НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

_____________________________________________________________

Степанова Інна Вікторівна

УДК 612.822:611.813.14

ДИНАМІЧНА ВЗАЄМОДІЯ КАЛЬЦІЄВИХ КАНАЛІВ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ З ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИМИ КАЛЬЦІЄВИМИ ДЕПО В СЕНСОРНИХ НЕЙРОНАХ ЩУРА

03.00.02 – біофізика

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Наукові керівники: | Академік НАН України, доктор біологічних наук, професор, директор Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідуючий відділом загальної фізіології нервової системи (ЗФНС), Костюк Платон Григорович

Доктор медичних наук, провідний науковий співробітник Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Костюк Олена Платонівна | Офіційні опоненти: | Член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, зав. відділом фізіології нейронних мереж Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Веселовський Микола Сергійович.

Член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, зав. відділом біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, Костерін Сергій Олексійович. |

Провідна установа: | Кафедра біофізики біологічного факультету Національного університету імені Тараса Шевченка

|

Захист відбудеться 07.02.2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий 25.12.2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Кальцій є найбільш універсальним і розповсюдженим вторинним посередником у клітині. Іони кальцію залучені у величезну кількість клітинних процесів, котрі визначають народження клітини, її життєдіяльність, патологічні зміни і загибель. В останні роки велика увага приділяється внеску окремих кальційрегулюючих механізмів у формування глобальних змін концентрації вільного внутрішньоклітинного Са2+ ([Ca2+]i). Зокрема, встановлено, що практично в усіх типах клітин амплітуда і швидкість захоплення Са2+ мітохондріями залежать не тільки від амплітуди підвищення [Ca2+]i, але й від джерела його надходження у клітину, а також від механізмів, за допомогою яких дане підвищення відбувається (Babcock et.al., 1997). Мітохондрії можуть захоплювати як кальцій, що входить через кальцієві канали плазматичної мембрани, так і іони, що вивільняються з депо ендоплазматичного ретикулуму (ЕР). В той же час ЕР у багатьох типах клітин здатен підсилювати кальцієвий сигнал, що надходить від кальцієвих каналів плазматичної мембрани шляхом механізму кальційіндукованого вивільнення Са2+ (calcium-induced calcium release, CICR) (Shmigol et.al., 1995). Спустошення депо ендоплазматичного ретикулуму здатне активувати йонні канали плазматичної мембрани, проникні для Са2+, ініціюючи так званий депозалежний вхід Са2+ у клітину (Bolotina et.al., 2004). Такий вхід Са2+ є основним механізмом, що забезпечує підвищення [Ca2+]i в незбудливих клітинах. Донедавна вважалося, що в збудливих клітинах такий механізм регуляції відсутній (Friel et.al., 1992), проте результати робіт останніх років спростовують це положення. З'являється все більше доказів того, що депозалежний вхід Са2+ відіграє важливу роль у забезпеченні кальцієвого гомеостазу в багатьох збудливих, у тому числі й нервових клітинах (Emptage et.al., 2001). Таким чином, наявні дані дозволяють говорити про складну взаємодію мембранних і внутрішньоклітинних кальційрегулюючих механізмів у процесі формування внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів.

Досліджувані в роботі нейрони спінальних гангліїв малого та середнього діаметру беруть участь у передачі больової інформації від відповідних рецепторів, і саме зміни кальцієвого гомеостазу в цих клітинах вважаються першопричиною виникнення больових синдромів при певних патологічних станах (таких, як цукровий діабет). Тому детальний аналіз впливу кальцієвих каналів плазматичної мембрани, мітохондрій і ЕР на формування внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, а також взаємодії цих структур у процесі формування кальцієвих сигналів у сенсорних нейронах, здогадно залучених у ноціцепцію, є дуже важливим і представляє безсумнівний науковий інтерес і велике практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур”.

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у оцінці того, яким є внесок кальцієвих каналів плазматичної мембрани різних типів (потенціалкерованих, рецепторкерованих та депоактивованих), ЕР, мітохондрій, а також взаємодії цих кальційрегулюючих механізмів у процес формування кальцієвих сигналів у нейронах СГ, вірогідно залучених у процеси ноціцепції. З урахуванням цього були поставлені наступні завдання:

1.

·

·

·

·

2.

3.

4.

5.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше визначено кінетичні характеристики функціонування мітохондрій і ЕР в процесі активності здогадно ноціцептивних соматосенсорних нейронів щура, викликаної деполяризацією плазматичної мембрани. Показано, що характеристики функціонування згаданих органел є важливими для нормальної роботи клітини і саме вони зазнають змін при розвитку експериментально-індукованого діабету. Виявлено, що обмін Са2+ у мітохондріях залежить від джерела підвищення концентрації іонів в цитозолі. Крім того, уперше досліджені характеристики входу Са2+, активованого спустошенням депо ЕР, висунуті припущення щодо можливої природи різниці кінетичних характеристик активації таких сигналів та ролі мітохондрій у їх формуванні. У роботі досліджено чутливість внутрішньоклітинних кальцієвих депо до капсаіцину, визначено значні відмінності в чутливості ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани і ЕР, а також досліджено участь мітохондрій у формуванні капсаіциніндукованих кальцієвих сигналів. Показано складний взаємозв’язок різних кальційрегуляторних механізмів у формувані внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати мають як теоретичне, так і практичне значення. Докладніше визначення кількісних характеристик мембранних та внутрішньоклітинних кальційрегуляторних механізмів, а також розуміння їх взаємодії у процесах формування внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів значно розширюють наші уявлення про механізми кальцієвого гомеостазу в нейронах спінальних гангліїв малого та середнього діаметру. Оскільки досліджувані в роботі нейрони передають больову інформацію, детальне вивчення процесів формування кальцієвих сигналів в них є необхідним для розуміння того, як формується такий сигнал в нормальних умовах. Порівняння роботи мітохондрій та ЕР в контрольних умовах та при патологічних станах (в роботі - модель діабету) поліпшить розуміння розвитку порушень у передачі сенсорної інформації при різних захворюваннях. Вивчення впливу різних хімічних речовин на функціонування систем, що підтримують кальцієвий гомеостаз, робить можливим застосування таких сполук у клінічній практиці.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі, статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних літератури, а також, за участю наукових керівників, у плануванні напрямків досліджень та аналізі одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на: конференції фізіологічного товариства Угорщини “Оксидативний стрес і клітинна сигналізація”, Будапешт, Угорщина, 2003; IV Національному конгресі патофізіологів України, Чернівці, 2004; літній школі IBRO “Сенсорна і інтегративна нейронаука: від рецепторів до поведінки”, Москва, Росія, 2004; літній школі IBRO “Рецептори. Канали. Посередники.”, Ялта, Україна, 2004, ; літній школі IBRO “Дослідницькі стратегії щодо вивчення комплексних нервових сітей.”, Дебрецен, Угорщина, 2005, а також на семінарах сектору молекулярної фізіології інституту фізіології ім. О.О. Богомольця.

Публікації. За результатами роботи опубліковано п’ять статей у наукових журналах та тези трьох доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів та результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 220 найменувань. Робота викладена на 150 сторінках та ілюстрована 31 рисунками.

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтовано актуальність дослідження взаємодії входу Са2+ з позаклітинного середовища до цитозоля клітини через потенціалкеровані, рецепторкеровані та депоактивовані кальцієві канали плазматичної мембрани з функціонуванням мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму у процесі формування внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів, сформульовані мета і завдання дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1 “Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих аспектів функціонування мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму як активних внутрішньоклітинних кальцієвих депо, а також висвітлено процес взаємодії цих органел при формуванні кальцієвих транзієнтів в різних типах клітин. Висвітлено аспекти, пов’язані зі змінами в кальцієвій сигналізації досліджуваних нейронів при діабеті. Надано основні характеристики ванілоїдних рецепторів, які є полімодальними детекторами больових стимулів, що експресуються у плазматичній мембрані сенсорних нейронів малого та середнього діаметру. Наведено відомості про депоактивований вхід Са2+ у клітини та його фізіологічну роль, а також можливу участь ванілоїдних рецепторів у формуванні таких сигналів.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 “Матеріали та методи дослідження” описано використання наступних методичних підходів:

·

·

·

·

·

Ферментативне виділення ізольованих нейронів DRG.

В експериментах використовували щурів лінії Вістар віком 1-1,5 місяці. Процедура декапітації щура проводилась у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин. Виділялись грудні і поперекові спинномозкові ганглії. Нейрони СГ ізолювались шляхом піпетування гангліїв після їх ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині Tyrode (склад розчинів наведений нижче) з додаванням 1 мг/мл протеїнази (тип XXIII, Sigma, США) і 0,5 мг/мл колагенази (тип IA, Sigma, США) протягом 35 хвилин (370 С).Клітини використовувалися в експерименті протягом 6-8 годин після виділення. Контрольні експерименти показали, що ізольовані таким методом нейрони зберігають свої основні характеристики протягом 24 годин.

Флуоресцентний метод вимірювання концентрації іонів Са2+. Для реєстрації змін концентрації вільного внутрішньоклітинного кальцію використовувалась методика двохвильової флуоресцентної кальційметрії з використанням мембранопроникної естерифікованої форми флуоресцентного барвника indo1. Ізольовані нейрони СГ інкубували протягом 30 хв при температурі 370 С в розчині, що містив 10 мкМ indo1/am. Після цього клітини відмивали чистим зовнішньоклітинним розчином і залишали в темряві при кімнатній температурі на 30 хв для деестерифікації барвника. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось при довжині хвилі 360 нм за допомогою ртутної лампи та відповідних фільтрів. Реєстрація емісії проводилась у двох діапазонах: 395-410 нм (F400) і 490-510 нм (F500) за допомогою двох фотопомножувачів. Сигнали з фотопомножувачів подавали на вхід аналогового ділителя (DIV100, Burr Broun, США), який у реальному часі обчислював співвідношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах хвиль: R = F400/F500 . Це співвідношення пропорційне концентрації внутрішньоклітинного кальцію ([Ca2+]i) і не залежить від концентрації барвника у клітині. Для точного обчислення [Ca2+]i нами використовувалася наступна формула:

[Ca2+]i = Kd · B · (R - Rmin) / (Rmax - R),

де Kd - константа дисоціації індикатору з кальцієм; B - коефіцієнт, обумовлений оптичними характеристиками установки, дорівнює співвідношенню F5000/F500s (F5000 – інтенсивність флуоресценції indo-1 у відсутності кальцію, F500s – інтенсивність флуоресценції indo-1 при насичуючій концентрації Са2+ ); Rmin – співвідношення F400/F500 у відсутності кальцію; Rmax – співвідношення F400/F500 при насичуючій концентрації іонів. Всі значення концентрацій представлені у вигляді середніх значення середньоквадратичне відхилення (SEM); n є кількістю досліджених клітин. Достовірність статистичних відмінностей при міжвибірковому порівнянні визначалась за допомогою критерія Ст’юдента (Т-тесту). Відмінності вважали достовірними при Р0,05. Апроксимацію кривих наростання кальцієвих транзієнтів виконували за формулою:

[Ca2+]i =[Ca2+]i o +A*(1 - exp(-)),

де [Ca2+]i – концентрація Са2+ в цитозолі клітини в даний момент часу, [Ca2+]i o – базальний рівень кальцію, t0 – початковий момент часу t1 – стала часу наростання транзієнта, А – амплітудний коефіцієнт.

Модель стрептозотоциніндукованого діабету. У моделі експериментального діабету використовувались щури віком 21 день. Стан діабету викликався внутрішньочеревинною ін’єкцією стрептозотоцину (СТЗ), розчиненому у фізіологічному розчині (ізотонічний розчин 0,9% NaCl для ін’єкцій), із розрахунку 80 мг/кг. Щури з СТЗ-індукованим діабетом та контрольні тварини того самого віку утримувались в однакових умовах з однаковим раціоном протягом усього періоду розвитку захворювання. Експерименти проводилися на тваринах через 3-4 тижні після ін’єкції стрептозотоцину. Концентрацію глюкози в плазмі крові, взятої із хвостової вени, виміряли за допомогою оптичного сенсора глюкози Глюкотренд (Roche Diagnostics Gmb., Mannheim, Німеччина). Із групи щурів з діабетом бралися тварини з рівнем глюкози в плазмі крові, більшим, ніж 18 мМ.

У третьому розділі “Результати досліджень” експериментально визначені особливості кальцієвої сигналізації у нейронах СГ малого та середнього діаметру, кінетичні кальційобмінні властивості внутрішньоклітинних кальцієвих депо в залежності від джерела надходження Са2+ до цитозолю.

Вклад мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму в кальцієвий транзієнт, викликаний деполяризацією плазматичної мембрани. Внутрішньоклітинна концентрація іонів кальцію [Ca2+]i в нейронах СГ місячних щурів за відсутності зовнішніх впливів підтримувалася на постійному (базовому) рівні. Середнє значення останнього складало 1189 нМ (n = 40). Аплікація гіперкалієвого розчину (50 мМ KCl) тривалістю 3 с викликала короткочасне підвищення [Ca2+]i, котре надалі буде називатися “кальцієвим транзієнтом”. Викликаний деполяризацією кальцієвий транзієнт мав фазу швидкого наростання тривалістю 3 с і фазу спаду, що характеризувалася складною кіне-тикою. Протягом перших 8 с відбувалося швидке зниження концентрації іонів кальцію до пев-ного значення, що потім збері-галося протягом 3–4 хв, утворю-ючи другу фазу спаду каль-цієвого транзієнта, так звану фазу плато. Пікові значення кальцієвих транзі-єнтів, викликаних деполяризацією плазматичної мембрани, складали в середньому 377±21 нМ. Повторна аплікація гіперкалієвого розчину після відновлення внутрішньо-клітинного рівня Ca2+ до базової концентрації викликала кальцієвий транзієнт, що достовірно не відрізнявся за характеристиками від попе-реднього (Рис.1). Для оцінки участі ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у формуванні транзієнтних змін концентрації Са2+ у цитозолі деполяризація плазматичної мембрани здійснювалася після преаплікації 1 мкМ тапсигаргіну – блокатора кальцієвої АТФ-ази ЕР.

Амплітуда кальцієвого транзієнта в цьому випадку знижувалася до 246±17 нМ (n=8, Р<0,001); тобто відносне зниження амплітуди склало 35% у порівнянні з контрольними умовами (Рис.2).

Для того, щоб виключити дію тапсигаргіну на потенціалкеровані кальцієві канали плазмалеми, аналогічні експерименти були проведені в умовах преаплікації 200 нМ іономіцину, що спустошує ЕР за рецепторнезалежним механізмом. Спустошення депо ЕР іономіцином не внесло достовірних змін у результати, отримані при спустошенні того ж депо тапсигаргіном. Для оцінки участі уніпортера мітохондрій у формуванні кальцієвого сигналу деполяризація плазматичної мембрани здійснювалася на тлі преаплікації 10 мкМ СССР (мітохондріального протонофору, що роз'єднує протонний градієнт на внутрішній мембрані мітохондрій). Амплітуда деполяризаційних транзієнтів, викликаних таким чином, досягала 525±14 нМ (n=11, P<0,001), збільшившись у порівнянні з контрольними умовами на 39%. Істотно змінилася і кінетика транзієнтів. Тривалість фази наростання істотно зросла в порівнянні з контрольними умовами (у чотири рази), її середня тривалість склала 16 с, а фаза спаду втратила чітко виражене плато (Рис.3).

Отримані дані дозволяють зробити висновок, що в досліджуваних нейронах ЕР значно підсилює кальцієві сигнали, що надходять від потенціалкерованих

каналів плазматичної мембрани. У той же час мітохондрії обмежують амплітуду деполяризаційного транзієнта й обумовлюють складну кінетику його спаду, активно захоплюючи кальцій, що надходить з зовнішньоклітинного середовища (Рис.4). Для детальнішого аналізу участі внутрішньоклітинних органел у підтриманні кальцієвого гомеостазу була проведена математична обробка отриманих даних і виділені криві, що характеризують зміни, внесені в амплітуду і кінетику кальцієвих транзієнтів уніпортером мітохондрій і ендоплазматичним ретикулумом (Рис.5). Криві отримані шляхом віднімання кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією плазматичної мембрани нейронів в контрольних умов та після блокування кальційобмінної функції або ЕР (шляхом преаплікації тапсигаргіну) або мітохондрій (шляхом преаплікації мітохондріального протонофору СССР).

Отримані результати свідчать, що кальційіндуковане вивільнення Са2+ з депо ЕР починалося на 1й - 3й секунді і досягало максимуму через 3,8 - 4,6 с після початку деполяризації. Потім протягом 6 - 7 с спостерігалося захоплення іонів кальцію з цитозоля АТФазами ЕР. Захоплення іонів кальцію мітохондріями починалося з 4ї – 8ї с і досягало максимуму через 14 - 18 с від початку деполяризації. Процеси вивільнення [Ca2+]i з мітохондрій через механізм Na+-Ca2+ обмінника починали переважати над процесами захоплення уніпортером через 38 - 43 с від початку деполяризації. Співставлення кінетики роботи мітохондрій і ретикулуму дозволяє припустити наявність функціонального зв'язку між цими структурами.

Взаємний вплив кальційрегулюючих органел у процесі формування кальцієвих сигналів. Вивільнення Ca2+ з ЕР в цитозоль викликалося шляхом активації ріанодинових рецепторів. Для цього використовувалася позаклітинна аплікація 30 мМ кофеїну. Для оцінки можливої участі мітохондрій у формуванні кофеїніндукованих кальцієвих транзієнтів порівнювались тран-зієнти в контрольних умовах та після преаплікації 10 мкМ мітохондріального протонофору СССР (Рис.6).

Блокування уніпортеру мітохондрій приводило до достовірних змін у кінетиці спаду кофеїн-індукованого кальцієвого сигналу; повернення концентрації Са2+ до базового рівню суттєво уповільнювалося. Такі зміни кінетики кофеїн-індукованого кальцієвого тран-зієнта, ймовірно, пов’язані з тим, що в контрольних умовах мітохондрії активно захоплюють Са2+, виведений з ЕР. Аплікація СССР на спаді кофеїніндукованого кальцієвого транзієнта викликала додаткове підвищення кон-центрації Са2+ в цитозолі, що також підтверджує участь уніпортеру мітохондрій у захопленні Са2+, що вивільняються з ЕР. Отримані дані свідчать про те, що в дослід-жуваних нейронах мітохондрії захоплюють не лише Са2+, що надходять з позаклітинного середовища, але і Са2+, що вивільняються з депо ендоплазматичного ретикулуму. При кофеїніндукованому кальцієвому транзієнті захоплення Са2+ мітохондріями починалося через 3 - 6 с від початку аплікації кофеїну, максимально ефективним мітохондріальне захоплення було на 12й –16й секундах спаду транзієнта, процес виведення починав переважати на 36й – 40й секундах спаду. На рис. 7 представлено криві кальцієвого обміну мітохондріями при різних джерелах надходження кальцію в цитозоль.

Таким чином, мітохондрії включаються в роботу незалежно від того, чи є джерелом іонів кальцію позаклітинне середовище, чи внутрішньоклітинні кальцієві депо. Відрізняється тільки ефективність кальцієвого обміну мітохондріями.

Зміна кінетичних характеристик взаємного функціонування мітохондрій та ЕР при цукровому діабеті. У контрольних умовах деполяризація плазматичної мембрани нейронів, узятих у тварин зі стрептозотоцин(СТЗ)-індукованим діабетом, викликала підвищення концентрації Са2+ від базального рівня 127±5 нМ до 430±22 нМ (n=11). Для визначення внеску мітохондрій у кальцієвий транзієнт деполяризація плазматичної мембрани відбувалась на тлі преаплікації мітохондріального протонофору СССР.

Амплітуда викликаного в такий спосіб кальцієвого транзієнта досягала 386±28 нМ (n=14). Отримані результати дозволяють говорити про те, що і в умовах діабету функціонування мітохондрій в досліджених нейронах обмежує амплітуду кальцієвих сигналів. Після накладання кальцієвих транзієнтів, котрі спостерігалися у контрольних умовах і при заблокованому уніпортері мітохондрій, були виділені криві, що характеризують кінетику кальцієвого обміну мітохондріями в нейронах щурів, хворих на діабет. Порівняння кривих обміну Са2+ мітохондріями у нейронах контрольних тварин та тварин з діабетом, виявило значні розбіжності. Знизилися амплітуди мітохондріального захоплення і виведення Са2+. Відбулися зміни часових характеристик наростання і спаду концентрації Са2+ у мітохондріях. Так, у тварин зі СТЗ-індукованим діабетом максимальна амплітуда захоплення і виведення Са2+ склала 218±18 і 60±4 нМ відповідно. У контрольних умовах величини відповідного мітохондриального захоплення і виведення склали 265±23 і 163±24 нМ відповідно. У нейронах діабетичних тварин спостерігалося значне уповільнення захоплення і виведення Са2+ мітохондріями. Так, постійна часу наростання концентрації Са2+ у мітохондріях склала 6,75±0,4 с для тварин з експериментальноіндукованим діабетом і 3,27±0,6 с для контрольних тварин. Параметром, що характеризує швидкість виведення Са2+ з мітохондрій, був обраний час, за який амплітуда [Са2+]м досягала 50% від свого максимального значення. Так, час напівспаду [Са2+]м при діабеті досягав значення 21±4 с, а в контрольних умовах - 12,6±2,4 с (Рис.8).

Рис.8. Зміни у характеристиках функціонування мітохондрій при експериментальноіндукованому діабеті. Ліва панель ілюструє обмін Са2+ мітохондріями в нейронах контрольних тварин (1) та тварин з експериментально-індукованим діабетом (2). Права панель - кількісні характеристики функціонування мітохондрій: а – амплітуда захоплення Са2+ мітохондріями, б – амплітуда вивільнення Са2+ мітохондріями, в,г – часові характеристики захоплення та виведення Са2+ мітохондріями в контролі (білі стовпчики) та при експериментальноіндукованому діабеті (чорні стовпчики).

Аплікація 30 мМ кофеїну викликала в нейронах тварин, хворих на цукровий діабет, кальцієві транзієнти з середньою амплітудою 197±35 нМ (n=14), що на 33% нижче, ніж у аналогічних кальцієвих транзієнтів, викликаних кофеїном у нейронах контрольних тварин (амплітуда яких досягала 295±8 нМ). Аплікація 10 мкМ СССР на спаді кофеініндукованого кальцієвого транзієнта призводила до додаткового підвищення концентрації кальцію на 140±16 нМ у порівнянні з 223±42 нМ у нейронах контрольних тварин (Р<0,05) (Рис.9).

Це свідчить про зниження ефективності захоплення мітохондріями не тільки іонів Са2+, які входять до цитозолю через кальцієві канали плазматичної мембрани, а і Са2+, що вивільняються з депо ЕР. Таким чином, зміни у функціонуванні кальційобмінних механізмів в мітохондріях та ЕР призводять до драматичних змін глобального кальцієвого транзієнта, і це може розглядатися я к найважливіший чинник, котрий лежить в основі порушень проведення больових стимулів.

Вхід Са2+ з позаклітинного середовища в цитозоль, активований спустошенням депо ЕР. Для дослідження можливої участі депокерованого входу Са2+ в цитозоль дослід-жуваних нейронів, було проведено експерименти по вивченню змін внутрішньоклітинної концентрації Са2+, які відбуваються при спусто-шенні ЕР у безкальцієвому та ка-льційвмісному зовнішньоклітин-них розчинах. Щоб стандартизу-вати початкові умови, всі дослід-жені нейрони піддавалися поперед-ній деполяризації, що призводила до перезаповнення депо. Після деполяризації над клітиною не проводилось ніяких маніпуляцій до повернення [Ca2+]i до базового рівня. Для вивчення можливого входу Са2+, викликаного спустошенням ЕР, порівнювали кінетичні характеристики кофеїніндукованих кальцієвих транзієнтів, викликаних аплікацією 10 мМ кофеїну у нормальному розчині Тіроде і у безкальцієвому позаклітинному розчині. Аплікація 10 мМ кофеїну в нормальному розчині, що містив 2 мМ Са2+, викликала в цитозолі транзієнтне підвищення [Ca2+]i, амплітуда якого досягала 13627 нМ (n=11), а постійна часу спаду склала 36,50,2 с. Амплітуда кальцієвого транзієнта, викликаного аплікацією кофеїну в безкальцієвому розчині достовірно не відрізнялася від такої в нормальному фізіологічному розчині і складала 12819 нМ (n=9). Однак при цьому відбувалися достовірні зміни кінетичних характеристик транзієнта. Відновлення концентрації Са2+ до базального рівня прискорювалося (постійна часу спаду транзієнта склала 15,80,1 с). На рис.10 співставлені кофеїніндуковані кальцієві сигнали у Са2+-вмісному та безкальцієвому розчинах.

Спустошення ЕР у кальційвмісному розчині призводило до появи додаткового кальцієвого сигналу, який повністю зникав при додаванні у зовнішньоклітинний розчин 100 нМ лантану.Для більш докладного вивчення кальцієвих транзієнтів, зв'язаних з депозалежним входом Са2+ у досліджувані нейрони, застосовувалось спустошення ЕР у безкальцієвому розчині шляхом активації ріанодинових (RYR) та інозитолтрифосфатчутливих (Ins3R) рецепторів ЕР, а також при блокуванні АТФаз (SERCA) цієї органели. Для цього застосовувалися аплікації 100 нМ ріанодину, 200 мкМ АТФ і 1 мкМ тапсигаргіну відповідно. Потім безкальцієвий позаклітинний розчин замінювався на розчин Тіроде, що містив 2 мМ Са2+. Аплікація ріанодину в безкальцієвому розчині призводила до виникнення кальцієвого транзієнта з середньою амплітудою 15634 нМ (n=14), який практично відновлювався до вихідного базового рівня протягом наступних 30 – 40 с. Заміна безкальцієвого розчину на кальційвмісний розчин призводила до виникнення кальцієвого транзієнта, що мав фазу швидкого наростання і фазу монотонного повільного спаду (Рис.11).

Аплікація 200 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині викликала Аплікація 200 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині викликала активацію метаботропних пуринорецепторів плазматичної мембрани, підвищення концентрації інозитолтрифосфату в цитозолі нейронів і вивільнення кальцію з інозитолтрифосфатчутливого депо ЕР. Амплітуда такого транзієнта досягала 4621 нМ (n=9). При заміні безкальцієвого розчину на кальційвмісний виникав кальцієвий транзієнт з амплітудою 6420 нМ (n=9). Після досягнення максимального значення транзієнт виходив на стійке плато, що зберігалося протягом тривалого часу (300 с і більше) (Рис.12).

Аплікація 1 мкМ тапсигаргіну викликала в безкальцієвому розчині підвищення [Ca2+]і, пов'язане з блокуванням кальцієвих АТФаз ЕР і виведенням Са2+ через канали витоку. Амплітуда такого тапсигаргініндукованого транзієнта складала 39±16 нМ (n=11); заміна безкальцієвого розчину кальційвмісним призво-дила до виникнення кальцієвих транзієнтів з амплітудою 59±12 нМ (Рис.13).

Додавання у кальцій-вмісний зовнішньоклітинний роз-чин 100 нМ лантану повністю бло-кувало підвищення [Ca2+]i у 100% дослід-жуваних нейронів. Наявність 100 нМ рутенія червоного призводила до зниження амплітуди депоза-лежного входу Са2+ на 18% тільки у випадку спустошення ЕР аплі-кацією ріанодину. Такий результат дозволяє припустити участь вані-лоїдних рецепторів у формуванні депозалежних кальцієвих сигналів, викликаних спустошенням ЕР ріанодином. Отримані дані дозволяють зробити висновок про те, що незалежно від того, за допомогою якого механізму відбувається виведення Са2+ з ЕР, спустошення депо ретикулуму викликає вхід Са2+ з позаклітинного середовища, і такий вхід відрізняється за своїми амплітудно-кінетичними характеристиками. Для більш детального аналізу кінетики наростання кальцієвих транзієнтів, викликаних депозалежним входом Са2+, були отримані усереднені (у кожному випадку суперпозиція 7 кривих) нормовані щодо максимального значення [Ca2+]i , викликані депозалежним входом кальцію, а також отримані відповідні значення сталих часу наростання транзієнтів у кожному випадку (Рис.14).

Отримані дані показали, що спустошення ЕР за допомогою АТФ і тапсигаргіну призводить до виникнення кальцієвих транзієнтів, що достовірно не відрізняються за кінетикою наростання. Постійні часу наростання для депозалежного входу Са2+, викликаного аплікацією АТФ і тапсигаргіну, склали 33,051,42 і 28,21,29 с відповідно. У той же час постійна часу наростання депозалежного входу Са2+, викликаного спустошенням депо ЕР ріанодином склала 8,770,86 с. Така різниця у характеристиках може бути пов’язана як з різними механізмами активації відповідних кальцієвих сигналів, так і компартменталізацією ЕР.

Для визначення можливої участі мітохондрій у формуванні депоактивованих кальцієвих транзієнтів аплікація індукторів вивільнення Са2+ з ЕР з подальшою заміною безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину кальційвмісним відбувалась на тлі преаплікації мітохондріального протонофору СССР. Блокування уніпортеру мітохондрій призводило до значних змін у кінетичних характеристиках кальцієвих сигналів, що активувались спустошенням ЕР. На рис.15 представлено нормовані щодо максимального значення кальцієві транзієнти, викликані спустошенням депо аплікацією ріанодину (А) та АТФ (Б) в контрольних умовах (темні символи) та при заблокованому уніпортері мітохондрій (світлі символи).

Отримані дані дозволяють зробити висновок про участь мітохондрій у формуванні кінетичних характеристик відповідних депоактивованих кальцієвих транзієнтів. У контрольних умовах мітохондрії сприяють подовженню такого депозалежного сигналу в часі; фаза спаду є повільнішою. Блокування уніпортеру мітохондрій призводить до швидкого відновлення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ до базального рівня. Подібні результати свідчать про те, що мітохондрії в досліджуваних нейронах захоплюють іони Са2+, які надходять в цитозоль через депокеровані канали плазматичної мембрани, перешкоджаючи таким чином їх кальційзалежній інактивації. При блокуванні уніпортеру мітохондрій відбувається швидка інактивація цього типу кальцієвих каналів і швидкий спад відповідних кальцієвих транзієнтів.

Капсаіциніндуковані кальцієві транзієнти. Здатність первинних сенсорних нейронів малого та середнього діаметру передавати інформацію про больові стимули пов'язана з тим, що в цих клітинах експресовані так звані ванілоїдні рецептори (TRPV1). Для дослідження чутливості ванілоїдних рецепторів нейронів СГ ми використовували аплікації капсаіцину в різних концентраціях у розчині, що містив 2 мМ Са2+, і в безкальцієвому позаклітинному розчині. У

кальційвмісному розчині капсаіцин викликав кальцієві сигнали, що характеризувалися фазою швидкого наростання і дещо уповільненою фазою спаду. Спад капсаіциніндукованих кальцієвих транзієнтів залежав від концентрації капсаіцину у розчині. Константа IC50 у випадку наявності Са2+ у звнішньоклітинному розчині склала 19 нМ. Аплікація капсаіцину в безкальцієвому розчині викликала дозозалежне збільшення [Ca2+]i в 53% досліджених нейронів (19 з 36). IC50 в цьому випадку склала 172 нМ. Таким чином, концентрація капсаіцину, що викликає кальцієвий транзієнт з амплітудою у 50% від максимальної (IC50), відрізняється для рецепторів плазматичної мембрани і ЕР майже на порядок. В іншій групі досліджуваних

нейронів (17 з 36) аплікація капсаіцину в безкальцієвому розчині викликала підвищення концентрації кальцію, що за амплітудою не перевищувало 50 нМ. Ймовірно, що ця група клітин відноситься до більших нейронів (з середнім діаметром соми). Ці клітини експресують у мембрані ЕР рецептори, подібні до ванілоїдних, але не чутливі до капсаіцину. При заміні безкальцієвого розчину, що містить капсаіцин, на нормальний розчин Тіроде, що містить 2 мМ Са2+, у 100% досліджуваних нейронів виникало підвищення [Ca2+]i, яке, досягнувши максимального значення, виходило на стійке плато і зберігалось у цитозолі протягом сотень секунд. У клітинах, у яких капсаіцин викликав дозозалежні кальцієві транзієнти в безкальцієвому розчині Тіроде, амплітуда кальцієвих сигналів, викликаних додаванням Са2+ у зовнішньоклітинне середовище, склала 126±18 нМ. У нейронах, що демонстрували слабку чутливість до капсаіцину в безкальцієвому розчині Тіроде, виникали транзієнти з середньою амплітудою 325±41 нМ (Рис.16).

Додавання до Са2+-вмісного розчину 100 нМ рутенія червоного (блокатору TRPV1), приводило до зниження амплітуд відповідних кальцієвих транзієнтів на 78%, основний вклад у формування таких транзієнтів вносять капсаїцинові рецептори плазматичної мембрани.

Для того, щоб перевірити можливу участь мітохондрій у кальцієвої сигналізації, пов’язаній з аплікацією капсаіцину, спустошення депо ЕР у безкальцієвому розчині відбувалось на тлі преаплікації мітохондріального протонофору СССР і блокування уніпортеру мітохондрій (Рис.17).

При цьому спостерігались значні зміни в амплітуді (спостерігалось підвищення амплітуди в обох групах клітин, більш вираженим - майже вдвічі зростання

було для клітин з високою чут-ливістю ЕР до капсаіцину) та кіне-тиці відповідних кальцієвих сигна-лів. Так, у контрольних умовах спад транзієнтів був набагато повільнішим; протягом перших 100 – 120 с з моменту заміни безкальцієвого на кальційвмісний розчин зберігалося стабільне зна-чення концентрації внутрішньо-клітинного Са2+. При забло-кованому уніпортері мітохондрій вже в перші 40 - 50 с з моменту заміни безкальцієвого розчину на розчин з 2 мМ Са2+, амплітуда такого капсаіциніндукованого кальцієвого транзієнта знижувалася в середньому на 54% у порівнянні з максимальним значенням його амплітуди. Таким чином, можна зробити висновок про те, що мітохондрії беруть активну участь у модуляції кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів, пов'язаних із входом кальцію, котрий викликаний спустошенням ЕР капсаіцином.

Обговорення результатів. Наша робота присвячена вивченню взаємної участі кальцієвих каналів плазматичної мембрани різних типів і внутрішньоклітинних кальційрегулюючих органел у кальцієвій сигналізації нейронів СГ малого та середнього діаметру при наявності різних джерел надходження Са2+ до цитозолю. Основним фактором, що визначає характер взаємодії різних кальційрегулюючих механізмів, є просторове розташуваннявнутрішньоклітинних органел, які беруть участь у кальцієвому гомеостазі, у цитоплазмі клітини відносно плазматичної мембрани. На культурі нейронів гіпокампу за допомогою вінбластіну - агента, що дестабілізує мікротрубочки цитоскелета, була показана зміна кальцієвої сигналізації в залежності від просторового розподілу мітохондрій у цитоплазмі (Wang et al., 2003). У нашій лабораторії раніше було показано, що існують значні відмінності в кальційрегулюючій функції мітохондрій у первинних та вторинних сенсорних нейронах (Shishkin et al., 2002). Це може бути обумовлене саме різним розподілом мітохондрій у цитоплазмі клітин. На основі даних електронної мікроскопії був зроблений висновок про те, що в нейронах СГ (первинні сенсорні нейрони) основна маса мітохондрій розташована в досить тонкому примембранному шарі; це обумовлює активну участь уніпортеру мітохондрій у захопленні Са2+, котрий надходить через кальцієві канали плазматичної мембрани. Отримані в роботі результати свідчать, що саме мітохондрії є найбільш потужним і універсальним кальційрегулюючим механізмом у даному типі клітин. При застосуванні блокаторів мітохондріального захоплення реєструвалися значні зміни у характеристиках кальцієвих сигналів, що викликались як активацією кальцієвих каналів плазматичної мембрани різних типів, так і вивільненням Са2+ з депо ЕР. Мітохондрії обмежують амплітуду і обумовлюють кінетику спаду внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів. Ендоплазматичний ретикулум в досліджуваних нейронах також функціонує як активне кальцієве депо, підсилюючи кальцієві сигнали, що надходять від каналів лпазматичної мембрани. Зіставлення кривих функціонування мітохондрій і ЕР, а також отримані в роботі кількісні характеристики активності кальційрегулюючих органел, дозволяють представити картину функціональної взаємодії даних структур у досліджених нейронах при формуванні кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією плазматичної мембрани:

1. Посилення кальцієвого сигналу, викликаного активацією потенціал-керованих каналів плазмалеми, за допомогою механізму CІCR починається з 1ї - 3ї секунди і досягає максимуму на 4й – 6й секунді після початку деполяризації.

2. Захоплення Са2+ мітохондріями починається на 4й – 8й секунді і досягає максимуму на 14й – 18й секунді після початку деполяризації.

3. Виведення Са2+ мітохондріями назад у цитозоль починається з 38ї – 43ї секунди.

Оскільки саме зміни кальцієвого гомеостазу у нейронах спінальних гангліїв малого та середнього діаметру пов’язують з виникненням больових синдромів, а найбільш часто розвиток таких змін відбувається при діабеті, ми проаналізували зміни у функціонуванні мітохондрій та ЕР при розвитку даної патології. Як було показано, важливою властивістю змін у сигнальних механізмах цих нейронів при діабеті є істотне подовження кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією плазматичної мембрани (Kostyuk et.al., 2001). Саме такі транзієнти відповідають за вивільнення нейротрансмітерів і передачу аферентних сигналів від первинних до вторинних сенсорних нейронів. Результати наших досліджень узгоджуються з даними літератури (Voitenko et al., 1999; Schmeichel et al., 2003). Діабетична гіперглікемія істотно знижує ефективність захоплення мітохондріями Са2+ (на 24% у порівнянні з контрольними умовами), значно знижуючи швидкість процесів захоплення і виведення Са2+ мітохондріями. Механізми описаних змін, що відбуваються в мітохондріях, на сьогоднішній день залишаються предметом дискусій. Гіперглікемія приводить до змін потенціалу на внутрішній мембрані мітохондрій, що у свою чергу відбивається на рушійній силі для захоплення Са2+ уніпортером мітохондрій. За даними літератури такі зміни потенціалу в мітохондріях відбуваються в першу чергу в нейронах периферичної нервової системи; нейрони ЦНС мають більш потужний антиоксидантний захист (Moreira et. al., 2004). Зміни у кінетичних характеристиках вивільнення Са2+ з мітохондрій пов’язані, очевидно, з погіршенням функціонування Na+-Ca2+ обмінника мітохондрій. Додавання блокатора так званих мітохондріальних пор з перехідною проникністю (PTP) не викликало змін у кальцієвих транзієнтах, які вивчалися, що виключає участь даного механізму у формуванні характеристик відповідних кальцієвих сигналів. Погіршення кальційаккумулюючої функції мітохондрій приводить до зниження продукції АТФ у клітинах (Heller et.al., 1994), що в свою чергу знижує ефективності роботи АТФаз плазматичної мембрани та мембрани ЕР. В роботі виявлено та проаналізовано пригнічення ефективності функціонування ЕР в умовах діабету. Порушення у роботі мітохондрій та ЕР є складовою частиною змін кальцієвого гомеостазу, які відбуваються при діабеті і ведуть до порушення проведення сенсорної інформації в нервовій системі.

Як було показано раніше, ріанодинчутливе депо ЕР досліджуваних нейронів може спонтанно перезаповнюватися при потенціалі спокою, в умовах, коли потенціалкеровані кальцієві канали не беруть участі у проведенні Са2+ з позаклітинного середовища в цитозоль клітини (Garaschuk et.al., 1997). Значна частина Са2+, що вивільняється з депо ЕР, негайно виводиться з цитозоля клітини (Werth, 1996), тому в перезаповненні депо ЕР при потенціалі спокою, можливо, бере участь Са2+, що надходить з позаклітинного середовища за допомогою механізму, який не залежить від потенціалу на мембрані і керується лише ступенем заповненості депо. Наші результати показали наявність такого механізму в досліджуваних нейронах. Депозалежний вхід Са2+ у незбудливих клітинах є основним шляхом підвищення [Ca2+]i. Таке надходження Са2+ в цих клітинах пов'язують в основному зі спустошенням ІnsР3-чутливого депо ЕР (Parekh, 1997). Депоактивований вхід Са2+, пов’язаний зі спустошенням ріанодинчутливого депо ЕР був показаний на клітинах лінії РС12 (Bennett, 1998). Результати нашої роботи свідчать про наявність зв'язку між спустошенням як ріанодинчутливого, так і інозитолтрифосфатчутливого депо ЕР з активацією депозалежного входу Са2+ у нейронах СГ малого та середнього діаметру. Структурна і функціональна подібність ріанодинчутливих і інозитолтрифосфатчутливих ЕР була показана раніше (Pozzan, 1994). Активація депозалежного входу Са2+, викликана блокуванням АТФаз ЕР у нейронах СГ, свідчить про те, що утворення інозитолтрифосфату не є необхідною умовою активації депозалежного входу Са2+ у ці клітини. У досліджуваних здогадно ноціцептивних нейронах СГ кінетика розвитку депокерованих кальцієвих транзієнтів достовірно відрізнялась у випадку спустошення ЕР різними індукторами вивільнення Са2+ з ЕР. Це може бути пов’язано як з наявністю різних механізмів активації таких сигналів, так