ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ
НАДКЕРНИЧНА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 631.461.5:576.851:155
ОСОБЛИВОСТІ ВЗАЄМОДІЇ МІКРО- І МАКРОСИМБІОНТІВ В СИСТЕМІ ДІАЗОТРОФИ - НЕБОБОВА РОСЛИНА
03.00.16 - екологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
КИЇВ - 2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в лабораторії біологічного азоту Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук
Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН ПАТИКА Володимир Пилипович, Інститут агроекології і біотехнології УААН, директор інституту
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор ГОЛОВКО Ераст Анатолійович, Центральний національний ботанічний сад НАН України, завідувач відділу алелопатії рослин
доктор біологічних наук, професор КУРДІШ Іван Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник КОЦЬ Сергій Ярославович, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу симбіотичної азотфіксації
Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка
Захист відбудеться 24 лютого 2004р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 при Інституті агроекології та біотехнології УААН.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН.
Відгуки на автореферат у двох примірниках, завірені печаткою, просимо надсилати за адресою: вул. Метрологічна, 12, Київ, Україна, 03143.
Автореферат розісланий 23 січня 2004р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради, кандидат
хімічних наук Заякіна Г.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Пріоритетною проблемою сучасної агроекології є розробка альтернативного шляху забезпечення небобових рослин доступним азотом за рахунок використання потенціалу грунтових азотфіксуючих мікроорганізмів (Умаров, 1986; Патика та ін., 1993; Gough et al., 1997). Переваги біологічного азоту в порівнянні з азотом мінеральних добрив в економічному плані загальновідомі. Але не менш важливі екологічні аспекти застосування біологічного азоту при якому не відбувається забруднення навколишнього середовища і не порушуються природні біоценози. У зв'язку з цим найбільш перспективним видається створення стійких асоціацій культурних рослин із діазотрофами, одержаними шляхом аналітичної селекції з природних біоценозів, що є одним із важливих заходів, направлених на збереження біологічної різноманітності і стабільності навколишнього середовища.
Ще в 70-х роках ХХ століття було висунуто припущення, що асоціації бактерій з рослинами можуть мати різний ступінь близькості. Ті асоціації, де нітрогеназна активність проявляється, в основному, в ризосферному грунті, стали називатися екзоризосферними, при локалізації діазотрофів на коренях чи всередині них - ендоризосферними (Dobereiner, 1978). Пізніше була розроблена фундаментальна концепція, згідно з якою всі рослини в екосистемі формують континуум асоційованих із коренями мікроорганізмів, який розповсюджується з ризосфери в ризоплану і далі, глибше - в рослинні тканини, включаючи епідерму, кору, ендодерму і васкулярну систему кореня (Klein et al., 1990).
Ефективна взаємодія мікро- і макроорганізмів в асоціативній системі діазотрофи - небобова рослина забезпечує активізацію процесу фіксації атмосферного азоту, продукування біологічно активних сполук, під впливом яких покращується живлення рослин, підвищується їх продуктивність, поліпшується якість сільськогосподарської продукції (Звягинцев, 1995; Белимов и др., 1998; Іутинська та ін., 2000; Курдиш, 2001). Але, навіть, за цих умов частина фіксованого азоту неминуче втрачається через процеси денітрифікації. Запобігти втратам можна шляхом перетворення асоціативних взаємовідносин у системі діазотрофи - небобова рослина на симбіотичні, де азот, який фіксується мікроорганізмами, повністю залучається до складу рослини. У деяких випадках це можливо через формування штучних симбіотичних систем діазотрофи - небобова рослина, яке відбувається під впливом поєднаного застосування хімічних і біологічних факторів (Ковальская и др., 2001).
Пошук мікроорганізмів, здатних виступати як біологічні нодуляційні агенти і формувати симбіози на коренях рослин, та створення на їх основі біопрепаратів для ефективного використання біологічного азоту є всі підстави вважати стратегічним напрямом досліджень, що відкриває широку перспективу підвищенню продуктивності агробіоценозів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили за: науково-технічною програмою у 1983-1990 рр. "Генетичні основи селекції сільськогосподарських рослин", завданням "Вивчити взаємовідносини азотфіксуючих мікроорганізмів з рослинами та удосконалити прийоми, що підвищують ефективність використання біологічного азоту в сільськогосподарському виробництві", ДР №01820077636; науково-технічною програмою з розробки систем землеробства на 1986-1990 рр. в УРСР, завданням "Створити бактеріальний препарат на основі асоціативних азотфіксаторів для підвищення урожаю злакових культур", ДР №01870073833; завданням "Дослідити видову гетерогенність злакових, круп'яних та бобових культур за їх здатністю до азотфіксації і відібрати сорти чутливі на інокуляцію, створити нові ефективні препарати азотфіксуючих бактерій", ДР №01950015883; завданням "Розробити прийоми ефективного використання біологічного і мінерального азоту в технології вирощування злакових культур", ДР №01880U081960; науково-технічною програмою УААН на 1991-1995 рр, завданням "Дослідити видову гетерогенність злакових, круп'яних та бобових культур за їх здатністю до азотфіксації і відібрати сорти чутливі на інокуляцію, створити нові ефективні препарати азотфіксуючих бактерій", ДР №01950015883; науково-технічною програмою УААН на 1996-2000 рр. "Родючість грунтів", завданням "Розробити систему раціонального використання азотфіксуючих бактерій у відновлювальних ресурсозберігаючих системах землеробства", ДР №0198U004584; науково-технічною програмою УААН на 2001-2005 рр. "Теоретично обгрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологічного використання природно-ресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращання якості умов життя людини", завданням "Розробити теоретичні основи створення препаратів агрономічно цінних штамів мікроорганізмів", ДР №0101U003749.
Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було вивчити взаємодію і взаємозумовленість азотфіксуючих мікроорганізмів і небобових рослин як основу існування і активного функціонування асоціативної системи діазотрофи - рослина, науково обгрунтувати можливість утворення специфічних симбіозів діазотрофів з небобовими рослинами, а також посилення активності процесу азотфіксації, підвищення родючості грунтів, урожайності небобових культур, поліпшення якості сільськогосподарської продукції за рахунок інтродукції в природний біоценоз нових штамів діазотрофів.
Відповідно до поставленої мети було сформульовано такі завдання:
· одержати високоефективні штами азотфіксуючих бактерій, спроможних суттєво активізовувати процес фіксації атмосферного азоту в кореневій зоні небобових рослин, підвищувати продуктивність рослин, поліпшувати якість одержаної продукції та сприяти збереженню довкілля від забруднення полютантами;
· визначити здатність виділених діазотрофів до формування активної асоціативної системи діазотрофи - озиме жито;
· визначити вплив макросимбіонта на формування і активне функціонування азотфіксуючого комплексу: діазотрофи - рослина;
· з'ясувати природу біологічного явища - спонтанного утворення бульбочок на коренях шовковиці;
· показати принципову можливість утворення специфічних симбіозів діазотрофів з небобовими рослинами;
· науково обгрунтувати роль біологічних чинників нодуляції в індукуванні азотфіксуючих симбіозів та посиленні процесу фіксації молекулярного азоту у небобових рослин;
· вивчити ультраструктуру бульбочок, які утворилися на коренях небобових рослин під впливом біологічних чинників нодуляції;
· створити новий мікробний препарат на основі азотфіксуючих бактерій для підвищення урожайності і якості зерна озимого жита, визначити умови його ефективного використання та розробити технології виробництва і застосування.
Об'єкт досліджень: діазотрофи кореневої зони озимого жита; виділені з бульбочок шовковиці азотфіксуючі бактерії A. brasilense 53, A. brasilense 54, A. brasilense 62, Agrobacterium radiobacter 51, A. radiobacter C-7; озиме жито (Secale cereale L.) 82 сортів і гібридів, рослини шовковиці (Morus alba L.) і моркви (Daucus sativus Roehl.) різних сортів.
Предмет досліджень: взаємодія мікро- і макроорганізмів в асоціативних і симбіотичних системах діазотрофи - небобова рослина.
Методи досліджень: 1) мікробіологічні - для виділення діазотрофів із природних екоценозів; 2) фізіолого-біохімічні і культурально-морфологічні - для ідентифікації діазотрофів; 3) генетичного маркування мікроорганізмів - для визначення ступеню колонізації ними кореневої зони сільськогосподарських культур; 4) газохроматографічний - для визначення азотфіксуючої активності мікроорганізмів і їх асоціацій з рослинами; 5) ізотопний 15N2 (метод ізотопного розбавлення) - для визначення надходження біологічного азоту в рослину; 6) біохімічні - для визначення загального і білкового азоту в зерні, амінокислотного складу білка; 7) електронно-мікроскопічні - для визначення видової належності бактерій та вивчення ультраструктури бульбочок, що утворилися на небобових культурах під впливом біологічних факторів нодуляції; 8) вегетаційних та польових дослідів - для визначення ефективності застосування діазотрофів і біопрепаратів на різних сільськогосподарських культурах; 9) математично-статистичні - для оцінки вірогідності отриманих результатів і визначення кореляційних зв'язків.
Наукова новизна одержаних результатів. Усвідомлення взаємодії мікроорганізмів і рослин як складного і багатогранного явища, яке сформувалося в процесі еволюції, дозволило автору ефективно використати можливості цього природного феномену для значного підвищення продуктивності сільськогосподарських культур, одержання високоякісної продукції за одночасного збереження довкілля.
Вперше вивчено структуру азотфіксуючого мікробного комплексу кореневої зони озимого жита і шовковиці. Показано особливості взаємодії і взаємозумовленості діазотрофів і рослин шовковиці та озимого жита різних сортів і ліній. Ця взаємодія розглядається як основа існування мікро- і макросимбіонтів в системі діазотрофи - небобова рослина.
Вперше показано принципову можливість утворення специфічних симбіозів діазотрофів з небобовими рослинами.
Розширено уявлення про роль небобових рослин у формуванні і ефективному функціонувані асоціативної системи діазотрофи - озиме жито.
Вперше з'ясовано природу біологічного явища - спонтанного утворення бульбочок на коренях шовковиці. З бульбочок виділені нові штами бактерій Azospirillum brasilense 53, A. brasilense 54, A. brasilense 61, Agrobacterium radiobacter 51, A. radiobacter C-7, які можна вважати відповідальними за утворення зазначених структур і їх високу нітрогеназну активність.
Отримано новий консорціум агробактерій, на основі якого створено препарат для підвищення продуктивності шовковиці.
Науково обгрунтовано і експериментально доведено можливість створення препарату діазобактерину на основі нового штаму азотфіксуючих бактерійї Azospirillum brasilense 18-2 для активізації процесу азотфіксації, підвищення родючості грунтів, урожайності озимого жита і поліпшення якості зерна.
Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень основних закономірностей формування ефективних асоціативних систем діазотрофи - небобова рослина дозволили рекомендувати сільськогосподарському виробництву новий штам азотфіксуючих бактерій Azospirillum brasilense 18-2, який забезпечує формування ефективної асоціативної системи азоспірили - озиме жито, при цьому активність фіксації молекулярного азоту підсилюється у 1,2-13,0 разів в залежності від сорту рослин і екологічних факторів, урожай зерна збільшується на 5,1-12,8 ц/га (10,2-37,4%), сумарна кількість амінокислот у зерні підвищується на 38,9-40,0, вміст незамінних амінокислот - на 42,6-47,8%.
На основі штаму A. brasilense 18-2 створено новий мікробний препарат діазобактерин для поліпшення азотного живлення рослин озимого жита, який забезпечує підвищення урожаю зерна на 2,3-7,1 ц/га (9,6-24,9%).
Запропоновано новий консорціум агробактерій для підвищення продуктивності рослин шовковиці, застосування якого дозволяє підвищити листову масу цієї культури на 14,6-67,9% в залежності від сорту.
Нові високоефективні штами та способи підвищення урожайності озимого жита і шовковиці захищені патентами України (№40542, 2001р.; №40549, 2001р.; №48835, 2002р.; №48836, 2002р).
Основні результати досліджень використані для розробки рекомендацій із ефективного застосування біопрепаратів азотфіксуючих та фосформобілізуючих бактерій в сучасному ресурсозберігаючому землеробстві (Київ, 1997; Чернігів, 1999), та "Сільськогосподарська мікробіологія - на допомогу аграрному виробництву" (Чернігів, 2001).
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Здобувачем проаналізована відповідна література, висунута робоча гіпотеза, розроблена програма досліджень, проведено лабораторні, вегетаційні, польові і виробничі досліди, та статистичну обробку одержаних даних. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретація та формулювання основних положень і висновків, а також друковані роботи підготовлено при безпосередній участі автора.
Дослідження комплексу асоціативних азотфіксуючих бактерій кореневої зони озимого жита проведено спільно з к.б.н. Н.М. Мальцевою, кореляційні зв'язки між рівнем асоціативної азотфіксації і селекційними ознаками озимого жита вивчалися з д.с.-г.н. Скориком В.В., ультраструктура бульбочок моркви - з ст.н.с. Мамчуром О.Є. У виконанні експериментальних робіт і проведенні дослідів брали участь співробітники лабораторії біологічного азоту Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, котрі є співавторами опублікованих робіт і яким автор висловлює глибоку подяку.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладені в дисертаційній роботі, були представлені на V Всесоюзному біохімічному з'їзді (Київ, 1986); Республіканській конференції "Пути повышения эффективности факторов интенсификации сельскохозяйственного производства" (Вільнюс, 1986); Установчому (VIII) з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993); 9-му Баховському колоквіумі (Пущіно, 1995); 10-th International Congress on Nitrogen Fixation (Saint-Petersburg, 1995); International workshop on associative interaction of nitrogen-fixing bacteria with plants (Saratov, 1995); 7-й Міжнародній науково-практичній конференції "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Алушта, 1998); II Міжнародній конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях" (Одеса, 1998); Міжнародній науковій конференції "Сталий розвиток агроекологічних систем в умовах обмеженого ресурсного забезпечення" (Київ, 1998); 22-nd Fodder Crops and Amenity Grasses Section Meeting "New Approaches and Techniques in Breeding Sustainable Fodder Crops and Amenity Grasses" (Saint-Petersburg, 1999); Всеросійській конференцій "Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI вв" (Санкт-Петербург, 2001); Міжнародній науково-практичній конференції "Состояние и перспективы развития люпиносеяния в XXI веке" (Брянськ, 2001); Міжнародній науковій конференції "Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів" (Одеса, 2001); Міжнародній конференції "Микробиология и биотехнология XXI столетия" (Мінськ, 2002); Міжнародній науковій конференції "Сталий розвиток агроекисистем" (Вінниця, 2002).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 46 наукових праць, з яких 25 статті у фахових журналах і збірниках, 14 - матеріалах конференцій, 3 - рекомендації виробництву, 4 - патенти України.
Обсяг і структура роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису об'єктів і методів досліджень, шести розділів викладення результатів досліджень, висновків, рекомендацій виробництву, списку використаної літератури, який містить 349 першоджерел.
Загальний обсяг роботи становить 305 сторінок. Дисертація ілюстрована 58 таблицями, 50 рисунками, 2 графіками.
ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В розділі наведено сучасні погляди вітчизняних та зарубіжних дослідників на один із пріоритетних напрямів сучасної біології, який бурхливо розвивається в останні два десятиліття - асоціативну взаємодію діазотрофів з рослинами. Розглядається перспективність підвищення продуктивності агробіоценозів шляхом використання азотфіксуючих мікроорганізмів.
ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єктами досліджень слугували: діазотрофи кореневої зони озимого жита; виділені з бульбочок шовковиці азотфіксуючі бактерії A. brasilense 53, A. brasilense 54, A. brasilense 62, Agrobacterium radiobacter 51, A. radiobacter C-7; озиме жито (Secale cereale L.) сортів Харківське 78, Харківське 79, Харківське 88, Харківське 60, Верхнячське 32, Боротьба, Струна, Київське 86, Чулпан, Плуто, Славутич 1, Зелене 10, Брянська 8, Раннє кормове, Вологодське, Волжанка, Краснодарське, Кіровське, Приєкульське, Донське 2, Росянка, Заозерне, Омка, Житкінське, Долинське, Заричанське зеленоукосне, Куштро, Добриня, Зоря, Свіча, Ясельда, Зубровка, Новозибківське 150, Пурга, Сніжне, Жнівень, Рукай, Вересань; рослини шовковиці (Morus alba L.) сортів Українська 1, Українська 107, Українська 510, Харківська 11; рослини моркви (Daucus sativus Roehl.) сорту Харківська.
Облік чисельності азотфіксуючих бактерій та їх виділення проводили за загальноприйнятими в грунтовій мікробіології методами і з використанням прийомів, описаних в оригінальних роботах ряду авторів (Iuzuka et al., 1963; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1980; Калининская и др., 1981; Caseras, 1982).
Ідентифікацію виділених культур проводили на основі вивчення морфологічних (фазово-контрастна та електронна мікроскопія), культуральних і фізіолого-біохімічних ознак за визначником Берджі (1997) і на основі порівняння з типовими штамами культур діазотрофів, які були отримані з колекції Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології. Використовували також опис бактерій роду Azospirillum в оригінальних роботах (Caseras et al., 1982).
Азотфіксуючу активність мікроорганізмів у чистій культурі і в асоціації з рослинами визначали ацетилен-етиленовим методом (Hardy et al., 1968; Stewart et al., 1967) на газовому хроматографі "Chrom-4" з полум'яноіонізаційним детектором. Колонка довжиною 370 см була заповнена хромосорбом із в-в'-?ксидіпропіонітрилом. Температура термостату 50оС, газ-носій - азот, витрата газів (в мл/хвилину): водню - 30, азоту - 100, повітря - 500.
Нітрогеназну активність в асоціативній системі діазотрофи - рослина визначали ацетиленовим методом у непорушеному моноліті грунту з коренями (Волкогон, 1984).
Надходження біологічного азоту в рослини під впливом інокуляції діазотрофами вивчали, застосовуючи метод ізотопного (15N2) розбавлення (Применение метода меченых атомов в исследованиях по земледелию, 1976). Ізотопний склад зразків визначали на мас-спектрометрі МИ-1305.
Здатність діазотрофів колонізувати ризосферний грунт, ризоплану і гістосферу рослин вивчали резистентним методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1980).
Вивчення ультраструктури бульбочок, які утворилися на коренях моркви під впливом біологічних факторів нодуляції, проводили з використанням електронно-мікроскопічних методів досліджень. Попередню фіксацію бульбочок для електронно-мікроскопічних досліджень проводили в 5% розчині глютарового альдегіду протягом 48 годин, після чого їх розрізували на декілька частин у краплі 8% глютарового альдегіду і фіксували OsO4 протягом двох годин. Матеріал послідовно зневоднювали 20, 40, 50, 70, 80, 96, 100% спиртом, а потім поміщали його на 18 годин в 70% спирт, який містив 2% урацилацетату. Для заливки використовували суміш смол Епон-812, DDSA, MNA, ДНР-30. Ультратонкі зрізи одержували на ультрамікротомі В5 490 А "Tesla" і переглядали на електронному мікроскопі B5 540 "Tesla".
Антагоністичну активність азоспірил щодо фітопатогенних грибів вивчали за допомогою методу агарових блоків (Методы экспериментальной микологии, 1982).
Для опису культуральних реакцій взаємодії фітопатогенних грибів з азоспірилами використовували модифіковану шкалу Джексона і Карла (Симонян, Мамиконян, 1982).
При обліку ураженості рослин кореневими гнилями використовували балову оцінку за розробленою шкалою і формулою (Коршунова и др., 1976).
Вміст загального азоту в зерні озимого жита вивчали за методом К'єльдаля, білкового азоту — за Барштейном (Практикум по биохимии растений, 1985), амінокислотний склад білка — на автоматичному аналізаторі амінокислот Т-339.
Вегетаційні досліди проводили в вегетаційному будиночку на дерново-середньопідзолистому пилувато-супіщаному грунті, який характеризувався наступними агрохімічними показниками: вміст гумусу становив 1,2%; азоту, що легко гідролізується (за Тюріним і Кононовою) - 57,0-58,0; рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 160,0-165,0 мг Р2О5; обмінного калію (за Кірсановим) - 110,0-112,0 мг К2О на 1кг грунту; рНН2О - 6,0. Вологість грунту підтримували на рівні 60% від повної вологоємності.
Польові досліди проводили на стаціонарі Козелецької держсортодільниці Чернігівської області (грунт - світло-сірий опідзолений супіщаний, вміст гумусу в орному шарі становив 1,5%, азоту, що легкогідролізується (за Тюріним і Кононовою) - 23-29 мг, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 140-160 мг Р2О5; обмінного калію (за Масловою) - 110-120 мг К2О на 1 кг грунту, рНсол - 5,6-6,2), в сівозміні дослідного поля відділу рослинництва Інституту сільського господарства нечорноземної зони України (грунт - дерново-середньопідзолистий супіщаний на морені, вміст гумусу - 1,1%, загального азоту - 0,06%, рухомого фосфору (за Кірсановим) - 148-151 мг Р2О5, обмінного калію (за Кірсановим) - 83-85 мг К2О на 1 кг грунту, рНсол - 5,0), на стаціонарі Носівської селекційної дослідної станції (грунт - чорнозем глибокий малогумусний вилугуваний легкосуглинковий. Вміст гумусу в орному шарі - 2,8%, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 148-150 мг Р2О5, обмінного калію (за Чириковим) - 85-88 мг К2О на 1 кг грунту, рНсол - 5,4), в сівозміні дослідного поля Чернігівського НВО "Еліта" (грунт - дерново-підзолистий пилувато-піщаний, вміст гумусу в орному шарі становив 1,0-1,2%, загального азоту - 0,09-0,14%, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 140-190 мг P2O5, обмінного калію (за Кірсановим) - 100-130 мг K2O на 1кг грунту, рНсол - 5,0).
Виробничі досліди з вивчення ефективності інокуляції озимого жита діазобактерином проводили в дослідному господарстві Інституту сільського господарства нечорноземної зони (грунт - дерново-підзолистий супіщаний, характеризувався такими показниками: вміст гумусу в орному шарі - 0,73%, загальний азот - 0,07%, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 80-85 мг Р2О5, обмінного калію (за Кірсановим) - 125-130 мг К2О на 1 кг грунту, рНсол - 4,8), на полях дослідного господарства Інституту сільськогосподарської мікробіології протягом 1993-1994 рр. (на площі 6га), 1997-1998 рр. (23 га), 1998-1999рр (25 га) (грунт - дерново-підзолистий пилувато-супіщаний. Вміст гумусу в його орному шарі становив - 0,9-1,1%, загального азоту - 0,08%, рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 80-100 мг Р2О5, обмінного калію (за Кірсановим) - 100-150 мг К2О на 1 кг грунту, рН водної витяжки - 6,0-6,5, рНсол - 5,2).
Планування, проведення польових дослідів, спостереження і обліки здійснювали за методиками польового досліду, розробленими Б.А. Доспєховим (1985). При обробці одержаних даних використовували методи математичної статистики (Доспехов, 1985).
АЗОТФІКСУЮЧИЙ ПОТЕНЦІАЛ АСОЦІАТИВНОЇ СИСТЕМИ ДІАЗОТРОФИ - НЕБОБОВА РОСЛИНА
Активність азотфіксації в кореневій зоні озимого жита вивчали протягом трьох років у трьох стаціонарних дослідах на дерново-підзолистих грунтах. Необхідність проведення досліджень впродовж тривалого періоду викликана тим, що азотфіксація є дуже мобільним процесом, на який впливає багато екологічних факторів (температура, вологість, фаза розвитку рослин тобто кількість продуктів кореневого екзоосмосу) (Патика та ін., 1993). Висока варіабельність фіксації атмосферного азоту викликана також динамічністю процесів трансформації азоту в грунті (денітрифікації, амоніфікації, нітрифікації) і перетворенням сполук азоту, які виникли в результаті цих процесів (Умаров, 1986).
Одержані нами результати свідчать, що продуктивність азотфіксації в кореневій зоні озимого жита на дерново-підзолистих грунтах Полісся в середньому складає біля 10кг азоту на 1га за три місяці вегетаційного періоду (від фази стеблування до повного дозрівання). В окремі строки відбору зразків була відмічена більш висока активність азотфіксації, яка сягала 26 і, навіть, 69кг азоту в перерахунку на 1га за вегетаційний період.
В кореневій зоні цієї культури створюються сприятливі умови для розвитку різних систематичних та еколого-трофічних груп діазотрофів. Найбільш поширеними і численними є гетеротрофні аеробні бактерії, серед яких представники родів Azotobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Bacillus, Enterobacter, Pseudomonas. Анаеробні гетеротрофи представлені видами роду Clostridium.
Всього з кореневої зони озимого жита та інших сільськогосподарських культур було виділено понад 5000 штамів азотфіксуючих бактерій, серед яких відібрали 503 штами з високою нітрогеназною активністю, що належали до вказаних родів.
Найбільш високою здатністю до фіксації атмосферного азоту відзначалися бактерії роду Azospirillum. Їх нітрогеназна активність становила від 5,8 до 11,2 мкг азоту на 1 мл поживного середовища за добу. Діазотрофи родів Azotobacter і Enterobacter також характеризувалися достатньо високим рівнем азотфіксуючої активності - 1,02-4,12 і 3,08-5,32 мкг азоту/мл середовища за добу відповідно. Встановлено, що 42% всіх виділених штамів бацил можна віднести до активних діазотрофів, діапазон нітрогеназної активності яких складав 0,63-2,53мкг азоту/мл середовища за 24 години. Вивчення азотфіксуючої здатності флуоресціюючих псевдомонад показало, що тільки 14% усіх виділених штамів виявляли азотфіксуючу активнісь, яка була в межах 0,020-1,493 мкг азоту/мл середовища за добу.
Виділені агробактерії були ідентифіковані нами як Agrobacterium radiobacter. Відомо, що бактерії роду Agrobacterium вважаються умовно патогенними (Лутова и др., 2000). Вони здатні викликати захворювання "волосяний корінь" і утворювати так звані гали на коренях рослин, крім Agrobacterium radiobacter, який не викликає патологічних змін на коренях рослин і вважається перспективним для інокуляції (Іутинська, Патика, 2000). Із виділених нами штамів Agrobacterium radiobacter лише 4 володіли азотфіксуючою активністю, але вона була незначною і становила 0,082-0,140 мкг азоту/мл середовища за добу.
Для того, щоб віднести діазотроф до асоціативних мікроорганізмів, недостатньо грунтуватися тільки на його здатності активно фіксувати молекулярний азот у чистій культурі на поживному середовищі. Важливою умовою відбору мікроорганізмів - асоціативних азотфіксаторів є їх спроможність приживатися в ризосферному грунті при інтродукції в кореневу зону рослин і забезпечувати активізацію процесу асоціативної азотфіксації. З цією метою у вегетаційних дослідах вивчали нітрогеназну активність діазотрофів, які характеризувалися різним рівнем азотфіксуючої активності в чистій культурі, в асоціації з рослинами озимого жита. Одержані результати свідчать про те, що прямої залежності між нітрогеназною активністю діазотрофів в чистій культурі і в асоціації з озимим житом не виявлено (рис. 1-2).
Інокуляція озимого жита азотфіксуючими бактеріями родів Enterobacter і Agrobacterium не призводила до збільшення нітрогеназної активності в кореневій зоні цієї культури. Отже, використовуючи згадані бактерії, нам не вдалося сформувати активну азотфіксуючу асоціацію діазотрофи - озиме жито.
Інтродукція бактерій родів Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas у кореневу зону озимого жита сприяє формуванню активної азотфіксуючої асоціації діазотрофи - озиме жито (рис. 2). Найбільш суттєве збільшення активності азотфіксації відмічено при використанні представників роду Azospirillum.
ГЕНЕТИЧНА ДЕТЕРМІНАЦІЯ НЕБОБОВИМИ РОСЛИНАМИ АЗОТФІКСУЮЧОГО КОМПЛЕКСУ З РИЗОСФЕРНИМИ ДІАЗОТРОФАМИ
Активне функціонування асоціативної системи діазотрофи - рослина обумовлюється рівною мірою як мікро-, так і макросимбіонтом. Асоціативні азотфіксатори при рослинно-мікробних взаємодіях виконують різноманітні функції, а саме: фіксують атмосферний азот, поліпшують живлення рослин за рахунок підвищення коефіцієнту використання мінерального азоту грунту, синтезують біологічно активні речовини, що стимулюють ріст і розвиток кореневої системи, підвищують стійкість рослин до дії патогенів. Рослина, в свою чергу, генетично детермінує склад, кількість і швидкість виділення кореневих ексудатів і кореневого опаду, які слугують джерелом енергії і живлення мікроорганізмів, синтезує фітогормони, які впливають на життєдіяльність діазотрофів та підвищують здатність коренів до адгезії азотфіксуючих мікроорганізмів (Шумный и др., 1991).
Здатність рослин контролювати формування азотфіксуючого комплексу в асоціації з ризосферними бактеріями і підтримувати цей процес визначена як nis-ознака (Rennie, 1981).
Скринінг 52 сортів і гібридів озимого жита за ознакою асоціативної азотфіксації показав, що існує міжсортова мінливість за даною ознакою. Нами встановлено спектр мінливості сортів і гібридів озимого жита за нітрогеназною активністю від 0 до 65 мкг азота/посудину за годину (рис. 3). Сорти з дуже високою і низькою азотфіксуючою активністю (більше 50 і менше 10 мкг азоту/посудину за годину) трапляються рідко. У 75% досліджених сортів і гібридів озимого жита нітрогеназна активність становила 15-25 мкг азоту/посудину за годину. Між сортами виявлено 14-кратні розбіжності.
На рис. 4. представлено результати скринінгу 36 сортів і гібридних ліній озимого жита за ознакою асоціативної азотфіксації. Середня нітрогеназна активність у досліді становила 19,25 мкг азоту/посудину за годину, в 21 генотипі нітрогеназна активність була меншою від середньої, в 15 генотипів - переважала середню. Отже, існує реальна можливість вести пошук сортів з підвищеною нітрогеназною активністю.
Нами показано, що поряд з міжсортовою існує внутрішньосортова мінливість озимого жита за здатністю до асоціативної азотфіксації, яка обумовлена як генетичною неоднорідністю сортів, так і впливом навколишнього середовища на цю ознаку. Насиченість популяцій того чи іншого сорту генотипами, які характеризуються високою азотфіксуючою активністю, обумовлює високий азотфіксуючий потенціал сорту. Одночасно в кожній популяції є рослини з низькою нітрогеназною активністю, тому при селекційній роботі з гетерогенними за nis-ознакою сортами є реальна можливість вести пошук генотипів-донорів високої нітрогеназної активності.
Кореляційні зв'язки між рівнем асоціативної азотфіксації і селекційними ознаками озимого жита вивчалися нами на сорті Струна з генами домінантної короткостеблості HlHl і імунітету до борошнистої роси ErEr. Результати визначення генетичних кореляцій азотфіксуючої активності з селекційними ознаками вихідних рослин і їх сімей засвідчили, що між висотою вихідних рослин і асоціативною азотфіксацією їх похідних сімей мають місце істотні негативні генетичні кореляції (rG рослин, 1991р. = -0,5507). Між висотою рослин похідних сімей і асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні цих рослин виявлено істотний негативний генетичний зв'язок (rG сімей 1992р. = -0,3844).
Нами також визначався, на прикладі озимого жита сорту Струна, коефіцієнт успадкування у вузькому розумінні (rG) здатності до асоціативної азотфіксації. З цією метою проведено кореляційно-регересивний аналіз між селекційними ознаками вихідних рослин (1991р.) і їх сімей (1992р.) з асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх прямих нащадків. Результати представлені в табл. 1.
Таблиця 1
Генетичні кореляції (rG) вихідних рослин (1991р.) і їх похідних сімей (1992р.) з асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх прямих нащадків (1993р.) озимого жита сорту Струна
Селекційна ознака | rG 1991р. | rG 1992р.
Висота рослин, см | -0,0803 | -0,1752
Продуктивна кущистість, шт. | 0,1131 | -0,3445*
Довжина колоса, см | 0,0258 | -0,0376
Число квіток у колосі, шт. | -0,1899 | -0,3875**
Число зерен у колосі, шт. | -0,2119 | -0,3801**
Озерненість колоса, % | -0,1195 | -0,0927
Щільність колоса | -0,1786 | -0,2565
Маса зерна з колоса, г | -0,2493 | -0,0630
Маса зерна з рослини, г | -0,0184 | -0,0404
Маса 100 зерен з рослини, г | 0,2619 | 0,1618
Примітка: *, **, - Істотно при 0,05 і 0,01 рівнях відповідно.
При репродукуванні в 1993 р. популяція жита за висотою рослин приходила до певної рівноваги і істотних генетичних кореляцій між висотою рослин озимого жита і асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх нащадків не виявлено, хоча негативна за напрямом генетична кореляція (rG = -0,0803) цієї ознаки залишалася. Негативна спрямованість генетичного коефіцієнту кореляції свідчить про підвищену азотфіксацію нащадків короткостеблових рослин озимого жита сорту Струна.
Певна негативна генетична кореляція (rG = -0,3445) продуктивної кущистості сімей (1992 р.) з асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх прямих нащадків (1993 р.) свідчить про більш високу активність азотфіксуючих бактерій в кореневій зоні озимого жита у нащадків рослин з меншою кущистістю.
Відносно довжини колоса у вихідних рослин і їх сімей, то за роки досліджень не виявлено чітко спрямованих генетичних кореляцій цього показника з асоціативною азотфіксацією в кореневій зоні їх нащадків.
Число квіток і зерен у колосі вихідних рослин і їх сімей має негативну кореляцію з нітрогеназною активністю в кореневій зоні прямих нащадків, хоча вона не завжди була істотною в межах прийнятого рівня істотності. Можна говорити про більш високу активність азотфіксаторів у зоні коренів озимого жита з меншим числом квіток у колосі вихідних батьківських рослин і сімей. Це підтверджується негативною генетичною кореляцією озерненості вихідних сімей у 2002 р. (rG = -0,5008) з асоціативною азотфіксацією в їх кореневій зоні.
Щільність колоса, маса зерна з колоса і рослини не виявили кореляції з нітрогеназною активністю в кореневій зоні прямих нащадків.
Коефіцієнт успадкування здатності до асоціативної азотфіксації у вузькому розумінні, визначений за подвоєним коефіцієнтом кореляції "мати - нащадок" виявився невисоким (h2 = 0,2986). Невисоке значення цього коефіцієнта означає, що тільки близько 30% рослин озимого жита успадковують підвищену здатність до асоціативної азотфіксації. Тому для проведення ефективних доборів рослин озимого жита за цією ознакою необхідна висока інтенсивність добору з перевіркою його результатів у прямих нащадків.
ВИКОРИСТАННЯ ДІАЗОТРОФІВ ЯК ЗАСОБІВ ПІДВИЩЕННЯ ПРОДУКТИВНОСТІ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ КУЛЬТУР
В результаті проведення серії вегетаційних і польових дослідів встановлено, що найбільшою нітрогеназною активністю відзначалися сорти Харківське 78, Харківське 60, Куштро, Новозибківське 150, Боротьба, Верхнячське 32. Мінімальну азотфіксуючу активність реєстрували в ризоплані сортів Зоря, Заозерське, Свіча.
Здатність сортів озимого жита відзиватися на інокуляцію діазотрофами вивчали в вегетаційних дослідах. Були використані сорти, які характеризувалися як мінімальною активністю асоціативної азотфіксації в ризоплані рослин, так і максимальною. Як свідчать одержані дані, сорти Боротьба, Харківське 78, Верхнячське 32 відзначалися найбільшою здатністю відзиватися на інокуляцію азотфіксуючими бактеріями родів Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas.
Критеріями відбору сортів рослин, здатних забезпечувати ефективне функціонування азотфіксуючої системи діазотрофи - рослина, слугували: підвищена активність асоціативної азотфіксації в ризоплані рослини, їх спроможність реагувати на інокуляцію діазотрофами підвищенням нітрогеназної активності в кореневій зоні рослин та зрештою - збільшенням урожайності.
Критеріями при селекції ефективних діазотрофів були: висока нітрогеназна активність бактерій в чистій культурі, їх здатність активно колонізувати кореневу зону рослин і вступати в асоціативні взаємовідносини з рослиною, посилюючи процес фіксації атмосферного азоту в системі діазотрофи - рослина, а також утворення в процесі життєдіяльності біологічно активних речовин, що в цілому сприяє підвищенню урожаю сільськогосподарських культур і поліпшенню його якості.
Вивчення динаміки колонізації кореневої зони озимого жита азоспірилами проводили з використанням одержаного нами мутанта штаму A. brasilense 18-2, стійкого до високих доз стрептоміцину (1200 мкг/мл) (рис. 5).
Аналіз одержаних даних показав, що азоспірили здатні приживатися в грунті ризосфери і в ризоплані озимого жита. Чисельність даних бактерій в ризосфері складала 1-8 тис. клітин на 1 г грунту і залишалась без істотних змін протягом усього періоду проведення досліду. В ризоплані мало місце значне зростання вмісту A. brasilense 18-2str протягом всього періоду досліджень. Так, через 35 діб чисельність даних бактерій збільшилась в 20 разів у порівнянні з першим визначенням через сім діб.
З літератури відомо, що неефективне застосування азоспірил, яке інколи трапляється, пов'язане зі слабким їх приживанням в кореневій зоні рослин в результаті інгібування їх росту аборигенними ризосферними мікроорганізмами (Omar, 1992). Іншими роботами показано, що азоспірили, інтродуковані в ризосферу злакових культур, здатні не тільки колонізувати поверхню коренів, а й проникати у внутрішню частину кореня (Bally et al., 1983; Renu et al., 1988; Levanony et al., 1990).
Враховуючи вищезазначене, ми визначали чисельність азоспірил не тільки в ризосфері і ризоплані, але й у внутрішніх тканинах коренів (гістосфері) рослин озимого жита (табл. 2).
Таблиця 2
Колонізація озимого жита A. brasilense 18-2str (вегетаційний дослід)
Термін визначення після інтродукції штаму, діб | Коренева сфера | Чисельність клітин, тис./г грунту (сирих коренів)
28 | Ризосферний грунт | 1,0
Ризоплана | 405,0
Гістосфера | 230,0
35 | Ризосферний грунт | 3,9
Ризоплана | 1020,0
Гістосфера | 400,0
Представлені дані свідчать про активну колонізацію азоспірилами гістосфери озимого жита. Даним фактом можна пояснити те, чому застосування культури A. brasilense 18-2 виявилося ефективним на такій озимій культурі, як жито. Азоспірили, що проникають у внутрішню частину коренів, знаходять більш сприятливі умови для приживання і розвитку, в цьому випадку вони позбавлені негативного впливу аборигенних ризосферних мікроорганізмів і від'ємних температур.
Завдяки утворенню стійких асоціацій з рослиною, інтродукований діазотроф краще пристосовується до умов навколишнього середовища і має переваги щодо живлення перед аборигенними мікроорганізмами. Чинники, що обумовлюють стійкість асоціативної системи діазотрофи - небобова рослина, різноманітні, їх функціонування сприяє створенню оптимальних умов для партнерів. Найбільш вагомим інтегральним показником стійкості утворених асоціативних систем, який визначає ефективність інтродукції діазотрофів в агробіоценоз, є продуктивність рослин.
Результати трьохрічних польових дослідів, проведених на світло-сірому опідзоленому грунті, показали високу ефективність інокуляції озимого жита сорту Харківське 78 культурою Azospirillum sp. 18-2. Як свідчать одержані дані (табл. 3), передпосівна обробка насіння озимого жита суспензією клітин A. brasilense 18-2 забезпечила суттєвий приріст урожаю зерна, який досягав 10,2-37,4%. Збільшився також вміст загального азоту в зерні озимого жита. Активність асоціативної азотфіксації в варіантах з інокуляцією переважала аналогічний показник контрольного варіанту в 1,2-2,8 раза.
Таблиця 3
Ефективність інокуляції A. brasilense 18-2 озимого жита сорту Харківське 78 (польовий дослід, стаціонар Козелецької держсортодільниці)
Варіант досліду | Роки досліджень | Урожай зерна, ц/га | Приріст урожаю зерна | Вміст загаль-ного азоту, % | Активність азотфіксації, мкг азоту/м2 за годину*
ц/га | %
Контроль, N60P60K60 (фон) | 1986 - 1987 рр. | 34,4 | --- | --- | 1,74 | 282
Фон + інокуляція | 47,2 | 12,8 | 37,4 | 2,02 | 451
НІР05 | 1,24
Фон | 1987 - 1988 рр. | 41,0 | --- | --- | 1,63 | 395
Фон + інокуляція | 46,2 | 5,1 | 12,7 | 1,87 | 478
НІР05 | 2,64
Фон | 1988 - 1989 рр. | 53,0 | --- | --- | 1,71 | 155
Фон + інокуляція | 58,4 | 5,4 | 10,2 | 1,99 | 434
НІР05 | 1,98
Примітка. * середня за вегетаційний період.
Важливим показником якості зерна є його амінокислотний склад. На рис. 6 і табл. 4 наведені результати аналізу вмісту амінокислот в зерні озимого жита під впливом інокуляції азоспірилами.
Таблиця 4
Вплив інокуляції азоспірилами на амінокислотний склад зерна озимого жита сорту Харківське 78 (польовий дослід 1988-1989 рр., стаціонар Козелецької держсортодільниці)
Амінокислоти | Без інокуляції | Інокуляція A. brasilense 18-2
1988 | 1989 | 1988 | 1989
1 | 2 | 3 | 4 | 5
Всього амінокислот в зерні, мг/100г зерна | 6346 | 5741 | 8887 | 7973
в тому числі:
незамінні | 1751 | 1776 | 2588 | 2532
замінні: | 4595 | 3965 | 6299 | 5441
в тому числі:
аланін | 317 | 281 | 327 | 334
аспарагінова кислота | 864 | 218 | 749 | 273
аргінін | 502 | 718 | 761 | 946
гістидін | 487 | 353 | 515 | 535
гліцин | 199 | 271 | 329 | 359
глутамінова кислота | 1327 | 1508 | 2436 | 2048
пролін | 482 | 248 | 564 | 404
серин | 241 | 158 | 448 | 197
тирозин | 176 | 210 | 170 | 344
Наведені дані свідчать про значне збільшення вмісту амінокислот в зерні озимого жита сорту Харківське 78 під впливом A. brasilense 18-2. Сумарна кількість амінокислот у варіантах із застосуванням азоспірил зросла на 38,9-40% у порівнянні з контролем (табл. 4). Вміст глутамінової кислоти, яка є ключовим субстратом азотного обміну, збільшився на 35,8-83,8% в залежності від року досліджень. Слід відмітити також істотне збільшення вмісту незамінних амінокислот - ізолейцину, лізину, трионіну, фенілаланіну.
Таким чином, проведеними дослідженнями встановлено, що інтродукція A. brasilense 18-2 в кореневу зону озимого жита сприяє посиленню процесу фіксації молекулярного азоту, збільшенню вмісту загального і біологічного азоту та амінокислот в урожаї. Зазначене є свідченням активного функціонування асоціативної системи азоспірили - озиме жито і її позитивної ролі в забезпеченні рослин зв'язаним азотом.
СПОНТАННЕ УТВОРЕННЯ
