УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ СВИНАРСТВА

ім. О.В. КВАСНИЦЬКОГО УААН

На правах рукопису

Чирков Олександр Григорович

УДК 612.014,636.4

ФІЗІОЛОГІЧНІ ФАКТОРИ ОПТИМІЗАЦІЇ УМОВ

РОЗВИТКУ В МАТЦІ РЕЦИПІЄНТА ЕМБРІОНІВ СВИНІ, ТРАНСПЛАНТОВАНИХ НЕХІРУРГІЧНО (ТРАНСЦЕРВІКАЛЬНО)

03.00. 13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Полтава – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії фізіології Інституту свинарства імені О.В.Квасницького Української академії аграрних наук

Науковий керівник – доктор біологічних наук,

Мартиненко Ніна Антонівна,

Інститут свинарства ім. О.В.Квасницького УААН,

головний науковий співробітник лабораторії фізіології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук,

Бусенко Олександр Трохимович,

професор кафедри виробництва молока та яловичини Національного аграрного університету, Кабінет Міністрів України

кандидат біологічних наук,

Близнюченко Олександр Григорович,

доцент кафедри розведення та генетики сільськогосподарських тварин Полтавської державної аграрної академії

Провідна установа – Інститут тваринництва УААН

Захист відбудеться 28 квітня 2006 р.

о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради

(К.44.351.01) при Інституті свинарства ім. О.В.Квасницького УААН

36006, м. Полтава, вул. Шведська Могила, 1.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту свинарства імені О.В.Квасницького УААН, м. Полтава, вул. Шведська Могила, 1

Автореферат розісланий 27 березня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.І.Підтереба.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність теми. Програми ДНК-технологій мають відіграти основну роль у селекції сільськогосподарських тварин ХХІ сторіччя, і сьогодні вони не задіяні лише в лічених країнах світу. Висока вартість цих робіт потребує спрощення і здешевлення окремих ланок біотехнологічного процесу і, перш за все, невід’ємної кінцевої його ланки – трансплантації реконструйованих ембріонів. Ця ланка вимагає наявності висококваліфікованих кадрів, спеціальних приміщень і дорогого обладнання, а також спеціального післяопераційного догляду реципієнтів, оскільки і донині в цих технологіях застосовується хірургічний спосіб трансплантації. Тому за останнє десятиріччя істотно зросла кількість досліджень, присвячених розробці нехірургічної (трансцервікальної) трансплантації ембріонів свині [Killian D.B., Steawart, 1991; Reichenbach H.D. et al., 1993; Galvin J.M. et al., 1994; Hazeleger W., Kemp B., 1994; Li J. et al., 1996; Yonemura I. et al., 1996; Kobayashi S. et al., 2000; Beatty D., 2001; Martinez E.A. et al., 2004]. Всі ці способи базуються на конструюванні пристроїв, здатних долати опір цервікса (cervix uteri) механічним шляхом, і у більшості випадків вимагають повної анестезії реципієнта і фіксації його на операційному столі або седації для гальмування скорочень матки внаслідок подразнення. Отже, виникає необхідність розробки альтернативного, атравматичного, способу введення ембріонів у матку на основі використання фізіологічних закономірностей динаміки проникності цервікса свині.

Ефективність застосування відомих способів нехірургічної трансплантації ембріонів за результатами опоросів у реципієнтів значно нижча – від 9 до 64%, ніж за умов хірургічної трансплантації – від 53 до 80% і вище [Holtz W.,1988; Cameron R.D. et al., 1989; Brussow K.-P., 1990; Galvin J.M. et al., 1994; Мартиненко Н.А. та ін., 1995], а розміри гнізда поросят – від 3,1±1,6 до 7,4 ±3,2 – не відповідають видовій нормі. Причини цього залишаються до кінця не з’ясованими, тому вивчення фізіологічних факторів, що від них залежить виживання ембріонів донора, має теоретичне і практичне значення, оскільки може бути використане для розробки способу оптимізації умов їх розвитку у матці реципієнта і підвищення виходу поросят трансплантаційного походження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною тематичного плану науково-дослідних робіт Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького УААН „Розробити технологію банку штучних ембріонів в генно-інженерних роботах з використанням нехірургічної трансплантації” (№ державної реєстрації 0197U003281).

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження – розкрити закономірності динаміки проникності цервікса свині протягом естрального циклу і початкових стадій вагітності, на підставі чого розробити спосіб нехірургічної трансплантації ембріонів і визначити фізіологічні фактори оптимізації умов розвитку ембріонів донора в організмі реципієнта.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:–

розкрити закономірності динаміки проникності цервікса протягом естрального циклу та початкових (доімплантаційних) стадій вагітності свині і визначити межі доступного періоду здійснення трансцервікальної трансплантації ембріонів;–

розробити спосіб нехірургічної трансплантації ембріонів (НХТЕ) на основі використання особливостей моторики матки свині протягом естрального циклу і розробити конструкцію приладу для здійснення способу;–

визначити ефективність розробленого способу НХТЕ при використанні інтактних (незапліднених) реципієнтів і з’ясувати причини випадків відновлення ними циклів;–

дослідити можливість оптимізації маткового середовища реципієнта шляхом штучного осіменіння еякулятом з убитими сперміями; –

визначити ефективність застосування НХТЕ спарованим реципієнтам; –

розробити спосіб оптимізації умов розвитку ембріонів донора у матці спарованого реципієнта з метою підвищення виходу поросят трансплантаційного походження.

Об’єкт дослідження – одержання приплоду свиней шляхом нехірургічної трансплантації ембріонів.

Предмет дослідження – фізіологічні фактори оптимізації умов розвитку у матці реципієнта ембріонів свині, трансплантованих трансцервікально.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше розкрито особливості динаміки проникності цервікса свині протягом естрального циклу і початкових (доімплантаційних) стадій вагітності та визначено пов’язані з цим граничні часові межі НХТЕ. Вперше використано фізіологічні особливості репродуктивного апарату свині для атравматичного введення ембріонів у матку. Уточнено дані щодо причин затримки розвитку ембріонів донора, трансплантованих інтактним реципієнтам. Розроблено теоретичне обґрунтування оптимізації умов розвитку ембріонів донора в організмі спарованих реципієнтів за рахунок нейтралізації суперіндукції.

Вперше в Україні і СНД одержано поросят шляхом НХТЕ.

Практичне значення отриманих результатів.

Розроблено принципово новий спосіб нехірургічної трансплантації ембріонів свині, який не потребує механічного подолання опору цервікса;. наркозу, седації і фіксації реципієнтів, і може бути застосований як до свиноматок, так і свинок в умовах свиноферми; розроблено пристрій для здійснення способу. Розроблено спосіб оптимізації умов розвитку ембріонів донора у матці спарованого реципієнта. Новизна засвідчена патентами України.

На підставі виявлених фізіологічних закономірностей розвитку і виживання ембріонів донора в організмі спарованих реципієнтів у зв’язку зі строками парування останніх, ступенем синхронності віку донора і віку матки реципієнта, а також віку ембріонів донора і ембріонів реципієнта підвищено вихід поросят трансплантаційного походження до 76,3±13,3%% при 83,33% опоросів у реципієнтів і розмірі гнізда поросят 9,2±1,06.

Особистий внесок здобувача. Роботи по організації досліджень, хірургічному одержанню ембріонів донора і лапаротомії реципієнтів, були проведені спільно зі співробітниками лабораторії фізіології, а генетичний аналіз приплоду, одержаного від спарованих реципієнтів, було здійснено співробітниками лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В.Квасницького УААН (ІСв УААН), що відбито у авторських публікаціях. Весь комплекс робіт з НХТЕ, аналіз першоджерел і отриманого фактичного матеріалу, формування та обґрунтування висновків і пропозицій проведені особисто здобувачем. Спосіб нехірургічної трансплантації і пристрій для його здійснення, а також спосіб оптимізації умов розвитку ембріонів донора в матці спарованих реципієнтів розроблені разом із співавторами, переліченими у патентах.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи повідомлені і обговорені на розширених засіданнях вченої ради ІСв УААН (2001 – 2004 рр.), Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (Львів, 1994), IY Міжнародній конференції ”Научно-производственные аспекты развития отрасли свиноводства” (Москва, Лесные Поляны, 1997), Міжнародній науково—практичній конференції „Интенсивность производства продуктов животноводства” (Беларусь, Жодино, 2002), Міжнародній науково-практичній конференції “Трансплантація ембріонів як інструмент селекції в новому тисячолітті” (Київ, 2004).

Публікації результатів досліджень. Основні матеріали досліджень опубліковані у 7 наукових статтях (з них 6 у фахових виданнях), 3 патентах і 3 тезах.

Структура и обсяг роботи.

Дисертація викладена на 134 сторінках комп’ютерного тексту, включає: вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки, практичні рекомендації; містить 10 таблиць, 6 рисунків, список літератури, що налічує 243 джерела, з яких 199 іноземних авторів (латиницею).

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконано в лабораторії фізіології і на експериментальній базі Інституту свинарства ім. О.В.Квасницького Української академії аграрних наук згідно наведеної схеми 1. Використано 227 свинок, з яких 42 – в гострому досліді, проведеному в умовах Полтавського м’ясокомбінату, а 185 свинок великої білої, полтавської м’ясної та миргородської порід, віком 6 - 12 міс, живою масою 65 – 150 кг, були під дослідом на експериментальній базі інституту і утримувались по 2-5 голів у станку, а реципієнти після НХТЕ – індивідуально. Годівлю здійснювали згідно кормових норм ІСв УААН. Охоту виявляли щоденно о 8 і 20 год. з використанням кнура-пробника. День першого прояву рефлексу нерухомості („охота”) вважався нульовим днем циклу. За початок охоти вважали середину проміжку часу між двома перевірками – коли свиня ще не прийняла кнура і коли уперше виявила рефлекс нерухомості. На підставі результатів перевірки підбирали за призначеним ступенем синхронності пари донор-реципієнт.

1. Схема досліджень фізіологічних факторів оптимізації умов розвитку в матці реципієнта ембріонів донора, трансплантованих трансцервікально.

Дослідження динаміки цервікальної проникності

тип досліду | кількість тварин

Хронічний, з урахуванням днів естрального циклу | 5

Разовий вимір ТЦП, забій тварин, визначення фази циклу за станом яєчників | 42

Процедура НХТЕ реципієнтам | 75

Досліди з нехірургічної трансплантації ембріонів

Характеристика реципієнтів за типом використання у досліді | використана кількість

реципієнтів | донорів | ембріонів

Інтактні | 18 | 23 | 253

Осіменіння еякулятом з убитими сперміями | 5 | 10 | 86

Спаровані в нормальному режимі | 10 | 10 | 85

Спаровані в режимі затримки | 12 | 17 | 172

Динаміку цервікальної проникності досліджували шляхом введення рідини у матку свині в період розслаблення м’язів цервікса за допомогою зонда штучного осіменіння УЗК-5, оснащеного манометром для реєстрації тиску. Величину тиску, під яким рідина долає опір цервікса в момент його розслаблення і починає перетікати по ендоцервікальному каналу в порожнину матки, позначили як тиск цервікальної проникності (ТЦП). Ембріони від донорів, а також від реципієнтів у процесі лапаротомії одержували шляхом хірургічного вимивання за методом, розробленим [Квасницький О.В. та ін., 1995] і удосконаленим [Мартиненко та ін.,1995] в ІСв УААН.. Трансплантацію здійснювали за власним способом (патент України UA 28926 А, Кл. А 61D 19/04) і розробленим для цього пристроєм (патент України UA № 55203 А, Кл. A 61D 19/04). Середовищем вимивання ембріонів було ФБС Дюльбекко із додаванням антибіотиків – 100 ОД/мл пеніциліну та 0,1 мг/мл стрептоміцину або 40 мкг/мл гентаміцину – і 1% плідної сироватки теляти (10% – для середовища трансплантації). Походження приплоду реципієнтів визначали шляхом ампліфікації мікросателітних локусів S 0097, SW 857, TNFB ДНК донорів, реципієнтів та приплоду з використанням полімеразно-ланцюгової реакції [Саики Р. и др., 1990]. Статистична обробка цифрового матеріалу здійснена з використанням ПЕОМ РС ІТ “Pentium” в середовищі “Windows 98”згідно програми “EXCEL 2000” і методів варіаційної статистики [Меркурьева Е.К.; 1964 Близнюченко А.Г., 2003]: алгоритми вивірені за [Жалдак М.І., Рамський Ю.С , 1984].

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Дослідження динаміки цервікальної проникності впродовж естрального циклу свині і початкових (доімплантаційних) стадій вагітності здійснено в 3 дослідах.

Дослід №1 проведено на 5 статевозрілих, датованих за циклом, свинках. Тривалість хронічного експерименту становила від 9 днів до 29 днів щоденного визначення тиску цервікальної проникності, що охопило від 0,5 до 1,5 естрального циклу. Проникність цервікса під тиском 50-300 мм.рт.ст. мала місце практично впродовж усього циклу, причому середнє значення ТЦП, а також індивідуальні його коливання зазнавали регу-лярних змін (рис.1) Статис-тично вірогідною була різниця між мінімальними показника-ми 1-4 дня і показ-никами від 8 до 19 (-2) дня: р < 0,05 – р < 0, 001.

Рис.1. Зміна тиску цервікальної проникності у свинок великої білої породи залежно від дня естрального циклу.

Дослід №2 проведено за умов однократного вимірювання ТЦП у кожної тварини з наступним її забоєм і визначенням стадії естрального циклу за характерними ознаками вилучених яєчників. Із групи препубертатних 4 тварини були віднесені до раннього препубертатного періоду; ТЦП цих свинок перебував у межах від 120 до 230 мм.рт.ст. при середньому значенні 165±27 мм.рт.ст. У 10 інших свинок цієї групи, що належали пізньому препубертатному періодові, ТЦП коливався від 80 до 220 мм.рт.ст. і склав у середньому 133,5±11,0 мм.рт.ст. Різниця середніх показників була статистично невірогідною (р>0,05). У статевозрілих свинок ТЦП був у межах 50-300 мм.рт.ст. і залежав від фази естрального циклу та ступеня її просунутості. Максимальний ТЦП спостерігався у тварин, що перебували в пізньому діеструсі – ранньому проеструсі, а мінімальний – в еструсі перед овуляцією та ранньому метеструсі при вірогідній (р<0,05 – р<0,001) різниці показ-ників, що репрезентують фази естраль-ного циклу (рис.2).

Рис.2. Тиск цервікаль-ної проникності залеж-но від фаз естрального циклу свині

Дослід №3 із застосуванням процедури НХТЕ 75 інтактним або попередньо спарованим реципієнтам показав, що в межах 3-9 дня естрального циклу цервікс є проникним для рідини у кількості, достатній для цілей НХТЕ, у 84,4% випадків. Усі випадки обмеженої проникності (13,8%) або непроникності (4,6%) припадали на 5-7 день циклу. Виявлено тісний зв’язок цервікальної проникності з добою естрального циклу реципієнтів: коефіцієнт лінеаризованої кореляції R=0,921 (р<0,05). Вірогідної відмінності між незаплідненими і вагітними власними ембріонами реципієнтами за ступенем цервікальної проникності не виявлено. Результати дослідів свідчать про можливість НХТЕ, як мінімум, впродовж 3-9 днів естрального циклу або вагітності реципієнтів.

Розробка способу нехірургічної трансплантації ембріонів свині і пристрою для здійснення способу. В основу розробки способу було покладено робочу гіпотезу про можливість атравматичного трансцервікального введення ембріонів у матку свині при використанні фізіологічних особливостей, властивих даному виду тварин. Спосіб ґрунтується на можливості проходження рідини через канал цервікса під час періодичних хвиль його розслаблення у післяеструсний період під дією обмеженого тиску середовища пересадки. Трансплантаційний зонд вводиться у цервікальний канал лише до упору, без насильного подолання опору маткової його частини в період скорочення м’язів. Пристрій для здійснення способу складається з катетера, оснащеного голівкою, форма якої запобігає втраті середовища з ембріонами, флакона для середовища з поділками ціною 1 мл, трубки із силіконової гуми, обладнаної затискачем (для подачі середовища із флакона в катетер) та балона Річардсона для створення і підтримання тиску у системі. З метою забору ембріонів у катетер, останній обладнаний додатковим пристосуванням. Перша перевірка працездатності пристрою була здійснена шляхом введення за його допомогою забарвленої рідини в матку двох свинок, двократно спарованих і убитих через 72 год. після першого парування і через 15 хвилин після введення барвника. Виявлено вільне його проходження через цервікс і проникнення на глибину 1/2 – 3/4 довжини кожного рогу матки. Результат робочої перевірки було визнано за показник можливості використання приладу для НХТЕ у свиней і подальша перевірка розроблюваних способу і пристрою для його здійснення проводилась в умовах експериментів, результати яких наведено нижче.

НХТЕ інтактним реципієнтам. У досліді використано 18 реципієнтів, яким трансцервікально трансплантували від 7 до 23 (14,0 в середньому) ембріонів від 23 донорів. Ступінь розходження естральних циклів донора і реципієнта коливався від повної синхронності до запізнення реципієнта на 2 доби ( у 72% випадків – на 1 добу).

Перша серія дослідів була проведена з метою визначення результативності НХТЕ 7-м інтактним реципієнтам за умов використання комбінації ранніх бластоцист і морул (4-5 діб) або виключно бластоцист на стадії розширення (6-7 діб) від 10 донорів. Результат був негативний в обох випадках: реципієнти відновили цикли, незважаючи на відмінну якість ембріонів і нормальний перебіг процедури НХТЕ у всіх, за винятком одного, випадках. Істотно більші порівняно з нормальною тривалістю періоди відновлення циклів у 42,86% реципієнтів свідчили про ембріональну смертність, а тому було прийнято рішення дослідити причини переривання можливої вагітності реципієнтів.

Друга серія дослідів з НХТЕ інтактним реципієнтам була здійснена з наступною їх лапаротомією або забоєм і аналізом стану розвитку трансплантованих ембріонів. Використано 11 реципієнтів, яким пересадили 133 ембріони від 13 донорів (12,1 в середньому). Кількість вимитих трансплантантів складала в середньому 41,54% (від 7,1 до 100% ) від числа пересаджених ембріонів. Відсутність ембріонів у змивах трьох 4-5-денних реципієнтів ми пов’язуємо з високим опором їх цервікса або експульсією середовища під час процедури їх введення. Місцем локалізації ембріонів у двох випадках було тіло матки і прилегла до нього ділянка 22 см рогів – обидва реципієнти були 4-денними, тоді як у решти реципієнтів, 6-7-денних за циклом, ембріони були знайдені по всій довжині обох рогів матки при відсутності їх у тілі. Усі живі (68,6% вимитих), а також 28,6% дегенеруючих трансплантантів, перебували на ембріональній стадії більш високій, ніж на момент пересадки, але всі, за винятком ембріонів одного реципієнта, відставали від своєї вікової норми. Ранні бластоцисти звільнились від zona pellucida і досягли стадії, що відповідала 7-й – 10-й добі, за фактичного віку 9-12 діб. Не виявлено залежності результатів НХТЕ від віку ембріонів донора (5-7 діб на день трансплантації), а також ступеня асинхронності циклів пари донор-реципієнт у межах від повної синхронності до відставання реципієнта на 1 добу. У всіх позитивних випадках тривалість рекультивації вимитих ембріонів складала 50-60 хв і була визнана за оптимальну для застосування в подальших дослідах. На підставі цих результатів було зроблено висновок, що, по-перше, застосована нами процедура НХТЕ забезпечує локалізацію ембріонів у рогах матки, їх краніальній частині включно, і, по-друге, причиною відновлення циклу інтактними реципієнтами є затримка у розвитку трансплантованих ембріонів, результатом чого має бути недостатній рівень ембріональних естрогенів у критичні 12-15 дні вагітності і, як наслідок, – лютеоліз.

НХТЕ з попереднім осіменінням реципієнтів еякулятом з убитими сперміями. Виходячи з аналізу літературних джерел, ми дійшли висновку, що природним фізіологічним фактором оптимізації маткового середовища реципієнта можуть бути біологічно активні речовини сперми кнура. НХТЕ незаплідненим реципієнтам позбавляє їх організм природних нейрогуморальних впливів і хімічних речовин, які входять до складу еякуляту, тобто чинників, які у нормі передують і супроводжують початкові стадії ембріогенезу свині. Для перевірки цієї гіпотези провели пошуковий експеримент на 5 реципієнтах, яких через 24 год. від початку охоти осіменили еякулятом з убитими (заморожуванням при –15°С) сперміями у кількості 80 мл, а надалі їм трансплантували 86 ембріонів від 8 донорів (17,2 в середньому), віком 6-9 діб. Чотири реципієнти відновили цикли нормальної тривалості, але п’ятий (№1076), що йому було трансплантовано 18 ембріонів, опоросився (20%). Генетичний аналіз показав, що всі 4 поросят походили від донора, бластоцисти якого були 7-денними і синхронними з маткою реципієнта за віком (44,4% пренатального виживання). Жодна з 8-денних бластоцист другого донора, асинхронних з маткою, не розвинулась до строку. Всі поросята, одержані внаслідок застосованої обробки матки реципієнта еякулятом з убитими сперміями, народилися живими, масою від 1,73 до 2,0 кг і не мали ніяких відхилень від норми. Отже, попередня обробка незапліднених реципієнтів еякулятом з убитими сперміями може оптимізувати маткове середовище і поліпшувати результат НХТЕ, і цей напрямок досліджень заслуговує подальшого розвитку.

Результати НХТЕ реципієнтам, спарованим у нормальному режимі. Оскільки результати НХТЕ інтактним реципієнтам показали, що гальмування розвитку ембріонів донора внаслідок трансплантаційного стресу очевидно порушує процес розпізнавання материнським організмом стану вагітності, ми надалі використали реципієнтів, попередньо спарованих у нормальному режимі (24-36 год. від початку охоти) з метою запобігання лютеолізу за рахунок їх власних ембріонів. Використали 10 реципієнтів, яким трансплантували від 4 до 14 ембріонів (8,5 в середньому), віком від 4 до 10 діб. Опоросилося 50% реципієнтів кількістю 59 поросят, від 9 до 16 у гнізді (11.8±1,38). Ці реципієнти одержали донорські ембріони, вік яких відставав від ембріонів реципієнта на 1 добу (табл.1). Показово, що в 5 з 6 випадків випередження ембріонами донора ембріонів реципієнта на 1 добу одержали опороси, тоді як у 3 випадках синхронності віку трансплантантів з ембріонами реципієнта опоросів не одержали. Нарешті, всі без винятку опороси були одержані при відставанні реципієнтів за циклом від донорів на 1-2 доби.

Перевірка генетичного походження приплоду була здійснена у трьох найбільш багатоплідних гніздах поросят, одержаних від свиноматок №№ 548, 544 і 1128. Кількість трансплантантів склала 26,5±13,8% від числа ідентифікованих. Переважна більшість їх (80%) була одержана за умови синхронності віку ембріонів донора і матки реципієнта (від початку охоти). Отже, НХТ ембріонів спарованим реципієнтам забезпечує одержання у приплоді трансплантантів і побічно підтверджує наші висновки про причини відновлення циклів інтактними реципієнтами. Саме цей методичний варіант забезпечив одержання нами перших в Україні і СНД поросят-трансплантантів у результаті НХТЕ.

Розробка способу оптимізації умов розвитку ембріонів донора в репродуктивному тракті реципієнта. У зв’язку з тим, що використання спарованих реципієнтів забезпечило лише 26,5±13,8% трансплантантів серед генетично перевіреного приплоду, причиною чого була загибель, у першу чергу, донорських ембріонів за умов суперіндукції у перевантаженій матці, виникла необхідність розробити спосіб коректування умов розвитку ембріонів у матці спарованого реципієнта. На підставі аналізу літературних джерел ми дійшли висновку про можливість використати феномен старіння ооцитів у реципієнтів при затриманому їх паруванні як першу складову комплексного методу нейтралізації явища суперіндукції за рахунок загибелі надлишкової частини їх власних ембріонів. Разом з тим, необхідно було враховувати вплив ступеня асинхронності циклів донора і реципієнта, а також віку ембріонів донора і реципієнта з метою використання цих фізіологічних параметрів для створення такої хронологічної конфігурації в системі ембріони-матка, яка б сприяла підвищенню конкурентної здатності трансплантантів. Тому з урахуван-ням літературних даних, а також виявленого і нами факту позитивного впливу

1. Результат нехірургічної трансплантації ембріонів реципієнтам, спарованим у нормальному режимі.

Реципієнт, інд.№ | Донор, інд.№ | Відношення циклів пар донор/ реципієнт, діб | Показники ембріонів донора | Вік ембріонів донора/вік матки реципієнта та ступінь асинхронності, діб | Вік ембріонів донора / вік ембріонів реципієнта і ступінь їх відставання | Одержано

поросят

n | розміри, м | Cv,% | ± у | вік, діб

M±m | lim | від I і II парування донора | уточнений за стадією

розвитку

1052 | 1298 | 11/7 [-4] | 14 | 3014±84 | 2400-3500 | 10,4 | 313.4 | 11…10 | 10 | 10/7 [-3] | 10/6 [-4] | -

662 | 136 | 9/8 [-1] | 10 | 377±16 | 308-434 | 23,9 | 52,3 | 9…8 | 8 | 8/8 [ 0 ] | 8 /7 [-1 ] | -

548 | 12 | 9/8 [-1] | 9 | 487±30 | 392-630 | 18,6 | 30,4 | 8 | 8 | 8/8 [ 0 ] | 8/7 [-1] | 11

1298 | 1242 | 8/7 [-1] | 10 | 281±22 | 140-350 | 24,5 | 69,0 | 8…7 | 7 | 7/7 [ 0 ] | 7/7 [0] | -

1246 | 1166 | 8/6 [-2] | 9 | 305± 14 | 224-350 | 33,7 | 41,9 | 8…7 | 7 | 7/6 [-1] | 7/6[-1] | 10

746 | C.7 | 7/7 [ 0 ] | 7 | 526± 28 | 420-630 | 14,1 | 74,0 | 7 | 7 | 7/7 [ 0 ] | 7/7 [0] | -

544 | 198 | 7/6 [-1] | 6 | 399± 3 | 392-406 | 1,9 | 7,7 | 7…6 | 7 | 7/6 [-1] | 7/6 [-1] | 16

1128 | 20 | 7/6 [-1] | 11 | 210±4 | 196-224 | 6,0 | 12,5 | 7…6 | 6 | 6/6 [ 0 ] | 6/5 [-1] | 13

128 | 1480 | 5/4 [-1 ] | 4 | 186±9 | 168-210 | 9,5 | 17,6 | 5 | 5 | 5/4 [-1] | 5/4 [-1] | 9

136 | 1178 | 5/5 [ 0 ] | 5 | 157±3 | 154-168 | 4,0 | 6,3 | 5…4 | 4 | 4/5 [+1] | 4/4 [0] | -

відставання реципієнта за циклом від донора на 1- 2 доби, ми включили цей варіант як другу складову розроблюваного комплексного методу. Використання затриманого парування реципієнтів забезпечило можливість збереження синхронності віку ембріонів донора і матки реципієнта при наявності асинхронності їх циклів, тому третьою складовою обрали синхронність віку ембріонів донора і віку (за циклом) матки реципієнта. Як четверту складову використали варіант випередження за віком ембріонів реципієнта ембріонами донора, оскільки відомо, що ембріони, які затримались у своєму розвиткові, не можуть конкурувати з більш просунутими в межах однієї матки. З метою експериментальної перевірки робочої гіпотези було проведено дослід на 29 свинках, з них – 12 реципієнтів, яких було спаровано в режимі затримки (48-60 год. від початку охоти) і 17 донорів спарованих у нормальному режимі (табл. 2). Для підвищення рівня суперіндукції, реципієнтам трансплантували по 14,3 ембріонів, в середньому, проти 8,5 у попередньому досліді з використанням реципієнтів, спарованих у нормальному режимі. Реципієнти відставали від донорів за циклом на 1-2 доби або були синхронними з ними. Разом з тим, затримане парування реципієнтів дозволило варіювати ступінь синхронності віку їх матки за циклом з віком ембріонів донора від повної синхронності до відставання матки від ембріонів донора на 1 чи навіть 2 доби. Одночасно затримка парування реципієнтів призводила до асинхронності віку їх матки з віком власних ембріонів, що також мусило забезпечувати пріоритетний розвиток ембріонам донора.

З метою з’ясування можливих меж асинхронності віку ембріонів донора з віком матки реципієнта при нормальному (див.табл.1) і затриманому (див. табл. 2) паруванні було перевірено варіанти: А - випередження маткою ембріонів на 1 добу [+1] за умов синхронності циклів і за умов їх розходження на 0,5 доби: Б - відставання ембріонів від віку матки на 1 добу [-1] при відставанні реципієнта за циклом на 1 чи 2 доби; В – відставання матки реципієнта від віку трансплантантів на 2 доби за умов такого ж рівня відставання його за циклом; Г – повна синхронність віку ембріонів донора і матки реципієнта за умов синхронності циклів або відставання за циклом реципієнта на 0,5 - 1 добу (10 випадків). У групі А одержано 66,60% опоросів, Б – 75% при тотожності хронологічної конфігурації щодо циклу і матки реципієнта ( [-1] і [-1] ) і навіть 100% за умов ( [-2] і [-1] ), у групі В – 50%., Г – 50% за умов повної синхронності обох показників і 81,8% за умов синхронності віку ембріонів з віком матки, але при відставанні реципієнтів за циклом. Всього в групі Г опоросилося 2 реципієнта з 5 спарованих у нормальному режимі (40%) і 8 з 8 спарованих у режимі затримки (100%).

У пошуках оптимальної вікової різниці ембріонів реципієнта і донора ми застосували варіанти відставання розвитку перших на 0,5 - 3 доби, і для кож-ного з використаних варіантів виявилось можливим одержання опоросів (див. табл.1, 2). Що ж стосується зв’язку цього показника з виходом трансплан-тантів,

2. Результати нехірургічної трансплантації ембріонів реципієнтам, спарованим у режимі затримки.

Реципієнт, інд.№ | Донори, інд.№№ | Відношення циклів пар донор/ реципієнт, діб | Показники ембріонів донора | Вік ембріонів донора / вік матки реципієнта та ступінь асинхронності, діб | Вік ембріонів донора / вік ембріонів реципієнта та ступінь їх відставання , діб | Одержано поросят

n (від кожного з донорів) | розміри, м | Cv,% | ± у | вік, діб

M±m | lim | від I і II парування донора | уточнений за стадією

розвитку

830 | 912 | 9/8 [-1] | 12 | 499±9 | 434-532 | 6,0 | 30,0 | 8 | 8 | 8/8 [0] | 8/6 [-2] | 5

554 | 2080 | 9/8 [-1] | 7 | 592±8 | 280-728 | 25,8 | 152,9 | 9…8 | 8 | 8/8 [0] | 8/6,5 [-1,5] | 11

2164 | 2318 | 8/8 [0] | 11 | 493±25 | 280-594 | 17,2 | 84.7 | 8…7 | 8 | 8/8 [0] | 8/6,5 [-1,5] | 9

622 | 8/8 [0] | 9 | 356±5 | 322-378 | 4,4 | 15,8 | 8…7 | 7 | 7/8 [+1] | 7/6,5 [-0,5]

1976 | 1589 | 8/8 [0] | 10 | 417±10 | 350-462 | 7,7 | 32,2 | 8…7 | 8 | 8/8 [0] | 8/5,5 [-2,5] | 9

2176 | 8/8 [0] | 11 | 255±10 | 196-294 | 13,4 | 34,2 | 8…7 | 7 | 7/8 [+1] | 7/5,5 [-1,5]

2030 | 552 | 8/7 [-1] | 11 | 479±10 | 434-546 | 6,6 | 32,8 | 8…7 | 8 | 8/7 [-1] | 8/5,5 [-2,5] | 11

2148 | 8/7 [-1] | 9 | 208±11 | 182-252 | 16,4 | 34,2 | 8…7 | 7 | 7/7 [0] | 7/5,5 [-1,5]

592 | 2304 | 8/7 [-1] | 11 | не вимірювали | - | 8…7 | 7 | 7/7 [0 ] | 7/6 [-1] | 8

2144 | 2096 | 8/6 [-2] | 14 | 502±24 | 280-608 | 18,2 | 91,3 | 8…7 | 8 | 8/6 [-2] | 8/5 [-3] | -

620 | 8/6 [-2] | 9 | 488±19 | 406-594 | 11,9 | 58,1 | 8…7 | 8 | 8/6 [-2] | 8/5 [-3]

272 | 664 | 7/6 [-1] | 11 | 196±15 | 154-266 | 24,5 | 48,1 | 7…6 | 6 | 6/6 [0] | 6/4 [-2] | 14

1974 | 7/6 [-1] | 14 | 203±11 | 126-252 | 20,9 | 42,4 | 7…6 | 6 | 6/6 [0] | 6/4 [-2]

2144 | 632 | 7/5 [-2] | 9 | 236±11 | 182-280 | 13.7 | 32.4 | 7 | 7 | 7/5 [-2] | 7/4 [-3] | 13

2046 | 6 | 7/5 [-2] | 9 | 219±16 | 140-280 | 22,3 | 49,0 | 7…6 | 6 | 6/5 [-1] | 6/3,5 [-2,5] | 8

2030 | 688 | 7/6 [-1] | 4 | 476±33 | 378-518 | 13,8 | 65,7 | 7…6 | 7 | 7/6 [-1] | 7/4,5 [-2,5] | -

620 | 924 | 8/7[-1] | 12 | 312±14 | 224-364 | 15,9 | 49,6 | 8…7 | 7 | 7/7[0] | 7/5 [-2] | 4

то всі зареєстровані випадки їх одержання за умов затриманого парування були отримані при випередженні ембріонів реципієнта ембріонами донора на 2 доби (для порівняння -– в межах групи нормального парування – на 1 добу). В цілому комплексне коректування умов розвитку ембріонів в організмі реципієнта забезпечило 83,33% опоросів і 92 поросяти, від 4 до 14 у гнізді (9,2±1,06).

Оскільки провідною складовою серед комплексу фізіологічних факторів, обраних нами для оптимізації умов розвитку трансплантантів у матці реци-пієнта, є затримка його парування, то для порівняння результатів двох варіантів НХТЕ здійснили ідентифікацію за генотипом приплоду реципієнтів, спарованих у режимі максимальної затримки, тобто 55-60 год. від початку охоти. Резуль-тати порівняння (табл. 3) свідчать про істотне (р<0,05) підвищення виходу поросят трансплантаційного походження при застосуванні комплексного коректування умов розвитку ембріонів у матці спарованого реципієнта.

3. Ефективність НХТЕ за умов використання реципієнтів, спарованих у нормальному режимі та режимі затримки.

Показники | Тип парування

нормальне | затримане

Трансплантовано ембріонів, n (на одного реципієнта) | 26 ( 8,6) | 39 (13,0)

Народилось поросят, n (ідентифіковано за генотипом) | 40 (36) | 23 (19)

Відсоток одержаних від кожного з реципієнтів (Р)

поросят-трансплантантів

від числа ідентифікованих | Р №548 | 9,09 | Р №620 | 75,0

Р №544 | 16,66 | Р №830 | 100,0

Р №1128 | 53,84 | Р №272 | 53,84

M | 26,5 | 76,3

± m | 13,8 | 13,3

±у | 24,0 | 23,1

Cv | 90,3 | 30,3

Отримані результати підтвердили важливість фактору синхронності ембріональної стадії трансплантантів і відповідної секреторної фази матки реципієнта: 93% поросят трансплантаційного походження було одержано за умов синхронності віку ембріонів донора і матки реципієнта.

Беручи до уваги, що різноякісність зародків за темпами розвитку є фізіологічним базисом рівня їх виживання, здійснили перевірку залежності результатів НХТЕ від ступеня розвитку ембріонів донора за показниками діаметру бластоцист і виходу поросят трансплантаційного походження. Графік, побудований на підставі таких даних (рис.3), ілюструє наявність статистично вірогідної (p < 0.05) лінійної прямої залежності (кореляція r = 0.86; детермінація d = 73.60%) між відсотком бластоцист з діаметром середнім і більшим (x) та відсотком трансплантантів від числа іденти-фікованих поросят (y), що дозволяє за відомими значеннями x цілком надійно прогнозувати можливі значення y за рівнянням прямолінійної регресії (див. пунктирна лінія на рис. 3).

Отже, кількість у пулі ембріонів донора більш просунутих у розвитку екземплярів, тобто біологічно більш повноцінних, вірогідно позитивно пов’язана з виходом поросят-трансплантантів у попередньо спарованих реципієнтів. При цьому характерно, що для всіх x значення y для затриманого парування (ре-ци-пієнти №№ 272, 620, 830) вищі за відповідні значення для нормального парування (ре-ци-пієнти №№ 548, 544, 1128 і це означає, що при застосуванні комплексного способу оптимізації умов розвитку ембріонів донора ступінь їх розвитку на момент НХТЕ впливає на її результат більшою мірою, ніж за умов нормального режиму парування реципієнтів.

Рис. 3. Взаємозв’язок між показни-ками діаметру бластоцист донора і виходом поросят-трансплан-тантів.

Таким чином, проведені дослідження в цілому підтверджують і дають практичне підґрунтя нашій робочій гіпотезі щодо можливості оптимізації умов розвитку трансплантантів в організмі реципієнта на основі коректування фізіологічних факторів системи ембріон-матка, а саме, її хронологічної конфігурації у взаємозв’язку показників віку ембріонів донора з віком ембріонів і матки реципієнта, спарованого в режимі затримки.

ВИСНОВКИ.

1.У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення проблеми нехірургічної (трансцервікальної) трансплантації ембріонів свині на підставі результатів вивчення фізіологічних факторів оптимізації умов розвитку ембріонів донора у матці реципієнта при застосуванні способу, заснованого на врахуванні динаміки періодів проникності цервікального каналу в залежності від скорочення і розслаблення м’язів цервікса.

2. Динаміка цервікальної проникності матки свині обумовлена перебігом естрального циклу, свідченням чого є високий коефіцієнт лінеаризованої детермінації R2 = 0,8488 (p<0,05). Цервікальна проникність дозволяє введення трансплантаційного середовища протягом перших 12 діб естрального циклу під неушкоджуючим тиском 100-200 мм.рт.ст. Ступінь цервікальної проникності протягом перших 9 діб циклу не має вірогідної відмінності між незаплідненими і вагітними власними ембріонами реципієнтами.

3. Розроблений спосіб нехірургічної трансплантації ембріонів свині принципово відрізняється від інших тим, що базується на використанні існуючих фізіологічних закономірностей моторики матки свині протягом естрального циклу, не потребує анестезії, седації і фіксації реципієнтів, насильного розкриття цервікального каналу та просування катетера у матку і може застосовуватись у виробничих умовах свиноферми.

4. Причиною відновлення циклів інтактними (незаплідненими) реципієнтами є затримка розвитку і зниження виживання ембріонів донора у матці реципієнта в критичні 12-15 дні вагітності.

5. Попередня, через 24 год. від початку охоти, обробка матки незапліднених 6-8-денних за циклом реципієнтів еякулятом з убитими сперміями поліпшує умови розвитку трансплантантів, про що свідчить народження живого, біологічно повноцінного приплоду (20% опоросів) при виживанні ембріонів донора на рівні 44,4%.

6. Використання реципієнтів, спарованих у нормальному режимі і вагітних власними ембріонами, забезпечує збереження вагітності в критичні 12-15 дні і одержання, як мінімум, 50% опоросів і 11,8±1,38 поросят у гнізді, серед яких 26,5±13,8% трансплантаційного походження.

7. Затримане до 48-60 год після початку охоти парування реципієнтів забезпечує 83,33% опоросів і розмір гнізда поросят 9,2±1,06, серед яких 76,3±13,3% трансплантаційного походження; при цьому оптимальним для одержання опоросів (100%) є варіант повної синхронності віку матки реципієнта (за циклом) з віком ембріонів донора при відставанні реципієнта за циклом від донора на 1 добу.

8. Комплексне коректування умов розвитку ембріонів донора у матці спарованого реципієнта, складовими якого є: затримане