національна академія наук україни

інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Смикун наталія василівна

удк 579.26:631.461+661.16:620.193.92+620.197.3

Роль мікроорганізмів техногенно забруднених ґрунтів

в біопошкодженні сталі

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрах біології та хімії Чернігівського державного педагогічного університету імені Т.Г. Шевченка Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент, Третяк Олександр Петрович, Чернігівський державний педагогічний університет імені Т.Г.Шевченка, в.о. декана хіміко-біологічного факультету, завідувач кафедри біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Гвоздяк Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних бактерій

доктор біологічних наук, професор, Коваль Елеонора Захарівна, Національний науково-дослідний реставраційний центр України, провідний науковий співробітник.

Провідна установа: Київський Національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінету Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “18лютого 2004 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано " 9 " __січня____ 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Мікробні пошкодження металевих споруд у ґрунті привертають все більшу увагу в зв’язку з величезними збитками як через прямі втрати металу, так і внаслідок техногенних аварій. Встановлено провідну роль бактерій циклу сірки в процесі мікробно індукованої корозії (МІК) [Андреюк и др., 1980; Козлова, 1989; Піляшенко-Новохатний, 2000]. Корозійно-небезпечні мікробні угруповання формуються в феросфері (зоні ґрунту, що безпосередньо контактує з поверхнею металу) і характеризуються сталістю якісного складу. При цьому участь мікроорганізмів розглядають в зв’язку з їх геохімічною діяльністю, яка, за В.І. Вернадським, активізується в умовах техногенезу.

Одним з факторів техногенного впливу на ґрунти є пестициди, які застосовуються в практиці сільськогосподарського виробництва протягом тривалого періоду. Активність пестицидів щодо мікроорганізмів визначила можливість їх використання як хімічних засобів захисту від біопошкоджень металу у водних середовищах Бочаров, 1983; Землянухин и др., 1983; Голяк и др., 1998, 1999, 2001. Проте стосовно поведінки корозійно-небезпечних мікробних угруповань та процесу біопошкодження металів в ґрунті в присутності пестицидів є лише окремі роботи [Наумова, 1985; Пат.2151819 Россия, МПК С23 F 11/14, 2000].

Деградація пестицидів (фізична, хімічна, біологічна) в ряді випадків веде до утворення токсичних для мікроорганізмів проміжних сполук або навпаки, речовин-субстратів метаболізму. Такі сполуки можуть бути агресивними по відношенню до металів, а це ставить питання оцінки наслідків застосування пестицидів щодо розвитку корозійно-небезпечних мікробних угруповань та швидкості корозії.

Особливе місце займають некондиційні пестициди, накопичені в ряді областей України, зокрема в Чернігівській їх кількість становить близько 803 тонн. Порушення правил зберігання цих речовин викликає забруднення довкілля. В зв’язку з цим актуальною є проблема утилізації некондиційних пестицидів, важливим напрямом якої є використання їх у протикорозійному захисті [Курмакова та ін.,1998, 1999]. Так, інгібуючі властивості за умов кислотної корозії виявляють пестициди симазин (S), лінурон (L), рамрод (R), гексилур (G) та ДНОК (D). Але пошук інгібіторів для захисту сталі від мікробних пошкоджень ускладнюється тим, що ці сполуки повинні мати біоцидні властивості і здатність зменшувати швидкість руйнування металу Погребова и др., 1998, 1999, 2000, 2001. Можливість хімічної модифікації пестицидів з одержанням інгібіторів-біоцидів являє собою велике практичне значення для захисту металу підземних споруд від мікробного пошкодження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Окремі розділи роботи виконані в межах держбюджетної теми № 5-98 (1998-1999 рр.): “Хіміко-біологічне обґрунтування можливості інгібування біокорозії неконди-ційними пестицидами та продуктами їх хімічної модифікації” згідно тематичного плану науково-дослідних робіт Чернігівського державного педагогічного інституту ім. Т.Г.Шевченка, затвердженого Міністерством освіти України.

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження ролі еколого-трофічних груп мікроорганізмів ґрунту в процесі біопошкодження сталі в присутності некондиційних пестицидів симазин, лінурон, рамрод, ДНОК, гексилур та пошук інгібіторів-біоцидів для захисту сталі від пошкодження мікроорганізмами серед похідних діючої речовини пестициду рамрод.

Відповідно до поставленої мети було визначено такі задачі:

·

·

·

·

·

·

Об’єкт досліджень: еколого-трофічні групи мікроорганізмів феросфери сталі в чорноземі опідзоленому; асоціативна культура сульфатвідновлювальних бактерій, чиста культура Desulfovibrio indonensis, асоціативна культура залізо-відновлювальних бактерій.

Предмет досліджень: закономірності змін чисельності та активності еколого-трофічних груп мікроорганізмів ґрунту – агентів пошкодження сталі в присутності некондиційних пестицидів; антимікробні та протикорозійні властивості азотовмісних гетероциклічних похідних діючої речовини пестициду рамрод за умов мікробного пошкодження сталі.

Методи дослідження. Для виконання поставлених задач використали мікробіологічні, біохімічні, хімічні та корозійні (гравіметричний, електрохімічний) методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначено закономірності змін чисельності мікробних угруповань феросфери сталі 45 (сульфатвідновлю-вальні, денітрифікувальні, амоніфікувальні, залізовідновлювальні бактерії та мікроскопічні гриби) в чорноземі опідзоленому в присутності некондиційних пестицидів рамрод, симазин, лінурон, ДНОК, гексилур в модельному експерименті, з’ясовано інгібуючі властивості пестицидів. Вперше показано, що за умов перебігу мікробного пошкодження сталі високі потенційні протикорозійні властивості лінурону та ДНОКу не реалізуються, а рамроду, симазину та гексилуру змінюються неоднозначно, що визначається хімічною структурою пестицидів. Вперше виявлено взаємозалежність між змінами в складі мікробного ценозу ґрунтів за присутності пестицидів та інтенсифікацією процесу корозії сталі .

Показано принципову можливість застосування інгібіторів-біоцидів, одержа-них на основі діючої речовини пестициду рамрод, для захисту сталі від мікробних пошкоджень. Вперше показано високу антимікробну ефективність щодо культур сульфатвідновлювальних бактерій азотовмісних гетероциклічних похідних діючої речовини пестициду рамрод: четвертинних солей піридинію, тіазольних сполук, речовини з пара-бромфеноксильним радикалом та бізарядної біс-четвертинної солі діазобіцикло2.2.2октану. Вперше встановлено високу ефективність попередження пошкодження сталі сульфатвідновлювальними бактеріями для похідного, що є четвертинною сіллю стирилпіридинію. З’ясовано кінетичні характеристики речовин-біоцидів.

Наукове значення роботи. Обґрунтовано та вивчено закономірності змін чисельності мікробних угруповань феросфери вуглецевої сталі та електрохімічних показників корозійного процесу під впливом антропогенних чинників, а саме некондиційних пестицидів симазин, лінурон, рамрод, ДНОК, гексилур в залежності від їх хімічної структури, що розвиває уявлення про механізм мікробного пошкодження сталі за умов техногенного навантаження на ґрунти.

З урахуванням специфічних особливостей процесу мікробного руйнування сталі визначено напрямки пошуку інгібіторів-біоцидів серед похідних N1-ізопропіл-N1-феніл-2-хлорацетаміду, що доповнює наукові знання про закономірності цілеспрямованого одержання речовин для захисту сталі.

Практичне значення отриманих результатів. Рекомендовано при оцінці агресивності ґрунтів (середовище перебігу біопошкоджень) враховувати, поряд з мікробіологічними та фізико-хімічними характеристиками, їх забрудненість пести-цидами групи сим-триазинів, хлорациланіліду, нітропохідних фенолу, похідних сечо-вини, піримідину. Запропоновано для попередження пошкоджень середньовуглецевої сталі сульфатвідновлювальними бактеріями застосовувати продукти хімічної модифі-кації діючої речовини пестициду рамрод: четвертинну сіль стирилпіридинію (хлорид N1-ізопропіл-N1-фенілкарбамоілметил-4-2-феніл-1-етенілпіридинію) та тіазольну речовину з двома N-фенільними радикалами (3-феніл-2-феніліміно-1,3-тіазолан-4-он), що одночасно дозволить розв’язати проблему утилізації некондиційного пестициду.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто на базі кафедри біології Чернігівського державного педагогічного університету імені Т.Г. Шевченка. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з даної проблеми, проведено статистичну обробку всіх отриманих експериментальних даних, їх аналіз та співставлення з існуючими даними літератури, а також підго-товку матеріалів результатів досліджень для публікації. Автором самостійно визначено чисельність груп мікроорганізмів ґрунтової корозійно-небезпечної мікро-флори та інтенсивність процесу біопошкодження сталі в присутності пестицидів. Особисто визначено чутливість культур сульфатвідновлювальних бактерій (асоціативної та чистої культури Desulfovibrio indonensis) та асоціативної культури залізовідновлювальних бактерій до гетероциклічних азотовмісних похідних діючої речовини пестициду рамрод. Досліджено кінетичні характеристики росту асоціації сульфатвідновлювальних бактерій під впливом діючої речовини рамроду та інгібіторів-біоцидів, одержаних на її основі, з’ясовано механізми інгібуючої дії речовин та розраховано їх константи інгібування, підготовлено культури СВБ до електрохімічних досліджень та зроблено розрахунки показників спряжених електродних процесів мікробного пошкодження сталі. Визначення чисельності ґрунтових корозійно-небезпечних груп мікроорганізмів проведено за консульта-тивною допомогою к.с.-г.н. Лохової В.І. (Інститут сільськогосподарської мікро-біології НААНУ, м. Чернігів, лабораторія біологічного азоту), яка є співавтором відповідних публікацій. Електрохімічні дослідження проведені сумісно з к.х.н. Курмаковою І.М. (Чернігівський державний педагогічний університет імені Т.Г. Шевченка, кафедра хімії), яка також є співавтором публікацій. У плануванні основних напрямків роботи та обговоренні результатів брав участь науковий керівник к.б.н., доцент Третяк О.П.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на І Всеукраїнській науковій конференції “Екологічний стрес і адапта-ція в біологічних системах” (Тернопіль, 27-29 жовтня 1998 р.); на V Міжнародній конференції-виставці “Проблеми корозії і протикорозійного захисту матеріалів” КОРОЗІЯ-2000 (Львів, 6-9 червня 2000 р.); на ІІ Установчому з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 11-14 вересня 2000 р.); на IV Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених „Екологія. Людина. Суспільство.” (Київ, 14-16 травня 2001 р.); міжнародній науковій конференції “Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 4-6 вересня 2001 р.); міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 4-7 жовтня 2001 р.); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології нану (Київ, 10-12 грудня 2002 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт (з них 5 статей у профільних журналах, 3 – в матеріалах і тезах конференцій).

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаної літератури, який включає 284 першоджерел (із них 84 іноземних).

Загальний обсяг роботи становить 172 сторінки. Робота містить 14 таблиць та 18 рисунків.

огляд літератури

Огляд літератури складається з трьох підрозділів, які містять інформацію про сучасні уявлення щодо процесу мікробно індукованої корозії металів та її механізму, а також розвитку ґрунтової корозійно-небезпечної мікрофлори під впливом пести-цидів. В розділі розглядається перспективність застосування біоцидів та інгібіторів, зокрема гетероциклічних сполук, для запобігання мікробним пошкодженням металів.

матеріали і методи досліджень

Об’єктами досліджень були природні еколого-трофічні групи мікроорганізмів (сульфатвідновлювальні (СВБ), денітрифікувальні (ДНБ), залізовідновлювальні (ЗВБ), амоніфікувальні бактерії (АБ) та мікроскопічні гриби (МГ)) чорнозему опідзоленого за умов МІК сталі 45; культури сульфатвідновлювальних бактерій (асоціативна і чиста культура Desulfovibrio indonensis) та асоціативна культура залізовідновлювальних бактерій. Асоціативні культури сульфат- та залізовідновлю-вальних бактерій виділено нами з ґрунту феросфери кородуючої труби методом накопичення на середовищах Постгейта “В” та Каліненка відповідно Романенко, Кузнецов, 1974. Культуру D.виділено та визначено в м. Портсмут (Великобританія) [Feio et al., 1998] та люб’язно надано співробітниками відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології НАН України (м. Київ).

Сталь 45 є середньовуглецевою якісною конструкційною, використовується для виготовлення деталей кріплення трубопроводів.

Як біоциди та інгібітори досліджувались некондиційні пестициди симазин, лінурон, рамрод, ДНОК та гексилур; діюча речовина пестициду рамрод - N1-ізопропіл-N1-феніл-2-хлорацетамід та її азотовмісні гетероциклічні похідні – пара-бромфеноксильна сполука, четвертинні солі піридинію, тіазольні сполуки, хіназо-лони, тіоефір бензолу, тіоефір тетразолу, тіоефіри триазолу, імідазоли, біс-четвертинна сіль діазобіцикло2.2.2октану. Похідні синтезовані на кафедрі хімії Черні-гівського державного педагогічного університету імені Т.Г.Шевченка під керів-ництвом д.фарм.н. Демченка А.М. Склад та будова сполук підтверджені сучасними методами фізико-хімічного аналізу.

Відбір ґрунтових зразків, виділення, облік і культивування мікроорганізмів здійснювали за загальноприйнятими в ґрунтовій мікробіології методами. Відбір проб проводили після 4, 15, 30, 75, 150 та 365 діб інкубації ґрунту (температура 27±2°С), виходячи з терміну природної деградації досліджених пестицидів Спра-вочник по пестицидам, 1974, 1986. Визначення чисельності мікроорганізмів прово-дили для ґрунту, що безпосередньо контактував з поверхнею стального зразка (феросфера) Козлова, 1989.

Кількісний вміст бактерій (титр) визначали методом граничних десякратних розведень на відповідних середовищах: АБ - на м’ясо-пептонному агарі; МГ – на сусло-агарі; ДНБ – на середовищі Гільтая; СВБ – на середовищі Постгейта “В”; ЗВБ – на середовищі Каліненка Романенко, Кузнецов, 1974. Чисельність мікро-організмів перераховували на 1 г абсолютно сухого (абс. сух.) ґрунту, вологість якого визначали ваговим методом.

У вихідному ґрунті визначали загальний вміст заліза (фотометричним методом з сульфосаліциловою кислотою) та сірки (осадженням ВаSO4 з наступним фото-метруванням отриманого мутного розчину на спектрофотометрі при ?=434 нм Остроумов, 1953).

Визначення чутливості культур корозійно-активних бактерій - СВБ (асоціативної і чистої культури Desulfovibrio indonensis) та асоціативної культури ЗВБ до похідних рамроду проводили загальноприйнятим методом дифузії в агар з використанням стерильних паперових дисків Егоров, 1969, змочених 0,1%, 0,2% та 2,0% розчинами речовин. В експериментах використали 3-5-добові культури бактерій. Титр бактерій 106 клітин в 1 мл елективних агаризованих середовищ. За діаметром зони пригнічення росту мікроорганізмів визначали їх чутливість до речовин.

Визначення параметрів росту асоціативної культури СВБ під впливом біоцидів здійснювали за приростом біомаси мікроорганізмів, яку оцінювали за вмістом білку методом ЛоуріLowry et al., 1951]. Досліди проводили протягом 48 годин за умов періодичного культивування СВБ в герметично закритих флаконах при температурі 28±2?С. Середовище Постгейта “В” засівали п’ятидобовою суспензією СВБ. Біоциди вносили у вигляді спиртового розчину (етанол) з розрахунку 100 мг/ л середо-вища. За отриманими результатами побудовано криві росту культури СВБ та визначено швидкість розмноження бактерій (Vсер). За графічним методом Лайнуівера-Берка визна-чали характер інгібування росту бактерій дослідженими сполуками і за загальновизнаними формулами розраховували їх константи інгібування (Кі).

Швидкість корозії металу визначали за втратою маси зразків Фокин, Жигалова, 1986 сталі 45, циліндричної форми (діаметром 17 мм, висотою 8 мм), відшліфованої по 4-5 класу чистоти. Розраховували коефіцієнт гальмування корозійного процесу (?m) та захисний ефект (Zm).

Протикорозійні властивості пестицидів та похідних (концентрація 20 мг/ л) досліджували електрохімічним методом в водних витяжках ґрунту (10 г ґрунту на 90 мл води). Також протикорозійні властивості похідних (концентрація 1,5•10-3 моль/ л середовища) визначали за умов МІК в 7-добових культурах СВБ - асоціативній та культурі D. іndonensis з титром 5 (температура 28±2°С, час - одна та п’ять діб). Повторність дослідів трикратна.

Поляризаційні криві (80 мВ /хв.) торцевого електрода зі сталі 45 знімали від потенціалу його вільної корозії ?ст за допомогою потенціостата П-5848 [Халдеев и др., 1979]. Використали скляну трьохелектродну комірку з розділеним катодним та анодним простором. Електрод порівняння – срібло хлоридний, допоміжний – платиновий. Потенціал перераховували на стандартну водневу шкалу. Температура досліджень 20?С. За поляризаційними кривими розраховували потенціали, струми та коефіцієнти гальмування вільної корозії (?ст, Іст, гст), катодного (?к, Ік, гк) та анодного (?а, Іа, га) процесів.

При обробці одержаних даних використали методи математичної статистики [Лакин, 1973. Чисельність мікроорганізмів на рідких поживних середовищах визна-чали за допомогою таблиць Мак-Креді; на твердих середовищах – з врахуванням середнього квадратичного відхилення. Статистичну обробку результатів корозій-ного дослідження проводили для рівня значимості 0,05 з врахуванням нормального t-розподілення. Відносна похибка представлених даних не перевищує 10%.

результати досліджень та їх обговорення

Зміни чисельності мікроорганізмів еколого-трофічних груп чорнозему опідзоленого та процес пошкодження сталі 45 в присутності пестицидів. Корозійно-агресивний ценоз мікроорганізмів створюється в феросфері підземних металевих споруд. Це пов’язують з адаптацією мікроорганізмів до умов феросфери, а сталість якісного складу мікробного угруповання, центральне місце в якому займають сульфатвідновлювальні бактерії, - трофічними зв’язками [Андреюк и др., 1980, 1994; Козлова, 1989; Marchal, 1999; Піляшенко-Новохатний, 2000, 2002].

Кількісний вміст еколого-трофічних груп мікроорганізмів у вихідному ґрунті становив (клітин/ на  г абс. сух. ґрунту): СВБ - 2,8*102, ДНБ - 1,3*104, ЗВБ - 4,5*103, АБ 4,6±0,4*105, МГ - 2,0±0,2*103. За вмістом сульфатвідновлювальних бактерій – основних збудників анаеробної МІК та загальним вмістом заліза і сірки (0,33 та 0,32% відповідно) досліджений ґрунт віднесено до неагресивного. Проте вже на 4-15-ту добу експерименту нами встановлено збільшення чисельності всіх досліджених груп мікроорганізмів в феросфері сталі 45 (табл.1). Визначення динаміки швидкості корозії сталі 45 в ґрунті показало, що протягом першого місяця експерименту руйнування металу було незначним (2,48-2,73*10-4 г/ м2*годину). Відмічене збільшення чисельності зазначених еколого-трофічних груп мікроорганізмів в 2-2,5 місяці експерименту зумовило зростання швидкості руйну-вання металу до 7,9*10-2 г/ м2*годину. Хоча в подальшому чисельність корозійно-небезпечних груп мікроорганізмів зростала, процес пошкодження сталі 45 стабілізувався (8,0*10-2 г/ м2*годину) з наступним зниженням його швидкості до 4,3*10-2 г/ м2*годину в 12 місяців.

Таблиця 1

Чисельність деяких еколого-трофічних груп мікроорганізмів чорнозему опідзоленого за умов МІК сталі 45

Тривалість експерменту, доби | Чисельність мікроорганізмів в 1 г абс. сух. ґрунту

СВБ | ДНБ | ЗВБ | АБ | МГ

4 | 6,1*102 | 6,8*104 | 6,8*104 | 4,0±0,2*105 | 1,5±0,2*103

15 | 1,4*103 | 3,9*104 | 7,0*104 | 4,5±0,4*105 | 1,9±0,2*103

30 | 1,2*103 | 6,0*102 | 7,0*104 | 2,5±0,2*105 | 5,0±0,3*102

75 | 9,0*102 | 4,5*103— | 6,0±0,6*106 | 1,2±0,1*104

150 | 1,5*104 | 1,2*104———

365 | 4,5*104 | 2,5*104— | 5,8±1,2*107—

Примітка. “—“ досліди не проводили

Незважаючи на численні дослідження по вивченню взаємодії ґрунтових мікробних угруповань з металами, до цього часу не можна надійно прогнозувати реакцію мікроорганізмів на техногенні навантаження (ізоляційні покриття, вико-ристання для протикорозійного захисту металевих споруд катодної поляризації), оскільки має місце їх комплексна дія. Значний техногенний пресинг на ґрунти здійснюють і пестициди.

Визначення нами чисельності еколого-трофічних груп мікроорганізмів чорно-зему опідзоленого в феросфері сталі 45 показало її відмінність за умов присутності пестицидів (дослід) та без пестицидів (контроль). В ході експерименту показано як стимуляцію, так і гальмування розвитку мікроорганізмів феросфери, що, в цілому, узгоджується з поведінкою в ґрунті досліджених груп пестицидів та продуктів їх деградації.

Мікробіологічний чинник є одним з визначальних процесу корозії сталі, але присутність пестицидів може змінювати характер корозійного процесу завдяки безпосередньому впливу на кінетику корозійних реакцій, що показано, зокрема, для кислотної корозії [Курмакова и др., 1998, 1999]. Тому поряд з встановленням чисельності корозійно-агресивних мікроорганізмів нами було з’ясовано динаміку швидкості пошкодження сталі 45 в ґрунті з пестицидами (рис.2) та корозійну агресивність водних витяжок з ґрунту (табл.3).

Так, показано чутливість сульфатвідновлювальних бактерій до сим-триазинів (симазин), можливість їх використання для захисту металів від мікробної корозії, індукованої СВБ, але лише на початку експозиції (рис.1). В подальшому відмічено збільшення чисельності бактерій, що може бути пов’язано як з адаптацією сульфат-редукторів до дії токсиканта (зокрема за рахунок адсорбції мікроорганізмів до поверхні сталі з утворенням захисної біоплівки), так і з деградацією пестициду до нетоксичних сполук. Депресія розвитку сульфатвідновлювальних бактерій феросфери наприкінці експерименту в присутності сима-зину може бути зумовлена впливом продуктів природ-ної деградації пестициду, метаболітів, утворених при коменсалізмі різними фізіологічними групами мікроорганізмів, що входять до складу ценозу феросфери.

В ході дослідження пока-зана токсичність симазину щодо мікроорганізмів циклу азоту (де-нітрифікаторів та амоніфікаторів) (рис.1, табл.2). Мікроміцети вия-вились резистент-ними до дії пести-циду (табл.2).

Мікрофлора ґрунту неоднозначно змінює захисні властивості симазину, вста-новлені за дани-ми електрохіміч-них досліджень водних витяжок ґрунту (захисний ефект становив 80%) (табл.3). Відмічена інтенсифікація пошкод-ження сталі в ґрунті з симази-ном (рис.3) зу-мовлена як збіль-шенням чисельності сульфатвідновлювальних бактерій, так і Сl--іонами, які утво-рюються при деградації пестициду. Зміни кінетичних показників корозії в водних витяжках ґрунту з симазином можуть бути пояснені накопиченням продуктів метаболізму різних груп мікроорганізмів феросфери.

Депресія сульфатвідновлювальних бактерій в феросфері сталі відмічена в присутності пестициду лінурон (похідне сечовини) на початку експе-рименту (рис.1). Це узгоджується з токсичними властивостями хлорпохідних з мінімальним числом вуглецевих атомів для бактерій.

Поступове збільшення чисельності СВБ пов’язано з деградацією лінурону з утво-ренням метаболітів, менш токсичних для бактерій цієї групи, ніж вихідна сполука. Зокрема можлива повна деградація пестициду з роз-криттям бензольного кільця та утворенням сукцинату та ацетату – субстратів, що окислюються деякими шта-мами сульфатвідновлю-вальних бактерій в процесі сульфатредукції.

Відмічена нами стимуляція розвитку ДНБ пов’язана з утворенням при деградації лінурону амінів та аміаку, які залучаються до циклу азоту (рис.1). Щодо амоніфікувальних бактерій лінурон проявив токсичні властивості (табл.2). Мікроміцети за умов мікробної корозії сталі в ґрунті під дією лінурону на початку експе-рименту (2,5 міс.) не змінили своєї чисельності (табл.2).

Вперше показано, що розвиток мікрофлори феросфери сталі 45 в присутності лінурону та вплив пестициду на електрохімічні показники корозійного процесу (табл.3) зумовлюють високий рівень руйнування сталі (рис.2).

Таблиця 2

Чисельність амоніфікувальних бактерій та мікроскопічних грибів в чорноземі опідзоленому за умов МІК сталі 45 в присутності пестицидів

Пестицид | Кількість мікроорганізмів на 1 г абс. сух. ґрунту

АБ | МГ

2,5 місяці | 12 місяців | 2,5 місяці

Контроль (без пестицидів) | 6,0±0,6*106 | 5,8±1,2*107 | 1,2±0,1*104

Симазин | 3,5±0,5*106 | 1,3±0,2*107 | 8,5±0,9*103

Лінурон | 5,2±1,0*106 | 7,0±1,0*105 | 1,3±0,1*104

Рамрод | <106 | 1,3±0,3*107 | 8,5±1,0*103

ДНОК | 6,8±1,4*106 | 8,8±0,3*107 | 1,1±0,2*104

Гексилур | 3,3±0,3*106 | 4,3±1,1*106 | 1,5±0,2*103

Таблиця 3

Коефіцієнти гальмування спряжених електродних процесів сталі 45 у водних витяжках ґрунту з пестицидами

Пести-цид | вихідні показники | після 5 місяців експерименту | після 12 місяців експерименту

гст | гк | га | гст | гк | га | гст | гк | га

S | 5,0 | 5,4 | 4,4 | 9,1 | 10,7 | 6,9 | 1,0 | 1,0 | 1,4

L | 4,8 | 4,5 | 5,3 | 0,7 | 1,2 | 0,1 | 0,4 | 1,4 | 410-2

R | 5,0 | 3,2 | 22,9 | 2,0 | 1,6 | 5,0 | 1,3 | 1,4 | 0,7

D | 2,2 | 0,8 | 63,2 | 0,9 | 0,9 | 0,9 | 2,6 | 2,9 | 1,4

G | 1,9 | 1,3 | 8,7 | 4,1 | 2,8 | 15,9 | 4,2 | 5,0 | 2,6

Примітка. ?a та ?к визначали при lg i = - 4,8; Iк при ?к = -0,38 В ; Iа при ?a = -0,16 В (для 12 міс. при ?a = -0,20 В); цк/lgІк = - 0,20; ца/lgІа = - 0,06.

Агресивність водних ви-тяжок ґрунту з лінуроном щодо сталі збільшується з часом, що є наслідком деградації пестициду з утворенням NH3, СО2, ацета-ту – корозійно-активних сполук, амінів, які в низькій концентра-ції також здатні стимулювати сірководневу корозію.

Визначено, що дина-міка чисельності досліджених еколого-трофічних груп мікроорганізмів під дією пестициду рамрод за умов мікробного пошкодження сталі відрізняється від ґрунту без стального зразка. Зокрема з’ясовано, що подвійний техногенний пресинг (у вигляді сталі та пестициду) протягом першого місяця призводить до домінування сульфат- та залізовідновлювальних бактерій – угруповання стає агресивним щодо металевих конструкцій.

Розвиток досліджених еколого-трофічних груп мікроорганізмів визначається присутністю рамроду й через 2,5 місяці експерименту, незважаючи на відому високу швидкість деструкції пестициду (2 місяці). Так, в 2,5-5 місяців експерименту нами відмічено збільшення чисельності СВБ в феросфері (рис.1). Інтенсивний розвиток СВБ забезпечив підвищення концентрації метаболітів, токсичних для бактерій, оскільки в 12 місяців чисельність цих мікроорганізмів знизилась. Також не виключена можливість токсичного впливу продуктів трансформації рамроду.

Відмічено стимулювання розвитку денітрифікувальних бактерій в ,5 місяці (рис.1), що пояснюється утворенням при деградації рамроду амінів та аміаку. Але в та 12 місяців чисельність бактерій цієї групи знизилась (табл.2).

Збільшення чисельності мікроскопічних грибів в ґрунті без сталі (на  добу) узгоджується з їх здатністю руйнувати ациланіліди. Але за умов МІК дана група мікроорганізмів пригнічувалась рамродом (табл.2).

Незважаючи на розвиток корозійно-небезпечних груп мікроорганізмів в присутності рамроду на початку експерименту, процес мікробної корозії в цей час уповільнений (рис.2). Це пояснюється зниженням корозійної агресивності водних витяжок з ґрунту (табл.3). Але в подальшому збільшення чисельності сульфат-відновлювальних бактерій, накопичення продуктів метаболізму інших груп мікро-організмів феросфери, деградація рамроду з утворенням аміаку та амінів зумовили зростання корозійної агресивності водних витяжок ґрунту з пестицидом, що показано нами (табл.3).

Розвиток мікроорганізмів феросфери визначається ДНОКом навіть після терміну його фізичної присутності в ґрунті, який за літературними даними становить 1 місяць. Нами відмічено суттєве та тривале збільшення чисельності СВБ (рис.1), деякі види яких здатні відновлювати нітрати (нітрити) – продукти деградації пестициду - до аміаку зі значним виходом біомаси. Також відмічено значне збільшення чисельності ДНБ (рис.1). Але з часом стимулювання росту ДНБ зменшилось, що пояснюється накопиченням як токсичних продуктів трансформації пестициду, так і метаболітів різних еколого-трофічних груп мікроорганізмів.

Амоніфікувальні бактерії та мікроскопічні гриби виявили резистентність до дії ДНОКу в контрольній точці 2,5 місяці (табл.2). Але в 12 місяців експерименту амоніфікувальні бактерії інтенсивно розвивались.

Відмічено узгодження між розвитком агресивних мікробних угруповань в 2,5 місяці, перебігом корозійного процесу, а також можливою деградацією пестициду з утворенням корозійно-небезпечних сполук (NO3-, NO2-). Але в подальшому результати мікробіологічних та корозійних досліджень не виявляють чіткої взаємозалежності, що дозволяє припустити вплив функціонування інших груп мікроорганізмів, які не враховані в дослідженнях. При цьому показано, що зміни агресивності водних витяжок ґрунту з пестицидом (табл.3) протилежні динаміці швидкості мікробної корозії сталі 45 в ґрунті з ДНОКом (рис.2).

Визначено пригнічення росту денітрифікувальних, амонфікувальних бактерій та мікроскопічних грибів феросфери в присутності гексилуру (рис.1, табл.2). Сульфатвідновлювальні бактерії пригнічувались пестицидом лише в  місяців (рис.1). Втрата гексилуром біоцидних властивостей до кінця експерименту, можливо, пояснюється природною деградацією пестициду та утворенням метаболітів, менш токсичних щодо СВБ, ніж сам пестицид.

Вперше визначено, що за даними гравіметрії біопошкодження сталі 45 в ґрунті з гексилуром уповільнене, хоча з часом зростало (рис.2). В  місяців поясненням цього може бути утворення поза-клітинних депо гідрогенази, оскільки чисельність СВБ та ДНБ була низькою. Показано, що водні витяжки ґрунту з пестицидом були менш корозійно агресивними, ніж водні витяжки контрольного ґрунту (табл.3). В 5 місяців це, ймовірно, пов’язано з загальним зниженням вмісту метаболітів в ґрунті через зменшення чисельності мікроорганізмів, а в 12 місяців - присутністю сполук, що мають проти-корозійні властивості.

Отже, результати проведених досліджень вперше показали, що в структурі мікробного ценозу феросфери сталі в чорноземі опідзоленому в присутності пестицидів симазин, лінурон, рамрод, ДНОК та гексилур відбуваються зміни з переважним розвитком еколого-трофічних груп мікроорганізмів, агресивних щодо сталі. Утворення корозійно-небезпечних угруповань феросфери сталі 45 в ґрунтах з зазначеними пестицидами зумовлює відмічену тенденцію інтенсифікації процесу пошкодження сталі. Разом з тим, взаємозв’язок між розвитком корозійно-небезпечних мікроорганізмів та швидкістю корозії сталі не завжди однозначний. Зміни, викликані пестицидами, є специфічними, оскільки визначаються хімічним складом препаратів.

Антимікробні властивості похідних діючої речовини пестициду рамрод щодо корозійно-небезпечних культур мікроорганізмів. Оскільки мікроорганізми є одним з визначальних чинників процесу пошкодження металів в ґрунтах, для попередження їх розвитку використовують сполуки з біоцидною дією.

На першому етапі даної роботи найбільш виражений характер біоцидної та протикорозійної дії за умов ґрунтової мікробної корозії сталі 45 визначено для некондиційних пестицидів рамрод та симазин. Тому наступним етапом наших досліджень було дослідження біоцидних властивостей похідних діючої речовини пестициду рамрод (N1-ізопропіл-N1-феніл-2-хлорацетамід) - 22 азотовмісні гетероциклічні сполуки.

Біоцидні властивості похідних було з’ясовано на культурах сульфат- та залізовідновлювальних бактерій, враховуючи їх високу корозійну небезпечність, особливості фізіології та спільне розповсюд-ження. Асоціативна культура СВБ виявилась чутливою до четвертинних солей піридинію. Зокрема найефективнішим біоцидом серед досліджених похідних виявилась четвертинна сіль стирилпіридинію (хлорид N1-ізопропіл-N1-фенілкарбамоілметил-4-2-феніл-1-етенілпіридинію) - при всіх концентра-ціях, але при концентрації 2,0% діаметр зони пригнічення росту бактерій був максимальним – 51,6±4,5 мм. Сполука, в піридинове кільце якої введено бензил-карбамоіл (хлорид 4-бензилкарбамоіл-N1-ізопропіл-N1-фенілкарбамоілметилпіридинію) мала низькі антимікробні властивості: при концентрації 2,0% діаметр зони пригнічення росту асоціації СВБ становив 9,1±0,6 мм. Ріст D. іndonensis четвертинні солі піридинію не пригнічували, що, вірогідно, зумовлено відмінностями в метаболізмі бактерій.

Біоцидні властивості щодо асоціативної культури сульфатвідновлювальних бактерій визначено для бізарядної сполуки – біс-четвертинної солі (1,4-діізопропіл(феніл)карбамоіл-метил-1,4-діазобіцикло2.2.2октан) при концентрації 2,0%. При цьому діаметр пригнічення росту бактерій становив 21,8±0,7 мм.

Підвищення біологічної активності сполук відмічають за наявності в молекулі крім азоту й інших гетероатомів, таких як сірка, фосфор, кисень Савельев, 1997. Нашими дослідженнями показано досить високу біоцидну дію тіазольних похідних щодо D.. Так, сполука з позитивно зарядженим атомом азоту в тіазоль-ному кільці (хлорид 2-аміно-3-фенілкарбамоілметил-1,3-бензотіазол-3-ій) виявила біоцидні властивості при всіх концентраціях, при концентрації 2,0% діаметр зони пригнічення 30,0±1,2 мм. Також з’ясовано, що тіазольна сполука з двома N-фенільними радикалами (3-феніл-2-феніліміно-1,3-тіазолан-4-он) забезпе-чувала пригнічення росту як D. іndonensis (діаметр зони пригнічення 26,7±3,4 мм при концентрації сполуки 0,2%), так і асоціативної культури СВБ (20,0±0,6 мм при концентрації 2,0%).

Показано пригнічення росту асоціативної культури СВБ сполукою з пара-бромфеноксильним радикалом (N1-ізопропіл-N1-феніл-2-(4-бромфеноксі)ацетамід) лише при концентрації 2,0% - 25,0±5,1 мм.

Визначено, що досліджені корозійно-небезпечні групи мікроорганізмів нечутливі до хіназолонів, тіоефірів бензолу, тетразолу, триазолу, імідазолів, отриманих на основі N1-ізопропіл-N1-феніл-2-хлорацетаміду. Проте невисоку активність щодо асоціації сульфатвідновлювальних бактерій виявлено для двох похідних пестициду рамрод, що є тіоефірами триазолу і містять в положенні С5 триазольного циклу аміногрупу (N1-ізопропіл-N1-феніл-2-(4,5-діаміно-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетамід) або етильний радикал (N1-ізопропіл-N1-феніл-2-(4-аміно-5-етил-4Н-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетамід) при концентрації 2,0%. При цьому діаметр пригнічення росту бактерій становив 23,9±1,0 та 13,6±0,7 мм відповідно, але асоціативна культура СВБ була гетерорезистентною до зазначених речовин.

Асоціативна культура залізовідновлювальних бактерій вираженої чутливості до розчинів азотовмісних гетероциклічних похідних не проявила.

Таким чином, встановлено високу біоцидну активність щодо сульфатвіднов-лювальних бактерій для похідних діючої речовини пестициду рамрод (четвертинних солей піридинію, сполук з тіазольним кільцем, сполуки з пара-бромфеноксильним радикалом).

Для розробки практичних рекомендацій застосування похідних діючої речовини пестициду рамрод для захисту сталі від пошкодження, індукованого СВБ, нами визначено механізм їх інгібуючої дії на ріст мікроорганізмів.

При цьому показано, що N1-ізопропіл-N1-феніл-2-хлорацет-амід проявляє конкурентний характер інгібування (рис.3) та має невисоку спорідненість до субстрат-зв’язуючого центру кліти-ни (константа інгібування (Кі) становить 6,3·10 –4 М).

Біоцидні властивості похідних пестициду рамрод (четвертинна сіль сти-рилпіридинію та тіазольна сполука з дво-ма N-фенільними радикалами), для яких визначено неконкурентний характер інгі-бування росту сульфатвідновлювальних бактерій (рис.4), не залежать від концентрації субстрату. Це надає їм перевагу для використання як інгібіторів МІК. Проте низькі значення Кі зазначених похідних (11,8·10-4 та 4,4·10-4 М відповідно) вказують на їх неспецифічну дію.

Отже, це дозволяє рекомендувати досліджені похідні лише в комплексі з іншими речовинами-біоцидами сульфатвідновлювальних бактерій.

Ефективність попередження мікробного пошкодження сталі 45 біоцида-ми – похідними діючої речовини пестициду рамрод. Як один з перспективних засо-бів боротьби з мікробними пошкодженнями металів розглядається застосування речовин, що мають поряд з біоцидними властивостями здатність гальмувати електрохімічну корозію.

З’ясовано, що за умов низької чисельності корозійно-небезпечних груп мікро-організмів у водних витяжках ґрунту (чорнозем опідзолений), похідні з четвертин-ним азотом (четвертинна сіль стирилпіридинію та хлорид 2-аміно-3-ізопропіл-3-феніл-карбамоілметил-1,3-бензотіазол-3-ій) стимулювали пошкодження сталі. Високі проти-корозійні властивості проявила тіазольна сполука з двома N-фенільними радикалами (захисний ефект 87%). В структурі її молекули є чотири гетероатоми (кисень, сірка, два азоти). Зокрема сірка та азот в циклі з неподіленими електронними парами здатні утво-рювати з d-орбіталями заліза міцні адсорбційні зв’язки, що й забезпечило захист сталі. Високі захисні властивості щодо сталі 45 відмічено й для пара-бромфеноксильного похідного (захисний ефект становив 61,5%), але вони нижчі, ніж у рамроду (80%).

Отже, процес пошкодження сталі корозійно-небезпечними мікроорганізмами ґрунту ефективно попереджається дослідженими речовинами-біоцидами, похідними діючої речовини пестициду рамрод: речовиною з пара-бромфеноксильним радика-лом та речовиною з тіазольним кільцем, що містить два N-фенільні радикали. Це дозволить запобігти розвитку мікрофлори, агресивної щодо сталі, і тим самим попередити втрати металу.

Оскільки найнебезпечнішою групою мікроорганізмів-агентів біопошкоджень металів є сульфатвідновлювальні бактерії, нами проведено дослідження їх впливу на електрохімічну поведінку сталі 45 в присутності похідних-біоцидів.

Характер анодних та катодних поляризаційних кривих металу в культурах суль-фатвідновлювальних бактерій вказував на інтенсифікацію руйнування металу (рис.5-6). Зокрема нами показано зміщення стаціонарного потенціалу сталі 45 в негативну область в досліджених асоціативній та чистій (D. іndonensis) культурах сульфатвідновлювальних бактерій, порівняно зі стерильним середовищем Постгейта “В”.

Визначено, що захист сталі від пошкодження, індукованого асоціацією СВБ, забезпечували діюча речовина пестициду рамрод та її пара-бромфеноксильне похідне (рис.5). На першу добу експерименту вони гальмували корозійний процес, особливо в анодній області (Za=86% та 80% відповідно). Але похідне було більш ефективним інгібітором біопошкодження, оскільки гальмувало також і катодний процес (на 11%) та забезпечувало більш високий захисний ефект при вільній корозії. Проте, незважаючи на раніше відмічені нами антимікробні властивості сполуки з пара-бромфеноксильним радикалом, в 5 діб вона стимулювала пошкодження сталі в інокульованих середовищах (рис.6).

Встановлено збільшення інгібуючих властивостей діючої речовини пестициду рамрод з часом. Зокрема на 5-ту добу ступінь гальмування анодного процесу корозії становив 99% (рис.6).

Вперше показано, що біопошкодження металу сульфатвідновлювальними бак-теріями ефективно попереджається четвертинною сіллю стирилпіридинію (рис.6). При цьому речовина проявляла вищі інгібуючі властивості, ніж в стерильному середовищі. Це пояснюється як біоцидними властивостями речовини, так і зміною структури подвійного електричного шару та гальмуванням перебігу електродних реакцій внаслідок зниження концентрації часток, які беруть участь в реакції суль-фатредукції (Hадс, Н+). Присутність в інокульованих агресивних середовищах зазначеної солі піридинію збільшувало поляризацію окремих катодних та анодних реакцій корозії сталі, зміщувало їх стаціонарні потенціали в більш позитивний бік (рис.6). Нами з’ясовано, що четвертинна сіль стирилпіридинію є інгібітором анод-ного типу. На першу добу гальмування вільної корозії становило 83,0%, її анодного процесу - 98,4%, катодного - 58,0%. На 5-ту добу Zст = 91,0%, Zа = ,5%, а катодний процес стимулювався. Протикорозійні властивості сполуки відмічено й в культурі D. indonensis (Zст = ,0%, Za ,1%).

Отже, біопошкодженню сталі сульфатвідновлювальними бактеріями ефек-тивно запобігало похідне діючої речовини пестициду рамрод – четвертинна сіль стирилпіридинію. Діюча речовина пестициду рамрод проявляла нижчі захисні властивості. Для речо-вини з пара-бромфеноксильним радикалом захисну дію відмічено лише в першу добу експерименту. Всі речовини є інгібіторами переважно анодного типу. Це від-криває можливість переробки некондиційного пестициду рамрод з отриманням ефективних інгібіторів-біоцидів для захисту сталі від мікробних пошкоджень.

висновки

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.