрація білка в сечі знижувалась у 1,3 раза (p<0,02), його екскреція – 1,5 раза (p<0,01) порівняно з групою нелікованих тварин.

Таблиця 3

Вплив даларгіну (0,5 мг/кг) на екскреторну функцію нирок

при сулемовій нефропатії (xSx)

Показники | Контроль,

(n=9) | Даларгін,

(n=9) | Сулема,

(n=6) | Даларгін + сулема,

(n=6) | Сулема + даларгін,

(n=6)

Діурез, мл/2 год | 3,260,15 | 4,040,22

p1<0,02 | 1,190,05 p1<0,001 | 1,870,12 p1<0,001 | p2<0,001

p3<0,01 | 1,050,09 p1<0,001 | p2<0,001

p3>0,05

Концентрація креатиніну в плазмі, мкмоль/л | 75,007,21 | 43,904,34

p1<0,001 | 121,331,52 p1<0,002 | 90,172,18 p1>0,05 | p2<0,001

p3<0,001 | 83,003,21 p1>0,05 | p2>0,05

p3<0,001

Клубочкова фільтрація, мкл/хв | 315,9726,62 | 745,2579,35

p1<0,002 | 162,494,93 p1<0,01 | 224,3816,32 p1<0,05 | p2<0,002

p3<0,02 | 178,5614,19 p1<0,02 | p2<0,001

p3<0,05

Концентрація білка в сечі, мг/л | 0,090,01 | 0,020,002

p1<0,001 | 0,5440,014 p1<0,001 | 0,1400,005 p1<0,01 | p2<0,001

p3<0,001 | 0,4220,033 p1<0,001 | p2<0,001

p3<0,02

Екскреція білка, мг/2 год | 0,290,02 | 0,070,01 p1<0,001 | 0,6440,021 p1<0,001 | 0,2600,016 p1>0,05 | p2<0,02

p3<0,001 | 0,4370,038 p1<0,02 | p2<0,001

p3<0,01

Екскреція білка, мг/100 мкл клубочкового фільтрату | 0,100,01 | 0,010,001 p1<0,001 | 0,3960,003 p1<0,001 | 0,1170,005 p1>0,05 | p2<0,001

p3<0,001 | 0,2540,021 p1<0,002 | p2<0,001

p3<0,002

Екскреція Na+, мкмоль/2 год | 2,160,43 | 2,650,20 | 19,131,42

p1<0,001 | 2,300,19 p1>0,05 | p2>0,05

p3<0,001 | 10,250,82 p1<0,001 | p2<0,001

p3<0,01

Фільтрована фракція Na+, мкмоль/хв | 44,133,43 | 110,5416,67

p1<0,002 | 22,500,97 p1<0,01 | 31,202,20 p1<0,05 | p2<0,01

p3<0,02 | 25,743,19 p1<0,02 | p2<0,01

p3>0,05

Реабсорбована фракція Na+, мкмоль/ хв | 44,113,74 | 110,5216,16

p1<0,002 | 22,350,96 p1<0,01 | 31,192,20 p1<0,05 | p2<0,01

p3<0,02 | 25,663,19 p1<0,02 | p2<0,001

p3>0,05

Дистальний транспорт Na+, мкмоль/2 год | 453,7621,70 | 592,5035,59 p1<0,02 | 145,337,25 p1<0,001 | 257,1315,90 p1<0,001 | p2<0,001

p3<0,002, | 141,5111,90

p1<0,001 | p2<0,001

p3>0,05

Проксимальний транспорт Na+,

мкмоль/2 год | 4,840,45 | 12,671,51 p1<0,002 | 2,540,11 p1<0,01 | 3,480,25 p1<0,05 | p2<0,002

p3<0,02 | 2,940,37

p1<0,05 | p2<0,002

p3>0,05

Екскреція Na+, мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату | 0,720,12 | 0,400,05

p1<0,05 | 11,750,77

p1<0,001 | 1,030,08 p1>0,05 | p2<0,002

p3<0,001 | 6,180,92 p1<0,01 | p2<0,002

p3<0,01

Примітки: 1. p1 – показник вірогідності порівняно з контролем.

2. p2 – показник вірогідності порівняно з даларгіном.

3. p3 – показник вірогідності порівняно з сулемою.

Введення препарату при сулемовій нефропатії відновлювало процеси реабсорбції в канальцях нирок і запобігало надмірній втраті йонів натрію. Концентрація йонів натрію у сечі зменшувалася в 1,6 раза (p<0,01), а їх екскреція – у 1,9 раза (p<0,01) порівняно з аналогічними показниками при нефропатії.

Таким чином, застосування даларгіну з профілактичною та лікувальною метою при експериментальній гострій нирковій недостатності запобігає порушенням та призводить до нормалізації показників функціональної діяльності нирок.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено комплексне дослідження характеру та механізмів ренальних ефектів синтетичного аналога опіоїдного пептиду лей-енкефаліну даларгіну, здійснено нове вирішення наукової задачі, що визначається експериментальним обґрунтуванням доцільності застосування даларгіну як нефропротекторного засобу при порушенні діяльності нирок.

1. Одноразове та повторні (7 днів) внутрішньоочеревинні введення даларгіну викликають у щурів помірну діуретичну та меншою мірою салуретичну дію, виразність якої залежить від дози препарату, тривалості його застосування та ступеню гідратації організму. Даларгін у оптимально ефективній дозі (0,5 мг/кг) за умов модельованої гіпергідратації організму збільшує об'єм виділеної сечі в 1,2 раза (р<0,05), переважно за рахунок зростання швидкості клубочкової фільтрації (в 2,4 раза, р<0,002).

2. Курсове (7 днів) застосування даларгіну (0,5 мг/кг) у щурів підсилює спонтанний діурез у 1,4 раза (р<0,05), збільшує екскрецію йонів натрію в 1,7 раза (р<0,05), йонів калію – в 2,5 раза (р<0,05).

3. Даларгін, не порушуючи фізіологічної структури хроноритмів йонорегулювальної та екскреторної функцій нирок, найбільш помітно впливає на їх діяльність у вечірньо-нічний період (2000–400 год). Показники діурезу в цей час зростають у 1,3 раза (р<0,05), швидкість клубочкової фільтрації – у 1,3 – 1,4 раза (р<0,05), екскреція йонів натрію – у 2,6–3,8 раза (р<0,05).

4. Ренальні ефекти даларгіну посилюються за умов пригнічення активності ренін-ангіотензин-альдостеронової системи (еналаприл, 10 мг/кг) – діурез збільшується в 1,2 раза (р<0,05), натрійурез – в 2,2 раза (р<0,05), а також на тлі блокади синтезу ейкозаноїдів (індометацин, 5 мг/кг) – діуретична дія зростає в 1,4 раза (р<0,02), натрійуретична – в 3,1 раза (р<0,05). Даларгін активує волюморегулюючу функцію нирок, підвищує натрійуретичну активність плазми крові у 2,2 раза (р<0,05). При застосуванні мінералокортикоїдів (ДОКСА, 10 мг/кг) ренальні ефекти препарату пригнічуються, що проявляється зменшенням діурезу в 1,8 раза (р<0,01), натрійурезу – в 12,9 раза (р<0,01), антагоніст мінералокортикоїдів спіронолактон (20 мг/кг) підсилює сечогінний ефект даларгіну – діурез зростає у 1,5 раза (р<0,002).

5. Даларгін (0,5 мг/кг) за умов тривалого (7 днів) введення зменшує депонування йонів натрію в тканинах печінки, серця (у 1,3 і 1,2 раза відповідно, р<0,05), тонкої кишки (у 1,6 раза, р<0,05), дещо збільшує вміст йонів калію в тканинах нирок, серця, тонкої та товстої кишки. Препарат не змінює вміст води у досліджуваних органах.

6. Даларгін активує фібринолітичну та протеолітичну активність плазми крові, сечі, а також тканин печінки та нирок (переважно кіркового шару). Після курсового застосування даларгіну сумарна фібринолітична активність сечі зростає у 1,5 раза (р<0,01), печінки – у 1,7 раза (р<0,001), кіркової речовини нирок – у 1,2 раза (р<0,05). Має місце прямий кореляційний зв'язок між зростанням швидкості клубочкової фільтрації та посиленням сумарної фібринолітичної активності кіркової речовини нирок під впливом даларгіну (r=0,8077, p<0,05).

7. Профілактичне введення даларгіну в оптимально ефективній дозі 0,5 мг/кг при експериментальній гострій нирковій недостатності запобігає порушенням процесів клубочкової фільтрації та канальцевої реабсорбції. Швидкість клубочкової фільтрації зростає у 1,4 раза (р<0,02), зменшується екскреція білку з сечею (у 2,5 раза, р<0,001), нормалізуються процеси реабсорбції іонів натрію порівняно з тваринами із сулемовою нефропатією. Застосування даларгіну через добу після виникнення експериментальної гострої ниркової недостатності зменшує концентрацію креатиніну в плазмі крові в 1,5 раза (р<0,001), обмежує протеїнурію та запобігає втратам іонів натрію з сечею.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.