УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

КАССІЧ ВОЛОДИМИР ЮРІЙОВИЧ

УДК: 619:615.98.579.873.21.083

МІНЛИВІСТЬ МІКОБАКТЕРІЙ, ЕПІЗООТОЛОГІЧНИЙ МОНІТОРИНГ, ЗАХОДИ І ЗАСОБИ БОРОТЬБИ З ТУБЕРКУЛЬОЗОМ ТВАРИН В УМОВАХ РАДІАЦІЙНОГО ВПЛИВУ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Харків – 2004 р.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

Науковий консультант доктор ветеринарних наук, професор, заслужений діяч науки Російської Федерації

Овдієнко Микола Павлович,

Всеросійський інститут експериментальної ветеринарії Російської академії сільськогосподарських наук, провідний науковий співробітник лабораторії мікобактеріозів

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН, заслужений діяч науки і техніки України, лауреат Державної премії України Романенко Володимир Пилипович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії імунології і генетики;

доктор ветеринарних наук, професор Буряк Євген Іванович, Одеський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики, завідувач кафедри мікробіології і вірусології;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Мандигра Микола Станіславович, Інститут епізоотології УААН, директор.

Провідна установа:

Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України (кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології).

Захист відбудеться “9” грудня 2004 р. о 9 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “8”листопада 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор А.Ф.Бабкін

1

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед інфекційних хвороб сільськогосподарських тварин особливе місце належить туберкульозу. Туберкульоз людей і тварин є найбільш розповсюдженою у світі інфекцією (від 0,002у США до 52у Перу) (Бернін Р.Е. зі співавт., 1992; Ткаченко О.А. зі співавт., 1999, 2004; Косенко В.М. зі співавт., 2000). Серед домашніх тварин найчастіше хворіє велика рогата худоба (ВРХ).

Економічні збитки від туберкульозу худоби складаються з втрат за рахунок зниження продуктивності, передчасного або необґрунтованого забою тварин, утилізації туш, а також за рахунок витрат на оздоровлення скотарських ферм. В Україні в умовах тривалого неблагополуччя з туберкульозу економічні збитки на хвору тварину становлять 585,9 грн. (Ткаченко О.А. зі співавт.,1999).

Оздоровлення тваринництва від туберкульозу має важливе епідеміологічне значення, оскільки хворі тварини можуть бути джерелом інфекції для людей (Бакулов І.А. зі співавт.,1979; Кузін О.І.,1987; Романенко В.П. зі співавт., 1997, 2001, 2003, 2004 та ін.). У різних країнах від хворих на туберкульоз людей M.bovis виділяють у 4,3 - 26,5 % випадків (Благодарний Я.А.,1972).

Основним методом прижиттєвої діагностики туберкульозу тварин є алергічні, а посмертної – патологоанатомічні та бактеріологічні дослідження (Буряк Є.І., 1986, 1992; Лисенко О.П., 1994; Донченко О.С., 1997; Найманов А.Х., 1999, 2000, 2002; Ощепков В. Г., 1999, 2000; Овдієнко М.П. зі співавт., 1999, 2000, 2002; Кассіч Ю.Я. зі співавт., 1990, 2000, 2002, 2003).

Особливе значення алергічних проб для діагностики туберкульозу визначається їх високою специфічністю (Вишелєсській С.Н., 1937; Вишневський П.П., 1937; Юсковець М.К., 1965; Ротов В.І. зі співавт., 1978; Овдієнко М.П. зі співавт., 2002; Кассіч Ю.Я. зі співавт., 2003, 2004).

Проте, реакції на туберкулін під час проведення алергічних досліджень на туберкульоз виникають і при сенсибілізації худоби атиповими мікобактеріями (Мартма О.В. зі співавт., 1982, 1987; Шаров О.М. зі співавт., 1990, 1999 та ін.), мікроорганізмами, що належать до родів Corynеbacterіum (Лазовська А.Л., 1999), Nocardia та Rodococc (Нуратінов Р.А., 1998, 2001) або при впливі на організм тварин різних несприятливих факторів, зокрема білкової перегодівлі, згодовуванні сечовини, септичних процесах, інвазуванні гельмінтами (Кокуричев П.І., 1969; Федюшин В.П. з співав.,1952; Буряк Є.І.,1968; Поддубський І.І.,1970, Газарх З.С. зі співавт., 1972 та ін.).

Однією з причин прояву неспецифічних реакцій може бути аутосенсибілізація продуктами розпаду власних тканин організму, що особливо виражено при променевому ураженні. Іонізуюча радіація впливає як на прояв туберкулінової чутливості, так і на перебіг туберкульозу та

2

аутоімунні процеси в організмі (Клемпарська Н.Н. зі співавт., 1958, 1978, 1985; Карташов П.О. зі співавт.,1978 та ін.).

Широке застосування ядерної енергії в народному господарстві має велике значення для розвитку вітчизняної економіки. Проте недбале її виробництво призводить до забруднення довкілля продуктами ядерних реакцій. У результаті аварії на Чорнобильській АЕС більше 144 тис. гектарів сільськогосподарських угідь зазнало радіоактивного забруднення (Пасієшвілі Л.М., 1997). Значне поголів’я сільськогосподарських тварин, у тому числі хворих на туберкульоз або сенсибілізованих атиповими мікобактеріями, утримується на забруднених територіях. У цих умовах великого значення набувають вивчення особливостей епізоотичного та інфекційного процесів при туберкульозі, механізмів біологічної дії іонізуючих випромінювань різної інтенсивності на організм тварин і на збудника хвороби, оптимізація заходів боротьби і розробка ефективних та специфічних засобів діагностики туберкульозу тварин в умовах впливу іонізуючої радіації, що визначає актуальність роботи.

У відповідності з листом № 15-9/351 голови Державного департаменту ветеринарної медицини України від 22.09.97 в ІЕКВМ УААН проведено епізоотологічний моніторинг туберкульозу ВРХ на забруднених радіонуклідами територіях та вивчення впливу іонізуючої радіації на збудника хвороби, інфекційний і епізоотичний процеси при туберкульозі тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною досліджень, передбачених тематичним планом ІЕКВМ УААН на 1991-1995 роки за темою: "Розробити ефективні методи профілактики та діагностики для створення екологічно безпечної системи боротьби з туберкульозом сільськогосподарських тварин", номер державної реєстрації UА 01009825 Р; на 1996-2000 роки за темою: "Визначити особливості патогенезу туберкульозу у тварин, уражених мікобактеріями різної біологічної активності", номер державної реєстрації 0197U000755; на 2001-2005 роки за темою: "Розробити систему заходів боротьби з туберкульозом сільськогосподарських тварин в умовах реформування тваринництва", номер державної реєстрації 0101U001615.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення характеру мінливості мікобактерій та її механізмів в умовах радіаційного впливу, здійснення епізоотологічного моніторингу і оптимізація заходів боротьби з туберкульозом ВРХ на радіоактивно забруднених територіях України, теоретичне обґрунтування, розробка нових та удосконалення існуючих засобів бактеріологічної і алергічної діагностики туберкульозу тварин.

3

Для досягнення мети поставлені такі задачі: –

провести аналіз культур збудника туберкульозу та атипових мікобактерій, виділених від тварин у господарствах України до та після Чорнобильської аварії;–

вивчити мінливість збудника туберкульозу і атипових мікобактерій в умовах впливу на них різних доз іонізуючої радіації. Теоретично обґрунтувати та визначити можливість використання феномену прискорення росту мікобактерій під впливом стимулюючого опромінювання при діагностиці туберкульозу; –

вивчити механізм дії стимулюючих доз іонізуючих випромінювань на мікобактерії. Відпрацювати оптимальні діапазони стимулюючих та стерилізучих доз радіаційного впливу на мікобактерії;–

вивчити морфологічні зміни при туберкульозі в органах експериментально опромінених тварин; –

теоретично обґрунтувати та визначити можливість використання опромінення тварин сублетальними дозами гамма-променів для прискорення біологічного дослідження на туберкульоз;–

вивчити стан епізоотичної ситуації з туберкульозу великої рогатої худоби на радіоактивно забруднених територіях у порівнянні з незабрудненими регіонами та оптимізувати заходи боротьби з хворобою;–

удосконалити існуючі та розробити нові живильні середовища і алергени для бактеріологічної і алергічної діагностики туберкульозу тварин.

Об’єкт дослідження: туберкульоз тварин в умовах радіаційного впливу: мікобактерії – збудники туберкульозу та атипові, інфекційний і епізоотичний процес, заходи і засоби боротьби з хворобою.

Предмет дослідження: мінливість мікобактерій, зумовлені ними інфекційний і епізоотичний процеси в умовах впливу іонізуючої радіації; заходи боротьби з туберкульозом великої рогатої худоби на територіях, що зазнали радіоактивного забруднення, живильні середовища і алергени для бактеріологічної і алергічної діагностики туберкульозу тварин.

Методи досліджень. Роботу виконували із застосуванням епізоотологічного, клінічного, алергічного, патологоанатомічного, гістологічного, бактеріологічного, електронномікроскопічного, цитохімічного, біохімічного, гематологічного, радіологічного та статистичного методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено моніторинг виділення та порівняльний аналіз культур збудників туберкульозу і атипових мікобактерій у господарствах України до та після

4

Чорнобильської аварії. Визначено, що за 10 років після аварії на ЧАЕС у порівнянні з попереднім десятиріччям при дослідженні патологічного матеріалу від реагуючої на туберкулін великої рогатої худоби у 1,5 раза зросла загальна кількість виділених культур мікобактерій (9254 та 14142 культур, відповідно) та у 9,5 раза збільшилась кількість культур атипових мікобактерій (1003 та 9480, відповідно). За цей період удвічі зменшилась кількість виділених культур M.bovis (7519 та 3825, відповідно) і M.tuberculosis (60 та 31, відповідно).

Уперше вивчено особливості біологічних і біохімічних властивостей та мінливість збудника туберкульозу і атипових мікобактерій в умовах впливу іонізуючої радіації. Визначено, що дози гамма-опромінювання у діапазоні 25-250 Р (0,00645-0,0645 Кл/кг) прискорюють ріст на живильних середовищах не тільки референтних штамів, але й польових ізолятів збудників туберкульозу в 3-4 рази. Встановлено, що механізм стимулюючої дії малих доз гамма-випромінення пов’язаний з прискоренням метаболізму мікобактерій у ланці перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), а саме з підвищенням антиокислювальної активності (АОА) та вмісту гідроперекисів ліпідів. Ефект прискорення росту мікобактерій під впливом опромінювання є тимчасовим проявом фенотипової мінливості. Оптимізовано діапазони стимулюючої (0,00645-0,0645 Кл/кг) та стерилізуючої (154,8 Кл/кг і вище) дії гамма-променів на мікобактерії. Стимулюючий ефект опромінювання використано для прискорення бактеріологічного дослідження на туберкульоз. Стерилізуючий ефект радіації використано для удосконалення способу девіталізації мікобактерій.

Вивчено особливості епізоотичного та інфекційного процесів при туберкульозі тварин в умовах радіаційного впливу. Імуносупресорну та аутосенсибілізуючу дію іонізуючої радіації на організм тварин використано для прискорення біологічного дослідження на туберкульоз та розробки способу диференціації псевдоалергічних реакцій на туберкулін.

Проведено епізоотологічний моніторинг туберкульозу великої рогатої худоби (ВРХ) на радіоактивно забруднених після аварії на Чорнобильській АЕС територіях України. Визначено, що і у цих регіонах реалізація заходів, передбачених чинними нормативними документами, забезпечує профілактику хвороби, встановлення діагнозу та ліквідацію в господарствах захворювання худоби на туберкульоз.

Розроблено живильне середовище для прискореного культивування мікобактерій, використання якого забезпечує прискорення росту культур M.bovis на 5-12 діб у порівнянні з базовим середовищем.

Визначено, що контроль активності ППД-туберкуліну для ссавців можна проводити на здоровій худобі, щепленій культурою БЦЖ.

Вперше в Україні розроблена технологія виготовлення, нормативна документація та впроваджені у виробництво вітчизняні препарати для алергічної діагностики туберкульозу тварин.

Новизна виконаної роботи підтверджена 12 патентами на винахід.

5

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені та впроваджені у виробництво методичні рекомендації: "Вплив іонізуючого випромінювання на стан епізоотичної ситуації по туберкульозу великої рогатої худоби в господарствах України", ухвалені рішенням Науково-методичної ради Державного департаменту ветеринарної медицини України від 19.12.2002 року.

Запропоновано способи прискорення культурального і біологічного досліджень на туберкульоз, спосіб радіаційної стерилізації культур мікобактерій та спосіб диференціації псевдоалергічних реакцій на туберкулін.

Розроблені та впроваджені у виробництво нові та удосконалені існуючі засоби алергічної і бактеріологічної діагностики туберкульозу та пакети нормативної документації: "Туберкулін очищений (ППД) для ссавців у стандартному розчині", ТУУ 24.4.00497087.645-2001; "Алерген сухий очищений із атипових мікобактерій (ААМ)", ТУУ 24.4-0049087-697-2003; "Розчинник мікобактеріальних алергенів", ТУУ 24.4.00497087-698-2003; Зміни № 1 і № 2 до ТУУ 46.15.063.95 "Сухе живильне середовище для культивування мікобактерій".

Особистий внесок здобувача полягає у створенні наукової концепції роботи. Особисто обґрунтовано і сформовано плани і робочі програми наукових досліджень, методи та схеми проведення дослідів із вивчення радіаційного впливу на збудника та перебіг туберкульозу в тварин. Особисто виконано і проаналізовано весь обсяг мікробіологічних та епізоотологічних досліджень на туберкульоз. Організовано та проведено радіобіологічні, електронномікроскопічні, біохімічні та гістологічні дослідження опромінених мікобактерій та тварин.

На основі патентного пошуку, літературних даних і власних досліджень вивчено механізм стимулюючої дії гамма-променів на мікобактерії.

На основі порівняльного вивчення епізоотичної ситуації з туберкульозу ВРХ у забруднених радіонуклідами та “чистих” областях України оптимізовано заходи боротьби з туберкульозом тварин та необхідність розробки вітчизняних препаратів для його діагностики.

Проведені експериментальні дослідження, розроблена нормативна документація та впроваджені у виробництво препарати для бактеріологічної і алергічної діагностики туберкульозу. Одержані результати узагальнені. Сформульовані висновки та практичні рекомендації. За результатами проведеної роботи одержано 1 двадцятирічний та 11 деклараційних патентів України на винаходи (у тому числі 5 одноосібно).

Розроблені та затверджені на Науково-методичній раді Державного департаменту ветеринарної медицини України від 19.12.2002 року рекомендації щодо боротьби з туберкульозом на радіоактивно забруднених територіях: "Вплив іонізуючого випромінювання на стан епізоотичної ситуації по туберкульозу великої рогатої худоби в господарствах України".

6

Біохімічні дослідження проведені за участю співробітника відділу біофізики мембран Інституту біології Харківського національного університету (ХНУ) к.б.н. Ю.В.Нікітченко; електронномікроскопічні дослідження проведені на базі Інституту невідкладної хірургії (м. Харків) за

участю к.б.н. В.П.Нєвзорова. Опромінення тварин і мікроорганізмів та радіологічні дослідження проведені на базі Інституту медичної радіології (м. Харків) та Харківського національного університету спільно зі співробітниками цих установ А.М.Куровим та кандидатом фізико-математичних наук О.Т.Ніконовим. Імунологічні дослідження опромінених тварин виконані спільно з кандидатом медичних наук, старшим науковим співробітником НД ІМВС ім. І.І.Мєчнікова (м. Харків) С.В.Брусник. Гістологічні дослідження виконані у лабораторії патоморфології ІЕКВМ УААН під керівництвом академіка УААН  Г.А.Краснікова. Розробка та впровадження у виробництво препаратів для культуральної і алергічної діагностики туберкульозу проводилась спільно зі співробітниками лабораторії вивчення туберкульозу ІЕКВМ УААН та Сумської біологічної фабрики, а також із фахівцями Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ), Державної центральної лабораторії ветеринарної медицини (ДЦЛВМ), Державного департаменту ветеринарної медицини (ДДВМ), що знайшло відображення у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації викладені на звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН та конференціях різного рівня: "Общая эпизоотология: иммунологические, экономические и методологические проблемы" (Харків, 1995 р.); Advanced school on : Walls of Mycobacteria and tuberculosis (Kiev, Ukraine, 1995); "Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми" (Харків, 1997 р.); "До сторіччя від дня народження академіка УАСГН Гжицького С.З." (Львів, 1999 р.); "Інфекційна патологія молодняку сільськогосподарських тварин і птиці" (Суми, 1999 р.); "Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки" (Харків, 1999 р.); Совещании руководителей ветеринарных научно-исследовательских институтов и лабораторий государств-участников СНГ (Харків, 2000 р.); "Проблемы инфекционной патологии животных", присвяченій 70-річчю від дня народження члена-кореспондента УААН та РАСГН Собка А. І. (Крим, 2001 р.); конференції, присвяченій 150-річчю від дня заснування ХЗВІ (Харків, 2001 р.); міжнародній науково-практичній конференції "ІЕКВМ – 80 років на передовому рубежі ветеринарної науки" (Харків, 2002 р.); міжнародній науково-практичній конференції "Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного ведения животноводства" (АР Крым, май-июнь 2003   г.); "Міжнародній науково-практичній конференції по проблемам епізоотології та інфекційних хвороб тварин" (Одеса, травень 2003 р.); международной научно-практической конференции "Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза

7

животных" (Москва, 2003 г.); міжнародній, науково-практичній конференції – “Ветеринарна медицина – 2004: Сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (травень 2004 р., АР Крим).

Публікації. Основні положення дисертації викладено в 53 друкованих роботах, у тому числі 29 статтях (20 одноосібно), що опубліковані у фахових наукових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, 4 зарубіжних виданнях, 8 матеріалах і тезах конференцій та Advanced school, а також у 12 патентах.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 299 сторінках комп'ютерного тексту, містить вступ, огляд літератури і вибір напрямків досліджень, матеріали і методи досліджень, результати досліджень, узагальнення результатів досліджень та їх аналіз, висновки та практичні пропозиції (6 сторінок), список використаних джерел (924 джерела, у тому числі 202 іноземних авторів) та додатки. Робота ілюстрована 35 таблицями та 25 рисунками.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Робота виконувалась протягом 1994-2003 років у лабораторії вивчення туберкульозу тварин ІЕКВМ УААН, Сумській біологічній фабриці, інших установах та тваринницьких господарствах України.

Матеріалом для досліджень були опромінені і неопромінені лабораторні та сільськогосподарські тварини, яких утримували в умовах ізоляторів ІЕКВМ і Сумської біологічної фабрики (понад 100 голів морських свинок і 6 голів ВРХ) та мікобактерії різних видів: 4 референтні штами M.bovis (BCG, Valle, “Bovinus №8”, "M.bovis ІЕКВМ-1") та 9 польових ізолятів; M.tuberculosis, штам H37RV; M.avium, штами: Avium-780, M.avium № 631, M.avium № 15, M.avium-К, M.avium ІЕКВМ УААН; атипові мікобактерії: M.kanzasii, M.gordone, M.scrofulaceum (штам 31/82), M.intracellulare (штам 78/98), М.fortuitum та патологічний матеріал від хворих на туберкульоз лабораторних тварин і ВРХ. Досліджено також склад і ростові властивості живильних середовищ для культивування мікобактерій та мікобактеріальні алергени (ППД-туберкулін для ссавців, алерген з атипових мікобактерій), які розроблялись у лабораторних, а виготовлялись в умовах промислового біологічного виробництва.

У радіоактивно забрудненій після аварії на ЧАЕС зоні сумарна поглинута ВРХ доза зовнішнього та внутрішнього опромінення коливається у межах від 5,69 до 224,78-364,83 рад (Мандигра М.С. зі співавт., 1993). Тому

для моделювання означених дозових навантажень у лабораторних тварин використовували загальне гамма-опромінювання в дозах 0,00258-0,0645 Кл/кг (10-250 Р). Мікобактерії опромінювали дозами від 10 Р до 1 млн.Р. (0, 00258-258 Кл/кг) з метою оптимізації діапазонів стимулюючих та стерилізуючих доз.

8

Дослідних тварин і мікобактерії піддавали опроміненню за допомогою гамма-випромінювачів РОКУС (джерело випромінювання 60Со, Р=0,0138-0,72 Гр/с), “Исследователь” (джерело випромінювання 60Со, Р=2 Гр/c, 2 Гр/год., 4 Гр/хв.), або за допомогою рентгенівського апарату РУМ-17. Контролем були неопромінені культури мікобактерій та тварини. Досліди з опромінення мікроорганізмів проводили у 3-9 повторностях, а на тваринах – у 3-х повторностях.

Аналіз кількості та співвідношення виділених за період з 1976 по 2003 роки культур M.bovis, M.tuberculosis, M.avium і атипових мікобактерій та епізоотологічний моніторинг туберкульозу худоби в радіоактивно забруднених регіонах України проводили за матеріалами звітності Державного департаменту та Державної центральної лабораторії ветеринарної медицини з застосуванням методу ретроспективного епізоотологічного аналізу та статистичних методів.

У роботі використовували бактеріологічні (тінкторіальний, культуральний, біологічний), електронномікроскопічний, біохімічний та цитохімічний методи досліджень. З використанням вказаних методів розробляли живильні середовища для прискореного культивування мікобактерій.

При роботі з опроміненими тваринами та розробці способів прискорення бактеріологічного (біологічного і культурального) дослідження на туберкульоз та диференціації псевдоалергічних реакцій застосовували клінічний, гематологічний, гістологічний та імунологічний методи. Особливу увагу приділяли алергічному методу діагностики туберкульозу та розробці вітчизняних алергенів для його проведення.

Радіологічні дослідження проводили на базі Інституту медичної радіології (м.Харків) та Харківського національного університету (ХНУ).

Електронномікроскопічні дослідження виконували на базі Інституту невідкладної хірургії (м.Харків). Ультратонкі зрізи препаратів з опромінених мікобактерій готували на ультрамікротомі УМТП-6 та після контрастування цитратом свинцю вивчали їх під електронним мікроскопом ЕМВ-100 БР із прискорюючою напругою 75 кВт. Збільшення добирали адекватно до мети досліджень.

Біохімічні механізми метаболізму опромінених стимулюючими дозами радіації мікроорганізмів та стан системи перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) вивчали на базі Інституту біології ХНУ. Бактеріальну масу мікобактерій піддавали опроміненню стимулюючою дозою гамма-променів 0,0387 Кл/кг (150 Р) на випромінювачі РОКУС (Р=0,72 Гр/с). Перед проведенням досліджень бактеріальну масу руйнували ультразвуком на диспергаторі УЗДН–А. Надалі з неї готували ліпідні екстракти мембран та розчинних фракцій ліпідів методом хлороформметанолової екстракції з подальшим центрифугуванням та диспергуванням на хлороформ- та воднометанолову фракції. В одержаних препаратах методом хемілюмінесценції визначали вміст гідроперекисів ліпідів (за методикою

9

Асакава); загальну антиокислювальну активність (АОА) за методикою Владімірова; каталазну (за Марклунгом), супероксиддисмутазну (за Фредовичем) та глютатіонпероксидазну активність (Владіміров Ю.А., 1972, 1980; Герасимов Ф.М. зі співавт., 1976; Sies H. et al.,1978; Zakovski I.I. et al.,1978; Ohcava H. еt al., 1979; Asakawa Т. et al., 1980; Kraus P. et al., 1980; Чевари С. зі співавт., 1985).

В опромінених тварин при патологоанатомічних дослідженнях згідно з методичними вказівками, розробленими  Г.А. Красніковим  зі співавт. (1982, 1985), визначали індекси маси органів. Відібраний для гістологічних досліджень патологічний матеріал консервували 10 % розчином нейтрального формаліну протягом 10 діб і далі обробляли за загальноприйнятою схемою.

Дослідження пофарбованих гематоксилін-еозином гістологічних зрізів проводили в імерсійній системі світлового мікроскопу Jenaval. Фотографування препаратів робили за допомогою фотонасадки МФН-10 УЧ.2.

Методи, що застосовували для оцінки епізоотичної ситуації з туберкульозу ВРХ в умовах радіаційного забруднення території, складались з порівняльного аналізу епізоотичної обстановки на радіоактивно забруднених та "чистих" територіях ("територіальний" аналіз) та аналізу епізоотичної ситуації з туберкульозу ВРХ у радіоактивно забруднених областях за 10 років до та 10-15 років після Чорнобильської аварії ("темпоральний" аналіз). Матеріали ветеринарної звітності, одержані у Державному департаменті ветеринарної медицини, дозволили розрахувати такі показники як “захворюваність тварин на туберкульоз”, тобто відношення реагуючих на туберкулін тварин до загальної кількості сприйнятливої до туберкульозу ВРХ по країні (Бакулов А.І. зі співавт., 1979, 1994; Макаров В.В. 2000) та число неблагополучних щодо туберкульозу ВРХ господарств.

Особливу увагу приділяли визначенню ступеня забруднення різних областей. У роботі використані матеріали Українського наукового центру радіаційної медицини АМН України “Матеріали дозиметричної паспортизації населених пунктів України” (1993). Середні показники сумарної радіаційної забрудненості та захворюваності ВРХ на туберкульоз в областях розраховували на основі даних за окремими населеними пунктами та порівнювали одержані результати в радіоактивно забруднених і вільних від радіонуклідів регіонах. Дозу вірогідного внутрішнього опромінення розраховували на базі середнього значення концентрації радіоізотопів у кормах. За матеріалами дозиметричної паспортизації для оцінки ступеня радіоактивного забруднення території розраховували середні величини радіоактивного забруднення найбільш потерпілих від наслідків Чорнобильської аварії районів (153 райони) 14 областей та 31 району трьох областей України з меншим рівнем забруднення. При радіобіологічних дослідженнях виміри радіоактивності проводили в загальноприйнятих радіаційних величинах.

10

Елективні живильні середовища для культивування мікобактерій виготовляли за загальноприйнятими методиками з додаванням біологічних добавок і факторів росту: Н-алканів, октадециламіну, сірчанокислого цинку, сироватки крові коня, картопляних екстрактів, гуматних солей.

При конструюванні вітчизняних препаратів для алергічної діагностики туберкульозу за основу взято розроблену в УНДІЕВ О.М.Говоровим та Ф.І.Осташком (1952, 1956) технологію виготовлення ППД-туберкуліну для ссавців, який дотепер вироблявся лише Курською біологічною фабрикою. Одержання та визначення специфічної активності деривату туберкулопротеїнів ППД-туберкуліну для ссавців і моноалергенів з атипових мікобактерій проводили за загальноприйнятими методиками (Seibert F.B., 1934, 1949; Ліннікова М.А., 1959; Фрадкін В.А., 1985, 1990, Шаров О.М. з співав., 1988, 1990, 2000). Згадані способи отримання, очистки, визначення активності, специфічності і стерильності туберкуліну використані при розробці технології, наукової документації та впроваджені у виробництво на підприємствах біологічної промисловості України препаратів для алергічної діагностики туберкульозу.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми "Statistica" для Windows. Оцінку вірогідності визначали за показниками Т-критерієв Ст'юдента-Фішера та методом Е.В.Монцевічуте-Ерінгене.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вплив іонізуючої радіації на мікобактерії

Моніторинг виділення культур мікобактерій у господарствах України після аварії на ЧАЕС. Першим етапом досліджень було вивчення впливу підвищеного радіаційного фону на збудника туберкульозу та атипові мікобактерії. Аналізом результатів бактеріологічних досліджень патологічного матеріалу від реагуючої на туберкулін ВРХ (за матеріалами звітності ДЦЛВМ України) встановлено, що за десятиріччя після Чорнобильської аварії виділення мікобактерій в Україні зросло і становило 14142 культури, у тому числі бичачого виду – 3825 культур, людського – 31, пташиного – 806; атипових мікобактерій – 9480 культур. У попереднє десятиріччя ці показники становили 9254, 7519, 60, 672, 1003, відповідно.

При порівнянні загальної кількості та співвідношення виділених культур мікобактерій за 10 років до та 10 років після Чорнобильської аварії визначено, що з 1986 по 1996 роки загальна кількість виділених культур зросла в 1,5 раза в порівнянні з попереднім десятиріччям (9254 та 14142 культур, відповідно). Кількість виділених культур M.bovis (7519 культур з 1976 по 1986 роки та 3825 – з 1986 по 1996 роки) та M.tuberculosis (60 та 31 культур, відповідно) зменшилась удвічі. Звертає на себе увагу значний ріст (майже у 9,5 раза) загального числа і співвідношення (67культур

11

атипових мікобактерій (з 1976 по 1986 роки виділено1003 культури, з 1986 по 1996 роки – 9480 культур).

Встановлено, що найбільше культур атипових мікобактерій виділено саме в радіоактивно забруднених регіонах (5644 культур або 58,8 % від загальної кількості 9480). Від тварин, які утримувались на території 17 радіоактивно забруднених областей, виділено також 2491 культури M.bovis, 28 культур M.tuberculosis, 574 культури M.avium. На території областей, що не зазнали радіоактивного забруднення (Луганській, Запорізькій, Львівській, Миколаївській, Одеській, Полтавській, Херсонській та АР Крим), за цей період виділено 1334 культур M.bovis, 3 культури M.tuberculosis, 333 культури M.avium та 3836 культур атипових мікобактерій.

Значне збільшення загальної кількості та співвідношення виділених культур атипових мікобактерій (у 9,5 разів) на фоні зменшення виділення збудників туберкульозу обумовило необхідність вивчення мінливості мікобактерій під впливом іонізуючої радіації в експериментальних умовах.

Морфологія та ультраструктура мікобактерій до і після опромінення. Методом електронної мікроскопії досліджено ультраструктуру мікобактерій різних видів. Особливу увагу приділяли вивченню морфологічних і функціональних змін мікроорганізмів, опромінених гамма-випромінюванням у дозах від 10 Р до 1 млн. Р (0,00258-258 Кл/кг), у порівнянні з неопроміненими.

При вивченні мікобактерій різних видів у препаратах з опромінених і неопромінених культур відзначали значний поліморфізм мікробних клітин. Більшість мікобактерій мали паличкоподібну, ледь вигнуту форму. Траплялись кокоподібні та веретеноподібні форми. На поверхні деяких клітин виявляли шар середньої електронної щільності, який визначали як мікрокапсулу. Під мікрокапсулою спостерігали осміофобний шар нерівномірної товщини – зовнішній шар клітинної стінки, під яким виявляли електроннощільний шар, що мав гомогенну структуру. Його було визначено як власно клітинну стінку. Внаслідок щільного контакту внутрішнього шару клітинної стінки та зовнішнього шару цитоплазматичної мембрани утворювалась єдина структура, помітна лише у окремих мікробних клітин.

Цитоплазма мікобактеріальних клітин була заповнена великою кількістю осміофільних гранул. Спостерігали різні за формою та розміром зерна (зерна Муха), мікрогранули та вакуолі. Окремі мікрогранули утворювали макрогранули, які досягали діаметра бактеріальних клітин, внаслідок чого спостерігали нерівну поверхню останніх.

Встановлено, що ультраструктура M.bovis та атипових-нефотохромогенних мікобактерій (M.intracellulare) після опромінення гамма-променями в дозах 0,00645-0,0645 Кл/кг (25-250 Р) не змінюються, проте у препаратах переважають мікробні клітини у процесі поділу (ізоморфного або брунькуванням).

Скотохромогенні мікобактерії (М.scrofulaceum) мають деякі морфо-функціональні особливості. У неопромінених культурах переважають

12

мікробні клітини характерної веретеноподібної форми. Після опромінення M.набувають сферичної або овоїдної форми та значної електронно-оптичної щільності цитоплазми (стають непроникливими для

електронного випромінювання), що визначає їх значну стійкість до дії іонізуючої радіації.

М.bovis та атипові мікобактерії, опромінені дозами 154,8 Кл/кг (600 тис. Р) і вище, зазнають дегенеративних змін, що призводить до припинення репродуктивної активності культур. Клітини мікобактерій при таких дозових навантаженнях втрачають чіткість обрису структурних елементів, цитоплазма набуває яскраво визначеної деструктивної зернистості (великі зерна). Відзначається частковий розпад клітинної стінки та цитоплазматичної мембрани. Клітини мікобактерій стають неструктурованими. Деякі клітини М.scrofulaceum набувають зміненої, нетипової форми. Помітні ущільнення цитоплазми з утворенням великогранулярних структур. Репродукуючі мікробні клітини в препаратах мікобактерій, опромінених високими дозами, відсутні.

Мінливість опромінених мікобактерій під впливом гамма-опромінювання. Бактеріологічними дослідженнями оптимізовано діапазони стимулюючих (прискорюють ріст культур на живильних середовищах у 3-4 рази: від 0,00645 до 0,0645 Кл/кг або 25-250 Р), толерантних (змін культуральних властивостей опромінених культур не спостерігається: від 0,077 до 20,54 Кл/кг або 0,3-80 тис. Р), пригнічуючих: 23,14-154,8 Кл/кг (90 тис.-500 тис. Р) та стерилізуючих: 154,8 Кл/кг (600 тис. Р) і вище щодо мікобактерій (збудників туберкульозу та атипових I, III та IV груп за Раніоном) доз гамма-радіації при потужності дози (Р) близько 2 Гр/с, що послужило основою для розробки способів прискореного культивування, радіаційної стерилізації та передпосівної обробки мікобактерій і патологічного матеріалу. За результатами попередніх досліджень вважали, що прискорення росту мікобактерій може бути досягнуто при опроміненні дозами 50-200 Р (Овдієнко М.П. зі співавт., 2002 та ін.).

На території Рівненської області, яка має найвище радіаційне забруднення в Україні, сумарна поглинута ВРХ доза зовнішнього та внутрішнього випромінювання досягає 224,78-364,83 рад. При цьому поглинута доза внутрішнього опромінення становить 99,59-93,06 від сумарного (Бялецький С.А., Мандигра М.С. зі співавт., 1993). Такі дозові навантаження тварини отримують за весь термін перебування на забрудненій території та насамперед – із радіонуклідами, що знаходяться у кормах. Тобто потужність сумарної поглинутої тваринами дози значно розтягнута за часом. У наших експериментах із мікобактеріями дозові навантаження в діапазоні 0,00645-0,0645 Кл/кг (25-250 Р) об'єкти дослідження отримували практично миттєво (потужність дози від 0,0138 до 2,2 Гр/c). Таким чином, у природних умовах у зоні радіоактивного забруднення дози опромінення не досягають

13

рівня "стимулюючих" і прискорення репродукції мікобактерій не відбувається.

Визначено, що вірулентність M.bovis, які не втратили здатності до репродукції після опромінення пригнічуючими дозами гамма-променів, не змінюється. Для M.scrofulaceum, на відміну від інших мікобактерій, доза 77,4 Кл/кг (300 тис.Р) не є фактором уповільнення швидкості росту на елективних середовищах. Цей феномен можна використовувати як додатковий метод диференціації атипових мікобактерій виду Scrofulaceum.

У наших дослідженнях доза гамма-опромінення 154,8 Кл/кг (600 тис.Р) при потужності дози близько 2 Гр/с чинить таку саму стерилізуючу дію на мікобактерії усіх досліджених штамів, як і дози 800 тис. та 1 млн.Р (206,4-258,0 Кл/кг) (відсутність росту на живильних середовищах, відсутність клінічних ознак і патологоанатомічних змін в інфікованих лабораторних тварин). При потужності дози Р=2 Гр/год загибель мікобактерій наставала тільки після опромінення дозами 206,4 Кл/кг (800 тис. Р) і вище.

Визначено, що при високих дозових навантаженнях (154,8 Кл/кг і вище) мікобактерії зазнають дегенеративних змін, що призводить до припинення їх репродуктивної активності. Клітини мікобактерій при таких дозових навантаженнях втрачають чіткість обрису структурних елементів, набувають деструктивної зернистості. Клітинна стінка має численні осередкові деструктивні пошкодження та ділянки відшарування цитоплазматичної мембрани. Помітні ущільнення цитоплазми з утворенням великогранулярних структур. Репродукуючі клітини в препаратах мікобактерій, опромінених високими дозами, не виявляються. Описані зміни свідчать про дегенеративні процеси, які призводять до загибелі мікробних клітин від високих доз радіації в результаті денатурації нуклеїнових кислот та білків. При забарвленні цитохімічним методом Мурахаші-Іошіда піддані впливу стерилізуючих доз радіації мікобактерії набувають червоного кольору, що, за даними авторів методу фарбування, свідчить про деполімерізацію ДНК.

Практичним результатом проведеної роботи була розробка "Способу девіталізації збудника туберкульозу та атипових мікобактерій" (деклараційний патент України на винахід № 31081 А).

Досліди з опроміненим гамма-променями патологічним матеріалом від хворих на туберкульоз тварин. Окремо були проведені досліди з вивчення впливу іонізуючого випромінювання в стимулюючих та пригнічуючих дозах на патологічний матеріал від хворих на туберкульоз лабораторних і сільськогосподарських тварин. Ріст культур M.bovis з опромінених стимулюючими дозами гамма-променів зразків патологічного матеріалу починався на 6-8 діб раніше, ніж у контрольних (не опромінених) зразках. При опроміненні стимулюючими дозами культур референтних штамів та польових ізолятів M.bovis і M.tuberculosis cпостерігали прискорення їх росту на елективних середовищах на 9-18 діб у порівнянні з

14

контролем (неопроміненими мікобактеріями). Результати роботи використані при розробці "Способу прискорення росту збудника туберкульозу” (деклараційний патент України № 30455 А).

У другій серії дослідів патологічний матеріал від хворих на туберкульоз тварин після гомогенізації замість обробки за методом А.П.Алікаєвої піддавали опроміненню пригнічуючими ріст банальної мікрофлори дозами радіації. З'ясовано, що передпосівна обробка патологічного матеріалу гамма-випромінюванням у дозах 25,8-51,6 Кл/кг (100000-200000 Р) припиняє ріст сапрофітної мікрофлори (знищує бактеріальне забруднення біологічного матеріалу), а дози 77,4 – 125,0 Кл/кг (300 тис.-500 тис. Р) затримують також і ріст мікобактерій туберкульозу. Таким чином, гамма-опромінення у дозах 100 тис.-200 тис. Р (25,8-51,6 Кл/кг) можна використовувати для передпосівної обробки патологічного матеріалу від хворих на туберкульоз тварин.

Визначено, що ефект прискорення росту мікобактерій стимулюючими дозами радіації зберігається протягом 20-30 діб після опромінення, після чого повністю втрачається і не успадковується, що свідчить про не генетичну (не мутаційну) його природу. Тобто визначений феномен є прикладом фенотипової модифікації мікроорганізмів під впливом іонізуючого випромінювання. Тому наступним етапом роботи було визначення механізму стимулюючої дії радіації на мікроорганізми.

Вивчення процесів перекисного окислення ліпідів мікобактерій. На основі проведених досліджень з урахуванням літературних даних було зроблено припущення, що природа модифікацій, які визначають тимчасове прискорення росту мікобактерій під впливом стимулюючих доз іонізуючої радіації, пов’язана з функціональними зрушеннями у мікробній клітині, зокрема, на рівні клітинних мембран та їх ліпідних компонентів, які впливають на здатність мікобактерій до росту. Це припущення послужило основою для вивчення біохімічної природи та механізмів стимулюючої дії гамма-випромінювання.

Методом хемілюмінесценції досліджені процеси перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) як важливого показника стану метаболізму опромінених мікобактерій.

Встановлено, що кожному виду мікобактерій властивий характерний для нього рівень антиокислювальної (АОА) та антиоксидантної активності. Має місце значне переважання антиокислювальної активності у M.bovis у порівнянні з атиповими мікобактеріями. Рівень АОА у M.bovis (68,11,8вірогідно вищий, ніж в атипових мікобактерій M.scrofulaceum (30,11,8та

M.fortuitum (43,61,8

Антиоксидантна система (АОС) мікобактерій забезпечується ферментними системами супероксиддисмутази (СОД) та каталази.

Найнижчою супероксиддисмутазною активністю відрізняється М.scrofulaceum (15,91,7 ум.од./мг) (рис. 1).

15

Рис. 1 Супероксидазна активність у ліпідних витяжках із мембран мікобактерій після опромінення стимулюючими дозами радіації

Каталазна активність ліпідних фракцій атипових мікобактерій M.scrofulaceum (195,22,3 мкмоль Н2О2/мг білка за 1 хв) та M.fortuitum (21,32,8 мкмоль Н2О2/мг білка за 1 хв) вірогідно вища, ніж у М.bovis (2,504 мкмоль Н2О2/мг білка за 1 хв), що дає можливість застосовувати цей метод при диференціації мікроорганізмів (рис. 2).

Стан антиоксидантної системи (АОС) та ферментативної активності опромінених мікобактерій. Після опромінення гамма-випромінюванням у дозах 0,00645-0,0645 Кл/кг (25-250 Р) активність супероксиддисмутази вірогідно зменшується в ліпідних фракціях M.bovis (з

46,93,1 до 32,61,8 умовних одиниць на мг білка) та M.fortuitum (з 56,51,5 до 38,55,3 відповідно).

Рівень каталазної активності після опромінення достовірно зменшується тільки у М.scrofulaceum (на 7,2–13,3 %), але при цьому значно перевищує цей показник в інших видів мікобактерій (116,310,9 – 168,320,9 мкМоль Н2О2/мг білку) (рис. 2).

Рис. 2 Каталазна активність у ліпідних витяжках із мембран мікобактерій після опромінення стимулюючими дозами радіації

16

Вивчення антиокислювальної активності ліпідів (АОА) опромінених мікобактерій. Після опромінення дозами 0,00645-0,0645 Кл/кг у М.bovis достовірно підвищується рівень антиокислювальної активності (з 62,01,8 до 72,01,2та вміст гідроперекисів ліпідів (з 1,950,02 до 2,340,05 нМоль МДА). У М.fortuitum та М.scrofulaceum АОА після опромінення знижується. Результати дослідження системи перекисного окислення ліпідів опромінених мікобактерій корелюють із результатами бактеріологічних досліджень. У М.bovis після опромінення дозами 0,00645-0,0645 Кл/кг (25-250 Р) спостерігається достовірне (на 11-13 діб) прискорення росту на живильних середовищах. У М.scrofulaceum та М.fortuitum прискорення росту виражено меншою мірою, проте М.scrofulaceum є найбільш стійким до радіаційного впливу (табл. 1).

Таблиця 1

Результати культуральних та біохімічних досліджень опромінених мікобактерій

Види мікобактерій та число пробірок з культурами (n) | Культуральні дослідження

мікобактерій | Біохімічні дослідження

ліпідних екстрактів з

мембран мікобактерій

Ріст на живильних

середовищах

(через / діб): | АОА

(у %) | Вміст гідропе-

рекисів ліпідів

(нмоль МДА)

Дослід:

опромінені

дозою (Р): | Конт-

роль

(не опро

мінені) | Дослід:

опромі-

нені

(150 Р) | Конт-

роль |

Дослід

(150 Р) | Конт-

роль

150 | 600

тис.

М.bovis

(90) | 5,00,5– | * | 16,03,0 | 72,01,2 | 62,01,8 | 2,34

0,05 | 1,95

1,2

М.fortu-

itum (90) | 3,51,5– | * | 4,52,3 | 22,11,5 | 30,11,5 | 0,80

0.05 | 0,68

0,02

М.scrofula-

ceum

(90) | 11,750,25 | -(+)

*** | 12,31,0 | 27,65,1 | 43,61,8 | 0,74

0,01 | 0,85

0,02

Примітка: 1. –* відсутність росту;

2. + наявність росту;

3. -(+)*** слабкий ріст або його відсутність.

17

Отже, біохімічними дослідженнями доведено, що прискорення репродукції опромінених дозами 25-250 Р (0,00645-0,0645 Кл/кг) мікобактерій має тимчасовий характер і тісно пов’язане з їх метаболізмом: змінами ферментативної активності антиоксидантної системи, змінами антиокислювальної активності та вмісту гідроперекисів ліпідів у розчинених фракціях і екстрактах із мембран мікробних клітин. Тобто прискорення репродуктивної активності мікобактерій стимулюючими дозами гамма-випромінювання пов’язане з прискоренням метаболізму ліпідів у межах системи ПОЛ, яке відбувається під впливом опромінювання.

Гістоморфологічні зміни у хворих на туберкульоз опромінених тварин

З метою вивчення особливостей патогенезу туберкульозу в опромінених тварин та вдосконалення біологічного методу діагностики туберкульозу проведено імунологічні, патологоанатомічні і гістологічні дослідження лабораторних тварин, попередньо опромінених гамма-променями в дозах 0,00645-0,0516 Кл/кг (25-200 Р) і заражених M.bovis.

При зараженні неопромінених морських свинок М.bovis в печінці, селезінці й нирках виявляли велику кількість переважно дрібних, окремо розташованих, прилягаючих одне до одного або злитих осередків запалення (туберкулів) здебільшого продуктивного типу, інколи з невеликими ділянками некрозу зі зруйнованих клітин. Осередки складались переважно з ретикулоепітеліальних та епітеліоїдних клітин. Ознак казеозу або гнійного запалення не відзначали. Межа між осередками та навколишньою печінковою тканиною чітко визначена. Гігантські клітини Пирогова-Лангханса поодинокі, мають велику кількість ядер, розташованих по периферії протоплазмового тіла. За розміром ці клітини у 3-4 рази перебільшують епітеліоїдні клітини, з яких вони й утворюються при зливанні останніх. Лімфоїдних клітин мало, хоча місцями вони