ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

ВОРОБЕЦЬ НАТАЛІЯ МИКОЛАІВНА

УДК 577.152.1: 577.152.2:157.175.1: 547.979.8: 546.81:546.23

ЕНДОГЕННІ МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ СТІЙКОСТІ РОСЛИН ДО ДІЇ СВИНЦЮ ЗА УЧАСТЮ АСКОРБАТ-ГЛУТАТІОНОВОЇ СИСТЕМИ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Чернівці – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті

імені Данила Галицького та Львівському національному

університеті імені Івана Франка

Науковий консультант - академік УААН, доктор біологічних наук, професор СНІТИНСЬКИЙ Володимир Васильович, Львівський державний аграрний університет, завідувач кафедри біології та агроекології, ректор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Мещишен Іван Федорович,

Буковинська державна медична академія,

завідувач кафедри медичної хімії

член-кор. НАН України, доктор біологічних наук, професор

Блюм Ярослав Борисович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії,

завідувач відділом клітинної біології та біотехнології,

заступник директора з наукової роботи

доктор біологічних наук, професор

Вінниченко Олександр Миколайович,

Дніпропетровський національний університет,

завідувач кафедри фізіології рослин і екології,

директор НДІ біології

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист відбудеться 17 березня 2004 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки (ІІІ корпус університету, аудиторія

№ 81), м. Чернівці, 58012, Україна

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки, 23, Чернівці, 58012, Україна

Автореферат розісланий 16 лютого 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Г.П. Копильчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Свинець належить до елементів, потреба яких для живих організмів, зокрема для рослин, не доведена, однак він зустрічається у складі всіх рослин. У ряді регіонів України забрудненість ґрунтів свинцем, в т.ч. рухомими формами, перевищує допустимі рівні в 1,5 – 14 разів (Костишин та інш., 1995; Мусієнко та інш., 2002; Руденко та інш., 1997; Тютюнник, Горлицкий, 1998). Найбільшу небезпеку для біоти становлять розчинні та рухомі форми свинцю, частка яких від 25 до 76 % від загальної кількості. Потрапляючи в організм рослини, свинець по ланцюгах живлення надходить до організмів тварин і людини, викликаючи значні порушення їх метаболізму. У наш час існує не лише необхідність вивчення екологічної ситуації, а й уміння протидіяти розвиткові забруднення природного оточуючого середовища сполуками важких металів. Погіршення екологічної ситуації істотно загострює проблему доконечного вивчення механізмів, за участю яких рослини можуть запобігати проникненню свинцю або уникати його шкідливої дії. Для нормального протікання біохімічних процесів у рослинному організмі є діапазон концентрації іонів свинцю, перевищення яких модулює низку негативних для метаболізму реакцій. Свинець належить до екологічних чинників, дія яких викликає в рослин стрес (Morange, 1997). Однією з реакцій на стрес є продукція активних форм кисню (АФК) (Inze, Van Montagu, 1995; Davies, 1998; Jamieson, 1998; Hancock, Neill, 1999; Барабой, Сутковой, 1997; Меньщикова, Зенков, 1993; Willekens et al.,1997; Rucinska et al., 1998), які здатні ініціювати пероксидне окиснення ліпідів та білків, започатковувати нові ланцюги вільнорадикальних процесів. Захист від АФК здійснюється на різних рівнях і приводить до нейтралізації АФК та/або відновлення продуктів окисного пошкодження ДНК, білків, ліпідів (Барабой, Сутковой, 1997; Modaras-Ferreira et al., 1996).

Зміна активності ферментів є первинним проявом стресу від надлишку іонів важких металів, що зумовлює каскад інших, вторинних, ефектів: гормональний дисбаланс, дефіцит необхідних елементів, інгібування фотосинтезу та азотного обміну, зміну водного режиму тощо, які в свою чергу збільшують гальмування росту рослин (Блюм, 2002, 2003; Костишин та інш., 1997; Мусієнко, Таран, 1997; Smirnoff, 1998; Klobus et al., 2002). Здатність ферментних систем знешкоджувати наслідки впливу іонів важких металів або пристосуватись шляхом зміни конформації молекули забезпечує підтримання гомеостазу рослинного організму. Знання біохімічних механізмів, які лежать в основі реакції рослин на дію іонів свинцю, та забезпечення їх стійкості мають суттєве значення для розуміння фундаментальних основ адаптації, розробки підходів для одержання стійких сортів і форм рослин, використання стійких видів з метою фіторемедіації.

Усе викладене стало підставою для дослідження механізмів стійкості рослин до дії іонів свинцю та способів впливу на них з метою корекції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є частиною наукових тематик: Бс 322Б „Світло-лазерна фотоактивація росту рослин”, № 0197U018119 держреєстрації; Бр 462Б “Відбір фізіолого-біохімічних маркерів стресу в рослин до дії промислових ксенобіотиків”, № 0193U041333 держреєстрації; “Регуляторна роль іонів кальцію у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи клітин”, № IH.07.00.0001.04 держреєстрації та Українсько-угорського проекту „Вивчення мобілізації, акумуляції, поширення і біоремедіації важких металів у забруднених екосистемах верхнього басейну ріки Тиса”, № М/490-2003 держреєстрації.

Мета і задачі дослідження. З’ясувати особливості функціонування антиоксидантної системи проростків квасолі та соняшника за умов дії іонів свинцю, як складової частини ендогенних механізмів формування стійкості рослин, а також можливості екзогенної регуляції процесу іонами селену та абсцизовою кислотою (АБК).

Для досягнення поставленої мети було необхідно:

- дати оцінку змін інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів, концентрації пероксиду водню в сім’ядолях і зародкових частинах насіння, а також коренях і пагонах рослин, вирощених за наявності іонів свинцю в поживному розчині й сумісної їх дії з селенітом, та в комбінації з абсцизовою кислотою;

- з’ясувати рівні накопичення іонів свинцю в сім’ядолях і зародкових частинах насіння, а також коренях і пагонах рослин, вирощених за наявності іонів свинцю в поживному розчині та їх сумісної дії з селенітом;

- установити водний статус рослин унаслідок дії іонів свинцю і їх сумісної дії з селенітом, та абсцизовою кислотою;

- установити рівень азотного обміну в рослинах під дією іонів свинцю та селеніту;

- вивчити зміни фотосинтетичних процесів унаслідок дії іонів свинцю та селеніту за змінами концентрації фотосинтетичних пігментів і компонентів віолаксантинового циклу;

- визначити концентрацію глутатіону, аскорбінової кислоти та її метаболітів у рослинах, вирощених за наявності іонів свинцю в поживному розчині та за сумісної дії іонів свинцю й селеніту;

- дослідити активність каталази, пероксидази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіон-S-трансферази, аскорбатпероксидази, монодегідроаскорбатредуктази, дегідроаскорбатредуктази, аскорбатоксидази за дії іонів свинцю та їх сумісної дії з селенітом;

- дослідити ефективність екзогенного впливу селеніту та абсцизової кислоти на біохімічні та фізіологічні процеси в рослин за умов дії на них іонів свинцю.

Об’єкт дослідження – механізм дії іонів свинцю на рослини соняшника та квасолі.

Предмет дослідження – показники пероксидного окиснення ліпідів, азотного обміну та фотосинтезу, активність віолаксантинового циклу, водний статус, активність ферментів антиоксидантної аскорбат-глутатіонової системи рослин під дією на них іонів свинцю, а також за умов сумісної дії з іонами селеніту й абсцизовою кислотою.

Методи дослідження – біохімічні, фізіологічні, фізико-хімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження та дано оцінку активності антиоксидантного захисту рослин унаслідок дії іонів свинцю.

Установлено, що внаслідок дії на рослини іонів свинцю в них змінюється активність ферментів азотного обміну, концентрація фотосинтетичних пігментів, зокрема компонентів віолаксантинового циклу.

Показано, що водний статус рослин залежить від впливу на них іонів свинцю.

Виявлено активацію антиоксидантної аскорбат-глутатіонової системи в результаті дії низьких концентрацій іонів свинцю і пригнічення її високими протягом періоду проростання та початкового росту рослин.

Вперше встановлено, що іони селеніту в низьких концентраціях позитивно впливають на ріст та розвиток рослин, активуючи процеси азотного метаболізму та фотосинтезу.

Доведено, що за умов дії на рослини іонів свинцю антиоксидантний захист активується екзогенною дією селеніту та абсцизової кислоти. На поживних середовищах з ацетатом свинцю абсцизова кислота через активацію ферментів асиміляції аміаку та відновлення водного статусу стимулює ростову активність коренів і пагонів рослин.

Вперше виявлено, що інтенсивність проростання насіння рослин за умов наявності іонів свинцю залежить від рівня вимушеного спокою насіння та наявності початкового рівня аскорбінової кислоти.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поглиблюють уявлення про механізми розвитку стресу в рослин унаслідок дії іонів свинцю, що відкриває можливість пошуку диференційованого підходу до подальшого вивчення адаптаційних можливостей рослин.

У результаті проведених досліджень виявлено нові властивості аскорбат-глутатіонової системи для забезпечення стійкості рослин в умовах свинцевого навантаження.

Експериментально доведено, що низькі концентрації селеніту натрію сприяють адаптації рослин до дії іонів свинцю на перших етапах їх росту.

Встановлено, що абсцизова кислота не перешкоджає проникненню іонів свинцю в органи рослин, однак сприяє адаптації до його дії.

Отримані результати дають змогу добирати види рослин, які, очевидно, будуть стійкими на ґрунтах з підвищеними концентраціями іонів свинцю з метою їх застосування для фіторемедіації забруднених ґрунтів.

Матеріали дисертації можуть бути використані в курсах лекцій для студентів з біохімії та фізіології рослин, екології, фармакогнозії. Вони стали основою для виконання низки дипломних і курсових робіт студентами біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка, а також дисертаційної роботи на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук під керівництвом здобувача.

Особистий внесок здобувача полягає в безпосередньому обґрунтуванні концепції роботи. Автор самостійно розробив дослідницьку програму, налагодив методики та схеми проведених досліджень і виконав більшість біохімічних, цитохімічних і фізико-хімічних досліджень (за винятком визначення мітотичного індекса).

Розроблено та обґрунтовано методичні підходи для вивчення біохімічних механізмів активності антиоксидантного захисту рослин унаслідок дії іонів свинцю. Опрацьовано дані літератури, узагальнено одержані результати, сформульовано висновки та практичні рекомендації.

При сумісному виконанні дослідів із співробітниками Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Інституту фізіології рослин і генетики НАН України та Львівського національного університету імені Івана Франка, вони є співавторами відповідних публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, були представлені на наукових конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка 1997-2002 р., 2nd Conference on Progress in Plant Breeding to growth Regulation (Mosonmagyarovar-Hungary, 1998); Міжнародній конференції „Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998); The 11th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology (Varna, Bulgaria, 1998); International Symposium on Plant Biotechnology (Kyiv, 1998); I Всеукраїнській науковій конференції „Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Тернопіль, 1998); IV з’їзді товариства фізіологів рослин Росії (Москва, 1999); Міжнародній конференції „Проблеми сучасної екології” (Запоріжжя, 2000); Congress of the FESPS (Budapest, Hungary, 2000), VII Молодіжній конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі (Санкт-Петербург, 2000); International scientific conference “Growth, Development and Productivity of Plants, Theoretical and Practical Problems” (Babtai, Lituania, 2000); 53-ій науково-технічній конференції студентів та аспірантів УкрДЛТУ (Львів, 2001); Шостій міжнародній конференції „Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях” (Москва, 2001); XI з’їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001); 17th International Conference on Plant Growth Substances (Brno, Czech Republic, 2001); International Symposium “Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems (ISPAS)” (Kyiv, 2001); Міжнародної наукової конференції „Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм рослин (Тернопіль, 2001); Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів „Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 2001); Fifth conference on Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants (Nice, France, 2001); VІІІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); III з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); 4th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cell Activation : Biological Signals and Their Target Enzymes” (Wrocіaw, Poland, 2002); IV Міжнародній науковій конференції „Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку” (Донецьк, 2003).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені в 46 публікаціях, у тому числі 26 статтях (з них - 11 одноосібних), які опубліковані в наукових фахових виданнях, та у 21 тезах доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису об’єкта та методів досліджень, опису отриманих результатів, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел (705 назв). Робота викладена на 324 сторінках, містить 60 таблиць, 35 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, завдання та методи досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи, зазначено особистий внесок здобувача і апробацію результатів дисертації.

У першому розділі систематизовано й узагальнено літературні результати щодо сучасної теорії стресу, проаналізовано експериментальні дані стосовно механізмів стійкості рослин до дії стресових факторів. Крім того, проаналізовано дані про вплив іонів свинцю на фізіолого-біохімічні параметри різних видів рослин, розглянуто участь низькомолекулярних антиоксидантів і ферментів їх утворення та метаболізму в захисті від АФК.

Другий розділ присвячений матеріалам і методам дослідження: тут описано об’єкти дослідження, наведено методи та матеріал дослідження, що використані в роботі.

Досліди виконані на соняшнику (Helianthus annus L., сорту Світоч та гібриду Погляд) та квасолі (Phaseolus vulgaris L., сортів Лисецька, Сперанца, Первомайська, Ювілейна), насіння яких надане Інститутом рослинництва імені Юр’єва (м. Харків).

Дослідження проводили за двома схемами. За першою схемою насіння відмивали водою, замочували і пророщували протягом трьох діб у темному термостаті при +23С 1С на поживних розчинах різних варіантів. Через три доби проростки пересаджували у водні культури і продовжували вирощувати в тих самих поживних розчинах до використання. За другою схемою насіння відмивали водою, замочували і пророщували протягом трьох діб у темному термостаті при + 23 1 С на бідистильованій воді. Через 3 доби проростки пересаджували на поживні суміші різних варіантів. Пророщували насіння в чашках Петрі або в емальованих кюветах. В обох схемах дослідів використовували такі варіанти поживних сумішей: водні розчини ацетату свинцю в концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М; водні розчини ацетату свинцю у концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М разом з 10-8 М та 10-9 М селенітом натрію; водні розчини ацетату свинцю в концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М разом з 10-10 М абсцизовою кислотою. Як контрольні варіанти використовували бідистильовану воду, розчин Кнопа, а також розчин 10-8 М або 10-9 М селеніту натрію та 10-10 М абсцизової кислоти.

Вивчали енергію проростання, схожість насіння та ріст проростків (у соняшника через 3 доби - енергію проростання, через 7 діб – схожість; у квасолі через 4 доби - енергію проростання, схожість – через 8 діб (Тютюрев, 1949). Приріст маси проростків обчислювали за (Гродзинский, Гродзинский, 1964), індекс толерантності рослин - за (Wilkins 1978). Вміст свинцю визначали атомно-адсорбційним методом на спектрофотометрі С-115 М1 в пропан-бутановому полум’ї з використанням електротермічного атомізатора “Графіт-2”, а також на атомно-адсорбційному спектрофотометрі Perkin Elmer model 33000 (Самохвалов и др., 1989). Вміст хлорофілів а та b і каротиноїдів встановлювали у вихідній витяжці пігментів ацетоном без попереднього їх розділення (Васильєва, 1978). Визначення вмісту пероксиду водню проводили колориметрично (Jana, Choudhuri, 1981). Вміст малонового діальдегіду виявляли за накопиченням у тканинах одного з кінцевих продуктів – малонового діальдегіду (МДА) у кольоровій реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (Health, Packer, 1968). Вимірювали вміст відновленого глутатіону (Lay, Casida 1976). Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951) або за методом Бредфорда (Bradford, 1976). Розподіл іонів свинцю вираховували гістохімічно (Серегин, Иванов, 1997). Лігнін визначали за методом Барської (Барская, 1967). Для з’ясування водного статусу рослин використовували такі показники, як водний потенціал, який визначали рефрактометричним методом (Григорюк и др., 1999), та відносний вміст води (Lazcano-Ferrat, Lovatt 1999). Для обчислення вмісту аскорбінової, дегідроаскорбінової та дикетогулонової кислот використовували методи (Соколовский и др., 1974) у модифікації (Окунцев, Аксенов, 1981). Активність пероксидази (гваяколпероксидази) (КФ 1.11.1.7) визначали за окисненням гваяколу до тетрагваяколу при 420 нм за наявності Н2О2 (Bisbis et al., 1998). Активність аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) та аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2) - за допомогою 2,4-динітрофенілгідразину (Тищенко, 1978). Концентрацію аміаку вимірювали мікродифузним методом (Любимов, 1968). Активність НАДН-глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2.) визначали за швидкістю окиснення НАДН (Joy, 1969). Активність глутамінсинтетази (КФ 6.3.1.2) – гідроксаматним методом (Евстигнеева и др., 1980). Активність каталази (КФ 1.11.1.6) визначали спектрофотометрично при 240 нм (Bisbis et al., 1998). Активність глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9) - за модифікованою методикою Моіна (Моин 1986). Активність аскорбатпероксидази (КФ 1.11.1.11) визначали спектрофотометрично за зменшенням екстинкції при 290 нм при окисненні аскорбату (Shigeoka et al., 1980; Nakano, Asada, 1981). Активність монодегідроаскорбатредуктази (КФ 1.6.5.4) - спектрофотометрично за зміною екстинкції при 360 нм (Miyake, Asada, 1992). Активність аскорбатоксидази (КФ 1.10.3.3) обчислювали за зміною поглинання при 265 нм внаслідок окиснення аскорбінової кислоти (Conklin et al., 1997). Активність глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2) визначали спектрофотометрично (Foyer, Halliwell, 1976) у модифікації (Vanaker et al., 1998) за зміною поглинання при 340 нм. Активність дегідроаскорбатредуктази (КФ 1.8.5.1) визначали спектрофотометрично за зміною поглинання при 265 нм і утворенням аскорбінової кислоти (Foyer et al., 1989; Miyake, Asada 1992).

Результати вимірів опрацьовували статистично, визначаючи середнє арифметичне значення (М) та похибку середнього (m). Вірогідність різниці середніх значень встановлювали за критерієм t Ст’юдента (Плохинский, 1970). Дисперсійний та кореляційний аналіз отриманих результатів здійснювали з використанням пакета комп’ютерних програм “Microsoft Office XP”.

У третьому розділі роботи, який складається з семи частин, викладено результати дослідження та їх обговорення.

Утворення активних форм кисню в рослинах соняшника та квасолі за дії свинцю, а також при сумісній дії з низькими концентраціями селеніту та АБК.

Ми виявили, що малоновий діальдегід утворюється в коренях та пагонах тридобових рослин соняшника на всіх поживних розчинах (табл. 1). Особливо високий його рівень у коренях рослин, вирощених на обох концентраціях іонів свинцю та разом із селенітом натрію: 209,4 –225,4 нмоль г-1 маси сирої речовини, тоді як у контролі вміст МДА був у 5 разів меншим і становив 42,5 нмоль г-1 маси сирої речовини (Р<0,05). У рослин, які росли на розчині селеніту натрію, вміст малонового діальдегіду становив 60,5 нмоль г-1 маси сирої речовини. У пагонах спостерігали подібні закономірності, однак рівень МДА був у кілька разів нижчим.

Вивчення вмісту МДА у частинах проростаючого насіння квасолі показало, що під дією іонів свинцю він підвищується. Найбільша концентрація МДА спостерігалась у коренях і пагонах тридобових рослин, які росли на поживних розчинах 10-3 М ацетату свинцю та 10-3 М ацетату свинцю разом з 10-8М селенітом натрію. При цьому в коренях концентрація МДА в 1,5-2 рази вища, ніж у пагонах.

Найвищий рівень пероксиду водню в коренях і пагонах рослин, які вирощені на найвищій концентрації іонів свинцю та разом з іонами селену. В усіх варіантах дослідів уміст пероксиду водню вищий у коренях, ніж у пагонах.

Таблиця 1

Концентрація малонового діальдегіду в органах квасолі під дією свинцю та селеніту натрію, нмоль• г-1 маси сирої речовини (M±m, n=6)

Варіанти | 3-добові рослини | 8-добові рослини

корені | пагони | корені | пагони

Н2О | 30 3,2 | 28 2,7 | 37 3,2 | 20 3,0

Розчин Кнопа | 20 0,9 * | 20 1,5 * | 29 4,8 | 27 3,6

10-8М Pb2+ | 68 5,9 * | 74 6,5 * | 100 14,8 * | 81 13,0 *

10-3М Pb2+ | 120 13,4 * | 96 4,9 * | 403 34,8 * | 396 28,8 *

10-8М SeO32- | 65 5,8 * | 68 5,6 * | 134 23,8 * | 58 13,5 *

10-8М Pb2+

+10-8М SeO32- | 88 6,9 * | 78 8,9 * | 66 7,8 * | 55 9,5 *

10-3М Pb2+

+10-8М SeO32- | 201 17,8 * | 137 14,2 * | 507 45,3 * | 488 52,1 *

* різниця з контролем (Н2О) вірогідна, Р < 0,05

Особливо високим був уміст Н2О2 у коренях рослин варіантів з 10-3 М ацетатом свинцю. Наявність іонів селеніту разом з високою концентрацією іонів свинцю не запобігала утворенню підвищеної кількості Н2О2.

Щоб виявити, чи проникають іони свинцю в частини насінини під час проростання її на розчинах зі свинцем, використовували гістохімічні методи. Для вивчення проникнення та розподілу іонів свинцю ми також використовували обидва варіанти досліду.

Гістохімічні дослідження рослин першого варіанта досліду показали, що поодинокі ґранули дитізонатів спостерігаються в коренях контрольних рослин квасолі: на ранніх етапах розвитку лише у протодермі та зовнішніх шарах периблеми, а у 12-добових рослин – у пасках Каспарі ендодерми. Форма та розміри клітин кореня при вирощуванні рослин на 10-8 М ацетаті свинцю протягом усього експерименту такі ж, як у контрольних. У 5-добових рослин, вирощених на розчині ацетату свинцю 10-8 М, дитізонати концентрувались у клітинах зовнішніх шарів кореня біля клітинних стінок. У паренхімних клітинах усіх зон кореня також спостерігали відклади дитізонатів, але переважно в середині клітин. У зоні кореневих волосків та проведення дитізонати були зосереджені біля клітинних стінок ендодерми. У камбіальних клітинах і перициклі відкладів дитізонатів не було. У варіанті з сумісним застосуванням 10-8 М ацетату свинцю з 10-8 М селенітом натрію розподіл дитізонатів по тканинах не змінювався, але візуально їх було менше. Аналіз 8- та 12-добових рослин показав, що перерозподілу дитізонатів не відбувалося, хоча інтенсивність забарвлення збільшилась у всіх варіантах досліду.За наявності 10-3 М ацетату свинцю в його комбінації з селенітом натрію відклади дитізонатів спостерігали практично в усіх зонах кореня та в усіх тканинах і квасолі і соняшника. Винятком були клітини камбію, у яких на варіанті з 10-3 М ацетату свинцю у його комбінації з селенітом натрію дитізонатів не було.

Одержані результати свідчать, що клітинна стінка є місцем акумуляції свинцю і можливим бар’єром для його пересування.

При вивченні ходу лігніфікації в шестидобових рослин соняшника контрольного варіанта виявлено, що кутикула добре виражена, ендодерма товстостінна коленхіматозного типу. Цей факт ми відзначаємо вперше, оскільки в паренхімних клітин зірчасто потовщені кути. Кільце провідних пучків майже зімкнуте. Протоксилемні елементи звичайні – 3-5 судин у первинних пучках. Широка зона камбію формує групу досить значних за діаметром вторинних флоемних елементів. Реакція на лігнін є лише у первинних ксилемних елементах кореня та гіпокотиля. Ксилема добре виражена.

На зрізах коренів рослин варіанта 10-8 М Pb(CH3COO)2 кутикула добре сформована. Чітко видно покривну тканину та коленхіму. Паренхіма кори з типовим потовщенням оболонок. Судинні пучки сформовані, протоксилемних елементів з відкладами лігніну 5-6. Добре розвинена вторинна флоема – до 10 ситоподібних трубок. На зрізах гіпокотилів видно зачатки луб’яних волокон. У кільчастих потовщеннях оболонок протоксилемних елементів гіпокотилю є лігнін. У коренях рослин варіанта 10-3 М Pb(CH3COO)2 на зрізах проявляються ознаки деструкції внутрішньої частини осьового циліндра – клітини лізовані, залишились лише ксилемні групи. Паренхіма кори без особливостей, ендодерма без змін. У гіпокотилях слабо виражена ксилемна зона – групи з 3-5 ксилемних елементів. Паренхіма кори нагадує коленхіматозну тканину – видно потовщення оболонок, оболонки своєрідно набрякають і мають зірчасту внутрішню структуру.

При вирощуванні рослин на 10-8 М Pb(CH3COO)2 приріст коренів та гіпокотилів дво- та тридобових рослин був меншим від контролю, у шестидобових рослин достовірно не відрізнявся від контролю. Це свідчить, що шестидобові рослини вже адаптувались до цієї концентрації свинцю. Приріст коренів та гіпокотилів дво- , три- та шестидобових рослин, які росли на 10-3 М Pb(CH3COO)2, був нижчим від контролю. Як показали наші попередні дослідження 10-3 М Pb(CH3COO)2 є летальною концентрацією для соняшника.

За наявності в поживному розчині 10-8 М іонів свинцю разом з селенітом натрію в однодобових рослин лігніфіковані лише окремі клітини покривів, паренхіми та ендодерми. На третю добу лігнін фіксується частково в метаксилемі, перициклі, а на дев’яту - в ендодермі, ризодермі провідної зони, частково екзодермі.

Дослідження лігніфікації в рослин, які пророщувались за наявності в поживному розчині 10-3 М іонів свинцю разом з селенітом натрію показало, що однодобові рослини найсильніше лігніфіковані в ендодермі, лігніфіковані також деякі клітини паренхіми та метаксилеми. Клітини покривів, ендодерми та метаксилеми кореня і пагона тридобових рослин сильно лігніфіковані. На дев’яту добу всі зазначені клітини містили лігнін.

При наявності в поживному розчині 10-8 М іонів свинцю разом з селенітом натрію в однодобових рослин лігніфіковані лише окремі клітини покривів, паренхіми та ендодерми. На третю добу лігнін фіксується частково в метаксилемі, перициклі, а на дев’яту - в ендодермі, ризодермі провідної зони, частково екзодермі.

Отримані результати свідчать про те, що лігніфікація клітин ендодерми може обмежувати пересування іонів свинцю симпластом. Процес лігніфікації клітинних стінок, принаймні частково, є пероксидаза/Н2О2 – залежним процесом (Ros Barcelo, 1999), а механізми захисту включають активацію антиоксидантної системи за участю пероксидаз (Reddy, Prasad, 1992; Meksongsee, Wongkaew, 1991; Shaw, 1995). Хоча є роботи, які заперечують це твердження (Lagrimini et al., 1997).

Вплив різних концентрацій ацетату свинцю, а також його сумісної дії з низькими концентраціями іонів селеніту та абсцизовою кислотою на ростові процеси в рослин

Залежно від концентрації іонів свинець впливає на схожість соняшника, а селеніт у застосованій концентрації сприяє цьому процесу. Відзначено позитивний вплив селеніту на енергію проростання насіння.

При сумісній дії іонів свинцю та селеніту на рослини спостерігався достовірний позитивний вплив останнього на процеси проростання. Особливо це помітно при дії високих концентрацій іонів свинцю.

У рослин соняшника, пересаджених на розчини ацетату свинцю після 3-добової експозиції на воді (II варіант досліду), їх вплив на ростові процеси залежав від концентрації солей та тривалості їх дії. Вже в пяти добових проростків достовірно проявляється інгібуюча дія високих концентрацій свинцю на ріст коренів і пагонів. Цей вплив посилюється з часом. Довжина кореня рослин на найнижчій із застосованих нами концентрацій свинцю мало відрізнялась від того, що у вирощених на розчині Кнопа. Однак маса коренів була вищою в контрольних рослин. Селеніт, який ми використовували, у моносольовому розчині позитивно впливав на ріст коренів, однак сумісно з іонами свинцю достовірно позитивного впливу ми не виявили. Маса та довжина пагона на концентрації 10-3 M Pb(CH3COO)2 разом з 10-8 M Na2SeO3 була нижчою, ніж при вирощуванні на інших варіантах поживного розчину. Найбільшою довжина та маса пагонів рослин була при вирощуванні їх на розчині Кнопа. Така ж закономірність у цілому збереглась до 7-ої доби вирощування. Однак у 7-добових рослин 10-8М ацетат свинцю проявляє стимулюючу дію на ріст коренів та приріст їх біомаси. Найменшими всі показники (довжина та маса коренів і пагонів) у 5-, 7- і 12-добових рослин були при вирощуванні їх на поживному середовищі з 10-3 М ацетаті свинцю.

Те, що селеніт у моносольовому розчині та разом з іонами свинцю достовірно сприяють росту рослин, підтверджується тим, що приріст біомаси 16 добових рослин соняшника був найвищим у тих з них, які вирощувались на 10-8М ацетаті свинцю або разом з 10-8 М селенітом.

Індекс толерантності рослин виявляв подібну закономірність. За наявності іонів селеніту в розчині зі свинцем індекс толерантності на відповідних розчинах підвищувався.

Отже, нами встановлено, що при застосуванні моносольового розчину ацетату свинцю спостерігається інгібуюча дія високих його концентрацій на ріст коренів, меншою мірою - пагонів. Цей вплив посилюється з часом. У варіантах із застосуванням селеніту відзначено його деякий стимулюючий вплив на ріст соняшника.

Збільшення кількості бічних коренів у рослин, які, крім іонів свинцю в поживному розчині, містили іони селену, може свідчити про позитивну дію останніх на ростові процеси та проліферацію вторинної меристеми коренів. Збільшення кількості бічних корінців повинно поліпшити водний статус рослин.

Застосування абсцизової кислоти не лише привело до 3-4-кратного збільшення кількості бічних корінців, але й до появи додаткових у нижній частині гіпокотиля.

Одночасно, при високих концентраціях іонів свинцю у розчині, відбувається їх накопичення і в зародкових осях, і в сім’ядолях порівняно з контролем (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст іонів свинцю в зародкових осях та сім’ядолях тридобових рослин квасолі, мкг·г-1 маси сухої речовини

Варіант досліду | Н2О | розчин Кнопа | 10-8 М Pb2+ | 10-3 М Pb2+ | 10-8 М Pb2+ +

10-10 М АБК | 10-3 М Pb2+ +

10-10 М АБК | 10-10 М АБК | розчин Кнопа + 10-10 М АБК

зародкова вісь | 5 | 5 | 5 | 79,0 1,56 | 5 | 122,0 ± 1,0 | 5 | 5

сім’ядолі | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 53,0 2,10 | 0,5 | 12,0 ± 0,20 | 0,5 | 0,5

Додавання до поживного розчину АБК сприяє накопиченню свинцю в зародкових осях та зменшує його накопичення в сім’ядолях.

Наведені результати свідчать, що іони свинцю проникають до зародкової осі квасолі і впливають на ріст зародкових корінців, хоча інгібування процесу проростання, яке ми спостерігали в насіння соняшника (Воробець, Микієвич, 2000), не відбувається.

Накопичення АБК і зниження вмісту цитокінінів можуть доповнювати одне одного в інгібуванні росту пагонів і, крім того, введення в рослину одного гормона викликає зміни концентрації інших, тобто може діяти не прямо, а опосередковано, змінюючи концентрацію іншого гормона, а накопичення АБК може бути не лише індикатором, але й активатором процесів, спрямованих на зниження концентрації цитокінінів у рослинах при стресі (Кудоярова и др., 1999). Одержані дані частково підтверджують це припущення. Проте, зміни під впливом низької концентрації АБК, які ми виявили, ймовірно викликані її участю як компонента сигнальної трансдукції. Нещодавно показано, що активні види кисню можуть діяти як вторинний месенджер в АБК сигналізації (Pei et al., 2000; Schroeder et al., 2001; Guan et al., 2000). Оскільки відома продукція активних видів кисню під дією важких металів, у випадку дії іонів свинцю також не виключена їх роль як “розподілювача” шляхів стресової сигналізації.

Азотний обмін рослин унаслідок дії іонів свинцю різних концентрацій та при сумісній дії з іонами селеніту й абсцизовою кислотою

У пагонах п,ятидобових проростків рослин квасолі контрольного варіанта, а також варіанта 10-8 М ацетату свинцю був високий вміст аміаку - в середньому 2,5 мкмоль · г-1 сирої речовини. У рослин, вирощених на 10-3 М Pb2+, вміст аміаку був 1 мкмоль · г-1 сирої речовини. При вирощуванні квасолі на розчині Кнопа, замість Н2О, вміст аміаку в пагонах становив 0,2±0,02, 0,5±0,04 і 1,2±0,1 мкмоль · г-1 маси сирої речовини відповідно в 5-, 7- і 16-добових рослин. У коренях за цих же умов він становив 2,3±0,2, 0,6±0,04 і 1,4±0,1 мкмоль · г-1 сирої речовини відповідно в 5-, 7- і 16-добових рослин. Накопичення NH4+ під дією іонів свинцю в органах рослин може бути пов’язане з недостатньою активністю ферментів у його перетворенні – глутамінсинтетази (ГС) та глутаматдегідрогенази (ГДГ) або зміною його поглинання з поживного розчину. Глутамінсинтетаза є одним з ключових ферментів, завдяки якому неорганічний азот в амонійній формі вводиться у склад амінокислот. Активність ГС у зародкових частинах досліджуваних тридобових контрольних рослин квасолі становила 0,44 ± 0,02 мкмоль ?-глутамілгідроксамату · (хв · г сирої маси)-1. Активність НАДН-ГДГ в контрольних рослин становила 0,016 ± 0,001 нмоль окисненого НАДН · (хв · г сирої маси)-1. Низькі концентрації іонів свинцю (10-8 М) та АБК (10-10 М) активують НАДН-ГДГ. При цьому активність ГС залишається високою. Високий вміст іонів свинцю у поживному розчині (10-3 М) інгібує активність ГДГ, але водночас підвищується активність ГС порівняно з контролем.

Дія абсцизової кислоти, яка викликає зміну активності ГС та ГДГ, за наявності іонів свинцю в поживному розчині може бути непрямою. Відомо, що в рослинах під час стресу, особливо водному дефіциті, накопичується пролін (Lazcano-Ferrat, Lovatt, 1999), попередником якого є глутамінова кислота, біосинтез якої лімітується активністю ГДГ та ГС. Оскільки абсцизова кислота контролює водний статус рослин (Ludewig et al., 1988), є медіатором програм розвитку та інтегратором внутрішньоклітинних сигналів для оптимізації росту рослин та їх виконання (Grill, Himmerbach, 1998), проявляється її позитивний вплив на активність ГДГ та ГС у зародкових частинах рослин квасолі внаслідок дії на них іонів свинцю.

Проведені дослідження показали, що в сухих зародкових осях квасолі наявна активність ГС і ГДГ. Вже через 6 год від початку набрякання активність ГС збільшується в 4 рази, потім знижується, а на 18 год знову зростає і стає більшою за контрольну в 2 рази. Активність ГДГ збільшується в процесі набрякання насіння впродовж 18 год практично лінійно.

Із часом активність ГС змінюється. Виявлено, що вже в п’ятидобових рослин помітна різниця в активності ГС залежно від варіанта досліду (рис. 1). Найвища активність відзначена в пагонах і коренях рослин, які росли на розчині Кнопа та 10-8 М ацетаті свинцю. У рослин, які росли на воді та розчинах ацетату свинцю 10-5М і 10-3М, активність ГС нижча більше як удвічі. Крім того, відзначено, що активність фермента в пагонах значно вища, ніж у коренях.

Рис. 1. Активність глутамінсинтетази в органах квасолі, мкмоль -ГГК (хв мг маси сирої речовини)-1.

З ростом рослин загальні тенденції у відмінностях активності ГС між варіантами зберігаються. В цілому активність ГС у пагонах вища, ніж у коренях на всіх варіантах досліду. Однак на 10-5М та 10-3М ацетаті свинцю активність значно нижча, ніж в обох контролів.

Тобто високі концентрації ацетату свинцю інгібують активність ГС у пагонах і коренях квасолі. Раніше подібні закономірності показані при дії іонів свинцю на рослини пшениці, кукурудзи та соняшника (Vorobets et al., 1998). У наших дослідах активність ГДГ в коренях контрольних рослин та на 10-8М ацетаті свинцю найвища до переходу їх на автотрофне живлення. У 16-добових рослин зростає активність фермента в пагонах і зменшується в коренях. На 10-3М ацетаті свинцю активність ГДГ в коренях 16-добових рослин нижча на 2 порядки порівняно з 5-ти та 7-ми добовими, а в пагонах вона низька протягом усього досліджуваного періоду, крім пагонів варіанта 10-8 М ацетату свинцю.

ГС і ГДГ – це ферменти, через які проходять два шляхи асиміляції амонію, життєво важливі для рослини. Один шлях – глутамілсинтетазний – необхідний для реасиміляції амонію, утвореного в процесі дезамінування амінокислот, другий – глутаматдегідрогеназний – забезпечує асиміляцію аміаку в мітохондріях, де він може концентруватися, не завдаючи шкоди рослині.

Показано, що через 6 год від початку набрякання насіння квасолі збільшуються активності АлаАТ і АспАТ, відповідно в 7,0 і 1,5 раза, потім їх активності зменшуються. Звертає на себе увагу паралельне збільшення вмісту аланіну та аспарагіну впродовж 6 год та зменшення вмісту цих амінокислот в наступні 6 год.

При рості рослин на моносольових розчинах ацетату свинцю та селеніту натрію в концентрації 10-8 М активність АспАТ висока і в коренях, і в пагонах, але нижча, ніж у контролі 1 (у коренях) та в контролі 2 (у пагонах). Моносольовий розчин ацетату свинцю у високій концентрації (10-3 М) активує АспАТ в пагонах, а в комбінації з селенітом натрію – у коренях. Однак при подальшому рості на високій концентрації свинцю різко проявляється його гальмівний вплив на активність АспАТ коренів, дещо меншою мірою - на АспАТ пагонів. Селеніт натрію не знімає цієї дії, не зважаючи на те, що загальний уміст білків дещо зростає.

Вплив іонів свинцю на процеси фотосинтезу в рослин

Порівняння вмісту ?-каротину в сім’ядолях насінин, які пророщували за наявності різних концентрацій іонів свинцю в поживному розчині, показало їх прямо пропорційну залежність - за дії 10-8 М Pb2+ вміст ?-каротину найнижчий, на концентрації 10-3 М Pb2+ - найвищий (рис.2).

За наявності іонів свинцю в поживному розчині відбулось деяке зниження вмісту ?-каротину в сім’ядольних листках семи- та дванадцятидобових рослин. Найменша концентрація пігменту спостерігається в сім’ядольних листках, якщо в поживному розчині найвищий уміст свинцю. Знижується вміст ?-каротину і в сім’ядольних листках. Отже, -каротин як антиоксидант особливо важливу роль відіграє при проростанні, коли ще недостатня кількість інших антиоксидантів, а іони селену сприяють підвищенню його вмісту.

Рис. 2. Уміст ?-каротину в сім’ядолях та сім’ядольних листках соняшника, вирощених на поживних середовищах з різною концентрацією свинцю

У сім’ядольних листках активно відбувається синтез хлорофілів а і b за наявності іонів